이 연구 프로젝트는 싱가포르 국립 의료 연구 협의회 (National Medical Research Council, NMRC)의 New Investigator 기금으로 지원되었습니다. 연구팀은 2012 년 11 월부터 2012 년 10 월까지 National Medical Research Council (NMRC) 해외 연구 연수 펠로우 십을 통해 University University of London (UCL)의 안과 연구소 (IoO)에서 Agrawal 박사에게 제공 한 연구 훈련에 대해 감사를 표합니다. David Shima. Agrawal 박사는 시마 박사의 실험실에서 세포에 라벨을 붙이고 영상을 찍기위한 개념과 기술을 습득했습니다. 따라서 팀은 David Shima 교수, Kenith Meissner 박사, Peter Lundh 박사 및 Daiju Iwata 교수의 훈련 펠로우쉽 중 감독과지도를 인정하고자합니다.

이 연구에 사용 된 동물 프로토콜은 싱가포르 싱가포르 SingHealth의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 얻었으며 안과 / 안과 분야에서의 동물 사용을위한 안과 / 안과 연구 협회 (ARVO)의 성명서 연구. 1. 형광 염료를 이용한 적혈구 및 백혈구의 표지 <ol><li> 시약 준비 <ol><li> 멸균 된 증류수 1800 μL에 ICG 3 mg을 녹여 ICG (1.5 mg / mL)를 준비하십시오. 10x 인산 완충 식염수 (PBS) 200 μL를 추가합니다. </li><li> 멸균 증류수 6 ML에 1X PBS 4 ML을 추가하여 40 % 1X PBS를 준비합니다. 1x PBS 10 ML에 BSA 100 MG를 추가하여 PBS에 1 % 소 혈청 알부민 (BSA)을 준비합니다. BSA가 녹을 때까지 잘 섞는다. </li></ol></li><li> 밀도 구배 원심 분리를 이용한 적혈구 및 백혈구 분리 <ol><li> 생쥐 마취 (야생 타이(ARVO 지침에 따라 스케쥴 1에 따라) 케타민 하이드로 클로라이드 (50mg / kg)와 크 실라 진 하이드로 클로라이드 (0.5mg / kg)의 조합을 사용하여 투여 하였다 (C57BL / 6). 페달 철수 반사 ( 즉 , 발가락 핀치)로 마취를 확인하십시오. </li><li> 29 게이지 바늘 (1 mL 주사기에 부착 됨)을 천천히 심장쪽으로 향하게하여 삽입하십시오. 바늘이 심장 안에 있는지 확인하려면 플런저를 약간 빼내고 혈액이 주사기 안으로 빠지는지 확인하십시오. 심장에서 0.8 - 1 mL의 피를 직접 뽑아냅니다. </li><li> 즉시 혈액 수집 튜브가 들어있는 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) (혈액 1.8 mL / mL)에 혈액을 옮기고 혈액 응고를 방지하기 위해 부드럽게 혼합하십시오. </li><li> pentobarbital (80mg / kg)을 복강 내 주사하여 마우스를 안락사하십시오. </li><li> 2 ML의 microcentrifuge 튜브와 centri에서 polysucrose과 나트륨 diatrizoate 솔루션 (1 : 1 비율, 밀도 1.077 g / ML)의 상단에 전혈을 계층화fuge (450 xg, 30 min)를 사용하여 혈장에서 백혈구와 적혈구를 분리시킵니다. </li><li> 피펫을 사용하여 상등액 (플라스마)을 제거하고 버립니다. 조심스럽게 피펫을 사용하여 버피 코트 (백혈구)와 적혈구 (적혈구 층)를 새롭고 분리 된 튜브로 옮깁니다. </li></ol></li><li> 적혈구의 ICG (1.5 %) 표지 <ol><li> 오염 물질을 제거하기 위해 1x PBS로 적혈구를 씻으십시오. 1x PBS (1 : 1)에 적혈구를 재 침투하여 50 % 헤마토크리트를 만듭니다. 50 % 헤마토크리트 0.5 mL (~ 250 μL 포장 된 적혈구)를 미세 원심 분리 튜브에 넣으십시오. 적혈구를 원심 분리하고 (750 xg, 5 분) 상등액을 버립니다. </li><li> pelleted erythrocytes에 40 % 1x PBS 200 μL를 추가 잘 혼합하고 5 분 동안 실온에서 품어. 적혈구 현탁액에 ICG (1.5 MG / ML)의 100 μL를 추가 튜브 부드럽게 혼합하여 5 분 실온에서 품어. 1x PBS 300 μL를 첨가하고쉐이커 배양기에서 37 ℃로 60 분간 방치 하였다. </li><li> 담체 적혈구 (750 xg, 3 분)를 원심 분리하고 1 ML 1X PBS에 resuspend. </li><li> 상청액이 맑아 때까지 1x PBS로 세포 ~ 3 ~ 5 번 씻으십시오 (1.3.3 단계). 마지막 세척 후 상층 액을 버리고 ICG 표지 된 적혈구의 50 % 헤마토크리트 (1.25 x 10 8 세포 / mL)를 얻기 위해 1 % BSA PBS (1 : 1)를 표지 된 미리 부풀린 적혈구에 첨가한다. </li></ol></li><li> 백혈구의 나트륨 fluorescein (1 %) 표시 <ol><li> 밀도 그라디언트 원심 분리 (단계 1.2.6에서)를 사용하여 혈액에서 버피 코트를 분리 후, 어떤 오염 물질을 제거하기 위해 10 분 동안 450xg에서 원심 분리하여 1x PBS 10 ML로 세포를 한 번 씻으십시오. 1x PBS 900 μL에 펠렛을 Resuspend. </li><li> 백혈구 현탁액의 900 μL에 10 % 나트륨 fluorescein의 100 μL를 추가하고 2 분 동안 실온에서 품어. centrifugi하여 10 ML 1X PBS로 세 번 레이블 세포를 씻으십시오ng (450 xg, 10 분). 100 μL 1X PBS에 세포를 Resuspend. </li></ol></li></ol> 2. 형광 라벨이 붙은 세포의 라이브 영상 <ol><li> ICG 표지 된 적혈구의 라이브 셀 이미징 <ol><li> 꼬리 정맥 또는 역 궤도 경로 를 통한 주사 용 세포를 준비하려면 ICG 표지 된 적혈구의 50 % 헤마토크리트를 1x PBS로 10 배 및 50 배 희석하여 각각 5 % 및 1 % 헤마토크리트 세포를 만듭니다. </li><li> 꼬리 정맥이 팽창하도록 5 분 동안 적외선 (250W 강도) 아래에 마우스를 놓습니다. 마우스를 케타민 하이드로 클로라이드 (50mg / kg)와 크 실라 진 하이드로 클로라이드 (0.5mg / kg)로 복강 내 주사 (여기서는 스케줄 1에 따라 ARVO 지침에 따라)로 마취시킨다. </li><li> 눈의 각 동공을 0.5 % 트로피 아미드와 2.5 % 페닐에 프린 하이드로 클로라이드 한 방울로 증량하십시오. </li><li> 이미징을 위해 콘택트 렌즈를 한쪽 눈 위에 올려 놓습니다. 이미징을위한 매체로 안과 용 젤을 사용하고 건조를 방지하십시오.s의 각막. 마우스 눈의 굴절을 보상하기 위해 + 25 디옵터 렌즈가있는 공 촛점 레이저 스캐닝 검안경 (SLO) 카메라를 수정하십시오. </li><li> 마우스를 SLO 이미징 플랫폼 위에 놓습니다. 마우스의 각막이 SLO 기계의 광학 헤드를 향해 직면하는지 확인하십시오. </li><li> 이미징 모듈을 켭니다. 관련 이미징 모듈 소프트웨어를 사용하여 &quot;New Patient&quot;버튼을 클릭하고 마우스 귀 태그 번호, 생년월일, 형광 염료의 백분율 및 분류 된 세포 유형과 같은 동물 식별 정보를 추가하십시오. <ol><li> 이미징 모듈을 조작하여 동물의 시신경을 이미징 스크린의 중앙에 배치합니다. 관련 이미징 모듈 소프트웨어를 사용하여 &quot;Acquire&quot;버튼을 클릭하여 30 ° 또는 15 ° 앵글 뷰 설정으로 적외선 (IR) 안저 이미지를 가져옵니다. 망막의 중심, 동공 및 레이저의 광학 경로가 최상의 품질의 이미지를 얻기 위해 정렬되어 있는지 확인하십시오. <br/&gt; 참고 : 광학 경로는 조이스틱을 조작하여 가장 선명한 이미지와 최상의 조명 효과를 얻도록 조정됩니다. </li></ol></li><li> ICG 안저 영상을 가져 가라. <ol><li> ICG 필터 (790 nm)를 켜고 30 ° 또는 15 ° 각도로 카메라를 고속 모드로 설정하고 표준화를위한 모든 판독 값에 대해 ICG 밝기를 85로 설정하십시오. 제어판에서 &quot;Acquire&quot;버튼을 클릭하여 1 분 동안 8.8 / 15 프레임 / 초로 비디오 (기본 제어)를 촬영하십시오. </li></ol></li><li> 30 게이지 바늘에 부착 된 인슐린 주사기에 ICG로 표지 된 적혈구 100 μL를 넣으십시오. <ol><li> 꼬리 정맥 경로 를 통한 주사의 경우, 바늘 베벨을 꼬리 정맥에 삽입하십시오. 혈액이 주사기로 역류되었는지 확인하여 정맥 내 접근을 확인하고 혈액 순환 세포에 표식 세포를 주입하십시오. </li><li> retro-orbital 경로를 통한 주입의 경우, 눈에 인접한 바늘을 retro-orbital spac이자형. 주사기에 혈액의 역류를 확인하여 retro - orbital 액세스를 확인하고 순환에 라벨 세포를 주입. </li></ol></li><li> 주입 후 마우스를 재배치하고 IR 안저 영상 (단계 2.1.6.1 참조) 및 비디오를 ICG 필터 (단계 2.1.7.1 참조)로 가져옵니다. 망막 순환에서 라벨 세포는 세포 주입 직후 시각 수 있습니다. </li><li> 비디오 프레임을 획득 한 후 SLO보기 모듈 소프트웨어를 사용하여 비디오를 내보낼 때 .tiff 형식을 선택하여 비디오 시퀀스의 .tiff 이미지를 추출하십시오. 원하는 폴더에 파일을 저장하십시오. </li><li> 콘택트 렌즈를 꺼내 다른 눈 위에 올려 놓고 2.1.4 - 2.1.7 단계에 설명 된대로 이미징을 완료하십시오. </li><li> 이미징 후 마취에서 회복 될 때까지 체온을 유지하기 위해 마취 동물을 적외선 (250W) 아래에 두십시오. 동물이 완전히 회복되면 마우스를 다시 새장에 넣으십시오.</li></ol></li><li> 1 % sodium fluorescein으로 표지 된 백혈구의 라이브 셀 이미징 <ol><li> 마우스를 준비하고 2.1 절의 설명에 따라 장비를 설정하십시오. </li><li> 단계 2.1.4 - 2.1.6에서 설명한대로 마우스를 위치시키고 IR 안저 사진을 찍습니다. <ol><li> 표준화를 위해 모든 판독 값에 대해 30 ° 또는 15 ° 각도보기 및 85에서의 형광 강도를 갖는 고속 카메라 모드의 형광 물질 필터 (488 nm)를 사용하여 마우스의 형광 안저 혈관 조영상을 얻습니다. 8.8 / 15 프레임 / 초 (기준 2.1.7.1 참조)에 비디오 (기준선 제어)를 기록하십시오. 참고 : 여기서 여러 비디오 트랙 (1 분 비디오)이 서로 다른 시간 간격으로 획득되었습니다. </li></ol></li><li> 2.1.8 절에서 설명한대로 꼬리 정맥 또는 역 궤도 주사를 통해 마우스에 100 μL 표지 백혈구를 주사하십시오. </li><li> 주사 직후에 마우스를 위치시키고 IR 안저 영상 (단계 2.1.5 및 2.1.6 참조)과 fluo마우스의 혈관 조영술 재개 (2.2.2 절 참조). </li><li> 이미징 모듈의 초점 노브를 돌려 스캐닝 레이저의 초점을 조정하여 망막 또는 맥락막 혈관의 표시된 세포를 관찰합니다. </li><li> SLO보기 모듈 소프트웨어 (단계 2.1.10 참조)를 사용하여 비디오 프레임과 이미지를 가져 와서 원하는 폴더에 저장하십시오. </li><li> 절차가 끝나면 동물 관리를 위해 2.1.12 단계를 수행하십시오. </li></ol></li><li> MtrackJ 소프트웨어로 이미지 분석 <ol><li> &quot;파일&quot;을 클릭하여 ImageJ에서 이미지 시퀀스를 엽니 다. &quot;가져 오기&quot;를 선택하고 &quot;이미지 시퀀스&quot;를 선택하고 원하는 이미지 폴더를 선택한 다음 &quot;열기&quot;를 클릭하십시오. &quot;시퀀스 옵션&quot;팝업 창이 화면에 나타납니다. &quot;확인&quot;을 클릭하십시오; 이미지 시퀀스가 ​​열립니다. </li><li> &quot;이미지&quot;를 클릭하고 속도 측정을 위해 &quot;속성&quot;을 선택하여 이미지 비디오의 프레임 간격을 설정하십시오. 여기, 8.8 프레임es / s. </li><li> &quot;Plugins&quot;을 선택하여 MTrackJ 플러그인을여십시오. &quot;Tracking&quot;을 선택하고 &quot;MtrackJ&quot;를 선택하십시오. 메뉴가 나타납니다. </li><li> 추적 설정을 조정하려면 메뉴 아래의 &quot;추적&quot;을 선택하고 &quot;점 추가 후 다음 시간 프레임 색인으로 이동&quot;확인란을 선택하십시오. </li><li> 첫 번째 셀을 추적하십시오. <ol><li> 하나의 셀을 찾고 후속 프레임에서 동일한 셀을 추적하십시오. 메뉴에서 &quot;추가&quot;를 클릭하여 새 트랙을 추가하십시오. </li><li> 이미지 위에 커서를 놓고 (+ 기호) 적절한 셀을 클릭하십시오. 참고 : MTrackJ는 자동으로 다음 시간 프레임으로 이동하고 궤도의 첫 번째 점의 위치를 ​​표시하는 작은 원을 추가합니다. </li><li> 이미지 시퀀스의 프레임을 이동하면서 셀의 현재 위치를 계속 클릭합니다. 참고 : 때때로 궤도의 이전 점을 표시하는 원이 현재 위치를 보는 기능을 방해합니다. 이 경우,단계 2.3.5.3.1로 진행하십시오. <ol><li> 메뉴에서 &quot;표시&quot;를 클릭하고 &quot;현재 트랙 포인트 만 표시&quot;옵션을 선택하여 궤적의 표시 옵션을 변경하십시오. 모든 궤도를 보려면이 옵션의 선택을 취소하십시오. </li></ol></li><li> 첫 번째 셀의 궤도가 보일 때까지 계속 클릭하십시오. 그런 다음 &quot;저장&quot;을 클릭하여 트랙을 저장하십시오. </li></ol></li><li> 두 번째 셀을 추적하십시오. <ol><li> 메뉴에서 &quot;추가&quot;를 클릭하여 새 트랙을 시작하십시오. 새 셀을 추적하려면 2.3.5.1 - 2.3.5.4 단계를 반복하십시오. 두 번째 트랙을 저장하려면 &quot;저장&quot;을 클릭하십시오. </li><li> 관찰 된 모든 추적 가능한 셀에 대해이 단계를 계속하십시오. 셀을 추적 한 후 메뉴 탭에서 &quot;측정&quot;및 &quot;확인&quot;을 클릭하여 결과를 가져옵니다. 참고 : 결과 창은 자동으로 열리 며 추후 분석을 위해 스프레드 시트에 저장하고 열 수 있습니다. </li></ol></li></ol></li></ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다. 재정적 또는 이해 상충은 없습니다.

망막 및 맥락막 순환에서 혈류 역학을 연구하는 것은 많은 안구 질환의 병리 생리학을 이해하는 데 중요합니다. 망막 순환에서의 혈류 역학은 Fourier-domain optical coherence tomography (FD-OCT), laser speckle flowgraphy (LSFG) 및 망막 산소 측정법에 의해 연구 될 수있다. 이 방법은 망막 순환에서 총 혈류를 연구하기 위해 다른 접근법을 사용하지만 40 , 41 , <sup c...

망막 및 맥락막 순환에서 혈구의 유동 역학을 연구하면 잠재적으로 시력이 위협되는 안구 질환 및 기타 안구 염증성 질환의 병인을 이해하는 것이 필수적입니다. 그러나 혈장 단백질에 형광 염료를 결합시키는 기존의 혈관 조영술은 적혈구 또는 백혈구의 동력학에 관한 정보를 제공하지 않습니다 1 . 적혈구 망막 혈류 역학은 망막에서의 대사 적으로 효율적인 순환과 다양한 염증 조건에서 세포 이동, 인식, 부착 및 파괴를 이해하기위한 백혈구 유동 역학을 연구하는데 중요합니다 2 . 다양한 세포 유형 3 의 동정과 특성 규명에 사용되는 몇 가지 형광 분자가 있습니다. 혈액 세포의 혈류 역학은 적절한 형광으로 염색하여 측정 할 수 있습니다염료 및 적절한 이미징 기술 적용 4 . 연령 관련 황반변 성 (AMD)과 당뇨 망막 병증 (DR)과 같은 안구 질환에서 염증 반응의 존재는 병변에 림프구가 축적되는 것을 의미합니다 5 , 6 . 조직에서 면역 세포를 추적하면 질병 발병 기전과 관련된 복잡한 사건을 이해하는 데 도움이됩니다. 51 Cr과 125 I와 같은 방사성 동위 원소는 초기 연구에서 세포 추적자로 사용되었다. 이 염료는 독성이 있고 세포 생존 능력에 영향을줍니다. 방사성 마커 3 H와 14 C는 낮은 방출 에너지로 인해 세포에 덜 독성이 있지만 시스템 7,8 에서 신호를 검출하기가 어렵습니다. 여러 가지 형광 염료가 잠재적 인 문제를 극복하기 위해 도입되었습니다.i 방사능 마커 및 형광 현미경 및 유동 세포 계측법을 사용하여 체외에서 림프구 이동 을 추적 9,10 . Hoechst 33342와 thiazole orange는 DNA 결합 형광 염료이며, 생체 내에서 림프구를 추적하는데 사용됩니다 . Hoechst 33342는 DNA의 AT가 풍부한 영역에 결합하고, 막 투과성이며, 2 ~ 4 일 동안 형광 시그널을 유지하며 9 , 10 소실에 내성입니다. Hoechst 33342와 thiazole orange의 단점은 림프구 증식의 억제 11 과 짧은 반감기 9 입니다. (FDA), 2 &#39;, 7&#39;- 비스 - (2- 카르복시 에틸) -5- (및 -6) - 카르복시 플루 오레 신, 아세 톡시 메틸 에스테르 (BCECF-AM), 5- (및 -6) (CFDA) 및 5- (및 -6) - 카르복시 플루 오레 신 디 아세테이트 아세 톡시 메틸 에스테르 (CFDA-AM)림프구 이동 연구에 사용되는 세포질 형광 염료입니다. 그러나 FDA, CFDA 및 CFDA-AM은 세포 내 보유력이 낮습니다 9 . BCECF-AM은 증식 반응을 감소시키고 주 화성 및 과산화물 생산에 영향을 미친다. Calcein-AM은 형광 염료이며 단기 생체 내 림프구 이동 연구 에 유용합니다. 그것은 강한 형광 신호를 방출하고 대부분의 세포 기능을 방해하지 않으며 최대 3 일 동안 형광 신호를 유지합니다 12 , 13 . Fluorescein isothiocyanate (FITC)와 carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFDA-SE)는 공유 결합 형광 염료이며 림프구 이동 연구에 사용됩니다. FITC는 세포 생존 능력에 영향을 미치지 않으며 T 림프구보다 B 림프구에 더 강한 친 화성을 갖는다 14 , 15 </sup&gt;. CFDA-SE 표지 림프구는 8 주 이상 및 8 세포 분열 9 , 16 시간 동안 생체 내에서 추적 할 수 있습니다. C18 DiI (1,1&#39;-dioctadecyl-3,3,3 &#39;, 3&#39;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate), DiO (3,3&#39;-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate), Paul Karl Horan (PKH) 2, PKH3 및 PKH26은 막 - 백혈구 및 적혈구를 표지하기 위해 사용되는 형광 친 지성 카보시 아닌 염료를 삽입한다. C18 Dil과 DiO는 세포막에 결합 될 때 더 높은 신호를 나타내며 상대적으로 독성이 없습니다 12 , 17 . PKH2, PKH3 및 PKH26로 표지 된 세포는 독성이 적은 18 , 19 , 20 , 21 , 22 의 형광 신호를 잘 유지합니다. 그러나, PKH2는 CD62L 발현을 감소시키고 ly를 감소시킨다<html> 림프구 생존율 23 . 상기 언급 된 대부분의 연구는 림프계에서 림프구 이동 및 증식을 추적하고 비 안과 순환에서 표지 된 적혈구를 연구하기 위해 수행되었다. 안과 순환에서 혈액 세포를 연구하기위한 표지 기술을 적용한 연구는 거의 없습니다. 주사 레이저 안검 내시경 (SLO)의 적용은 안저 혈관 조영술 24에 의한 생체 내 망막 및 맥락막 순환 에서 표지 된 세포를 연구하는데 큰 이점이 있습니다. SLG 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 30에 의해 망막 순환에서 백혈구를 연구하는데 사용되는 ICG, 아 크리 딘 오렌지, FITC, 나트륨 플루오 레세 인 및 CFDA와 같은 여러 가지 형광 염료가있다 .class = &quot;xref&quot;&gt; 31 , 32 , 33 , 34 . acridine 오렌지의 광 독성과 발암 성 26 , 27 , 세포 활동과 FITC의 간섭, 망막과 맥락막 혈관의 해상도를위한 혈관 내 조영제의 요구 사항은 생체 내 동물 실험 29 그들의 응용 프로그램을 제한합니다. Sodium fluorescein 및 ICG는 식품 의약품 안전청 (Food and Drug Administration)의 승인을 얻은 무독성이며 인체 검사시 안전합니다 32 , 35 . 유동 역학 연구의 대부분은 백혈구 또는 적혈구의 표지 및 망막 및 맥락막 혈관에서의 시각화와 관련이있다 36 , 37 , 38 , 39 </s업&gt;. 여기, 적혈구의 ICG 라벨링, 백혈구의 나트륨 fluorescein 라벨링, SLO를 사용하여 마우스 망막 순환에서 시각화 된 라벨 세포 추적 표준화 프로토콜을 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>Cardiogreen polymethine dye (Indocyanine green)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>12633-50MG</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein 100 mg/mL</td><td>Novartis</td><td>U1705A/H-1330292</td><td></td></tr><tr><td>10x Phosphate-buffered saline (PBS) Ultra Pure Grade</td><td>1st BASE</td><td>BUF-2040-10X1L</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7906-100G</td><td></td></tr><tr><td>Microtainer tubes with K2E (K2EDTA) - EDTA concentration - 1.8 mg/mL of blood</td><td>BD, USA</td><td>REF 365974</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque 1077 solution</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5810 R</td><td>Eppendorf</td><td>05-413-401</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge tubes 2 mL</td><td>Axygen</td><td>MCT-200-C-S</td><td></td></tr><tr><td>Vortex mixer</td><td>Insta BioAnalytik pte. ltd</td><td>FINE VORTEX</td><td></td></tr><tr><td>Shaker incubator</td><td>Lab Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ceva Ketamine injection (Ketamine hydrochloride 100 mg/mL)</td><td>Ceva</td><td>KETALAB03</td><td></td></tr><tr><td>ILIUM XYLAZIL-20 (Xylazine hydrochloride 20 mg/Ml)</td><td>Troy Laboratories PTY. Limited</td><td>LI0605</td><td></td></tr><tr><td>1% Mydriacyl 15 mL (Tropicamide 1%)</td><td>Alcon&amp;nbsp;Laboratories, Inc. USA</td><td>NDC&amp;nbsp;0998-0355-15</td><td></td></tr><tr><td>2.5% Mydfrin 5 mL (Phenylephrine hydrochloride 2.5%)</td><td>Alcon&amp;nbsp;Laboratories, Inc. USA</td><td>NDC&amp;nbsp;0998-0342-05</td><td></td></tr><tr><td>Terumo syringe with needle 1 cc/mL Tuberculin</td><td>Terumo (Philippenes) Corporation, Philippines</td><td>SS-01T2613</td><td></td></tr><tr><td>Vidisic Gel 10 G</td><td>Dr. Gerhard Mann, Chem.-Pharm, Fabrik Gmbh, Berlin, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alcohol swabs</td><td>Assure medical disposables</td><td>7M-004-L-01</td><td></td></tr><tr><td>Confocal laser scanning angiography system (Heidelberg Retina Angiograph 2)</td><td>Heidelberg Engineering, GmbH, Heidelberg, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hiedelberg Spectralis Viewing Module software, v4.0</td><td>Heidelberg Engineering, GmbH, Heidelberg, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent microscope</td><td>ZEISS</td><td>Model: axio imager z1</td><td></td></tr></tbody></table>

fluorescent dye labeling of erythrocytes and leukocytes for studying the flow dynamics in mouse retinal circulation

망막 및 맥락막 혈류 역학은 녹내장, 당뇨병 성 망막증, 연령 관련 황반변 성 (AMD) 및 기타 안구 염증성 질환과 같은 다양한 안구 질환의 병태 생리 및 후유증에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 또한 눈의 치료 반응을 모니터하는 데 도움이 될 수 있습니다. 표지 세포의 살아있는 세포 이미징과 결합 혈액 세포의 적절한 라벨링, 망막과 맥락 순환에 흐름 역학의 조사 수 있습니다. 여기에서 마우스 적혈구 및 백혈구의 1.5 % indocyanine green (ICG) 및 1 % sodium fluorescein 표지의 표준화 된 프로토콜을 각각 설명합니다. Scanning laser ophthalmoscopy (SLO)는 C57BL / 6J 마우스 (야생형)의 망막 순환에서 표지 된 세포를 시각화하기 위해 적용되었습니다. 두 방법 모두 생쥐 망막 순환에서 특이 적으로 형광 표지 된 세포를 보였다. 이러한 표지 방법은 다양한 안구 질환에서 더 넓은 적용 범위를 가질 수 있습니다모델.

1.5 % ICG로 표지 된 적혈구를 C57BL / 6J 마우스 (야생형)의 망막 순환에서 시각화 하였다. 1.5 % ICG 표지 된 적혈구의 1 % 및 5 % 헤마토크릿 모두 망막 순환에서 구별 할 수 있었다. 그러나 개별 표식 된 세포는 1.5 % ICG 표지 된 적혈구의 1 % 헤마토크리트로 더 명확하게 시각화되었습니다 ( 그림 1 ). 5 % 헤마토크리트에서 망막 혈관의 많은 수의 표식 세포로 ?...

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Fluorescent Dye Labeling of Erythrocytes and Leukocytes for Studying the Flow Dynamics in Mouse Retinal Circulation

안구 혈액 순환에서 표지 된 혈액 세포의 라이브 셀 이미징은 당뇨 망막 병증 및 연령 관련 황반변 성의 염증 및 허혈에 대한 정보를 제공 할 수있다. 망막 순환에서 혈액 세포를 표지하고 표지 된 세포를 영상화하는 프로토콜이 기술되어있다.

마우스 망막 순환에서 유동 역학을 연구하기위한 적혈구 및 백혈구의 형광 염료 표지

The retinal and choroidal blood flow dynamics may provide insight into the pathophysiology and sequelae of various ocular diseases, such as glaucoma, ...

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12.3K 조회수.  Tan Tock Seng Hospital.  안구 혈액 순환에서 표지 된 혈액 세포의 라이브 셀 이미징은 당뇨 망막 병증 및 연령 관련 황반변 성의 염증 및 허혈에 대한 정보를 제공 할 수있다. 망막 순환에서 혈액 세포를 표지하고 표지 된 세포를 영상화하는 프로토콜이 기술되어있다. 

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Intravital Microscopy of the Mouse Brain Microcirculation using a Closed Cranial Window

This experimental model was designed to assess the mouse pial microcirculation during acute and chronic, physiological and pathophysiological hemodynamic, inflammatory and metabolic conditions, using in vivo fluorescence microscopy. A closed cranial window is placed over the left parieto-occipital cortex of the mice. Local microcirculation is recorded in real time through the window using epi and fluorescence illumination, and measurements of vessels diameters and red blood cell (RBC) velocities are performed. RBC velocity is measured using real-time cross-correlation and/or fluorescent-labeled erythrocytes. Leukocyte and platelet adherence to pial vessels and assessment of perfusion and vascular leakage are made with the help of fluorescence-labeled markers such as Albumin-FITC and anti-CD45-TxR antibodies. Microcirculation can be repeatedly video-recorded over several days. We used for the first time the close window brain intravital microscopy to study the pial microcirculation to follow dynamic changes during the course of Plasmodium berghei ANKA infection in mice and show that expression of CM is associated with microcirculatory dysfunctions characterized by vasoconstriction, profound decrease in blood flow and eventually vascular collapse.

Intravital microscopy to follow temporal and spatial hemodynamic and inflammatory events in the pial microcirculation.

휴일 두개골 윈도우를 사용하여 마우스 뇌 엑기스의 Intravital 현미경

This experimental model was designed to assess the mouse pial microcirculation during acute and chronic, physiological and pathophysiological hemodynamic, ...

연구

신경과학

Intravital Video Microscopy Measurements of Retinal Blood Flow in Mice

Alterations in retinal blood flow can contribute to, or be a consequence of, ocular disease and visual dysfunction. Therefore, quantitation of altered perfusion can aid research into the mechanisms of retinal pathologies. Intravital video microscopy of fluorescent tracers can be used to measure vascular diameters and bloodstream velocities of the retinal vasculature, specifically the arterioles branching from the central retinal artery and of the venules leading into the central retinal vein. Blood flow rates can be calculated from the diameters and velocities, with the summation of arteriolar flow, and separately venular flow, providing values of total retinal blood flow. This paper and associated video describe the methods for applying this technique to mice, which includes 1) the preparation of the eye for intravital microscopy of the anesthetized animal, 2) the intravenous infusion of fluorescent microspheres to measure bloodstream velocity, 3) the intravenous infusion of a high molecular weight fluorescent dextran, to aid the microscopic visualization of the retinal microvasculature, 4) the use of a digital microscope camera to obtain videos of the perfused retina, and 5) the use of image processing software to analyze the video. The same techniques can be used for measuring retinal blood flow rates in rats.

Intravital microscopy can be used in animals to visualize and measure retinal vascular diameters, bloodstream velocities, and total retinal blood flow.

Alterations in retinal blood flow can contribute to, or be a consequence of, ocular disease and visual dysfunction. Therefore, quantitation of altered ...

의학

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal environment. Biological activities of immune cells mainly rely on their motility capacities. Blood monocytes have short half-life in the bloodstream; they originate in the bone marrow and are constitutively released from it. In inflammatory condition, this process is enhanced, leading to blood monocytosis and subsequent infiltration of the peripheral inflammatory tissues. Identifying the biomechanical events controlling monocyte trafficking from the bone marrow towards the vascular network is an important step to understand monocyte physiopathological relevance. We performed in vivo time-lapse imaging by two-photon microscopy of the skull bone marrow of the Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP (MacBlue) mouse. The MacBlue mouse expresses the fluorescent reporters enhanced cyan fluorescent protein (ECFP) under the control of a myeloid specific promoter 1, in combination with vascular network labelling. We describe how this approach enables the tracking of individual medullar monocytes in real time to further quantify the migratory behaviour within the bone marrow parenchyma and the vasculature, as well as cell-to-cell interactions. This approach provides novel insights into the biology of the bone marrow monocyte subsets and allows to further address how these cells can be influenced in specific pathological conditions.

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Monocytes are key regulators of innate immunity and play a critical role in the renewal of the peripheral mononuclear phagocytic system and in case of inflammation. This manuscript describes the procedure of real time imaging of the mouse calvaria bone marrow to study the monocyte mobilisation mechanism.

마우스 골수 단핵구를 추적<em&gt; 생체</em

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal ...

면역학 및 감염병학

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, including phagocytosis of damaged synapses or cells, debris, and/or invading pathogens. Impaired phagocytic function has been implicated in the pathogenesis of diseases such as Alzheimer's and age-related macular degeneration, where amyloid-&#946; plaque and drusen accumulate, respectively. Despite its importance, microglial phagocytosis has been challenging to assess in vivo. Here, we describe a simple, yet robust, technique for precisely monitoring and quantifying the in vivo phagocytic potential of retinal microglia. Previous methods have relied on immunohistochemical staining and imaging techniques. Our method uses flow cytometry to measure microglial uptake of fluorescently labeled particles after intravitreal delivery to the eye in live rodents. This method replaces conventional practices that involve laborious tissue sectioning, immunostaining, and imaging, allowing for more precise quantification of microglia phagocytic function in just under six hours. This procedure can also be adapted to test how various compounds alter microglial phagocytosis in physiological settings. While this technique was developed in the eye, its use is not limited to vision research.

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglial phagocytosis is critical for the maintenance of tissue homeostasis and inadequate phagocytic function has been implicated in pathology. However, assessing microglia function in vivo is technically challenging. We have developed a simple but robust technique for precisely monitoring and quantifying the phagocytic potential of microglia in a physiological setting.

망막 미세 아교 식세포의 기능을 평가<em&gt; 생체</em&gt;은 유동 세포 계측법 기반 분석을 사용하여

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent and cause visual impairment and blindness. Understanding how such diseases progress is critical to formulating new treatments. In vivo&#160;microscopy in animal models of disease is a powerful tool for understanding neurodegeneration and has led to important progress towards treatments of conditions ranging from Alzheimer&#39;s disease to stroke. Given that the retina is the only central nervous system structure inherently accessible by optical approaches, it naturally lends itself towards in vivo imaging. However, the native optics of the lens and cornea present some challenges for effective imaging access.
This protocol outlines methods for in vivo two-photon imaging of cellular cohorts and structures in the mouse retina at cellular resolution, applicable for both acute- and chronic-duration imaging experiments. It presents examples of retinal ganglion cell (RGC), amacrine cell, microglial, and vascular imaging using a suite of labeling techniques including adeno-associated virus (AAV) vectors, transgenic mice, and inorganic dyes. Importantly, these techniques extend to all cell types of the retina, and suggested methods for accessing other cellular populations of interest are described. Also detailed are example strategies for manual image postprocessing for display and quantification. These techniques are directly applicable to studies of retinal function in health and disease.

In vivo imaging is a powerful tool for the study of biology in health and disease. This protocol describes transpupillary imaging of the mouse retina with a standard two-photon microscope. It also demonstrates different in vivoimaging methods to fluorescently label multiple cellular cohorts of the retina.

경동공 이광자 마우스 망막의 생체 내 이미징

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

Recent advances in protein biology and mouse genetics have made it possible to measure intracellular calcium fluctuations of brain cells in vivo and to correlate this with local hemodynamics. This protocol uses transgenic mice that have been prepared with a chronic cranial window and express the genetically encoded calcium indicator, RCaMP1.07, under the &#945;-smooth muscle actin promoter to specifically label mural cells, such as vascular smooth muscle cells and ensheathing pericytes. Steps are outlined on how to prepare a tail vein catheter for intravenous injection of fluorescent dyes to trace blood flow, as well as how to measure brain pericyte calcium and local blood vessel hemodynamics (diameter, red blood cell velocity, etc.) by two photon microscopy in vivo through the cranial window in ketamine/xylazine anesthetized mice. Finally, details are provided for the analysis of calcium fluctuations and blood flow movies via the image processing algorithms developed by Barrett et al. 2018, with an emphasis on how these processes can be adapted to other cellular imaging data.

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

This protocol presents steps to acquire and analyze fluorescent calcium images from brain ensheathing pericytes and blood flow data from nearby blood vessels in anesthetized mice. These techniques are useful for studies of mural cell physiology and can be adapted to investigate calcium transients in any cell type.

생체 내 트랜스제닉 마우스의 뇌 성 구체 칼슘 및 혈역학 이미징

Recent advances in protein biology and mouse genetics have made it possible to measure intracellular calcium fluctuations of brain cells in vivo and to ...

Dynamic Measurement and Imaging of Capillaries, Arterioles, and Pericytes in Mouse Heart

Coronary arterial tone along with the opening or closing of the capillaries largely determine the blood flow to cardiomyocytes at constant perfusion pressure. However, it is difficult to monitor the dynamic changes of the coronary arterioles and the capillaries in the whole heart, primarily due to its motion and non-stop beating. Here we describe a method that enables monitoring of arterial perfusion rate, pressure and the diameter changes of the arterioles and capillaries in mouse right ventricular papillary muscles. The mouse septal artery is cannulated and perfused at a constant flow or pressure with the other dynamically measured. After perfusion with a fluorescently labeled lectin (e.g., Alexa Fluor-488 or -633 labeled Wheat-Germ Agglutinin, WGA), the arterioles and capillaries (and other vessels) in right ventricle papillary muscle and septum could be readily imaged. The vessel-diameter changes could then be measured in the presence or absence of heart contractions. When genetically encoded fluorescent proteins were expressed, specific features could be monitored. For examples, pericytes were visualized in mouse hearts that expressed NG2-DsRed. This method has provided a useful platform to study the physiological functions of capillary pericytes in heart. It is also suitable for studying the effect of reagents on the blood flow in heart by measuring the vascular/capillary diameter and the arterial luminal pressure simultaneously. This preparation, combined with a state-of-the-art optic imaging system, allows one to study the blood flow and its control at cellular and molecular level in the heart under near-physiological conditions.

Presented here is a protocol to study the coronary microcirculation in living murine heart tissue by ex vivo monitoring of the arterial perfusion pressure and flow that maintains the pressure, as well as vascular tree components including the capillary beds and pericytes, as the septal artery is cannulated and pressurized.

마우스 심장의 모세혈관, 동맥 및 페리사이클의 동적 측정 및 이미징

Coronary arterial tone along with the opening or closing of the capillaries largely determine the blood flow to cardiomyocytes at constant perfusion ...

Measuring Retinal Vessel Diameter from Mouse Fluorescent Angiography Images

It is important to study the development of retinal vasculature in retinopathies in which abnormal vessel growth can ultimately lead to vision loss. Mutations in the microphthalmia-associated transcription factor (Mitf) gene show hypopigmentation, microphthalmia, retinal degeneration, and in some cases, blindness. In vivo imaging of the mouse retina by noninvasive means is vital for eye research. However, given its small size, mouse fundus imaging is difficult and might require specialized tools, maintenance, and training. In this study, we have developed a unique software enabling analysis of the retinal vessel diameter in mice with an automated program written in MATLAB. Fundus photographs were obtained with a commercial fundus camera system following an intraperitoneal injection of a fluorescein salt solution. Images were altered to enhance contrast, and the MATLAB program permitted extracting the mean vascular diameter automatically at a predefined distance from the optic disk. The vascular changes were examined in wild-type mice and mice with various mutations in the Mitf gene by analyzing the retinal vessel diameter. The custom-written MATLAB program developed here is practical, easy to use, and allows researchers to analyze the mean diameter and mean total diameter, as well as the number of vessels from the mouse retinal vasculature, conveniently and reliably.

Mouse retinal vasculature is particularly interesting in understanding the mechanisms of vascular pattern formation. This protocol automatically measures the diameter of mouse retinal vessels from fluorescent angiography fundus images at a fixed distance from the optic disk.

Mouse Fluorescent Angiography 이미지에서 망막 혈관 직경 측정

It is important to study the development of retinal vasculature in retinopathies in which abnormal vessel growth can ultimately lead to vision loss. ...

Monitoring Dynamic Growth of Retinal Vessels in Oxygen-Induced Retinopathy Mouse Model

Oxygen-induced retinopathy (OIR) is widely used to study abnormal vessel growth in ischemic retinal diseases, including retinopathy of prematurity (ROP), proliferative diabetic retinopathy (PDR), and retinal vein occlusion (RVO). Most OIR studies observe retinal neovascularization at specific time points; however, the dynamic vessel growth in live mice along a time course, which is essential for understanding the OIR-related vessel diseases, has been understudied. Here, we describe a step-by-step protocol for the induction of the OIR mouse model, highlighting the potential pitfalls, and providing an improved method to quickly quantify areas of vaso-obliteration (VO) and neovascularization (NV) using immunofluorescence staining. More importantly, we monitored vessel regrowth in live mice from P15 to P25 by performing fluorescein fundus angiography (FFA) in the OIR mouse model. The application of FFA to the OIR mouse model allows us to observe the remodeling process during vessel regrowth.

This protocol describes a detailed method for the preparation and immunofluorescence staining of mice retinal flat mounts and analysis. The use of fluorescein fundus angiography (FFA) for mice pups and image processing are described in detail as well.

산소 유발 망막병증 마우스 모델에서 망막 혈관의 동적 성장 모니터링

Oxygen-induced retinopathy (OIR) is widely used to study abnormal vessel growth in ischemic retinal diseases, including retinopathy of prematurity (ROP), ...

생물학

Intravital Microscopy to Study Platelet-Leukocyte-Endothelial Interactions in the Mouse Liver

Inflammation and thrombosis are complex processes that occur primarily in the microcirculation. Although standard histology may provide insight into the end pathway for both inflammation and thrombosis, it is not capable of showing the temporal changes that occur throughout the time course of these processes. Intravital microscopy (IVM) is the use of live-animal imaging to gain temporal insight into physiologic processes in vivo. This method is particularly powerful when assessing cellular and protein interactions within the circulation due to the rapid and sequential events that are often necessary for these interactions to occur. While IVM is an extremely powerful imaging methodology capable of viewing complex processes in vivo, there are a number of methodological factors that are important to consider when planning an IVM study. This paper outlines the process of conducting intravital imaging of the liver, identifying important considerations and potential pitfalls that may arise. Thus, this paper describes the use of IVM to study platelet-leukocyte-endothelial interactions in liver sinusoids to study the relative contributions of each in different models of acute liver injury.

Intravital microscopy is a powerful tool that provides insight into both the temporal and spatial relationships of rapid and/or sequential processes. Herein, we describe a protocol to assess both protein-protein interactions and platelet-neutrophil-endothelial interactions in liver sinusoids in a murine model of experimental sepsis (endotoxemia).

Inflammation and thrombosis are complex processes that occur primarily in the microcirculation. Although standard histology may provide insight into the ...

마우스 망막 순환에서 유동 역학을 연구하기위한 적혈구 및 백혈구의 형광 염료 표지

요약

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