この手順の全体的な目標は、ヒト末梢血における内因性LRRK2キナーゼ活性を評価する方法を提供することにある。これは、マイケルJ.フォックス財団のホスホ特異的なRabモノクローナル抗体を採用して、RABタンパク質のLRRK2媒介リン酸化を監視することによって達成される。ここでは、Rab2とRab10の両方の高い発現レベルを有する均質な部位集団を構成するヒト末梢血好中球に焦点を当てる。
好中球の分離は、終了したアクションの40分以内に99%の純粋で生存可能な好中球の分離を可能にし、同時に高い量のタンパク質レベルを生み出すという否定的な選択に基づいています。採血管に10ミリリットルの血液を集める。チューブを7~8回反転してやさしく混ぜます。
血液10ミリリットルを50ミリリットルの円錐管に移す。EDTAストック溶液1、0.1モルEDTA PBS溶液の血液100マイクロリットルに加え、穏やかに混合する。500マイクロリットルの分離カクテルを加え、好中球分離キットから全血サンプルに1ミリリットルあたり50マイクロリットルを加えます。
非常に微細な磁気ビーズを再懸濁させるために、使用前に30秒間、好中球分離キットからの磁気ビーズを渦。血液サンプルに500マイクロリットルの磁気ビーズを加え、チューブを数回反転して穏やかに混ぜます。室温で5分間インキュベートします。
EDTAストック溶液2でチューブを50ミリリットルまで上げる。これは、1ミリモルEDTA PBS溶液です。2~3回上下にピペットを軽く入れ込んで混ぜます。
チューブをマグネットに入れ、蓋を取り外してチューブのその後の攪拌を避けます。室温で10分間インキュベートします。慎重にピペット濃縮細胞懸濁液は、新しい50ミリリットル円錐管に好中球を含みます。
磁石に接触しているチューブの側面に触れないようにし、チューブの底部にある赤血球の採取と摂動を避けてください。約10ミリリットルの赤血球懸濁液をチューブの底に残します。渦磁気ビーズは使用前に30秒間、濃縮された好中球を含むチューブに0.5ミリリットルの磁気ビーズを加えます。
管を逆にしてやさしく混ぜます。室温で5分間インキュベートします。チューブを磁石に入れ、蓋を取り外して、その後の動揺を避けます。
室温で5分間インキュベートします。新しい50ミリリットル円錐形チューブに好中球を含む濃縮細胞懸濁液を慎重にピペット。磁石に接触しているチューブの側面に触れないでください。
チューブの底部に約5ミリリットルの懸濁液を残します。細胞混合物から磁気ビーズを完全に除去するために、濃縮された細胞を含むチューブを磁石に入れます。室温で10分間インキュベートします。
新しい50ミリリットルの円錐形の管に今純粋な好中球を含んでいる濃縮された細胞懸濁液を慎重にピペット。磁石に接触しているチューブの側面に触れないでください。チューブの底部に約5ミリリットルの懸濁液を残します。
1ミリモルEDTAストック溶液2で単離した細胞を約41ミリリットルの最終体積に上げる。ピペットを上下に混ぜ合わせます。各チューブに約20ミリリットルの2つのチューブに溶液を均等に分割します。
遠心分離機は両方のチューブを335Gで5分間行う。遠心分離工程中、MLi-2インヒビターストックを取り、マイナス80度冷凍庫から200マイクロモルスラッシュ1000X濃度を取り、その後の使用のために室温で放置する。遠心分離ステップの直後とチューブの攪拌なしに、好中球ペレットを乱すことなく上清を注ぎます。
細胞ペレットを上下に4回軽くピペット処理して、10ミリリットルの細胞培養培地を室温で再懸濁させる。1つのチューブDMSOと他のチューブMLi-2にラベルを付けます。DMSOラベルチューブには、DMSOの10マイクロリットルを追加し、混合するために上下に穏やかにピペットすることにより、200マイクロモルMLi-2ストック溶液の10マイクロリットルを追加します。
室温で30分間サンプルをインキュベートする。インキュベーション期間中は10分ごとに反転してやさしく混ぜます。30分間のLRRK2キナーゼ阻害剤治療中に、マイナス80度冷凍庫から0.5モルDIFPストック溶液を取り除き、氷の上のヒュームフードに入れる。
その後、ミクロシスチン-LRストック溶液当たり1ミリグラムをマイナス80度冷凍庫から移動し、室温で解凍します。アリコートを解凍し、0.25ミリリットルのリシスバッファーを冷凍庫から取り出し、室温で解凍し、その後使用するために氷の上に置きます。DMSOの1マイクロリットルを含むRPMI培地の1ミリリットルをこのDMSO再懸濁液バッファーと呼んで準備します。
200マイクロモルMLi-2または代替LRRK2キナーゼ阻害剤の1マイクロリットルを含むRPMI培地の1ミリリットルを調製し、このMLi-2リサスペンションバッファーを呼び出します。30分間のインキュベーション期間の後、遠心分離機は、前と同様に5分間、335Gで両方のチューブを。慎重に好中球ペレットを乱すことなく、各チューブ内の上清を捨てます。
DMSO標識チューブの場合、1ミリリットルのDMSO再懸濁液バッファーにペレットを静かに再懸濁させます。そして、MLi-2標識チューブの場合、MLi-2リサスペンションバッファーの1ミリリットルにペレットを再懸濁します。DMSOとMLi-2と遠心分離チューブを3分間335Gでラベル付けされた対応する遠心管に再懸濁した細胞ペレットを移管する。
遠心分離工程中に、リシスバッファーを調製する。ヒュームフードには、0.5モルDIFP溶液の0.25マイクロリットルと、0.25ミリリットルの溶解バッファーに1ミリグラムの0.25マイクロシスチン-LRを慎重に追加します。混ぜて氷の上に置いておいて使います。
遠心分離の直後に、慎重かつ完全にピペットですべての上清を除去し、好中球ペレットを乱さず、氷の上にチューブを置きます。DIFPおよびマイクロシスチン-LRを含む100マイクロリットルのライシスバッファーを各チューブに直ちに加えます。100~200マイクロリットルのピペットを使用し、約5〜10回上下にピペットを作って細胞ペレットを再懸濁する。
10分間氷の上に細胞を置きます。その後、遠心管を20,000倍Gで4°Cで15分間15分間、細胞の破片を除去する。好中球溶菌を含むDMSOおよびMLi-2上清を新しい遠心管に移す。
破片ペレットを捨てる。好中球の球体の乾燥物は使用の準備ができているか、液体窒素で凍結し、将来の分析のためにマイナス80度で保存することができる。このグラフは、一般に公開されているインポートデータベースからのデータを用いて、LRRK2およびRab10タンパク質の豊富さがヒト末梢血中好中球および単球において特に高いことを示している。
この手順でヒト末梢血好中球を単離すると、細胞の高い不純な収率が得られます。上の表は、3人の健常ドナーからの末梢血10ミリリットルから単離された細胞の総数を示す。また、単離された細胞の純度および生存率、ならびに全タンパク質のリセート収量も示される。
LRRK2キナーゼ阻害剤の有無にかかわらず処理した後、MLi-2は、好中球は強力なプロテアーゼ阻害剤、DIFPの存在下で溶菌される。左側の図Bについて、1レーン当たりの全細胞抽出物の10マイクログラムを、示された抗体を用いて多重定量免疫ブロット分析を行った。右の図Cは、タンパク質分解の防止、特に大型LRRK2タンパク質のDIFPの重要性を示しています。
それに比べて、PMSFの高濃度は単独ではあまり効果的ではない。ここで、LRRK2制御のRab10リン酸化は、コントロールと比較して、異種性VPS35 D620N突然変異を有する遺伝性パーキンソン病患者に由来する末梢血好中球において約3倍有意に増加することを示した。上のグラフは、マルチプレックスイムノブロット分析及び底部、その定量を示す。
これはVPS35 D620N突然変異が、まだ未知のメカニズムによって活動のLRRK2キナーゼ経路を活性化することを示唆している。要約すると、ヒト末梢由来好中球におけるRab10などのRabタンパク質リン酸化をモニタリングすることによってLRRK2キナーゼ経路活性を測定するためのファシリティと堅牢なアッセイを提示し、この方法はLRRK2経路活性を評価し、突然変異、疾患状態または阻害剤がLRRK2経路活性を調節する方法を決定することを可能にする。
