この研究プロジェクトはシンガポール国家医学研究評議会（NMRC）のNew Investigator助成金のもとで資金提供された。研究チームは、2012年11月から2014年10月まで、National Medical Research Council（NMRC）の海外研究訓練フェローシップの下、University College of Ophthalmology（IoO）、University College（UCL）のAgrawal博士に研究訓練を教えていただきます。 David Shima。 Agrawal博士は、細胞を標識し、Shima博士の研究室でライブイメージングの概念と技術を取得しました。チームはDavid Shima教授、Kenith Meissner教授、Peter Lundh博士、Daiju Iwata教授からの訓練フェローシップの監督と指導を認めたいと思っています。

この研究で使用された動物プロトコールはシンガポールSingHealthの動物実験および使用委員会の承認を受けており、眼および視力における動物の使用に関するビジョンアンド眼科研究協会（ARVO）の声明研究。 1.蛍光色素による赤血球および白血球の標識<ol><li> 試薬の調製 <ol><li> 1800μLの滅菌蒸留水中に3mgのICGを溶解してICG（1.5mg / mL）を調製する。 10×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）200μLを加える。 </li><li>滅菌蒸留水6 mLに4 mLの1×PBSを加えて40％1×PBSを調製する。 PBS中の1％ウシ血清アルブミン（BSA）を、10mLの1×PBSに100mgのBSAを加えることによって調製する。 BSAが溶解するまで十分に混合する。 </li></ol></li><li> 密度勾配遠心分離を用いた赤血球および白血球の単離 <ol><li>マウスを麻酔する（野生ty（ARVOガイドラインのスケジュール1に従って）塩酸ケタミン塩酸塩（50mg / kg）と塩酸キシラジン塩酸塩（0.5mg / kg）との組み合わせを使用して、C57BL / 6を投与した。ペダル踏み戻し反射（ すなわち 、つまみ）で麻酔を確認する。 </li><li>ゆっくりと29ゲージの針（1mLシリンジに取り付けられています）を心臓に向けた肋骨の角度で挿入します。針が心臓の内側にあることを確認するには、プランジャーをわずかに引き抜き、血液がシリンジに抜き取られているかどうかを確認します。心臓から直接0.8 - 1 mLの血液を蘇生させる。 </li><li>直ちに、採血管を含むエチレンジアミン四酢酸（EDTA）（血液1.8mg / mL）に血液を移し、血液の凝固を防ぐために穏やかに混合する。 </li><li>ペントバルビタール（80mg / kg）を腹腔内注射することによりマウスを安楽死させる。 </li><li>ポリスクロースおよびジアトリゾアートナトリウム溶液（1：1比;密度1.077g / mL）の上に全血を2mLのマイクロ遠心チューブおよびセントリ血漿からの白血球および赤血球の分離を可能にするために、フュージ（450×g、30分）。 </li><li>ピペットを用いて上清（血漿）を除去して捨てる。ピペットを使用してバフィコート（白血球）と赤血球（赤血球層）を新しく分離したチューブに注意深く移す。 </li></ol></li><li> 赤血球のICG（1.5％）標識 <ol><li>汚染物質を除去するために1x PBSで赤血球を洗浄する。赤血球を1×PBS（1：1）に再懸濁し、50％ヘマトクリットを作成する。 0.5％の50％ヘマトクリット（約250μLの充填赤血球）をマイクロ遠心チューブに分注する。赤血球（750×g、5分）を遠心分離し、上清を捨てる。 </li><li> 40％1×PBS200μLをペレット状の赤血球に加え、よく混合し、室温で5分間インキュベートする。赤血球懸濁液に100μLのICG（1.5mg / mL）を添加し、チューブを反転させて穏やかに混合し、室温で5分間インキュベートする。 300μLの1×PBSを加え、シェーカーインキュベーターで37℃で60分間インキュベートする。 </li><li>担体赤血球（750 xg、3分）を遠心分離し、1 mL PBSで再懸濁する。 </li><li>上清が透明になるまで細胞を1×PBSで3〜5回洗浄する（ステップ1.3.3）。最後の洗浄後、上清を傾瀉し、ICG標識赤血球の50％ヘマトクリット（1.25×10 8細胞/ mL）を達成するために、標識された前膨潤赤血球に1％BSA PBS（1：1）を加える。 </li></ol></li><li> 白血球のナトリウムフルオレセイン（1％）標識 <ol><li>密度勾配遠心分離（ステップ1.2.6からの）を用いて血液からバフィコートを分離した後、450xgで10分間遠心分離して10mLの1×PBSで細胞を1回洗浄し、汚染物を除去する。ペレットを900μLの1×PBSに再懸濁する。 </li><li> 100μLの10％ナトリウムフルオレセインを900μLの白血球懸濁液に加え、室温で2分間インキュベートする。標識された細胞を遠心分離によって10mLの1X PBSで3回洗浄する。ng（450×g、10分）。 100μLの1×PBSに細胞を再懸濁する。 </li></ol></li></ol> 2.蛍光標識細胞のライブイメージング<ol><li> ICG標識赤血球の生細胞イメージング <ol><li>尾静脈または逆行軌道を介して注入する細胞を調製するために、ICG標識赤血球の50％ヘマトクリットを1倍PBSで10倍および50倍希釈して、それぞれ5％および1％ヘマトクリット細胞を作製する。 </li><li>マウスを赤外線（250W強度）の下に5分間置いて尾静脈を拡張させる。ケタミン塩酸塩（50mg / kg）および塩酸キシラジン（0.5mg / kg）を腹腔内注射（ここでは、ARVOガイドラインのスケジュール1に従って）してマウスを麻酔する。 </li><li> 0.5％トロピカミドと2.5％フェニレフリン塩酸塩の滴で眼の各瞳孔を希釈する。 </li><li>イメージングのためにコンタクトレンズを一方の目の上に置きます。イメージングのための媒体として眼科用ゲルを使用し、乾燥物を防ぐsの角膜。マウス眼の屈折を補正するために、+ 25ジオプターレンズを備えた共焦点レーザー走査眼科検査（SLO）カメラを固定する。 </li><li>マウスをSLOイメージングプラットフォームに置きます。マウスの角膜がSLOマシンの光学ヘッドに向かって真っ直ぐに向いていることを確認します。 </li><li>イメージングモジュールのスイッチを入れます。関連するイメージングモジュールソフトウェアを使用して、 &quot;New Patient&quot;ボタンをクリックし、マウスの耳のタグ番号、生年月日、蛍光色素のパーセント、および標識細胞タイプなどの動物識別情報を追加します。 <ol><li>イメージングモジュールを操作して、動物の視神経をイメージングスクリーンの中央に配置します。関連するイメージングモジュールソフトウェアを使用して、「Acquire」ボタンをクリックして、30°または15°のアングルビュー設定の赤外線（IR）眼底画像を撮影します。最高品質の画像を得るために、網膜の中心、瞳孔、およびレーザーの光路が調整されていることを確認してください。 <br/&gt;注：光路は、ジョイスティックを操作して最も鮮明な画像と最良の照明を得るように調整されています。 </li></ol></li><li> ICG眼底ビデオを撮る。 <ol><li> ICGフィルター（790 nm）をオンにし、カメラを30°または15°の角度で高速モードに設定し、ICG強度を85に設定してすべての標準値を読み取ります。コントロールパネルで、 &quot;Acquire&quot;ボタンをクリックして8.8 / 15フレーム/秒で1分間ビデオ（ベースラインコントロール）を撮影します。 </li></ol></li><li> 30ゲージの針に取り付けられたインスリンシリンジに100μLのICG標識赤血球をロードする。 <ol><li>尾静脈経路を介した注射のために、ニードルベベルを尾静脈に挿入する。血液のシリンジへの逆流をチェックして静脈内アクセスを確認し、標識細胞を循環系に注入する。 </li><li>眼窩後方経路を介した注入のために、眼に隣接する針を眼窩後方の空間に挿入するe。血液のシリンジへの逆流をチェックし、循環細胞に標識された細胞を注入することにより、眼窩後方へのアクセスを確認する。 </li></ol></li><li>注入後、マウスの位置を変えて、IR眼底画像（ステップ2.1.6.1を参照）とビデオをICGフィルタ（ステップ2.1.7.1を参照）を用いて撮影する。網膜循環中の標識された細胞は、細胞の注入直後に視覚化することができる。 </li><li>ビデオフレームを取得したら、SLO表示モジュールソフトウェアを使用してビデオを書き出すときに.tiff形式を選択して、ビデオシーケンスの.tiff画像を抽出します。ファイルを目的のフォルダに保存します。 </li><li>コンタクトレンズを取り外し、もう片方の目の上に置き、ステップ2.1.4〜2.1.7で説明したようにイメージングを完了します。 </li><li>撮影後、麻酔をかけた動物を赤外線（250W）下に置き、麻酔から回復するまで体温を維持します。動物が完全に回復したら、マウスを保持ケージに戻します。</li></ol></li><li> 1％ナトリウムフルオレセイン標識白血球の生細胞イメージング <ol><li>マウスを準備し、セクション2.1で説明されているように機器をセットアップします。 </li><li>ステップ2.1.4〜2.1.6で説明したように、マウスを置いて赤外線眼底画像を撮影します。 <ol><li> 30°または15°の角度の視野を有する高速カメラモードおよび標準化のためのすべての読み取りについて85でのフルオレセイン強度を有するフルオレセインフィルター（488nm）を使用して、マウスのフルオレセイン血管造影像を得る。 8.8 / 15フレーム/秒でビデオ（ベースライン制御）を記録する（ステップ2.1.7.1を参照）。 注：ここでは、複数のトラックのビデオ（1分のビデオ）が異なる時間間隔で取得されました。 </li></ol></li><li>セクション2.1.8で説明したように、100μLの標識白血球をマウスの尾静脈またはレトロオービタル注射液に注入します。 </li><li>注射直後にマウスを置いて、赤外線眼底画像（ステップ2.1.5と2.1.6参照）とフルオマウスの血行再建術（2.2.2節参照）。 </li><li>イメージングモジュール上のフォーカスつまみを回してスキャンレーザーの焦点を調整し、網膜または脈絡膜血管の標識細胞を観察します。 </li><li> SLO表示モジュールソフトウェア（ステップ2.1.10参照）を使用してビデオフレームと画像を取得し、目的のフォルダに保存します。 </li><li>手順の後、動物の世話のためにステップ2.1.12に従ってください。 </li></ol></li><li> MtrackJソフトウェアによる画像解析 <ol><li> 「File」をクリックしてImageJで画像シーケンスを開きます。 &quot;インポート&quot;を選択し、 &quot;イメージシーケンス&quot;を選択し、目的のイメージフォルダを選択し、 &quot;開く&quot;をクリックします。画面に「Sequence options」というポップアップウィンドウが表示されます。 [OK]をクリックします。画像シーケンスが開きます。 </li><li> 「画像」をクリックして画像のフレーム間隔を設定し、速度測定のために「プロパティ」を選択します。ここでは、それは8.8フレームですes / s。 </li><li> &quot;プラグイン&quot;を選択してMTrackJプラグインを開きます。 「トラッキング」を選択し、「MtrackJ」を選択します。メニューが表示されます。 </li><li>トラッキング設定を調整するには、メニューの「トラッキング」を選択し、「ポイントを追加した後の次のタイムフレームのインデックスに移動」チェックボックスをオンにします。 </li><li>最初のセルを追跡します。 <ol><li> 1つのセルを探し、後続のフレームで同じセルを追跡します。メニューで「追加」をクリックして新しいトラックを追加します。 </li><li>画像（+記号）の上にカーソルを置き、適切なセルをクリックします。 注：MTrackJは自動的に次の時間フレームにジャンプし、軌跡の最初のポイントの位置をマークする小さな円を追加します。 </li><li>画像シーケンスのフレームを移動しながら、セルの現在の位置を続けてクリックします。 注：時々、軌跡の前のポイントをマークする円は、現在の位置を表示する機能を妨げます。これが発生した場合、ステップ2.3.5.3.1に進んでください。 <ol><li>メニューの「表示」をクリックし、「現時点のトラックポイントのみを表示する」オプションを選択して、軌道の表示オプションを変更します。すべての軌跡を表示するには、このオプションの選択を解除します。 </li></ol></li><li>最初のセルの軌跡が見えるまでクリックし続けます。次に、[保存]をクリックしてトラックを保存します。 </li></ol></li><li> 2番目のセルを追跡します。 <ol><li>メニューで、[追加]をクリックして新しいトラックを開始します。新しいセルを追跡するためにステップ2.3.5.1〜2.3.5.4を繰り返します。 2番目のトラックを保存するには、[保存]をクリックします。 </li><li>観察されたすべての追跡可能な細胞について、これらのステップを続ける。セルをトラッキングした後、メニュータブで &quot;Measure&quot;と &quot;OK&quot;をクリックして結果を取得します。 注記：結果ウィンドウが自動的に開き、詳細な分析のためにスプレッドシートに保存して開くことができます。 </li></ol></li></ol></li></ol>

著者は何も開示することはない。財務的または利益相反はありません。

網膜および脈絡膜循環における血行動態の研究は、多くの眼疾患の病態生理を理解する上で不可欠です。網膜循環における血流動態は、フーリエドメイン光コヒーレンストモグラフィ（FD-OCT）、レーザースペックルフローグラフィ（LSFG）および網膜オキシメトリーによって研究することができる。これらの方法は、網膜循環路40,41,42,43,44,45における全血流を研究するために異なるアプローチ?...

網膜および脈絡膜循環における血球の流動ダイナミクスの研究は、潜在的に視力を脅かす眼疾患および他の眼の炎症状態の病因の理解に不可欠である。しかし、蛍光色素の血漿タンパク質への結合を含む従来の血管造影技術は、赤血球または白血球の動態に関する情報を提供していない1 。赤血球網膜流動ダイナミクスは、様々な炎症状態における細胞の移動、認識、接着および破壊を理解するために、網膜における代謝的に効率的な循環および白血球流動の研究に重要である2 。種々の細胞タイプの同定および特徴付けに使用されるいくつかの蛍光分子がある3 。血液細胞の血行動態は、それらを適切な蛍光で染色することによって測定することができる適切なイメージング技術を適用する4 。 加齢性黄斑変性症（AMD）や糖尿病性網膜症（DR）のような眼内疾患の炎症反応の存在には、病変部にリンパ球が蓄積している5,6 。組織内の免疫細胞を追跡することは、病因のメカニズムに関与する複雑な事象を理解するのに役立ちます。初期の研究では、 51 Crや125 Iのような放射性同位体を細胞トレーサーとして用いた。これらの色素は毒性であり、細胞生存率に影響を及ぼす。放射性マーカー3 Hおよび14 Cは、それらの低い放出エネルギーのために細胞に対して毒性が低いが、系7,8 においてそれらのシグナルを検出することは困難である。関連する潜在的な問題を克服するために、いくつかの蛍光色素が導入された蛍光顕微鏡法とフローサイトメトリーを用いたインビトロでのリンパ球遊走の追跡9,10 。 Hoechst 33342およびチアゾールオレンジは、インビボでリンパ球を追跡するために使用されるDNA結合蛍光色素である。 Hoechst 33342は、DNAのATリッチ領域に結合し、膜透過性であり、2〜4日間蛍光シグナルを保持し、クエンチング9,10 に耐性がある。ヘキスト33342およびチアゾールオレンジの欠点は、リンパ球増殖の阻害11および短い半減期9である 。 カルセイン-AM、フルオレセインジアセテート（FDA）、2 &#39;、7&#39;-ビス - （2-カルボキシエチル）-5-（および-6） - カルボキシフルオレセイン、アセトキシメチルエステル（BCECF-AM）、5-（および-6） - （CFDA）、および5-（および-6） - カルボキシフルオレセインジアセテートアセトキシメチルエステル（CFDA-AM）リンパ球移動研究に用いられる細胞質蛍光色素である。しかし、FDA、CFDAおよびCFDA-AMは細胞内の保持率が低い9 。 BCECF-AMは、増殖応答を低下させ、走化性およびスーパーオキシド産生に影響を及ぼす9,12。カルセイン-AMは蛍光色素であり、短期インビボリンパ球遊走研究に有用である。それは強い蛍光シグナルを放出し、細胞機能の大部分を妨げず、3日まで蛍光シグナルを保持する（ 12,13） 。フルオレセインイソチオシアネート（FITC）およびカルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（CFDA-SE）は、リンパ球の移動研究に使用される共有結合性の蛍光色素です。 FITCは、細胞生存率に影響を示さず、Tリンパ球14,15よりもBリンパ球との親和性が強い</sup&gt;。 CFDA-SEで標識されたリンパ球は、8週間以上および8細胞分裂までの間、インビボで追跡することができる9,16。 C18ジ（1,1&#39;-ジオクタデシル-3,3,3 &#39;、3&#39;-テトラメチルインドカルボシアニン過塩素酸塩）、DiO（3,3&#39;-ジオクタデシルオキサカルボシアニン過塩素酸塩）、Paul Karl Horan（PKH）2、PKH3およびPKH26は、白血球および赤血球を標識するために使用される蛍光親油性カルボシアニン色素を挿入する。 C18 DilおよびDiOは、細胞膜に取り込まれるとより高いシグナルを示し、比較的毒性がない12,17。 PKH2、PKH3およびPKH26標識細胞は、毒性の低い18,19,20,21,22の蛍光シグナルの良好な保持を示す。しかし、PKH2はCD62L発現をダウンレギュレートし、<html> mphocyte viability 23 。 上記の研究の大部分は、リンパ球におけるリンパ球の移動および増殖を追跡し、非眼球循環における標識された赤血球を研究するために行われてきた。眼球循環中の血液細胞を研究するための標識技術を応用した研究はほとんどない。走査型レーザー検眼鏡（SLO）の適用は、眼底血管撮影法24によって網膜および脈絡膜循環中の標識細胞をインビボで研究することに大きな利点を有する。 SLO 25,26,27,28,29,30,32,34,36,38,40,42,44,46,56,56,58,56,56,56,56,56,56,56,56,56,56,56,56,56,56,56,56,56,58,56,56,56,56,56,56,56,57,58,56,56,56,56,56,57,58,59,56,56,56,56,56,56,56,56class = &quot;xref&quot;&gt; 31,32,33,34 。アクリジンオレンジの光毒性および発がん性26,27 、 FITCと細胞活性の干渉、および網膜および脈絡膜血管の解像度のための血管内造影剤の必要性は、インビボ動物実験29 におけるそれらの適用を制限する。フルオレセインナトリウムおよびICGは、食品医薬品局によって承認された非毒性であり、ヒトでの試験に安全です32,35 。フローダイナミックス研究の大部分は、白血球または赤血球の標識および網膜および脈絡膜血管におけるその視覚化に関連する36,37,38,39 </sアップ&gt;。ここでは、赤血球のICGラベリング、白血球のフルオレセインナトリウム標識、およびSLOを用いたマウス網膜循環における可視化標識細胞の追跡の標準化プロトコルを記載する。

<table><tbody><tr><td>Cardiogreen polymethine dye (Indocyanine green)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>12633-50MG</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein 100 mg/mL</td><td>Novartis</td><td>U1705A/H-1330292</td><td></td></tr><tr><td>10x Phosphate-buffered saline (PBS) Ultra Pure Grade</td><td>1st BASE</td><td>BUF-2040-10X1L</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7906-100G</td><td></td></tr><tr><td>Microtainer tubes with K2E (K2EDTA) - EDTA concentration - 1.8 mg/mL of blood</td><td>BD, USA</td><td>REF 365974</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque 1077 solution</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5810 R</td><td>Eppendorf</td><td>05-413-401</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge tubes 2 mL</td><td>Axygen</td><td>MCT-200-C-S</td><td></td></tr><tr><td>Vortex mixer</td><td>Insta BioAnalytik pte. ltd</td><td>FINE VORTEX</td><td></td></tr><tr><td>Shaker incubator</td><td>Lab Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ceva Ketamine injection (Ketamine hydrochloride 100 mg/mL)</td><td>Ceva</td><td>KETALAB03</td><td></td></tr><tr><td>ILIUM XYLAZIL-20 (Xylazine hydrochloride 20 mg/Ml)</td><td>Troy Laboratories PTY. Limited</td><td>LI0605</td><td></td></tr><tr><td>1% Mydriacyl 15 mL (Tropicamide 1%)</td><td>Alcon&amp;nbsp;Laboratories, Inc. USA</td><td>NDC&amp;nbsp;0998-0355-15</td><td></td></tr><tr><td>2.5% Mydfrin 5 mL (Phenylephrine hydrochloride 2.5%)</td><td>Alcon&amp;nbsp;Laboratories, Inc. USA</td><td>NDC&amp;nbsp;0998-0342-05</td><td></td></tr><tr><td>Terumo syringe with needle 1 cc/mL Tuberculin</td><td>Terumo (Philippenes) Corporation, Philippines</td><td>SS-01T2613</td><td></td></tr><tr><td>Vidisic Gel 10 G</td><td>Dr. Gerhard Mann, Chem.-Pharm, Fabrik Gmbh, Berlin, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alcohol swabs</td><td>Assure medical disposables</td><td>7M-004-L-01</td><td></td></tr><tr><td>Confocal laser scanning angiography system (Heidelberg Retina Angiograph 2)</td><td>Heidelberg Engineering, GmbH, Heidelberg, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hiedelberg Spectralis Viewing Module software, v4.0</td><td>Heidelberg Engineering, GmbH, Heidelberg, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent microscope</td><td>ZEISS</td><td>Model: axio imager z1</td><td></td></tr></tbody></table>

fluorescent dye labeling of erythrocytes and leukocytes for studying the flow dynamics in mouse retinal circulation

網膜および脈絡膜血流動態は、緑内障、糖尿病性網膜症、加齢性黄斑変性（AMD）および他の眼炎症状態などの様々な眼疾患の病態生理学および後遺症についての洞察を提供し得る。また、眼の治療反応をモニターするのに役立ちます。標識された細胞の生細胞イメージングと結びついた血液細胞の適切な標識は、網膜および脈絡膜循環における血流動態の調査を可能にする。ここでは、マウス赤血球および白血球のそれぞれ1.5％インドシアニングリーン（ICG）および1％ナトリウムフルオレセイン標識の標準化プロトコルを記載する。 C57BL / 6Jマウス（野生型）の網膜循環中の標識された細胞を視覚化するために走査型レーザー検眼鏡（SLO）を適用した。両方の方法は、マウス網膜循環において明瞭な蛍光標識細胞を示した。これらの標識方法は、様々な眼疾患モデル。

1.5％ICGで標識した赤血球を、C57BL / 6Jマウス（野生型）の網膜循環において視覚化した。 1.5％ICG標識赤血球の1％および5％ヘマトクリットの両方が、網膜循環において区別可​​能であった。しかし、個々の標識細胞は、1.5％ICG標識赤血球の1％ヘマトクリットでより明瞭に視覚化された（ 図1 ）。 5％ヘマトクリットでは、網膜血管中の多数の?...

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Fluorescent Dye Labeling of Erythrocytes and Leukocytes for Studying the Flow Dynamics in Mouse Retinal Circulation

眼循環中の標識された血液細胞の生細胞イメージングは​​、糖尿病性網膜症および加齢性黄斑変性における炎症および虚血に関する情報を提供し得る。血球を標識し、網膜循環中の標識細胞を画像化するプロトコルが記載されている。

マウス網膜循環における血流動態を調べるための赤血球および白血球の蛍光色素標識

The retinal and choroidal blood flow dynamics may provide insight into the pathophysiology and sequelae of various ocular diseases, such as glaucoma, ...

fluorescent-dye-labeling-erythrocytes-leukocytes-for-studying-flow

Research

JoVE Journal

Medicine

12.3K ビュー.  Tan Tock Seng Hospital. 眼循環中の標識された血液細胞の生細胞イメージングは​​、糖尿病性網膜症および加齢性黄斑変性における炎症および虚血に関する情報を提供し得る。血球を標識し、網膜循環中の標識細胞を画像化するプロトコルが記載されている。 

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Intravital Microscopy of the Mouse Brain Microcirculation using a Closed Cranial Window

This experimental model was designed to assess the mouse pial microcirculation during acute and chronic, physiological and pathophysiological hemodynamic, inflammatory and metabolic conditions, using in vivo fluorescence microscopy. A closed cranial window is placed over the left parieto-occipital cortex of the mice. Local microcirculation is recorded in real time through the window using epi and fluorescence illumination, and measurements of vessels diameters and red blood cell (RBC) velocities are performed. RBC velocity is measured using real-time cross-correlation and/or fluorescent-labeled erythrocytes. Leukocyte and platelet adherence to pial vessels and assessment of perfusion and vascular leakage are made with the help of fluorescence-labeled markers such as Albumin-FITC and anti-CD45-TxR antibodies. Microcirculation can be repeatedly video-recorded over several days. We used for the first time the close window brain intravital microscopy to study the pial microcirculation to follow dynamic changes during the course of Plasmodium berghei ANKA infection in mice and show that expression of CM is associated with microcirculatory dysfunctions characterized by vasoconstriction, profound decrease in blood flow and eventually vascular collapse.

Intravital microscopy to follow temporal and spatial hemodynamic and inflammatory events in the pial microcirculation.

クローズ頭蓋窓を使用してマウス脳の微小循環の生体顕微鏡

This experimental model was designed to assess the mouse pial microcirculation during acute and chronic, physiological and pathophysiological hemodynamic, ...

神経科学

Intravital Video Microscopy Measurements of Retinal Blood Flow in Mice

Alterations in retinal blood flow can contribute to, or be a consequence of, ocular disease and visual dysfunction. Therefore, quantitation of altered perfusion can aid research into the mechanisms of retinal pathologies. Intravital video microscopy of fluorescent tracers can be used to measure vascular diameters and bloodstream velocities of the retinal vasculature, specifically the arterioles branching from the central retinal artery and of the venules leading into the central retinal vein. Blood flow rates can be calculated from the diameters and velocities, with the summation of arteriolar flow, and separately venular flow, providing values of total retinal blood flow. This paper and associated video describe the methods for applying this technique to mice, which includes 1) the preparation of the eye for intravital microscopy of the anesthetized animal, 2) the intravenous infusion of fluorescent microspheres to measure bloodstream velocity, 3) the intravenous infusion of a high molecular weight fluorescent dextran, to aid the microscopic visualization of the retinal microvasculature, 4) the use of a digital microscope camera to obtain videos of the perfused retina, and 5) the use of image processing software to analyze the video. The same techniques can be used for measuring retinal blood flow rates in rats.

Intravital microscopy can be used in animals to visualize and measure retinal vascular diameters, bloodstream velocities, and total retinal blood flow.

Alterations in retinal blood flow can contribute to, or be a consequence of, ocular disease and visual dysfunction. Therefore, quantitation of altered ...

医学

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal environment. Biological activities of immune cells mainly rely on their motility capacities. Blood monocytes have short half-life in the bloodstream; they originate in the bone marrow and are constitutively released from it. In inflammatory condition, this process is enhanced, leading to blood monocytosis and subsequent infiltration of the peripheral inflammatory tissues. Identifying the biomechanical events controlling monocyte trafficking from the bone marrow towards the vascular network is an important step to understand monocyte physiopathological relevance. We performed in vivo time-lapse imaging by two-photon microscopy of the skull bone marrow of the Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP (MacBlue) mouse. The MacBlue mouse expresses the fluorescent reporters enhanced cyan fluorescent protein (ECFP) under the control of a myeloid specific promoter 1, in combination with vascular network labelling. We describe how this approach enables the tracking of individual medullar monocytes in real time to further quantify the migratory behaviour within the bone marrow parenchyma and the vasculature, as well as cell-to-cell interactions. This approach provides novel insights into the biology of the bone marrow monocyte subsets and allows to further address how these cells can be influenced in specific pathological conditions.

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Monocytes are key regulators of innate immunity and play a critical role in the renewal of the peripheral mononuclear phagocytic system and in case of inflammation. This manuscript describes the procedure of real time imaging of the mouse calvaria bone marrow to study the monocyte mobilisation mechanism.

マウス骨髄単球の追跡<em&gt;インビボ</em

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal ...

免疫・感染学

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, including phagocytosis of damaged synapses or cells, debris, and/or invading pathogens. Impaired phagocytic function has been implicated in the pathogenesis of diseases such as Alzheimer's and age-related macular degeneration, where amyloid-&#946; plaque and drusen accumulate, respectively. Despite its importance, microglial phagocytosis has been challenging to assess in vivo. Here, we describe a simple, yet robust, technique for precisely monitoring and quantifying the in vivo phagocytic potential of retinal microglia. Previous methods have relied on immunohistochemical staining and imaging techniques. Our method uses flow cytometry to measure microglial uptake of fluorescently labeled particles after intravitreal delivery to the eye in live rodents. This method replaces conventional practices that involve laborious tissue sectioning, immunostaining, and imaging, allowing for more precise quantification of microglia phagocytic function in just under six hours. This procedure can also be adapted to test how various compounds alter microglial phagocytosis in physiological settings. While this technique was developed in the eye, its use is not limited to vision research.

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglial phagocytosis is critical for the maintenance of tissue homeostasis and inadequate phagocytic function has been implicated in pathology. However, assessing microglia function in vivo is technically challenging. We have developed a simple but robust technique for precisely monitoring and quantifying the phagocytic potential of microglia in a physiological setting.

網膜ミクログリアの貪食機能を評価します<em&gt;インビボ</em&gt;フローサイトメトリーベースのアッセイを使用しました

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent and cause visual impairment and blindness. Understanding how such diseases progress is critical to formulating new treatments. In vivo&#160;microscopy in animal models of disease is a powerful tool for understanding neurodegeneration and has led to important progress towards treatments of conditions ranging from Alzheimer&#39;s disease to stroke. Given that the retina is the only central nervous system structure inherently accessible by optical approaches, it naturally lends itself towards in vivo imaging. However, the native optics of the lens and cornea present some challenges for effective imaging access.
This protocol outlines methods for in vivo two-photon imaging of cellular cohorts and structures in the mouse retina at cellular resolution, applicable for both acute- and chronic-duration imaging experiments. It presents examples of retinal ganglion cell (RGC), amacrine cell, microglial, and vascular imaging using a suite of labeling techniques including adeno-associated virus (AAV) vectors, transgenic mice, and inorganic dyes. Importantly, these techniques extend to all cell types of the retina, and suggested methods for accessing other cellular populations of interest are described. Also detailed are example strategies for manual image postprocessing for display and quantification. These techniques are directly applicable to studies of retinal function in health and disease.

In vivo imaging is a powerful tool for the study of biology in health and disease. This protocol describes transpupillary imaging of the mouse retina with a standard two-photon microscope. It also demonstrates different in vivoimaging methods to fluorescently label multiple cellular cohorts of the retina.

経瞳孔二光子マウス網膜のin vivoイメージング

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

Recent advances in protein biology and mouse genetics have made it possible to measure intracellular calcium fluctuations of brain cells in vivo and to correlate this with local hemodynamics. This protocol uses transgenic mice that have been prepared with a chronic cranial window and express the genetically encoded calcium indicator, RCaMP1.07, under the &#945;-smooth muscle actin promoter to specifically label mural cells, such as vascular smooth muscle cells and ensheathing pericytes. Steps are outlined on how to prepare a tail vein catheter for intravenous injection of fluorescent dyes to trace blood flow, as well as how to measure brain pericyte calcium and local blood vessel hemodynamics (diameter, red blood cell velocity, etc.) by two photon microscopy in vivo through the cranial window in ketamine/xylazine anesthetized mice. Finally, details are provided for the analysis of calcium fluctuations and blood flow movies via the image processing algorithms developed by Barrett et al. 2018, with an emphasis on how these processes can be adapted to other cellular imaging data.

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

This protocol presents steps to acquire and analyze fluorescent calcium images from brain ensheathing pericytes and blood flow data from nearby blood vessels in anesthetized mice. These techniques are useful for studies of mural cell physiology and can be adapted to investigate calcium transients in any cell type.

生体内のトランスジェニックマウスにおける脳ペリサイトカルシウムと血行力学イメージング

Recent advances in protein biology and mouse genetics have made it possible to measure intracellular calcium fluctuations of brain cells in vivo and to ...

Dynamic Measurement and Imaging of Capillaries, Arterioles, and Pericytes in Mouse Heart

Coronary arterial tone along with the opening or closing of the capillaries largely determine the blood flow to cardiomyocytes at constant perfusion pressure. However, it is difficult to monitor the dynamic changes of the coronary arterioles and the capillaries in the whole heart, primarily due to its motion and non-stop beating. Here we describe a method that enables monitoring of arterial perfusion rate, pressure and the diameter changes of the arterioles and capillaries in mouse right ventricular papillary muscles. The mouse septal artery is cannulated and perfused at a constant flow or pressure with the other dynamically measured. After perfusion with a fluorescently labeled lectin (e.g., Alexa Fluor-488 or -633 labeled Wheat-Germ Agglutinin, WGA), the arterioles and capillaries (and other vessels) in right ventricle papillary muscle and septum could be readily imaged. The vessel-diameter changes could then be measured in the presence or absence of heart contractions. When genetically encoded fluorescent proteins were expressed, specific features could be monitored. For examples, pericytes were visualized in mouse hearts that expressed NG2-DsRed. This method has provided a useful platform to study the physiological functions of capillary pericytes in heart. It is also suitable for studying the effect of reagents on the blood flow in heart by measuring the vascular/capillary diameter and the arterial luminal pressure simultaneously. This preparation, combined with a state-of-the-art optic imaging system, allows one to study the blood flow and its control at cellular and molecular level in the heart under near-physiological conditions.

Presented here is a protocol to study the coronary microcirculation in living murine heart tissue by ex vivo monitoring of the arterial perfusion pressure and flow that maintains the pressure, as well as vascular tree components including the capillary beds and pericytes, as the septal artery is cannulated and pressurized.

マウス心臓における毛細血管、細動脈、および周囲細胞の動的測定とイメージング

Coronary arterial tone along with the opening or closing of the capillaries largely determine the blood flow to cardiomyocytes at constant perfusion ...

Measuring Retinal Vessel Diameter from Mouse Fluorescent Angiography Images

It is important to study the development of retinal vasculature in retinopathies in which abnormal vessel growth can ultimately lead to vision loss. Mutations in the microphthalmia-associated transcription factor (Mitf) gene show hypopigmentation, microphthalmia, retinal degeneration, and in some cases, blindness. In vivo imaging of the mouse retina by noninvasive means is vital for eye research. However, given its small size, mouse fundus imaging is difficult and might require specialized tools, maintenance, and training. In this study, we have developed a unique software enabling analysis of the retinal vessel diameter in mice with an automated program written in MATLAB. Fundus photographs were obtained with a commercial fundus camera system following an intraperitoneal injection of a fluorescein salt solution. Images were altered to enhance contrast, and the MATLAB program permitted extracting the mean vascular diameter automatically at a predefined distance from the optic disk. The vascular changes were examined in wild-type mice and mice with various mutations in the Mitf gene by analyzing the retinal vessel diameter. The custom-written MATLAB program developed here is practical, easy to use, and allows researchers to analyze the mean diameter and mean total diameter, as well as the number of vessels from the mouse retinal vasculature, conveniently and reliably.

Mouse retinal vasculature is particularly interesting in understanding the mechanisms of vascular pattern formation. This protocol automatically measures the diameter of mouse retinal vessels from fluorescent angiography fundus images at a fixed distance from the optic disk.

マウス蛍光血管造影画像からの網膜血管径の測定

It is important to study the development of retinal vasculature in retinopathies in which abnormal vessel growth can ultimately lead to vision loss. ...

Monitoring Dynamic Growth of Retinal Vessels in Oxygen-Induced Retinopathy Mouse Model

Oxygen-induced retinopathy (OIR) is widely used to study abnormal vessel growth in ischemic retinal diseases, including retinopathy of prematurity (ROP), proliferative diabetic retinopathy (PDR), and retinal vein occlusion (RVO). Most OIR studies observe retinal neovascularization at specific time points; however, the dynamic vessel growth in live mice along a time course, which is essential for understanding the OIR-related vessel diseases, has been understudied. Here, we describe a step-by-step protocol for the induction of the OIR mouse model, highlighting the potential pitfalls, and providing an improved method to quickly quantify areas of vaso-obliteration (VO) and neovascularization (NV) using immunofluorescence staining. More importantly, we monitored vessel regrowth in live mice from P15 to P25 by performing fluorescein fundus angiography (FFA) in the OIR mouse model. The application of FFA to the OIR mouse model allows us to observe the remodeling process during vessel regrowth.

This protocol describes a detailed method for the preparation and immunofluorescence staining of mice retinal flat mounts and analysis. The use of fluorescein fundus angiography (FFA) for mice pups and image processing are described in detail as well.

酸素誘発網膜症マウスモデルにおける網膜血管の動的成長のモニタリング

Oxygen-induced retinopathy (OIR) is widely used to study abnormal vessel growth in ischemic retinal diseases, including retinopathy of prematurity (ROP), ...

生物学

Intravital Microscopy to Study Platelet-Leukocyte-Endothelial Interactions in the Mouse Liver

Inflammation and thrombosis are complex processes that occur primarily in the microcirculation. Although standard histology may provide insight into the end pathway for both inflammation and thrombosis, it is not capable of showing the temporal changes that occur throughout the time course of these processes. Intravital microscopy (IVM) is the use of live-animal imaging to gain temporal insight into physiologic processes in vivo. This method is particularly powerful when assessing cellular and protein interactions within the circulation due to the rapid and sequential events that are often necessary for these interactions to occur. While IVM is an extremely powerful imaging methodology capable of viewing complex processes in vivo, there are a number of methodological factors that are important to consider when planning an IVM study. This paper outlines the process of conducting intravital imaging of the liver, identifying important considerations and potential pitfalls that may arise. Thus, this paper describes the use of IVM to study platelet-leukocyte-endothelial interactions in liver sinusoids to study the relative contributions of each in different models of acute liver injury.

Intravital microscopy is a powerful tool that provides insight into both the temporal and spatial relationships of rapid and/or sequential processes. Herein, we describe a protocol to assess both protein-protein interactions and platelet-neutrophil-endothelial interactions in liver sinusoids in a murine model of experimental sepsis (endotoxemia).

Inflammation and thrombosis are complex processes that occur primarily in the microcirculation. Although standard histology may provide insight into the ...

マウス網膜循環における血流動態を調べるための赤血球および白血球の蛍光色素標識

要約

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