이 연구는 캐나다의 자연 과학 및 공학 연구위원회 (Natural Science and Engineering Research Council of Canada)의 지원을 받았다.

1. 관심 유전자 얻기 <ol><li> 합성 유전자를 디자인하십시오. <ol><li> 대장균 발현을위한 유전자 서열을 최적화하십시오. </li><li> 염기 서열 (AvrII, NdeI, EcoRI 및 XbaI)에서 문제가되는 제한 효소 부위를 제거합니다. </li><li> 복제를위한 제한 사이트 통합; 5&#39;-NdeI 사이트 및 3&#39;-EcoRI 사이트가 권장된다. 필요한 경우 다른 사이트를 사용할 수 있습니다. 선택된 플라스미드의 다중 클로닝 영역을 참조하십시오 ( 그림 S1- S4 ). 원하는 경우 Western blot detection을 위해 5 &#39;또는 3&#39;encoding tag를 포함하십시오. </li><li> 상업적으로 설계된 유전자를 주문하십시오. </li><li> 제조 업체의 지시에 따라 무딘 복제 키트를 사용하여 무딘 벡터에 유전자를 무작위로 복제하십시오. 유전자를 증폭시키는 프라이머를 디자인한다 (단계 1.2.2로 진행). 또는 pMGX 플라스미드에 직접 클로닝하기 위해 추가로 5 &#39;및 3&#39;말단을 첨가하고 단계 2로 진행한다. 여기서, th대표적인 결과는 관심있는 유전자를 무딘 복제 한 결과입니다. </li></ol></li><li> 원하는 유전자를 증폭하십시오 (설계되고 최적화 된 합성 유전자로부터, 또는 원하는 유전자를 포함하는 주형 DNA로부터). 15 . <ol><li> 클로닝을위한 제한 사이트가있는 프라이머 디자인; 5&#39;-NdeI 사이트 및 3&#39;-EcoRI 사이트가 권장된다. 필요한 경우 다른 사이트를 사용할 수 있습니다. 선택된 플라스미드의 다중 클로닝 영역을 참조하십시오 ( 그림 S1- S4 ). 원하는 경우 Western blot detection을 위해 5 &#39;또는 3&#39;encoding tag를 포함 시키십시오. </li><li> PCR은 원하는 유전자를 증폭 15 . </li><li> 아가로 오스 겔 전기 영동에 의한 PCR 분석 16 . </li><li> 비특이적 증폭이있는 경우 젤 추출을 통해 증폭 된 유전자를 제거하십시오. 그렇지 않으면 효소 정화 키트를 사용하십시오. </li><li> 흡광도를 확인하여 분광 광도계를 사용하여 DNA를 정량화하십시오260 nm에서의 e; 용리 완충액이없는 blank 17 . </li></ol></li></ol> 2. 다중 유전자 발현 시스템 벡터 pMGX 18 에 대한 관심 유전자 클로닝 <ol><li> 제한은 얻은 관심 유전자와 원하는 벡터 인 pMGX를 NdeI 및 EcoRI로 소화시킨다. 참고 : 많은 양의 재 원형화 된 플라스미드를 얻은 경우, EcoRI을 첨가하기 전에 1 시간 동안 NdeI 반응을 진행시킨다. <ol><li> 0.5-1.5 μg의 DNA와 각 효소 1 μL를 포함하는 40 μL 다이제스트 반응을 적절한 10x 완충액 4 μL와 함께 사용하십시오. </li><li> NdeI 및 EcoRI 소화를 위해 EcoRI 완충액을 사용하고 먼저 NdeI 엔도 뉴 클레아 제를 첨가한다. 37 ° C에서 1 시간 동안 분해하십시오. 그런 다음 EcoRI 엔도 뉴 클레아 제를 첨가하고 다이제스트가 추가 시간 동안 진행되도록하십시오. NdeI는 DNA 말단에 가까운 절단에 민감하므로 EcoRI에 의한 초기 소화는 NdeI에 의한 효과적인 소화를 방해 할 수있다. </li></ol></li><li> 전기아가로 오스 젤에 제한 다이제스트를 ophorese (1 킬로바이트 유전자, 55 분 동안 110 V에서 0.7 % 아가로 오스 겔을 사용, 다른 유전자 크기에 대한 아가로 오스 겔의 비율을 선택하려면 참조 16 참조하십시오. </li><li> 깨끗한 메스 또는 면도날을 사용하여 삽입 및 벡터 밴드를 잘라 내고 excised gel segment를 1.5 mL 튜브에 넣으십시오. </li><li> 제조 업체의 프로토콜에 따라 젤 추출 키트를 사용하여 아가로 오스 겔에서 DNA를 추출합니다. </li><li> 3 : 1 인서트 - 벡터 비율을 사용하여 관심있는 유전자를 pMGX 벡터에 삽입한다. 삽입물없이 소화가 된 pMGX의 음성 연결을 설정하십시오. <ol><li> 1 μL의 T4 DNA ligase, 0.15-0.5 μg의 벡터 DNA (~ 5 μL) 및 3 : 1 insert-to-vector ratio와 크기에 기초한 적절한 양의 insert를 포함하는 20 μL 연결 반응을 설정하십시오 삽입 된 유전자; pMGX 백본의 크기는 5,312 ~ 5,504 bp입니다. 모든 것을 포함하는 부정적인 반응 반응 포함 bu삽입되는 유전자. 음성 대조군 연결 및 벡터 삽입 삽입 반응에서 벡터 DNA의 양이 동등한 지 확인하십시오. </li></ol></li><li> ligation 반응을 XL1-Blue 화학적으로 유능한 대장균 세포로 연결하고 플라스미드 pMGX- yfg1 (관심 유전자 1 포함), pMGX- yfg2 (관심 유전자 2 포함) ... pMGX- yfgn (관심 유전자 n 함유). 무균 기술 (바이오 안전성 캐비닛 내부 또는 화염 아래)을 사용하십시오. <ol><li> 화학적으로 유능한 XL1-Blue E. coli 의 100 μL 분량을 얼음 위에서 5 분 동안 녹인 다음 5 μL의 연결 반응을 추가하십시오. 얼음 위에서 30 분 동안 품어 낸다. </li><li> 42 ° C에서 보관 한 수욕에서 45 초 동안 세포를 가열 충격을 가한 다음 차가운 LB 200 μL를 넣으십시오. 얼음 위에서 2 분 동안 품어 낸다. </li><li> 1 시간 동안 37 ° C, 220 RPM에서 세포를 흔들고, 다음을 포함하는 LB- 한천 플레이트에 플레이트 100 μL을 펼칩니다.priate 선택 마커 (암피실린 또는 카나마이신). </li></ol></li><li> 양성 형질 전환 체를 스크리닝하십시오. <ol><li> 음성 대조군 및 연결 플레이트의 식민지 수를 비교합니다. 1 : 2보다 큰 식민지 비율이 요구됩니다. 음성 대조군 플레이트에 많은 수의 콜로니가 있으면 단계 2.1로 돌아가서 메모를 검토합니다. </li><li> 스크리닝 (1 n)을 위해 삽입 된 다른 유전자의 각 연결 반응으로부터 4-8 개의 개별 콜로니 (음성 대조군에 따라 : 라이 게이션 비)를 선택하고 4 mL LB 및 적절한 항생제 밤새 배양 / 개별 콜로니에 접종한다. 37 ° C 및 220 rpm으로 흔들어서 밤새 배양하십시오. </li><li> 제조 업체의 프로토콜에 따라 플라스미드 DNA 분리 키트를 사용하여 플라스미드 DNA를 분리합니다. </li><li> 적절한 150X 버퍼 2 μL와 150-500 NG DNA 및 각 효소 1 μL를 포함하는 20 μL NdeI + EcoRI 다이제스트 반응을 설정하십시오. 에서NdeI와 EcoRI를 동시에 추가하여 관심 유전자가 제한 효소 사이에 삽입되도록하십시오. 빈 pMGX 벡터로 부정적인 제어가 권장됩니다. 37 ℃에서 2 시간 동안 수욕상에서 소화시킨다. </li></ol></li></ol> 3. 유전자 1, pMGX - yfg1을 포함하는 pMGX 벡터에 유전자 2 삽입 <ol><li> 제한 효소는 AvrII 로 pMGX- yfg1 을 소화시키고 종아 장 인산 가수 분해 효소 (CIP)로 치료한다. <ol><li> 0.5-1.5 μg의 벡터 DNA (~ 5 ~ 10 μL의 분리 된 DNA)와 1 μL의 Avr II를 포함하는 40 μL 다이 제스트 반응물을 적절한 10x 완충액 4 μL와 함께 사용합니다. 37 ° C에서 1.5 시간 동안 다이제스트 한 다음 CIP 1.5 μL를 첨가합니다. 37 ℃에서 30 분간 더 방치한다. </li></ol></li><li> 제한 효소 는 AvrII 및 XbaI로 pMGX- yfg2 를 분해하여 관심 유전자를 유리시킨다. <ol><li> 0.5-1.5 μg의 DNA와 1 μ를 함유하는 40 μL 분해 반응을 사용하십시오; 4㎕의 적절한 10x 완충액을 갖는 각 효소의 L. 37 ° C에서 2 시간 동안 분해하십시오. </li></ol></li><li> 전기 영동 제한은 적절한 퍼센트 (0.7 %) 아가로 오스 겔에서 소화되고 깨끗한 메스 / 면도날을 사용하여 삽입 및 벡터 밴드를 제거합니다 (2.2-2.3 단계 참조). </li><li> 제조 업체의 프로토콜에 따라 젤 추출 키트를 사용하여 DNA를 추출하고 DNA를 정량 17 . </li><li> 3 : 1 인서트 - 벡터 비율을 사용하여 pMGX- yfg1에 Ligate 유전자 2를 삽입. 추가 삽입물이없는 pMGX- yfg1 의 음성 연결을 설정하십시오. 2.5 단계에서 위와 같이 설정하십시오. </li><li> 단계 2.6에서 볼 수 있듯이 5 μL의 연결 반응을 XL1-Blue 화학적으로 유능한 대장균 세포로 연결하고 플라스미드 pMGX- yfg1,2 (관심 유전자 1 및 2 포함) 및 음성 pMGX- yfg1 대조 물을 연결 합니다. </li><li> 음성 대조군 및 연결 플레이트의 식민지 수를 비교하십시오. 콜로니 카운트 비율 g1 : 2 이상이 필요합니다. 네거티브 컨트롤 플레이트에 많은 수의 콜로니가 있으면 단계 3.1로 돌아가서 CIP 처리를 검토하십시오. </li><li> 라이 게이션 반응에서 4-8 개별 식민지 (부정적인 제어에 따라 : 결찰 비율)를 선택하고 개별 식민지 당 적절한 항생제 플러스 LB 4 ML을 접종하고 37 ° C와 220 RPM에서 하룻밤 자랍니다. </li><li> 제조 업체의 프로토콜에 따라 플라스미드 DNA 절연 키트를 사용하여 플라스미드 DNA를 분리하고 DNA 17 정량. </li><li> EcoRI로 pMGX- yfg1,2 의 제한 효소 절단을 수행하여 두 번째 유전자의 효과적인 삽입을 스크리닝 하십시오 . <ol><li> 150-500 ng의 DNA와 1 μL의 EcoRI 효소와 2 μL의 EcoRI 10x 완충액을 포함하는 20 μL 분해 반응을 사용하십시오. 37 ° C에서 2 시간 동안 분해하십시오. </li></ol></li><li> 적절한 퍼센트 아가 로스 겔에서 제한 다이제스트를 전기 영동한다; 해당하는 밴드를 찾는다.s를 유전자 2의 크기로 증가시킨다 (2.2 단계 참조). 유전자는 원하지 않는 역전 된 방향으로 벡터에 삽입 될 수 있습니다. </li></ol> 4. 유전자 1과 2, pMGX - yfg1,2를 포함하는 pMGX 벡터에 세 번째 유전자를 추가 <ol><li> 제한은 AvrII 로 pMGX- yfg1,2 를 다이제스트하고 3.1 단계에서 볼 수 있듯이 CIP로 처리합니다. </li><li> 제한 3.2 절에서 볼 수 있듯이 AvrII와 XbaI를 갖는 pMGX- yfg3 를 소화시킨다. </li><li> 깨끗한 메스 / 면도날을 사용하여 적절한 퍼센트 아가로 오스 겔에서 제한 효소 절단 및 전기 용품 삽입 및 벡터 밴드의 전기 분해; 단계 2.2-2.3을 참조하십시오. </li><li> 겔 추출 키트를 사용하여 아가로 오스 젤에서 DNA를 추출하고 DNA를 계량 17 . </li><li> 3 : 1 삽입 대 벡터 비율을 사용하여 pMGX- yfg1,2 로 Ligate 유전자 3을 삽입하고 단계 3.5에서 볼 수 있듯이 추가 삽입없이 digested pMGX- yfg1,2 의 음성 연결을 설정합니다. </li><li> 5 μL의 연결 반응을 XL로 전환1-Blue 화학적으로 유능한 대장균 세포, 단계 2.6에서 볼 수 있듯이 플라스미드 pMGX- yfg1,2,3 (관심 유전자 1, 2 및 3 포함) 및 음성 pMGX- yfg1,2 컨트롤을 연결했다. </li><li> 음성 대조군 및 연결 플레이트의 식민지 수를 비교하십시오. 네거티브 컨트롤 플레이트에 많은 수의 콜로니가있는 경우 4.1 단계로 돌아가서 CIP 처리를 검토하십시오. </li><li> 라이 게이션 반응에서 4 ~ 8 개의 개별 콜로니 (음성 대조군에 따라 결찰 비율에 따라)를 선택하고 개별 콜로니 당 적절한 항생제 + LB 4mL를 접종하십시오. 37 ° C와 220 rpm으로 밤새 자랍니다. </li><li> 제조 업체의 프로토콜에 따라 플라스미드 DNA 분리 키트를 사용하여 플라스미드 DNA를 분리합니다. </li><li> 단계 3.10에서 볼 수 있듯이 EcoRI로 pMGX - yfg1,2,3 의 제한 다이제스트를 수행하여 세 번째 유전자의 효과적인 삽입을 스크리닝 하십시오 . </li><li> 적절한 퍼센트 아가 로스 겔에서 제한 다이제스트를 전기 영동한다; 보기유전자 2와 유전자 3의 크기에 상응하는 밴드 (2.2 단계 참조). 참고 : 유전자 3은 원하지 않는 반대 방향으로 벡터에 삽입 될 수 있습니다. 유전자 2와 3이 같은 크기라면, 다른 적당한 제한 다이제스트 사이트가 스크리닝을 위해 선택되어야한다. 참고 : 각 새 유전자에 대해 필요한만큼 반복하십시오. </li></ol> 5. Multigene 발현 시스템을 사용하여 관심있는 단백질 생산 및 Western Blotting에 의한 생산 평가 <ol><li> 관심있는 모든 유전자를 포함하는 양성 클론을 BL21- (λDE3)과 같은 화학적으로 유능한 단백질 생산 대장균 으로 변형시킵니다. <ol><li> 화학적으로 유능한 BL21 - (λDE3) 대장균 의 100 μL 분량을 얼음에 5 분 동안 녹인 다음 1 μL의 양성 복제 된 플라스미드 DNA를 첨가하십시오. 얼음 위에서 30 분 동안 품어 낸다. </li><li> 42 ° C로 유지 수조에서 45 초 동안 세포를 가열 충격을 가한 다음 차가운 LB 200 μL를 추가합니다. 얼음 위에서 2 분 동안 품어 낸다. </li><li>1 시간 동안 37 ° C와 220 RPM에서 세포를 흔들고 적절한 선택 마커 (암피실린 또는 카나마이신)가 들어있는 LB- 한천 플레이트에 플레이트 100 μL을 펴십시오. </li></ol></li><li> isopropyl-β-D-1- thiogalactopyranoside (IPTG) 유도로 단백질을 발현하십시오. <ol><li> B21 - (λDE3) 변형 플레이트에서 격리 된 식민지를 선택하고 적절한 항생제를 더한 LB 4 ML을 접종하십시오. 37 ° C 및 220 rpm으로 흔들어 밤새 성장. </li><li> 하룻밤 배양 1 ML을 사용하여 적절한 항생제 문화 플러스 100 ML LB를 예방 접종. </li><li> OD 600 이 0.6이되도록 220 rpm으로 흔들어 주면서 37 ° C에서 성장시킵니다. </li><li> 100 μM IPTG로 배양하고 25 ° C 및 220 rpm에서 15 시간 동안 성장시킵니다. </li><li> 문화 1 ML을 제거하고 1 분 13,000 XG에서 원심 분리기; 상등액을 버린다. </li></ol></li><li> 제조 업체의 지침에 따라 용해 솔루션을 사용하여 세포를 Lyse용해성 세포 용 해물의 웨스턴 블럿을 수행하여 모든 단백질이 성공적으로 생산되었는지 여부를 확인하십시오 19 . </li></ol>

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복합 유전자의 동시 발현은 특히 복잡하고 다중 유전자 대사 경로 3 , 4 , 5 를 특성화하고 재구성하는 데 점점 더 필수적입니다. pMGX 시스템은 대장균 루틴 6 , 7 , 8 에서 다중 유전자 동시 발현을 만들고 다양한 연구자가 접근 할 수 있도록한다. 이 연?...

여러 단백질의 동시 발현은 점점 더 필수적이며, 특히 합성 생물학 분야에서 여러 기능적 모듈이 표현되어야한다. 단백질 단백질 복합체를 연구 할 때, 발현과 기능은 흔히 동시 발현 2 , 3을 필요로 한다. 경로의 각 유전자가 4 , 5 , 6 , 7 , 8 로 표현되어야하는 생합성 경로를 특성화하고 활용하는데있다. 실험실 재조합 단백질 발현을위한 작업 말인 대장균 (Escherichia coli) 에서 특히 공동 발현을위한 많은 시스템이 개발되었다. 예를 들어, 선택성 마커가 다른 여러 플라스미드를 사용하여 다양한 다른 ex<html> 압흔 벡터들 ( 10 , 11) . 다중 단백질 발현을위한 단일 플라스미드 시스템은 각 유전자의 발현을 조절하기 위해 다중 프로모터를 사용 하였다. 다수의 유전자가 단일 전사 물에 암호화되어있는 합성 오페론 2 , 13 ; 또는 어떤 경우에는 궁극적으로 단백질 분해 처리 된 폴리 펩타이드를 암호화하는 단일 유전자로 목적하는 목적 단백질을 생성한다. <img alt="그림 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55187/55187fig1.jpg" /> 그림 1 : polycistronic vector의 구조를 보여주는 pMGX workflow. pMGX 시스템은 유도 성 T7 프로모터의 제어하에 합성 오페론을 제조하기위한 유연하고 사용하기 쉬운 전략을 제공한다.e.com/files/ftp_upload/55187/55187fig1large.jpg &quot;target =&quot;_ blank &quot;&gt;이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 이 원고에서 유도 성 T7 RNA 중합 효소 ( 그림 1 )의 제어하에 multigene 합성 오페론의 건설을위한 매우 효과적인 시스템의 사용이 설명됩니다. 이 시스템은 많은 유전자가 한 플라스미드에서 동시에 발현되도록합니다. 이것은 원래 pKH22라고 불리는 플라스미드 시스템에 기반을두고 있으며, 여러 가지 다양한 응용 분야에서 성공적으로 사용되고 있습니다. 6 , 7 , 8 . 여기서,이 플라스미드 세트는 4 개의 관련된 벡터, 즉 C- 또는 N- 말단 태그가없는 발현 벡터 인 pMGX-A 및 암피실린 내성 마커를 포함하도록 확대된다. pMGX-hisA, N- 말단 헥사 히스티딘 태그 및 암피실린 내성 마커를 코딩하는 발현 벡터; pMGX-K, 발현 벡터 l임의의 C- 또는 N- 말단 태그 및 카나마이신 내성 마커를 수취하는 단계; 및 N 말단 헥사 히스티딘 태그 및 카나마이신 내성 마커를 코딩하는 발현 벡터 인 pMGX-hisK. 이 연구에서, pMGX 시스템, 특히 pMGX-A를 사용하여 5 개의 유전자를 포함하는 폴리 시스트 론 벡터를 생성하는 방법이 대장균 에서 각각의 개별 단백질의 성공적인 생산과 함께 입증되었다.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Enzymes&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0290S</td><td></td></tr><tr><td>AvrII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0174S</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0101S</td><td></td></tr><tr><td>NdeI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0111S</td><td></td></tr><tr><td>XbaI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0145S</td><td></td></tr><tr><td>Herculase II Fusion DNA Polymerase</td><td>Agilent Technologies</td><td>600677</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 kb DNA ladder</td><td>New England Biolabs</td><td>N3232L</td><td></td></tr><tr><td>4-20% Mini-PROTEAN TGX Stain-Free Protein Gels</td><td>Bio-Rad</td><td>456-8095</td><td></td></tr><tr><td>50x TAE</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>BP1332-4</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>BP1423-500</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>BP160-500</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilin</td><td>Sigma-Alrich</td><td>A9518-5G</td><td></td></tr><tr><td>BL21 (DE3) chemically comeptent cells</td><td></td><td></td><td>Comeptent cell prepared in house</td></tr><tr><td>B-PER Bacterial Protein Extraction Reagent</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>PI78243</td><td></td></tr><tr><td>dNTP mix</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td>Supplied with polymerase</td></tr><tr><td>Gel Extraction Kit</td><td>Omega</td><td>D2500-02</td><td>E.Z.N.A Gel Extraction, supplied by VWR Cat 3: CA101318-972</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>BP381-1</td><td></td></tr><tr><td>His Tag Antibody [HRP], mAb, Mouse</td><td>GenScript</td><td>A00612</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate</td><td>EMD Millipore</td><td>WBKLS0100</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma-Alrich</td><td>15502-10G</td><td></td></tr><tr><td>LB</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>BP1426-500</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>A411-20</td><td></td></tr><tr><td>Pasteurized instant skim milk powder</td><td>Local grocery store</td><td></td><td>No-name grocery store milk is adequate</td></tr><tr><td>Nitrocellulose membrane</td><td>Amersham Protran (GE Healthcare Life Sciences)</td><td>10600007</td><td>Membrane PT 0.45 &amp;micro;m 200 mm x 4 m, supplied by VWR Cat #: CA10061-086</td></tr><tr><td>Plasmid DNA Isolation Kit</td><td>Omega</td><td>D6943-02</td><td>E.Z.N.A Plasmid DNA MiniKit I, supplied by VWR Cat #: CA101318-898</td></tr><tr><td>pMGX</td><td>Boddy Lab</td><td></td><td>Request from the Boddy Lab Contact cboddy@uottawa.ca</td></tr><tr><td>Primers</td><td>Intergrated DNA Technologies</td><td></td><td>Design primers as needed for desired gene</td></tr><tr><td>Synthetic Gene</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>Design and optimize as needed</td></tr><tr><td>Thick Blot Filter Paper</td><td>Bio-Rad</td><td>1703932</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>BioShop</td><td>TRS001.1</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Alrich</td><td>P9416-50ML</td><td></td></tr><tr><td>XL1-Blue chemically competent cells</td><td></td><td></td><td>Comeptent cell prepared in house</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioSpectrometer</td><td>Eppendorf</td><td>RK-83600-07</td><td></td></tr><tr><td>Gel box - PAGE</td><td>Bio-Rad</td><td>1658005</td><td>Mini-PROTEIN Tetra Vertical Electrophoresis Cell</td></tr><tr><td>Gel Imager</td><td>Alpha Innotech</td><td></td><td>AlphaImager EC</td></tr><tr><td>Incubator-oven</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>11-690-650D</td><td>Isotemp</td></tr><tr><td>Incubator-shaker</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>SHKE6000-7</td><td>MaxQ 6000</td></tr><tr><td>Personna Razors</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>S04615</td><td></td></tr><tr><td>Power Pack</td><td>Bio-Rad</td><td>S65533Q</td><td>FB300</td></tr><tr><td>Transilluminator</td><td>VWR International</td><td>M-10E,6W</td><td></td></tr><tr><td>Thermocylcer</td><td>Eppendorf</td><td>Z316091</td><td>Mastercycler Personal, supplied by Sigma</td></tr><tr><td>UV Face-Shield</td><td></td><td>18-999-4542</td><td></td></tr><tr><td>Waterbath</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>15-460-2SQ</td><td></td></tr><tr><td>Western Transfer Apparatus</td><td>Bio-Rad</td><td>1703935</td><td>Mini-Trans Blot Cell</td></tr></tbody></table>

inducible t7 rna polymerase-mediated multigene expression system, pmgx

여러 단백질의 동시 발현은 합성 생물학, 단백질 - 단백질 복합체 연구, 생합성 경로 규명 및 활용에 점점 더 필수적입니다. 이 원고에서, 유도 성 T7 RNA 중합 효소의 조절하에 multigene 합성 오페론의 건설을위한 매우 효과적인 시스템의 사용이 설명된다. 이 시스템은 많은 유전자가 한 플라스미드에서 동시에 발현되도록합니다. 여기서, 암피실린 또는 카나마이신 내성 선택 마커 (A 및 K) 및 N 말단 헥사 히스티딘을 보유하거나 보유하지 않은 4 개의 관련된 벡터, pMGX-A, pMGX-hisA, pMGX-K 및 pMGX-hisK의 세트 태그 (his)가 공개됩니다. 이 벡터 시스템을 이용한 합성 오페론의 구축을위한 상세한 프로토콜은 대응 유전자와 함께 제공되어, 5 개의 유전자를 함유하는 pMGX- 기반 시스템이 용이하게 구축되어 대장균 에서 5 가지 암호화 된 단백질 모두를 생성하는데 사용될 수 있음을 보여준다. 이 시스템em과 프로토콜을 사용하여 연구자는 대장균 에서 복잡한 다중 구성 요소 모듈과 경로를 일상적으로 표현할 수 있습니다.

이 연구에서 목표는 단일 플라스미드에서 5 개의 단백질을 동시에 발현시키는 것이 었습니다. N- 또는 C- 말단 헥사 히스티딘 태그를 암호화하는 5 개 코돈 최적화 된 합성 유전자 단편은 상업적으로 구매되었다. 합성 유전자를 PCR에 의해 증폭시키고 개별적으로 PCR-blunt 벡터에 클로닝하고 서열을 결정 하였다. 폴리 시스 트론 플라스미드를 생성하기 위해, 관심있는 5 개의 ?...

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Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

이 연구는 pMGX 플라스미드 시스템을 사용하여 대장균 에서 단일 플라스미드로부터 다중 유전자의 T7 매개 공동 - 발현을위한 방법을 기술한다.

유도 성 T7 RNA 중합 효소 매개 멀티젠 발현 시스템, pMGX

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing ...

inducible-t7-rna-polymerase-mediated-multigene-expression-system-pmgx

Research

JoVE Journal

Genetics

13.3K 조회수.  University of Ottawa.  이 연구는 pMGX 플라스미드 시스템을 사용하여 대장균 에서 단일 플라스미드로부터 다중 유전자의 T7 매개 공동 - 발현을위한 방법을 기술한다. 

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Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be investigated through electrophysiological analysis, biochemical characterization, mutational studies, and their effects on cellular processes. Transient transfections offer a simple protocol in which the protein becomes available for analysis within a few hours to days. Although this method presents a relatively straightforward and time efficient protocol, one of the critical components is calibrating the expression of the gene of interest to physiological relevant levels or levels that are suitable for analysis. To this end, many different approaches that offer the ability to control the expression of the gene of interest have emerged. Several stable cell transfection protocols provide a way to permanently introduce a gene of interest into the cellular genome under the regulation of a tetracycline-controlled transcriptional activation. While this technique produces reliable expression levels, each gene of interest requires a few weeks of skilled work including calibration of a killing curve, selection of cell colonies, and overall more resources. Here we present a protocol that uses transient transfection of the Transient Receptor Potential cation channel subfamily V member 1 (TRPV1) gene in an inducible system as an efficient way to express a protein in a controlled manner which is essential in ion channel analysis. We demonstrate that using this technique, we are able to perform calcium imaging, whole cell, and single channel analysis with controlled channel levels required for each type of data collection with a single transfection. Overall, this provides a replicable technique that can be used to study ion channels structure and function.

Studying ion channels through a heterologously expressing system has become a core technique in biomedical research. In this manuscript, we present a time efficient method to achieve tightly controlled ion channel expression by performing transient transfection under the control of an inducible promoter.

유도 성 과도 형질을 통해 제어 이온 채널 식

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

연구

유전학

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

In research models of liver cancer, regeneration, inflammation, and fibrosis, flexible systems for in vivo gene expression and silencing are highly useful. Hydrodynamic tail vein injection of transposon-based constructs is an efficient method for genetic manipulation of hepatocytes in adult mice. In addition to constitutive transgene expression, this system can be used for more advanced applications, such as shRNA-mediated gene knock-down, implication of the CRISPR/Cas9 system to induce gene mutations, or inducible systems. Here, the combination of constitutive CreER expression together with inducible expression of a transgene or miR-shRNA of choice is presented as an example of this technique. We cover the multi-step procedure starting from the preparation of sleeping beauty-transposon constructs, to the injection and treatment of mice, and the preparation of liver tissue for analysis by immunostaining. The system presented is a reliable and efficient approach to achieve complex genetic manipulations in hepatocytes. It is specifically useful in combination with Cre/loxP-based mouse strains and can be applied to a variety of models in the research of liver disease.

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Hydrodynamic tail vein injection of transposon-based integration vectors enables stable transfection of murine hepatocytes in vivo. Here, we present a practical protocol for transfection systems that enables the long-term constitutive expression of a single transgene or combined constitutive and doxycycline-inducible expression of a transgene or miR-shRNA in the liver.

유체역학 꼬리 정 맥 주입을 사용 하 여 마우스 Hepatocytes의 유전 Vivo에서 수정에 대 한 제정 및 유도할 수 있는 시스템

In research models of liver cancer, regeneration, inflammation, and fibrosis, flexible systems for in vivo gene expression and silencing are highly ...

An Ecdysone Receptor-based Singular Gene Switch for Deliberate Expression of Transgene with Robustness, Reversibility, and Negligible Leakiness

Precise control of transgene expression is desirable in biological and clinical studies. However, because the binary feature of currently employed gene switches requires the transfer of two therapeutic expression units concurrently into a single cell, the practical application of the system for gene therapy is limited. To simplify the transgene expression system, we generated a gene switch designated as pEUI(+) encompassing a complete set of transgene expression modules in a single vector. Comprising of the GAL4 DNA-binding domain and modified EcR (GvEcR), a minimal VP16 activation domain fused with a GAL4 DNA-binding domain, as well as a modified Drosophila ecdysone receptor (EcR), the newly developed singular gene switch is highly responsive to the administration of a chemical inducer in a time- and dosage-dependent manner. The pEUI(+) vector is a potentially powerful tool for improving the control of transgene expression in both biological research and pre-clinical studies. Here, we present a detailed protocol for modulation of a transient and stable transgene expression using pEUI(+) vector by the treatment of tebufenozide (Teb). Additionally, we share important guidelines for the use of Teb as a chemical inducer.

Here, we present a protocol for the modulation of transgene expression using pEUI(+) singular gene switch by tebufenozide treatment.

Ecdysone 수용 체 기반 단일 유전자 스위치 견고성, 가역, 및 무시할 수 시키는 Transgene의 의도적인 표현에 대 한

Precise control of transgene expression is desirable in biological and clinical studies. However, because the binary feature of currently employed gene ...

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the flexible and efficient GreenGate cloning system with the proven and benchmarked LhGR system (here termed GR-LhG4) for the inducible expression, we have generated a set of transgenic Arabidopsis lines that can drive the expression of an effector cassette in a range of specific cell types in the three main plant meristems. To this end, we chose the previously developed GR-LhG4 system based on a chimeric transcription factor and a cognate pOp-type promoter ensuring tight control over a wide range of expression levels. In addition, to visualize the expression domain where the synthetic transcription factor is active, an ER-localized mTurquoise2 fluorescent reporter under control of the pOp4 or pOp6 promoter is encoded in driver lines. Here, we describe the steps necessary to generate a driver or effector line and demonstrate how cell type specific expression can be induced and followed in the shoot apical meristem, the root apical meristem and the cambium of Arabidopsis. By using several or all driver lines, the context specific effect of expressing one or multiple factors (effectors) under control of the synthetic pOp promoter can be assessed rapidly, for example in F1 plants of a cross between one effector and multiple driver lines. This approach is exemplified by the ectopic expression of VND7, a NAC transcription factor capable of inducing ectopic secondary cell wall deposition in a cell autonomous manner.

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Here, we describe the generation and application of a set of transgenic Arabidopsis thaliana lines enabling inducible, tissue-specific expression in the three main meristems, the shoot apical meristem, the root apical meristem, and the cambium.

유도할 수 있는, 애기 thaliana 통해 LhGR 중재 트랜스에 셀 형식 관련 식-활성화

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the ...

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts of recombinant RNAs are limited. Here, we describe a protocol to produce large amounts of recombinant RNA in Escherichia coli based on co-expression of a chimeric molecule that contains the RNA of interest in a viroid scaffold and a plant tRNA ligase. Viroids are relatively small, non-coding, highly base-paired circular RNAs that are infectious to higher plants. The host plant tRNA ligase is an enzyme recruited by viroids that belong to the family Avsunviroidae, such as Eggplant latent viroid (ELVd), to mediate RNA circularization during viroid replication. Although ELVd does not replicate in E. coli, an ELVd precursor is efficiently transcribed by the E. coli RNA polymerase and processed by the embedded hammerhead ribozymes in bacterial cells, and the resulting monomers are circularized by the co-expressed tRNA ligase reaching a remarkable concentration. The insertion of an RNA of interest into the ELVd scaffold enables the production of tens of milligrams of the recombinant RNA per liter of bacterial culture in regular laboratory conditions. A main fraction of the RNA product is circular, a feature that facilitates the purification of the recombinant RNA to virtual homogeneity. In this protocol, a complementary DNA (cDNA) corresponding to the RNA of interest is inserted in a particular position of the ELVd cDNA in an expression plasmid that is used, along the plasmid to co-express eggplant tRNA ligase, to transform E. coli. Co-expression of both molecules under the control of strong constitutive promoters leads to production of large amounts of the recombinant RNA. The recombinant RNA can be extracted from the bacterial cells and separated from the bulk of bacterial RNAs taking advantage of its circularity.

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Here, we present a protocol to produce large amounts of recombinant RNA in Escherichia coli by co-expressing a chimeric RNA that contains the RNA of interest in a viroid scaffold and a plant tRNA ligase. The main product is a circular molecule that facilitates purification to homogeneity.

대장균 에서 바이로이드 파생 시스템을 사용 하 여 원형 발판에 재조합 RNAs의 대규모 생산

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts ...

생화학

Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a signaling pathway. The method is based, on the one hand, on the inducible expression of a specific protein to initiate a signaling event at a defined and predetermined step in the selected signaling cascade. Concomitant expression, on the other hand, of the gene of interest then allows the investigator to evaluate if the activity of the expressed target protein is located upstream or downstream of the initiated signaling event, depending on the readout of the signaling pathway that is obtained. Here, the apoptotic cascade was selected as a defined signaling pathway to demonstrate protocol functionality. Pathogenic bacteria, such as Coxiella burnetii, translocate effector proteins that interfere with host cell death induction in the host cell to ensure bacterial survival in the cell and to promote their dissemination in the organism. The C. burnetii effector protein CaeB effectively inhibits host cell death after induction of apoptosis with UV-light or with staurosporine. To narrow down at which step CaeB interferes with the propagation of the apoptotic signal, selected proteins with well-characterized pro-apoptotic activity were expressed transiently in a doxycycline-inducible manner. If CaeB acts upstream of these proteins, apoptosis will proceed unhindered. If CaeB acts downstream, cell death will be inhibited. The test proteins selected were Bax, which acts at the level of the mitochondria, and caspase 3, which is the major executioner protease. CaeB interferes with cell death induced by Bax expression, but not by caspase 3 expression. CaeB, thus, interacts with the apoptotic cascade between these two proteins.

The method described here is used to induce the apoptotic signaling cascade at defined steps in order to dissect the activity of an anti-apoptotic bacterial effector protein. This method can also be used for inducible expression of pro-apoptotic or toxic proteins, or for dissecting interference with other signaling pathways.

유도 발현 시스템을 적용하면 세포 내 신호와 세균 독성 요인의 간섭을 연구하기 위해

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a ...

면역학 및 감염병학

DNA-Tethered RNA Polymerase for Programmable In vitro Transcription and Molecular Computation

DNA nanotechnology enables programmable self-assembly of nucleic acids into user-prescribed shapes and dynamics for diverse applications. This work demonstrates that concepts from DNA nanotechnology can be used to program the enzymatic activity of the phage-derived T7 RNA polymerase (RNAP) and build scalable synthetic gene regulatory networks. First, an oligonucleotide-tethered T7 RNAP is engineered via expression of an N-terminally SNAP-tagged RNAP and subsequent chemical coupling of the SNAP-tag with a benzylguanine (BG)-modified oligonucleotide. Next, nucleic-acid strand displacement is used to program polymerase transcription on-demand. In addition, auxiliary nucleic acid assemblies can be used as &#34;artificial transcription factors&#34; to regulate the interactions between the DNA-programmed T7 RNAP with its DNA templates. This in vitro transcription regulatory mechanism can implement a variety of circuit behaviors such as digital logic, feedback, cascading, and multiplexing. The composability of this gene regulatory architecture facilitates design abstraction, standardization, and scaling. These features will enable the rapid prototyping of in vitro&#160;genetic devices for applications such as bio-sensing, disease detection, and data storage.

We describe the engineering of a novel DNA-tethered T7 RNA polymerase to regulate in vitro transcription reactions. We discuss the steps for protein synthesis and characterization, validate proof-of-concept transcriptional regulation, and discuss its applications in molecular computing, diagnostics, and molecular information processing.

시험관 내 전사 및 분자 계산을 위한 DNA 테더드 RNA 폴리머라제

DNA nanotechnology enables programmable self-assembly of nucleic acids into user-prescribed shapes and dynamics for diverse applications. This work ...

생체공학

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Proteomics research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that proteins in cells mostly exist not as isolated entities but exert their biological activity in association with many other proteins, in humans ten or more, forming assembly lines in the cell for most if not all vital functions.1,2 Knowledge of the function and architecture of these multiprotein assemblies requires their provision in superior quality and sufficient quantity for detailed analysis. The paucity of many protein complexes in cells, in particular in eukaryotes, prohibits their extraction from native sources, and necessitates recombinant production. The baculovirus expression vector system (BEVS) has proven to be particularly useful for producing eukaryotic proteins, the activity of which often relies on post-translational processing that other commonly used expression systems often cannot support.3 BEVS use a recombinant baculovirus into which the gene of interest was inserted to infect insect cell cultures which in turn produce the protein of choice. MultiBac is a BEVS that has been particularly tailored for the production of eukaryotic protein complexes that contain many subunits.4 A vital prerequisite for efficient production of proteins and their complexes are robust protocols for all steps involved in an expression experiment that ideally can be implemented as standard operating procedures (SOPs) and followed also by non-specialist users with comparative ease. The MultiBac platform at the European Molecular Biology Laboratory (EMBL) uses SOPs for all steps involved in a multiprotein complex expression experiment, starting from insertion of the genes into an engineered baculoviral genome optimized for heterologous protein production properties to small-scale analysis of the protein specimens produced.5-8 The platform is installed in an open-access mode at EMBL Grenoble and has supported many scientists from academia and industry to accelerate protein complex research projects.

Protein complexes catalyze key cellular functions. Detailed functional and structural characterization of many essential complexes requires recombinant production. MultiBac is a baculovirus/insect cell system particularly tailored for expressing eukaryotic proteins and their complexes. MultiBac was implemented as an open-access platform, and standard operating procedures developed to maximize its utility.

EMBL에서 MultiBac 단백질 복잡한 생산 플랫폼

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

생물학

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for expressing proteins and genetic circuits in a controlled manner as well as for providing a prototyping environment for synthetic biology.2,3 To achieve the latter goal, cell-free expression systems that preserve endogenous Escherichia coli transcription-translation mechanisms are able to more accurately reflect in vivo cellular dynamics than those based on T7 RNA polymerase transcription. We describe the preparation and execution of an efficient endogenous E. coli based transcription-translation (TX-TL) cell-free expression system that can produce equivalent amounts of protein as T7-based systems at a 98% cost reduction to similar commercial systems.4,5 The preparation of buffers and crude cell extract are described, as well as the execution of a three tube TX-TL reaction. The entire protocol takes five days to prepare and yields enough material for up to 3000 single reactions in one preparation. Once prepared, each reaction takes under 8 hr from setup to data collection and analysis. Mechanisms of regulation and transcription exogenous to E. coli, such as lac/tet repressors and T7 RNA polymerase, can be supplemented.6 Endogenous properties, such as mRNA and DNA degradation rates, can also be adjusted.7 The TX-TL cell-free expression system has been demonstrated for large-scale circuit assembly, exploring biological phenomena, and expression of proteins under both T7- and endogenous promoters.6,8 Accompanying mathematical models are available.9,10 The resulting system has unique applications in synthetic biology as a prototyping environment, or "TX-TL biomolecular breadboard."

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

This five-day protocol outlines all steps, equipment, and supplemental software necessary for creating and running an efficient endogenous Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system from scratch. With reagents, the protocol takes 8 hours or less to setup a reaction, collect, and process data.

구현을위한 프로토콜<em&gt; 대장균</em합성 생물학&gt;을 바탕으로 TX-TL의 무 세포 발현 시스템

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for ...

Inducible Tet-Off Regulatable System: An In Vitro Method to Modulate Gene Expression in Cultured Cells Using Tetracycline-Off System

Source: Migneault, F. et al, <a href="https://www.jove.com/v/60654">Efficient Transcriptionally Controlled Plasmid Expression System for Investigation of the Stability of mRNA Transcripts in Primary Alveolar Epithelial Cells.</a> J. Vis. Exp. (2020).
This video describes the method of regulating gene expression in cultured cells by transfection with a plasmid containing a gene of interest and a regulatory plasmid. The expression of this plasmid can be controlled by tetracycline or its synthetic analogs, making this system a useful model to study regulatable gene expression.

유도성 Tet-Off 조절 시스템: Tetracycline-Off 시스템을 사용하여 배양된 세포의 유전자 발현을 조절하는 In vitro 방법

Source: Migneault, F. et al, Efficient Transcriptionally Controlled Plasmid Expression System for Investigation of the Stability of mRNA Transcripts in ...