この研究は、カナダの自然科学および工学研究評議会によって支持された。

1.興味のある遺伝子を得る<ol><li> 合成遺伝子を設計する。 <ol><li> 大腸菌発現のための遺伝子配列を最適化する。 </li><li>配列（AvrII、NdeI、EcoRIおよびXbaI）から問題のある制限部位を除去する。 </li><li>クローニングのための制限部位を組み込む。 5&#39;-NdeI部位および3&#39;-EcoRI部位が推奨される。必要に応じて、他のサイトも使用できます。選択したプラスミドのマルチクローニング領域を参照してください（ 図S1〜S4 ）。必要に応じて、ウェスタンブロット検出用の5 &#39;または3&#39;エンコードタグを含めます。 </li><li>設計された遺伝子を商業的に注文する。 </li><li>製造者の指示に従って、平滑化クローニングキットを用いて平滑化ベクターに遺伝子を平滑化する;遺伝子を増幅するためのプライマーを設計する（ステップ1.2.2に進む）。またはさらに5 &#39;および3&#39;末端を加えてpMGXプラスミドに直接クローニングし、ステップ2に進む。ここで、th代表的な結果は、関心のある遺伝子を無作為にクローニングすることによる。 </li></ol></li><li> 所望の遺伝子を増幅する（設計および最適化された合成遺伝子または所望の遺伝子を含む鋳型DNAから） 15 。 <ol><li>クローニングのための制限部位を有するプライマーを設計する; 5&#39;-NdeI部位および3&#39;-EcoRI部位が推奨される。必要に応じて、他のサイトも使用できます。選択したプラスミドのマルチクローニング領域を参照してください（ 図S1〜S4 ）。必要に応じて、ウェスタンブロット検出用の5 &#39;または3&#39;エンコードタグを含める。 </li><li>所望の遺伝子をPCR増幅する15 。 </li><li>アガロースゲル電気泳動によるPCRの解析16 。 </li><li>非特異的な増幅がある場合、ゲル抽出によって増幅された遺伝子を浄化する。そうでない場合は、酵素クリーンアップキットを使用してください。 </li><li>分光光度計を使用してDNAを定量する。260nmにおけるe。溶出緩衝液を含むブランク17 。 </li></ol></li></ol> 2.マルチ遺伝子発現系ベクターpMGX 18への関心対象遺伝子のクローニング<ol><li> 制限は、得られた目的の遺伝子および所望のベクターpMGXをNdeIおよびEcoRIで消化する。 注：大量の再環状化プラスミドが得られた場合、EcoRIを添加する前にNdeI反応を1時間進行させます。 <ol><li> 0.5-1.5μgのDNAと1μLの各酵素と4μLの適切な10倍緩衝液を含む40μLの消化反応物を使用する。 </li><li> NdeIおよびEcoRI消化物については、EcoRI緩衝液を使用し、最初にNdeIエンドヌクレアーゼを添加する。 37℃で1時間消化する。次に、EcoRIエンドヌクレアーゼを添加し、ダイジェストをさらに1時間進行させる。 NdeIはDNAの末端近くの切断に敏感であるため、EcoRIによる初期消化はNdeIによる効果的な消化を妨げる可能性があります。 </li></ol></li><li>電気アガロースゲル上で制限消化物を発色させる（1kb遺伝子については、110Vで0.7％アガロースゲルを55分間使用する;異なる遺伝子サイズに対するアガロースゲルのパーセントを選択するには、参考文献16を参照のこと）。 </li><li>きれいなメスまたはカミソリの刃を使用して挿入バンドとベクターバンドを切り出し、切除したゲルセグメントを1.5mLチューブに入れる。 </li><li>ゲル抽出キットを使用してアガロースゲルからDNAを製造元のプロトコールに従って抽出する。 </li><li> 3：1インサート - ベクター比を用いて目的の遺伝子をpMGXベクターにライゲートする。インサートなしで消化したpMGXのネガティブライゲーションを設定する。 <ol><li> T4 DNAリガーゼ1μL、ベクターDNA（〜5μL）0.15〜0.5μg、および3：1インサート対ベクター比に基づいて適切な量のインサートを含む20μL連結反応をセットアップし、挿入されている遺伝子; pMGXバックボーンは、5,312〜5,504bpのサイズである。すべてのbuを含むネガティブコントロール反応を含める挿入されている遺伝子。ベクターDNAの量が、陰性対照ライゲーションおよびベクタープラス挿入ライゲーション反応において同等であることを確認する。 </li></ol></li><li> 連結反応をXL1-Blue化学的にコンピテントな大腸菌細胞に連結し、連結したプラスミドpMGX- yfg1 （目的遺伝子1を含む）、pMGX -yfg2 （目的遺伝子2を含む）、pMGX -yfgn （目的遺伝子nを含む）。無菌技術を使用する（バイオセーフティキャビネット内または炎の下）。 <ol><li>化学的にコンピテントなXL1-Blue E. coliの 100μLアリコートを氷上で5分間解凍し、ライゲーション反応液 5μLを加えます。氷上で30分間インキュベートする。 </li><li> 42℃に保たれた水浴中で細胞を45秒間熱ショックし、次いで200μLの冷LBを加える。氷上で2分間インキュベートする。 </li><li>細胞を37℃、220rpmで1時間振盪し、次いでプレートを100μLをLBを含有する寒天プレート上に広げる。（アンピシリンまたはカナマイシンのいずれか）を含む。 </li></ol></li><li> 陽性形質転換体のクローンをスクリーニングする。 <ol><li>ネガティブコントロールおよびライゲーションプレート上のコロニー数を比較する。 1：2より大きいコロニーカウント比が望ましい。ネガティブコントロールプレート上に多数のコロニーがある場合は、ステップ2.1に戻り、メモを確認します。 </li><li>スクリーニング（1 n）のために挿入された異なる遺伝子の各ライゲーション反応から4-8個のコロニー（ネガティブコントロール：ライゲーション比に依存する）を選択し、4 mLのLBおよび適切な抗生物質一晩培養/個々のコロニーに接種する。 37℃および220 rpmで振とうしながら一晩培養します。 </li><li>製造業者のプロトコールに従ってプラスミドDNA単離キットを用いてプラスミドDNAを単離する。 </li><li> 150〜500ngのDNAと1μLの各酵素を含む20μLのNdeI + EcoRI消化反応を2μLの適切な10×緩衝液で設定する。第一に関心のある遺伝子が制限部位の間にあるのと同時にNdeIおよびEcoRIを添加する。空のpMGXベクターによる陰性対照が推奨される。水浴中で37℃で2時間消化する。 </li></ol></li></ol> 3.遺伝子1、pMGX -yfg1を含むpMGXベクターへの遺伝子2の挿入<ol><li> 制限は、AvrIIでpMGX- yfg1を消化し、仔ウシ腸ホスファターゼ（CIP）で治療する。 <ol><li> 0.5-1.5μgのベクターDNA（約5-10μLの単離されたDNA）および1μLのAvrIIを含む40μLの消化反応物を、適切な10×緩衝液4μLとともに使用する。 37℃で1.5時間消化し、次いで1.5μLのCIPを添加する。 37℃でさらに30分間放置する。 </li></ol></li><li> 制限酵素消化物pMGX- yfg2をAvrIIおよびXbaIで消化して目的の遺伝子を遊離させる。 <ol><li> 0.5〜1.5μgのDNAと1μMのDNAを含む40μLの消化反応;各酵素のLを4μLの適切な10×緩衝液で希釈する。 37℃で2時間消化する。 </li></ol></li><li>電気泳動制限は、適切なパーセント（0.7％）のアガロースゲルで消化し、きれいなメス/カミソリの刃を用いてインサートおよびベクターバンドを切除する（ステップ2.2〜2.3参照）。 </li><li>ゲル抽出キットを使用してDNAを抽出し、DNA 17を定量する。 </li><li> 3：1インサート - ベクター比を用いて、L遺伝子2をpMGX- yfg1に挿入する。追加の挿入物なしで消化したpMGX -yfg1のネガティブライゲーションを設定する。上記の手順2.5で設定します。 </li><li>ステップ2.6で見られるように、ライゲーション反応物5μLをXL1-Blue化学的コンピテント大腸菌細胞に連結し、プラスミドpMGX -yfg1,2 （目的遺伝子1および2を含む）および陰性pMGX -yfg1コントロールに連結する。 </li><li>ネガティブコントロールおよびライゲーションプレート上のコロニー数を比較する。コロニー数の比g1：2以上が望ましい。ネガティブコントロールプレート上に多数のコロニーがある場合は、ステップ3.1に戻り、CIP処理を確認します。 </li><li>ライゲーション反応から4-8個のコロニー（ネガティブコントロール：ライゲーション比に応じて）を選択し、個々のコロニーあたり4 mLのLBと適切な抗生物質を接種し、37℃および220 rpmで一晩増殖させます。 </li><li>製造業者のプロトコールに従ってプラスミドDNA単離キットを用いてプラスミドDNAを単離し、DNA17を定量する。 </li><li> EcoRIでpMGX -yfg1,2の制限消化を行うことにより、第2の遺伝子の有効な挿入をスクリーニングする。 <ol><li> 150-500 ngのDNAと1μLのEcoRI酵素と2μLのEcoRI 10xバッファーを含む20μLの消化反応を使用します。 37℃で2時間消化する。 </li></ol></li><li>適切な％アガロースゲル上で制限消化物を電気泳動する;対応するバンドを探すsを遺伝子2のサイズに合わせる（ステップ2.2参照）。遺伝子は、望ましくない逆向きのベクターに挿入することができる。 </li></ol>第1および第2遺伝子pMGX-yfg1,2を含むpMGXベクターへの第3遺伝子の付加 <ol><li>制限はAvrIIでpMGX- yfg1,2を消化し、ステップ3.1に示すようにCIPで治療する。 </li><li>ステップ3.2に見られるように、制限消化物pMGX- yfg3をAvrIIおよびXbaIで消化する。 </li><li>適切な％アガロースゲル上で制限消化物を電気泳動し、きれいなメス/カミソリの刃を用いてインサートおよびベクターバンドを切除する;手順2.2-2.3を参照してください。 </li><li>ゲル抽出キットを使用してアガロースゲルからDNAを抽出し、DNA 17を定量する。 </li><li> 3：1インサート対ベクター比を用いてL遺伝子3をpMGX- yfg1,2に挿入し、ステップ3.5に示すように、追加の挿入物なしで消化したpMGX -yfg1,2のネガティブライゲーションを設定した。 </li><li> 5μLの連結反応をXLに変換する1-Blue化学的にコンピテントな大腸菌細胞、ライゲートしたプラスミドpMGX- yfg1,2,3 （目的の遺伝子1,2および3を含む）、および陰性pMGX -yfg1,2対照（ステップ2.6参照）。 </li><li>ネガティブコントロールおよびライゲーションプレート上のコロニー数を比較する。ネガティブコントロールプレート上に多数のコロニーがある場合は、ステップ4.1に戻り、CIP処理を確認します。 </li><li>ライゲーション反応から4〜8個のコロニー（ネガティブコントロール：ライゲーション比に応じて）を選択し、個々のコロニーあたり4 mLのLBと適切な抗生物質を接種する。 37℃および220rpmで一晩増殖させる。 </li><li>プラスミドDNA単離キットを製造元のプロトコールに従って用いてプラスミドDNAを単離する。 </li><li>ステップ3.10に示すように、EcoRIでpMGX -yfg1,2,3の制限消化を行うことにより、第3の遺伝子の有効な挿入をスクリーニングする。 </li><li>適切な％アガロースゲル上で制限消化物を電気泳動する;見える遺伝子2および遺伝子3のサイズに対応するバンドについては（ステップ2.2参照）。注：遺伝子3は、望ましくない逆向きのベクターに挿入することができます。遺伝子2および3が同じサイズである場合、スクリーニングのために別の適切な制限消化部位を選択しなければならない。 注：新しい遺伝子ごとに必要に応じて繰り返します。 </li></ol> 5.マルチ遺伝子発現系を用いた目的タンパク質の産生およびウエスタンブロッティングによる産生の評価<ol><li> 関心のある全ての遺伝子を含む陽性クローンを、BL21-（λDE3）のような化学的コンピテントなタンパク質生産大腸菌に形質転換する。 <ol><li>化学的にコンピテントなBL21-（λDE3） 大腸菌の 100μLアリコートを氷上で5分間解凍し、次いで陽性クローン化プラスミドDNA1μLを加える;氷上で30分間インキュベートする。 </li><li> 42℃に保たれた水浴中で細胞を45秒間熱ショックし、次いで200μLの冷LBを加える。氷上で2分間インキュベートする。 </li><li>細胞を37°Cおよび220 rpmで1時間振とうし、プレート100μLを適切な選択マーカー（アンピシリンまたはカナマイシンのいずれか）を含むLB-寒天プレートに塗布する。 </li></ol></li><li> イソプロピル-β-D-1-チオガラクトピラノシド（IPTG）誘導によりタンパク質を発現させる。 <ol><li> B21-（λDE3）形質転換プレートから単離されたコロニーを選択し、適切な抗生物質を加えた4mLのLBに接種する。一晩増殖し、37℃および220rpmで振とうする。 </li><li> 1mLの一晩培養液を使用して、100mLのLBに適切な抗生物質培養物を加えて接種する。 </li><li> OD 600が0.6になるまで220 rpmで振盪しながら37℃で増殖させる。 </li><li> 100μMIPTGで培養物を誘導し、25℃および220rpmで15時間増殖させる。 </li><li> 1 mLの培養液を取り除き、13,000 xgで1分間遠心してください。上清を捨てる。 </li></ol></li><li>製造元の指示に従って溶解液を用いて細胞を溶解する可溶性細胞ライセートのウエスタンブロットを行い、すべてのタンパク質がうまく産生されたかどうかを調べる19 。 </li></ol>

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著者は何も開示することはない。

特に複雑な多遺伝子代謝経路の特徴付けおよび再構築には、複数の遺伝子の同時発現がますます必要不可欠となっている3,4,5 。 pMGXシステムは、 大腸菌ルーチン6,7,8で多遺伝子同時発現を行い、多様な研究者にアクセス可能である。この研究では、目的の5つのタンパク質が、pMGX-Aを用いて単一のプラスミドシステムから同時に生成されることが示された。現?...

特に、複数の機能モジュールを発現させなければならない合成生物学アプリケーションでは、複数のタンパク質の共発現がますます必要不可欠となっている。発現および機能がしばしば共発現2,3を必要とするタンパク質 - タンパク質複合体の研究において ;経路中の各遺伝子が4,5,6,7,8で発現されなければならない生合成経路を特徴づけ、利用することにある。特に宿主生物であるエシェリヒア・コリ （ Escherichia coli）において、共発現のための多くの系が開発されている。例えば、異なる選択可能なマーカーを有する複数のプラスミドを使用して、豊富な異なるex<html>プレスベクトル10,11 。複数のタンパク質発現のための単一プラスミド系は、各遺伝子の発現を制御するために複数のプロモーターのいずれかを使用している10,12 ;複数の遺伝子が単一の転写産物にコードされている合成オペロン2,13;場合によっては、最終的にタンパク質分解処理されたポリペプチドをコードする単一の遺伝子を含み、目的の所望のタンパク質14を生じる。 <img alt="図1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55187/55187fig1.jpg" /> 図1：ポリシストロニックベクターの構築を示すpMGXワークフロー。 pMGXシステムは、誘導性T7プロモーターの制御下で合成オペロンの構築のための柔軟で使い易い戦略を提供する。e.com/files/ftp_upload/55187/55187fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt;この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 この原稿では、誘導性T7 RNAポリメラーゼ（ 図1 ）の制御下にある多重遺伝子合成オペロンの構築のための非常に有効なシステムの使用が記載されている。このシステムは、多くの遺伝子が1つのプラスミドから同時に発現されることを可能にする。これは元々pKH22と呼ばれていたプラスミドシステムに基づいており、これは数多くのさまざまなアプリケーションでよく使用されています6,7,8。ここでは、このプラスミドセットは、4つの関連ベクター：pMGX-A、C末端タグまたはN末端タグを欠く発現ベクターおよびアンピシリン耐性マーカーを含むように拡大される。 pMGX-hisA、N末端ヘキサヒスチジンタグおよびアンピシリン耐性マーカーをコードする発現ベクター; pMGX-K、発現ベクターl任意のC末端タグまたはN末端タグとカナマイシン耐性マーカーとを接触させる工程;およびN末端ヘキサヒスチジンタグおよびカナマイシン耐性マーカーをコードする発現ベクターであるpMGX-hisK。この研究では、pMGXシステム、特にpMGX-Aを使用して5つの遺伝子を含むポリシストロニックベクターを作製する方法が、 大腸菌における個々のタンパク質の成功した産生と共に実証される。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1224">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Enzymes</td>
			<td style="width:312px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP)</td>
			<td style="width:312px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:139px;">M0290S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AvrII</td>
			<td style="width:312px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:139px;">R0174S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EcoRI</td>
			<td style="width:312px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:139px;">R0101S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NdeI</td>
			<td style="width:312px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:139px;">R0111S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">XbaI</td>
			<td style="width:312px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:139px;">R0145S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Herculase II Fusion DNA Polymerase</td>
			<td style="width:312px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:139px;">600677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td style="width:312px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:139px;">M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:327px;">Name</td>
			<td style="width:312px;">Company</td>
			<td style="width:139px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Reagents</td>
			<td style="width:312px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1 kb DNA ladder</td>
			<td style="width:312px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:139px;">N3232L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4-20% Mini-PROTEAN TGX Stain-Free Protein Gels</td>
			<td style="width:312px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:139px;">456-8095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 x TAE</td>
			<td style="width:312px;">Fisher Thermo Scientific</td>
			<td style="width:139px;">BP1332-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agar</td>
			<td style="width:312px;">Fisher Thermo Scientific</td>
			<td style="width:139px;">BP1423-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose</td>
			<td style="width:312px;">Fisher Thermo Scientific</td>
			<td style="width:139px;">BP160-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ampicilin</td>
			<td style="width:312px;">Sigma-Alrich</td>
			<td style="width:139px;">A9518-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BL21 (DE3) chemically comeptent cells</td>
			<td></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:448px;">Comeptent cell prepared in house</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B-PER Bacterial Protein Extraction Reagent</td>
			<td style="width:312px;">Fisher Thermo Scientific</td>
			<td>PI78243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">dNTP mix</td>
			<td style="width:312px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td>Supplied with polymerase</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gel Extraction Kit</td>
			<td style="width:312px;">Omega</td>
			<td style="width:139px;">D2500-02</td>
			<td>E.Z.N.A Gel Extraction, supplied by VWR Cat 3: CA101318-972</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycine</td>
			<td style="width:312px;">Fisher Thermo Scientific</td>
			<td style="width:139px;">BP381-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">His Tag Antibody [HRP], mAb, Mouse</td>
			<td style="width:312px;">GenScript</td>
			<td style="width:139px;">A00612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate</td>
			<td style="width:312px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:139px;">WBKLS0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IPTG</td>
			<td style="width:312px;">Sigma-Alrich</td>
			<td style="width:139px;">15502-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LB</td>
			<td style="width:312px;">Fisher Thermo Scientific</td>
			<td style="width:139px;">BP1426-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methanol</td>
			<td style="width:312px;">Fisher Thermo Scientific</td>
			<td style="width:139px;">A411-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pasteurized instant skim milk powder</td>
			<td style="width:312px;">Local grocery store</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td>No-name grocery store milk is adequate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Nitrocellulose membrane</td>
			<td style="width:312px;">Amersham Protran (GE Healthcare Life Sciences)</td>
			<td style="width:139px;">10600007</td>
			<td>Membrane PT 0.45 &#181;m 200 mm X 4 m, supplied by VWR Cat #: CA10061-086</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid DNA Isolation Kit</td>
			<td style="width:312px;">Omega</td>
			<td style="width:139px;">D6943-02</td>
			<td>E.Z.N.A Plasmid DNA MiniKit I, supplied by VWR Cat #: CA101318-898</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pMGX</td>
			<td style="width:312px;">Boddy Lab</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td>Request from the Boddy Lab Contact cboddy@uottawa.ca</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Primers</td>
			<td style="width:312px;">Intergrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td>Design primers as needed for desired gene</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Synthetic Gene</td>
			<td style="width:312px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td>Design and optimize as needed</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thick Blot Filter Paper</td>
			<td style="width:312px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:139px;">1703932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris base</td>
			<td style="width:312px;">BioShop</td>
			<td style="width:139px;">TRS001.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween-20</td>
			<td style="width:312px;">Sigma-Alrich</td>
			<td style="width:139px;">P9416-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">XL1-Blue chemically competent cells</td>
			<td></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:448px;">Comeptent cell prepared in house</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:327px;">Name</td>
			<td style="width:312px;">Company</td>
			<td style="width:139px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Equipment</td>
			<td style="width:312px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BioSpectrometer</td>
			<td style="width:312px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:139px;">RK-83600-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gel box - PAGE</td>
			<td style="width:312px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:139px;">1658005</td>
			<td>Mini-PROTEIN Tetra Vertical Electrophoresis Cell</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gel Imager</td>
			<td style="width:312px;">Alpha Innotech</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td>AlphaImager EC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Incubator-oven</td>
			<td style="width:312px;">Fisher Thermo Scientific</td>
			<td style="width:139px;">11-690-650D</td>
			<td>Isotemp</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Incubator-shaker</td>
			<td style="width:312px;">Fisher Thermo Scientific</td>
			<td style="width:139px;">SHKE6000-7</td>
			<td>MaxQ 6000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Personna Razors</td>
			<td style="width:312px;">Fisher Thermo Scientific</td>
			<td style="width:139px;">S04615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Power Pack</td>
			<td style="width:312px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:139px;">S65533Q</td>
			<td>FB300</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Transilluminator</td>
			<td style="width:312px;">VWR International</td>
			<td style="width:139px;">M-10E,6W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermocylcer</td>
			<td style="width:312px;">Eppendorf</td>
			<td>Z316091</td>
			<td>Mastercycler Personal, supplied by Sigma</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UV Face-Shield</td>
			<td style="width:312px;"></td>
			<td style="width:139px;">18-999-4542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Waterbath</td>
			<td style="width:312px;">Fisher Thermo Scientific</td>
			<td style="width:139px;">15-460-2SQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Western Transfer Apparatus</td>
			<td style="width:312px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:139px;">1703935</td>
			<td>Mini-Trans Blot Cell</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inducible t7 rna polymerase-mediated multigene expression system, pmgx

合成生物学、タンパク質 - タンパク質複合体の研究、および生合成経路の特徴付けおよび利用には、複数のタンパク質の共発現がますます必要不可欠である。この原稿では、誘導性T7RNAポリメラーゼの制御下にある多重遺伝子合成オペロンの構築のための非常に有効なシステムの使用が記載されている。このシステムは、多くの遺伝子が1つのプラスミドから同時に発現されることを可能にする。ここでは、アンピシリンまたはカナマイシン耐性選択マーカー（AおよびK）のいずれかとN末端ヘキサヒスチジンを有するかまたは欠いている4つの関連ベクターpMGX-A、pMGX-hisA、pMGX-KおよびpMGX-hisKのセットタグ（his）が開示される。 5つの遺伝子を含むpMGXベースのシステムが容易に構築され、 大腸菌で 5つのコードされたタンパク質すべてを産生することができることを示す、このベクターシステムを用いた合成オペロンの構築のための詳細なプロトコールを対応するデータと共に提供する。このシステムemとプロトコルは、研究者が大腸菌で複雑な多成分モジュールと経路を日常的に発現することを可能にする。

この研究では、目的は単一のプラスミドから5つのタンパク質を同時発現させることであった。 N-またはC-末端ヘキサヒスチジンタグのいずれかをコードする5コドン最適化合成遺伝子断片を商業的に購入した。合成遺伝子をPCRによって増幅し、個々にPCR-平滑ベクターにクローニングし、配列決定した。ポリシストロニックプラスミドを作製するために、目的の5つの遺?...

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Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

この研究は、pMGXプラスミド系を用いて、 大腸菌（Escherichia coli）における単一のプラスミドからの複数の遺伝子のT7媒介性同時発現のための方法を記載する。

誘導性T7 RNAポリメラーゼ媒介マルチ遺伝子発現システム、pMGX

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing ...

inducible-t7-rna-polymerase-mediated-multigene-expression-system-pmgx

Research

JoVE Journal

Genetics

13.2K ビュー.  University of Ottawa. この研究は、pMGXプラスミド系を用いて、 大腸菌（Escherichia coli）における単一のプラスミドからの複数の遺伝子のT7媒介性同時発現のための方法を記載する。 

ビデオ: Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA interactions such as microRNA-mRNA interactions have been shown to regulate gene expression, the full extent to which RNA interactions occur in the cell is still unknown. Previous methods to study RNA interactions have primarily focused on subsets of RNAs that are interacting with a particular protein or RNA species. Here, we detail a method named Sequencing of Psoralen crosslinked, Ligated, and Selected Hybrids (SPLASH) that allows genome-wide capture of RNA interactions in vivo in an unbiased manner. SPLASH utilizes in vivo crosslinking, proximity ligation, and high throughput sequencing to identify intramolecular and intermolecular RNA base-pairing partners globally. SPLASH can be applied to different organisms including bacteria, yeast and human cells, as well as diverse cellular conditions to facilitate the understanding of the dynamics of RNA organization under diverse cellular contexts. The entire experimental SPLASH protocol takes about 5 days to complete and the computational workflow takes about 7 days to complete.

Here, we detail the method of Sequencing of Psoralen crosslinked, Ligated, and Selected Hybrids (SPLASH), which enables genome-wide mapping of intramolecular and intermolecular RNA-RNA interactions in vivo. SPLASH can be applied to study RNA interactomes of organisms including yeast, bacteria and humans.

ビオチン化ソラレンを用いたRNA-RNA相互作用のマッピング

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

遺伝学

Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

Here we provide protocols for the kinetic examination of lagging-strand DNA synthesis in vitro by the replication proteins of bacteriophage T7. The T7 replisome is one of the simplest replication systems known, composed of only four proteins, which is an attractive feature for biochemical experiments. Special emphasis is placed on the synthesis of ribonucleotide primers by the T7 primase-helicase, which are used by DNA polymerase to initiate DNA synthesis. Because the mechanisms of DNA replication are conserved across evolution, these protocols should be applicable, or useful as a conceptual springboard, to investigators using other model systems. The protocols described here are highly sensitive and an experienced investigator can perform these experiments and obtain data for analysis in about a day. The only specialized piece of equipment required is a rapid-quench flow instrument, but this piece of equipment is relatively common and available from various commercial sources. The major drawbacks of these assays, however, include the use of radioactivity and the relative low throughput.

Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

We describe sensitive, gel-based discontinuous assays to examine the kinetics of lagging-strand initiation using the replication proteins of bacteriophage T7.

遅行本鎖DNA合成の動態<em&gt;インビトロ</em&gt;バクテリオファージT7複製タンパク質によって

Here we provide protocols for the kinetic examination of lagging-strand DNA synthesis in vitro by the replication proteins of bacteriophage T7. The T7 ...

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be investigated through electrophysiological analysis, biochemical characterization, mutational studies, and their effects on cellular processes. Transient transfections offer a simple protocol in which the protein becomes available for analysis within a few hours to days. Although this method presents a relatively straightforward and time efficient protocol, one of the critical components is calibrating the expression of the gene of interest to physiological relevant levels or levels that are suitable for analysis. To this end, many different approaches that offer the ability to control the expression of the gene of interest have emerged. Several stable cell transfection protocols provide a way to permanently introduce a gene of interest into the cellular genome under the regulation of a tetracycline-controlled transcriptional activation. While this technique produces reliable expression levels, each gene of interest requires a few weeks of skilled work including calibration of a killing curve, selection of cell colonies, and overall more resources. Here we present a protocol that uses transient transfection of the Transient Receptor Potential cation channel subfamily V member 1 (TRPV1) gene in an inducible system as an efficient way to express a protein in a controlled manner which is essential in ion channel analysis. We demonstrate that using this technique, we are able to perform calcium imaging, whole cell, and single channel analysis with controlled channel levels required for each type of data collection with a single transfection. Overall, this provides a replicable technique that can be used to study ion channels structure and function.

Studying ion channels through a heterologously expressing system has become a core technique in biomedical research. In this manuscript, we present a time efficient method to achieve tightly controlled ion channel expression by performing transient transfection under the control of an inducible promoter.

誘導性一過性トランスフェクションを介して制御可能なイオンチャネルの発現

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase activity. Although TERT is named as a reverse transcriptase, structural and phylogenetic analyses of TERT demonstrate that TERT is a member of right-handed polymerases, and relates to viral RNA-dependent RNA polymerases (RdRPs) as well as viral reverse transcriptase. We firstly identified RdRP activity of human TERT that generates complementary RNA stand to a template non-coding RNA and contributes to RNA silencing in cancer cells. To analyze this non-canonical enzymatic activity, we developed RdRP assay with recombinant TERT in 2009, thereafter established in vitro RdRP assay for endogenous TERT. In this manuscript, we describe the latter method. Briefly, TERT immune complexes are isolated from cells, and incubated with template RNA and rNTPs including radioactive rNTP for RdRP reaction. To eliminate single-stranded RNA, reaction products are treated with RNase I, and the final products are analyzed with polyacrylamide gel electrophoresis. Radiolabeled RdRP products can be detected by autoradiography after overnight exposure.

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) synthesizes not only telomeric DNA but also double-stranded RNA through RNA-dependent RNA polymerase activity. Here, we describe a newly established assay to detect RNA-dependent RNA polymerase activity of endogenous TERT.

テロメラーゼ逆転写酵素蛋白質の RNA 依存 RNA ポリメラーゼ活性の半定量的な検出

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

RNA Pull-down Procedure to Identify RNA Targets of a Long Non-coding RNA

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding RNA&#39;s family. Although their biological functions remain largely unknown, the number of these lncRNAs has steadily increased and it is now estimated that humans may have more than 10,000 such transcripts. Some of these are known to be involved in important regulatory pathways of gene expression which take place at the transcriptional level, but also at different steps of RNA co- and post-transcriptional maturation. In the latter cases, RNAs that are targeted by the lncRNA have to be identified. That&#39;s the reason why it is useful to develop a method enabling the identification of RNAs associated directly or indirectly with a lncRNA of interest.
This protocol, which was inspired by previously published protocols allowing the isolation of a lncRNA together with its associated chromatin sequences, was adapted to permit the isolation of associated RNAs. We determined that two steps are critical for the efficiency of this protocol. The first is the design of specific anti-sense DNA oligonucleotide probes able to hybridize to the lncRNA of interest. To this end, the lncRNA secondary structure was predicted by bioinformatics and anti-sense oligonucleotide probes were designed with a strong affinity for regions that display a low probability of internal base pairing. The second crucial step of the procedure relies on the fixative conditions of the tissue or cultured cells that have to preserve the network between all molecular partners. Coupled with high throughput RNA sequencing, this RNA pull-down protocol can provide the whole RNA interactome of a lncRNA of interest.

This RNA pull-down method allows identifying the RNA targets of a long non-coding RNA (lncRNA). Based on the hybridization of home-made, designed anti-sense DNA oligonucleotide probes specific to this lncRNA in an appropriately fixed tissue or cell line, it efficiently allows the capture of all RNA targets of the lncRNA.

RNA プルダウン長い非コード RNA の RNA 標的を識別する手順

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding ...

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to abiotic stresses and diseases. As the plant microbiome can be highly complex, low-cost, high-throughput methods such as amplicon-based sequencing of the 16S rRNA gene are often preferred for characterizing its microbial composition and diversity. However, the selection of appropriate methodology when conducting such experiments is critical for reducing biases that can make analysis and comparisons between samples and studies difficult. This protocol describes in detail a standardized methodology for the collection and extraction of DNA from soil, rhizosphere, and root samples. Additionally, we highlight a well-established 16S rRNA amplicon sequencing pipeline that allows for the exploration of the composition of bacterial communities in these samples, and can easily be adapted for other marker genes. This pipeline has been validated for a variety of plant species, including sorghum, maize, wheat, strawberry, and agave, and can help overcome issues associated with the contamination from plant organelles.

Here, we describe a protocol to obtain amplicon sequence data of soil, rhizosphere, and root endosphere microbiomes. This information can be used to investigate the composition and diversity of plant-associated microbial communities, and is suitable for the use with a wide range of plant species.

探索ルート マイクロバイ: 土、根、およびルート Endosphere から細菌群集のデータを抽出

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems

The outlined protocol describes streamlined methods for the efficient and cost-effective generation of Cas9-associated guide RNAs. Two alternative strategies for guide RNA (gRNA) cloning are outlined based on the usage of the Type IIS restriction enzyme BsmBI in combination with a set of compatible vectors. Outside of the access to Sanger sequencing services to validate the generated vectors, no special equipment or reagents are required aside from those that are standard to modern molecular biology laboratories. The outlined method is primarily intended for cloning one single gRNA or one paired gRNA-expressing vector at a time. This procedure does not scale well for the generation of libraries containing thousands of gRNAs. For those purposes, alternative sources of oligonucleotide synthesis such as oligo-chip synthesis are recommended. Finally, while this protocol focuses on a set of mammalian vectors, the general strategy is plastic and is applicable to any organism if the appropriate gRNA vector is available.

Here, a simple, efficient, and cost-effective method of sgRNA cloning is outlined.

哺乳類システムのクローン作成 CRISPR ガイド RNA

The outlined protocol describes streamlined methods for the efficient and cost-effective generation of Cas9-associated guide RNAs. Two alternative ...

Maintaining Biological Cultures and Measuring Gene Expression in Aphis nerii: A Non-model System for Plant-insect Interactions

Aphids are excellent experimental models for a variety of biological questions ranging from the evolution of symbioses and the development of polyphenisms to questions surrounding insect's interactions with their host plants. Genomic resources are available for several aphid species, and with advances in the next-generation sequencing, transcriptomic studies are being extended to non-model organisms that lack genomes. Furthermore, aphid cultures can be collected from the field and reared in the laboratory for the use in organismal and molecular experiments to bridge the gap between ecological and genetic studies. Last, many aphids can be maintained in the laboratory on their preferred host plants in perpetual, parthenogenic life cycles allowing for comparisons of asexually reproducing genotypes. Aphis nerii, the milkweed-oleander aphid, provides one such model to study insect interactions with toxic plants using both organismal and molecular experiments. Methods for the generation and maintenance of the plant and aphid cultures in the greenhouse and laboratory, DNA and RNA extractions, microsatellite analysis, de novo transcriptome assembly and annotation, transcriptome differential expression analysis, and qPCR verification of differentially expressed genes are outlined and discussed here.

Maintaining Biological Cultures and Measuring Gene Expression in Aphis nerii: A Non-model System for Plant-insect Interactions

The aphid Aphis nerii colonizes on highly-defended plants in the dogbane family (Apocyanaceae) and provides numerous opportunities to study plant-insect interactions. Here, we present a series of protocols for the maintenance of plant and aphid cultures, and the generation and analysis of molecular and -omic data for A. nerii.

生物学的文化とワタアブラムシ neriiの遺伝子発現を測定を維持する: 植物・昆虫間の相互作用の非モデル系

Aphids are excellent experimental models for a variety of biological questions ranging from the evolution of symbioses and the development of polyphenisms ...

Inducible and Reversible Dominant-negative (DN) Protein Inhibition

Dominant-negative (DN) protein inhibition is a powerful method to manipulate protein function and offers several advantages over other genome-based approaches. For example, although chimeric and Cre-LoxP targeting strategies have been widely used, the intrinsic limitations of these strategies (i.e., leaky promoter activity, mosaic Cre expression, etc.) have significantly restricted their application. Moreover, a complete deletion of many endogenous genes is embryonically lethal, making it impossible to study gene function in postnatal life. To address these challenges, we have made significant changes to an early genetic engineering protocol and combined a short (transgenic) version of the Rb1 gene with a lysosomal protease procathepsin B (CB), to generate a DN mouse model of Rb1 (CBRb). Due to the presence of a lysosomal protease, the entire CB-RB1 fusion protein and its interacting complex are routed for proteasome-mediated degradation. Moreover, the presence of a tetracycline inducer (rtTA) element in the transgenic construct enables an inducible and reversible regulation of the RB1 protein. The presence of a ubiquitous ROSA-CAG promoter in the CBRb mouse model makes it a useful tool to carry out transient and reversible Rb1 gene ablation and provide researchers a resource for understanding its activity in virtually any cell type where RB1 is expressed.

Inducible and Reversible Dominant-negative DN Protein Inhibition

Here we present a protocol to develop a dominant-negative inducible system, in which any protein can be conditionally inactivated by reversibly overexpressing a dominant-negative mutant version of it.

誘導およびリバーシブルのドミナント ネガティブ (DN) 蛋白質の阻害

Dominant-negative (DN) protein inhibition is a powerful method to manipulate protein function and offers several advantages over other genome-based ...

In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for reversible and tunable expression control of an endogenous gene of interest in living model systems. The REMOTE-control system employs enhanced lac repression and tet activation systems to achieve down- or upregulation of a target gene within a single biological system. Tight repression can be achieved from repressor binding sites flexibly located far downstream of a transcription start site by inhibiting transcription elongation. Robust upregulation can be attained by enhancing the transcription of an endogenous gene by targeting tet transcriptional activators to the cognate promoter. This reversible and tunable expression control can be applied and withdrawn repeatedly in organisms. The potency and versatility of the system, as demonstrated for endogenous Dnmt1 here, will allow more precise in vivo functional analyses by enabling investigation of gene function at various expression levels and by testing the reversibility of a phenotype.

This protocol outlines the steps needed to generate a model system in which the transcription of an endogenous gene of interest can be conditionally controlled in live animals or cells using enhanced lac repressor and/or tet activator systems.

体内の内因性遺伝子操作のリモート制御システムのアプリケーション

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...