This work was supported by the Committee Technology and Innovation (CTI) Switzerland grant 14796-PFLS-LSCTI. MicroPost arrays were generously provided by MicroDuits GmbH.

マイクロポストアレイ上の1細胞を培養します注：すべての手順は、無菌性を確保するために、バイオセーフティキャビネット内で実行する必要があります。ここで指定したボリュームは、T25細胞培養フラスコのためのものです。細胞培養培地レシピ及び細胞播種密度は、骨癌細胞株HuO9およびM132のために最適化されます。 <ol><li>マイクロポストアレイ上に播種するための細胞培養を準備します。 <ol><li>標準光顕微鏡で培養フラスコを配置することによって、細胞培養の品質を検査します。細胞がカバーされているどのくらいの培養フラスコの底部の推定し、典型的な成長と形態を示していることを確認してください。 70％-80％のカバレッジが健全な成長率を反映しています。彼らは死んだ細胞および/または過成長文化を表すとして、浮遊細胞の量に注意してください。 </li><li> 4ミリリットル1×リン酸を含む培地と洗浄を除去することにより、トリプシン処理細胞を、生理食塩水（PBS）のバッファをバッファリング。 0.8ミリリットル1×トリプシン/エチレンジアミン四酢酸（EDTA）を追加し、セルまで室温でインキュベートSは約2〜4分をとる、取り除きます。顕微鏡でプロセスを確認し、時折脱落をサポートするために、静かにフラスコをタップします。 </li><li> 5 mlの細胞培養培地（ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、10％ウシ胎児血清（FBSと/ F12）、1％ペニシリン/ストレプトアビジン（ペニシリン/ストレプトマイシン））反応を停止し、じっと座って残留細胞を洗浄するための追加フラスコの底に。その後、均一な混合物を得るために上下に数回この懸濁液をピペット。効果的な脱落を得るために、フラスコの元の成長分野全体のすべてのソリューションをピペッティングすることを確認します。 </li><li> 15mlチューブに細胞懸濁液を移し、3分間0.5×gでテーブルトップ遠心分離器を使用して遠心します。 </li><li>上清を除去し、ピペッティングによって、および5回上下5 mlの培地中で細胞ペレットを再懸濁。そうすることながら、気泡の発生を回避することを確認します。 </li><li>細胞計数チャンバと光microscoを使用して、細胞密度を決定しますPE。細胞集合体のための細胞計数チャンバー内の細胞懸濁液を確認し、その後の実験のために、単一の細胞を持っていることを確認します。ピペット再び数回上下細胞は、それらを分離するために凝集体を形成する傾向がある場合。 </li><li> 25,000細胞/ mlの細胞溶液を得るために十分な培地で細胞懸濁液を希釈します。閉じたチューブを数回反転させてそれをよく混ぜます。 </li></ol></li><li>細胞播種のためのマイクロポストの配列を準備します。 クリティカル注：これは、潜在的に不要な気泡が導入されている場合は特に、マイクロポストに害を及ぼす可能性があるので、直接マイクロポストアレイ上にピペットしないでください。また、発生する毛管力はマイクロポストの崩壊につながるとして、マイクロポストの配列が乾燥することはありませんことを確認してください。 <ol><li>ピンセットを用いて、12ウェルプレートのウェルに表向きにし、1 mlのエタノール（99％）を加えることにより、それを湿らマイクロポストのアレイを有するガラス基板を配置します。 20〜30秒間、室温でインキュベートします。 </li><li>希エタノールウェル側に約1 mlの滅菌脱イオン水（DI水）を添加し、トランスファーピペットまたは吸引装置を用いて、およそ1 mlで吸引することにより、段階的。このステップを少なくとも3回繰り返します。 </li><li>約1mlを添加し、吸引することにより、同様にPBS緩衝液で脱イオン水を交換してください。このステップを3回繰り返します。 </li><li>追加し、約1mlの培地を吸引することにより、媒体とPBS緩衝液を交換してください。このステップを3回繰り返します。 </li></ol></li><li>各準備マイクロポストの配列の上にピペット1ミリリットルの細胞溶液（25,000細胞）。クローズマルチウェルプレートインキュベーター（5％CO 2、37℃）に移します。細胞が付着し、6 -7時間、マイクロポストの上に成長しましょう​​。 </li><li>光学顕微鏡を用いて、時折接着プロセスを検査します。細胞のほとんどは、複数のマイクロポストにまたがって表示されていることを確認してください。 </li></ol> 2.細胞を固定＆染色注：すべてのステップとここで指定したボリュームは、12ウェルプレートの1ウェルのためのものです。これは、マイクロポストの崩壊につながるであろう、任意の液体を吸引した後、ウェルの乾燥を避けるために、一度に12のウェルの4以上ないを処理することをお勧めします。 <ol><li>ウェルから培地を吸引し、洗浄細胞を1 mlのPBSバッファーで2倍。インキュベーション中にマイクロポストアレイ上に蓄積された細胞破片を除去し、死細胞を分離するために、PBSで洗浄しながら緩やかな力を適用することを確認します。 </li><li> 5分間0.5ミリリットル3.7％緩衝ホルムアルデヒド溶液で細胞を固定してください。 </li><li> 1ミリリットルの滅菌DI水でマイクロポストアレイ2回洗浄することにより、ホルムアルデヒド溶液を交換してください。 </li><li>約90秒間（50％水、40％エタノールおよび10％酢酸中0.05％クマシーブリリアントブルー）染料で細胞を染色します。 1ミリリットルの滅菌脱イオン水で2回オフ余分な染色液を洗います。配列をマイクロポストする1ミリリットルのDI水を追加します。 </li><li>光顕微鏡を用いて染色結果を確認してください。繰り返しトン細胞体を可視化するにはあまりにもかすかであるならば、彼は、ステップを染色します。 </li><li> 4℃の冷蔵庫内で上に染色された細胞を用いた店舗マイクロポストアレイ。すべての回で水の下でそれらを保つために確認してください。 </li></ol> 3.細胞イメージング注：ステップ4は、無限遠補正された光学顕微鏡なしに適用されます。 <ol><li>高分解能イメージングのための薄いガラス底部を有するペトリ皿に2ミリリットルの脱イオン水を追加します。 </li><li>マイクロポストを上に向けてイメージング皿にピンセットを使用して、マイクロポストのアレイを転送します。 </li><li>光学顕微鏡の可動ステージ上の画像ペトリ皿を置きます。 </li><li>スケールの数は、ガラス基板、シリコーンエラストマーと上に液体の屈折率の不整合を補償するための光路に沿ってすべての材料の厚さの合計を表しまで、イメージングのために使用されるレンズの補正リングを回します。これは、マイクロポストの明るい外観につながるはずコア。 </li><li>ダウン50％への照明側の絞りを閉じ、通常の明視野モードを有効光路から任意の位相差リングを取り外します。 </li><li>マイクロポストは、観察視野を横切って水平線を形成するマイクロポストの配列の位置を合わせます。開始点（例えば、左上）を定義し、多数の画像を撮影しながら、マイクロポストの配列を走査し、ステージ全体でペトリ皿を段階的に移動します。 </li><li> 20Xや40X対物レンズを使用してカメラの最高解像度が設定されたすべての画像を取ります。画像の中央に1つのセルを持つことを目指しています。 </li><li>マイクロポストの先端が焦点になるまで基板を介してz軸に沿ってスイープ。顕微鏡の微調整フォーカスホイールを使用し、約2〜3ミクロンのためのマイクロポストの底に焦点を当てた方にそれを回します。 </li><li>露光時間、例えば、（一度に一つのパラメータの撮像を掃引する1つの配列セクションのテスト一連の画像を撮影することにより、標準的なイメージング手順を確立し、）、ランプ等の設定を設定するアイリス。 MechProfilerで画像を分析し、高速で信頼性の高い分析に適したパラメータセットを決定します。 </li></ol>オープンソースソフトウェア「MechProfiler「4.画像解析注：すべてのソフトウェア機能は、マウスの左ボタンを使用して、ポインティングデバイスを用いて活性化することができます。しかし、訓練を受けたオペレータは、効率的な両手の画像処理を可能にするために、キーボードの左半分になるように設計、文書化のショートカットキーを使用します。 <ol><li>画像解析ソフトウェアMechProfilerを起動し、「開く」をクリックして分析する必要がある画像の範囲を開きます。 </li><li>ソフトウェア開発者によって与えられた「設定」セクションにすべてのパラメータを挿入します。カスタムソフトウェアのマニュアルにより詳細に記載された手順に従って（ すなわち、輪郭しきい値と最小距離）に設定する必要があるパラメータを決定します。 </li><li>画像を分析一つ一つ「クロップ」を使用して関心領域にそれらをトリミングすることによって（マウスボタンをクリックしてドラッグを押下）です。このアクションを完了するために描かれた長方形の内側をダブルクリックします。 </li><li> 「セルの枠線の描画」とセルが接続されているすべてのマイクロポストを含む描画に十字カーソルを使用をクリックすることで、それぞれの可視セルのアウトライン一つ一つをマーク。 </li><li> 「廃棄投稿」をクリックすることにより、不要なマイクロポストを破棄し、描画するための十字カーソルを使用しています。画像セクションの外のセルに属しているか、それは他の理由ではなく、目的の細胞によって偏向されているすべてのマイクロポストを囲みます。 </li><li>マウスクリックにより「重心を探す「ソフトウェアサブルーチンを起動します。右横に中央に赤い×印で表示されているすべてのマイクロポストが登録されるまで、「重心を検索」ボタンへのフィルタ設定を調整します。フィルタ設定が低すぎると、それは高すぎるムーであればマイクロポストは、無視されますltiple位置は、単一のマイクロポストのためにマークされます。分析セッションの間に一定のフィルタ設定をしてください。 </li><li>複数または逃したマイクロポストの位置に重心のマニュアル編集機能「手動編集」を使用してください。クリックして、それを越えてドラッグすることで、問題のマイクロポストを選択するために、マウスの十字線を使用してください。長方形の内側をダブルクリックして、自動的に閉じ拡大画像]セクションに不足している赤いマーカーを配置します。それが描かれたセルの輪郭の外側にある場合は先に進む前に、（ステップ4.5を参照）、このようなマイクロポストを捨てます。 </li><li>マウスクリックで「グリッドの生成」機能を活性化することにより、理想的なマイクロポストのグリッドを検索します。位置が描かれたセルアウトラインの内側、青いリングによって示される、真のマイクロポストのヘッドに対応することを確認してください。 </li><li>マウスクリックで対応する「マヌエル編集」機能を使用して、必要に応じ、セル領域内の任意の見当違いのグリッドメーカーを修正してください。クにマイクロポストを選択するために十字を使用して、クリックして、それを越えてドラッグしestion。登場する四角形の内側をダブルクリックして、自動的に閉じ拡大画像]セクションに不足している青色のマーカーを配置します。 </li><li>画像部と、生成された理想的なグリッド内部のマイクロポストの位置との差に基づいて算出された偏差値のヒストグラムを取得するためにクリックしマウスでボタン「計算たわみ &quot;を使用してください。 </li><li> 「保存」をマウスでクリックすることにより、値のテーブルを含む完全な分析を保存します。 </li><li> 「表示をリセット」と「次の画像」上の他の画像部分やマウスのクリックを分析し、便利な右のキーボードのカーソルキーを使用して行うことができるをクリックすることで、どちらかの画像解析を続行します。 </li></ol> 5.データ分析 - Mechanoprofiling <ol><li>分析画像をフォルダからオフィススプレッドシートプログラムでファイル &quot;results.xls」を開きます。それはアルとのデータが含まれていますlは分析された細胞によってすべてのマイクロポストのたわみや、仕事などの標準的な微分措置を含む値（ すなわち、基板の変形エネルギー）を算出しました。 </li></ol>

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The lead author (NG) is co-founder of MicroDuits GmbH, the commercial supplier of the micropost arrays used in this study. No other authors have any potential conflicts of interest with this work.

この作品は、実質的にエントリへの技術的、実用的な障壁を下げることによって牽引力顕微鏡の分野を進めることを目指しています。これらの障壁は、二つの側面から来ます。まず第一に再現可能に製造し、実験的にマイクロポストの配列を委託するために克服しなければならない多数の非自明な技術的課題があります。典型的な実験は、細胞の数百または数千もの分析を必要とするかもし?...

メカノ敏感な細胞ベースのアッセイは、メカニックが細胞生物学でプレーすることができます中心的な役割を反映して、幅広いアプリケーションで、接着細胞を調査することを可能にします。これらのアプリケーションは、多くの場合、細胞内プロセスまたは全細胞の挙動を駆動機序に焦点を当てています。一方、このような細胞外マトリックス組成物またはマトリックスの剛性などの外部環境要因が劇的に細胞の機械的および生物学的応答に影響を与えることができる。1同様の薬学的に活性な化合物の多くのクラスの使用後に観察することが可能である効果がそれらの多くの場合、細胞培養モデルを用いて特徴づけ、そのような自発的または実験的に誘導され、遺伝子の突然変異によって引き起こされるもののような一方の遺伝子型の性質上2を 、細胞骨格の構造および機能の変化と関連している細胞の表現型の著しい変化を誘導することができる。3これらの実施例は、あります多くの可能なのほんの一部トピックれる細胞の機械的な表現型が関連しており、これらの全てが有用マイクロポストのアレイで検討されています。 この記事の執筆時点では、約200の記事は、細胞マイクロポストの相互作用を記述する公開されています。これらの作品は、マイクロポスト偏向原則の理論的側面だけでなく、その製造上の実際的な手順について説明します。細胞や柔軟なマイクロポストアレイの相互作用を記述した最初の記事は、連続する軟質基板はnanonewton規模細胞収縮、タンらを推定するために使用されている古典的な牽引力顕微鏡（TFM）とは対照的に、2003年4タンらによって発表されました。シリコーンエラストマー製の複数の近接した垂直方向のビームを使用する方法を記載しています。この技術の主な利点は、2つの主要な特徴から出てきます。維持しつつ、第1セル見かけ基板の剛性を変更するために、1つは、マイクロポストの寸法を変更する必要がありますそれ以外の場合は一定のため、表面トポロジーと化学の違いを回避基質組成物。第二マイクロポストは、離散的に個々の焦点接着のために力と空間分解能で分析することができ、標準的なTFMにより類似の分析に固有の分析の課題を減らすことができ、個々のバネのように作用します。 今日マイクロポストアレイの適用範囲が大幅にいくつかの単一細胞のための力のほんのマッピングを超えています。たとえば、秋山は、昆虫の筋肉のパワーで動く自律マイクロロボットを開発するために、マイクロポストアレイ用アクチュエータとして蛾の毛虫から分離された背側の血管組織の使用を報告している。5 しかし、マイクロポストのほとんど公開された出願は、感染症や癌のような医学的状態の研究に焦点を当てています。例えば、マイクロポストアレイは、ナイセリアgonorrhのバンドルIV型線毛の力発生を研究するために使用されています感染を増強するシグナルカスケードに関連しているOEAコロニー6その他の細胞骨格を標的とする医薬化合物で処理された乳癌細胞を研究するためにマイクロポストを使用している。7 マイクロポストのたわみは、多くの場合、細胞のみをマイクロポストの非常に先端に取り付けられていると仮定すると、エンド負荷のカンチレバーのための古典的なビーム理論を用いて説明します。たわみδが発生する 。ここで適用される力 F は、マイクロポストの「曲げ剛性」Kに依存して計算され： <img alt="式（1）" src="/files/ftp_upload/53350/53350eq1.jpg" /> （1） Eと、I、およびLは、ヤング率が、それぞれ慣性ビーム長の面積モーメントです。ビームは剪断および曲げだけでなく、基板の反りがACに入れないので、この式の結果は、仕事だけで力の一般的な近似を与えますカウント。マイクロポストは、典型的には、ポリジメチルシロキサン（PDMS）のような軟質材料から作られていることを考慮すると、シリコーンゴムをベースこれらの要因が含まれる必要があります。 。シェーンらは、マイクロポストのアスペクト比（L / D）と、対応するポリマーのポアソン比 Vに基づいて、そのような補正係数があることを実証した8これは、で与えられます。 <img alt="式（2）" src="/files/ftp_upload/53350/53350eq2.jpg" /> （2） T チルト（v）は 、同じ記事で見つけることができるようにフィッティングパラメータa = 1.3が含まれて傾斜係数であることで： <img alt="式3" src="/files/ftp_upload/53350/53350eq3.jpg" /> （3） それがマイクロポストの補正後の剛性 k CORRは、純粋な曲げ剛性 k = k個の曲がり補正係数CORRの製品であることを意味しますで与えられます： <img alt="式（4）" src="/files/ftp_upload/53350/53350eq4.jpg" /> （4） したがって、細胞力の計​​算は、現在読んで、式（1）の、より洗練された変化を使用して実行されるべきです。 <img alt="式（5）" src="/files/ftp_upload/53350/53350eq5.jpg" /> （5） 補正の影響はすぐにマイクロポストの大きさの標準値が使用されているように、より明白になります。例えば、円形の断面とPDMSベースのシリコーンゴム製の5ミクロンの直径15ミクロン、長マイクロポストは、0.77の補正係数をもたらし、したがって、未補正の計算は、23％によって及ぼされる細胞力を過大評価するであろう。これは、より小さなアスペクト比を有するマイクロポストのためにさらに深刻になります。 伝統的には、マイクロポストの画像分析は、理想的なビーム曲げ理論に基づいています。 2005年にMICRの使用を開拓グループOPOSTアレイは、マイクロポスト解析に適した画像解析ソフトウェアを発表した9ソフトウェアは、ソフトウェアライセンスを必要とし、ユーザーはそれぞれの位置のための3つの画像を取る必要があります。送信モードと染色された細胞で蛍光モードで別の1でマイクロポストの上部と下部の平面から一つずつ。それぞれに上部と下部の位置を比較した後、ソフトウェアが力のベクトル場を決定し、ポストあたりの力のような関連パラメータを計算するマイクロポスト。他のソフトウェア・パッケージが存在し、彼らの分析の原則を簡単にそれらを記述し、対応する記事に記載されているが、これらの解析ソフトウェアパッケージは、一般公開されていません。10,11 マッピングセル力のために設計されマイクロポストのアレイは、全ての隣接マイクロポストの間に等距離ギャップの利点を有する後者の直交マイクロポストのレイアウトや六角形一つであることのいずれかに分類することができます。典型的なマイクロポストヘクタール円形断面をまし、それらの寸法は、長さ50μmの直径及び2に1.0ミクロンから10ミクロンの範囲にある。4しかし、楕円形または正方形の断面を有するマイクロポストも報告されている。12,13 マイクロポスト材料としてPDMSベースのシリコーン混合物の使用は、混合物中にナノ粒子を添加することが可能になります。例えばコバルトナノロッドを追加すると、マイクロポストの磁気活性化を可能にし、したがって、潜在的な実験デザインに別の自由度を与える。14ほとんどのグループは、カバーガラスのような、またはペトリ皿の内側のフラットリジッド基板上でのマイクロポストアレイを生成します。しかし、マンと共同研究者は最近、伸縮性膜上に形成されたマイクロポストの配列を報告した。15これは、細胞収縮性の点で生細胞の細胞内の動的応答を勉強しながら、セルのアプリケーションは接着細胞に力を伸ばしことができます。 広く使用されている最もESTABSU8フォトレジストを用いてシリコンウエハの上に微細構造を生成するために使用される短い標準クリーンルーム工程においてシニァデツキら。16-18の洞察に満ちたプロトコールに記載されているようにマイクロポストのアレイを作製するためのプロセスがlishedソフトリソグラフィーに基づくものです。これは、シリコーンゴムを金型にそれらを移送構造体上にキャストされたコピー処理が続きます。第二段階では、これらの型は、選択された基板の上にシリコンゴムを使用して初期の微細構造を複製するために使用されます。しかし、彼らのアプリケーションに関連する出版物の大規模で増えているにもかかわらず、マイクロポストの製造プロセスを確立することはあっても、マイクロエンジニアリングの専門家のためにかなりの時間がかかります。許容可能な品質レベルを得るために、特定のラボ環境とマイクロポストレイアウトに最適化と適応を必要とする多くの処理工程があります。 市販のマイクロポストアレイは準備ができて-Tで使用できるようになりました一貫して高品質のO-使用（「既製」）形式。そのため彼らは、オンサイト生産に必要な複雑かつ長時間の製造プロセスに代わるもの。この論文では、市販のマイクロポストのアレイは、単一の明視野顕微鏡画像を用いて、細胞の力をマッピングするために使用しました。さらに重要なのは、この資料では、この原稿の副教材としてダウンロードすることができますMechProfilerという名前のフル機能のオープンソース・ソフトウェアを、説明し、文書化します。ソフトウェアの活発にメンテナンスバージョンもhttp://www.orthobiomech.ethz.chで見つけることができます。 「既製」アッセイと互換性のあるオープンソースの解析ソフトウェアの組み合わせは、著しく正確なTFM実験を達成するために、エントリハードルを下げます。クリーンルーム施設やソフトウェア開発の専門知識のいずれかを利用できない研究者が成功した細胞の力を分析することができます。これはmechanosに注力することを可能にensitivityアッセイ出力ではなく、技術そのもの、およびより広範な地域社会への牽引力の測定値を利用できるようになります。さらに、これはマイクロポストアレイの完全自動スクリーニングへの道を切り開くための重要なステップです。 MechProfiler解析ソフトウェアは、ファイル形式、TIFF、PNG、BMPおよびJPGの画像を処理します。画像は、蛍光、位相差または明視野光学顕微鏡を用いて撮影することができます。スタンドアロンのプログラムは、（で入手できます： 図12）は、フリーのMatlabのコンパイラのランタイムと一緒に実行され、基礎となるアルゴリズムは、約1分で、単一または複数のセルで画像を処理することを可能にする、合理化された画像処理を可能にします。さらに、これらの細胞を、生きてもよいし、「固定」。 MechProfilerソフトウェアが大きく品質の商用マイクロポストのアレイの再現性に依存することにより、データ分析のスループットを増加させることができ、より具体的には、デフォルト・＃8220;配列内の各ポストの非偏向」位置が理想的なグリッドに対して推定することができる（この研究のために使用される配列内のグリッドの製造偏差は100nm未満でした）。 短いものでは、関心領域にそれらの作物、分析のための画像ファイルの選択を開き、細胞で覆われたポストを定義するか、廃棄する必要がある、ポスト位置を決定し、偏向/理想格子に対する力を計算し、最終的に標準的なオフィスのスプレッドシートに含め、輸出の可能性を持つすべてのセル固有のデータを保存します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>T25 cell culture flasks</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>156367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS-buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium DMEM/F12</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS South America</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin 100x</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml centrifuge vials</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropost array&#160;</td>
			<td rowspan="2">MicroDuits</td>
			<td rowspan="2">MPA-col1/FN</td>
			<td>Micropost dimensions:</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pre-coated with Collagen I/Fibronectin</td>
			<td>&#216;= 6.4 &#181;m, l=18.2 &#181;m; grid=&#160;13 &#181;m, kcorr= 2.87 nN/&#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol abs p.A.</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100.983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plate</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>150628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin solution, neutral buffered 10%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HT5011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Blue G-250</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>27815</td>
			<td>Coomassie blue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol ACS p.A.</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.06009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>695092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dish</td>
			<td>WillCo Wells BV</td>
			<td>GWSb-3522</td>
			<td>35 mm diameter, aperture 22&#160;mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-100 Eclipse</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Inverted microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D3-L3</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Camera controler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DS Fi2</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Camera</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

easy and accurate mechano-profiling on micropost arrays

Cell culture substrates with integrated flexible microposts enable a user to study the mechanical interactions between cells and their immediate surroundings. Particularly, cell-substrate interactions are the main interest. Today micropost arrays are a well-characterized and established method with a broad range of applications that have been published over the last decade. However, there seems to be a reservation among biologists to adapt the technique due to the lengthy and challenging process of micropost manufacture along with the lack of easily approachable software for analyzing images of cells interacting with microposts. 
The force read-out from microposts is surprisingly easy. A micropost acts like a spring with the cell ideally attached at its tip. Depending on size a cell applies force from its cytoskeleton through one or multiple focal adhesion points to the micropost, thus deflecting the micropost. The amount of deflection correlates directly to the applied force in direction and in magnitude. The number of microposts covered by a cell and the post deflection patterns are characteristic and allow determination of values like force per post and many biologically relevant parameters that allow &#8220;mechano-profiling&#8221; of cell phenotypes.
A convenient method for mechano-profiling is described here combining the first generation of ready-to-use commercially available microposts with an in-house developed software package that is now accessible to all researchers. As a demonstration of typical application, single images of bone cancer cells were taken in bright-field microscopy for mechano-profiling of cell line models of metastasis. This combination of commercial traction force sensors and open source software for analysis allows for the first time a rapid implementation of the micropost array technique into routine lab work done by non-expert users. Furthermore, a robust and streamlined analysis process enables a user to analyze a large number of micropost images in a highly time-efficient manner.

記載された技術の主な利点は、通常の実験室の作業に迅速かつ効果的な統合のためのシンプルさと可能性にあります。オープンソースソフトウェアと対になって高品質の商用センサアレイの組み合わせは、そうでなければ、クリーンルーム施設や画像解析やソフトウェア開発についての深い知識へのアクセスを必要とするであろう。 図1は、提示された方法のワークフローを示し...

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Easy and Accurate Mechano-profiling on Micropost Arrays

Described are protocols for quantifying mechanical interactions between adherent cells and microstructured substrates. These interactions are closely linked to essential cell behaviors including migration, proliferation, differentiation, and apoptosis. The protocols present an open-source image analysis software called MechProfiler, which enables determination of involved forces for each micropost.

マイクロポストアレイ上の簡単かつ正確なメカノプロファイリング

Cell culture substrates with integrated flexible microposts enable a user to study the mechanical interactions between cells and their immediate ...

easy-and-accurate-mechano-profiling-on-micropost-arrays

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.1K ビュー.  Balgrist University Hospital. Described are protocols for quantifying mechanical interactions between adherent cells and microstructured substrates. These interactions are closely linked to essential cell behaviors including migration, proliferation, differentiation, and apoptosis. The protocols present an open-source image analysis software called MechProfiler, which enables determination of involved forces for each micropost. 

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Studying Cell Rolling Trajectories on Asymmetric Receptor Patterns

Lateral displacement of cells orthogonal to a flow stream by rolling on asymmetric receptor patterns presents an opportunity for development of new devices for label-free separation and analysis of cells1. Such devices may use lateral displacement for continuous-flow separation, or receptor patterns that modulate adhesion to distinguish between different cell phenotypes or levels of receptor expression. Understanding the nature of cell rolling trajectories on receptor-patterned substrates is necessary for engineering of the substrates and design of such devices.
Here, we demonstrate a protocol for studying cell rolling trajectories on asymmetric receptor patterns that support cell rolling adhesion2. Well-defined, &mu;m-scale patterns of P-selectin receptors were fabricated using microcontact printing on gold-coated slides that were incorporated in a flow chamber. HL60 cells expressing the PSGL-1 ligand 3were flowed across a field of patterned lines and visualized on an inverted bright field microscope. The cells rolled and tracked along the inclined edges of the patterns, resulting in lateral deflection1. Each cell typically rolled for a certain distance along the pattern edges (defined as the edge tracking length), detached from the edge, and reattached to a downstream pattern. Although this detachment makes it difficult to track the entire trajectory of a cell from entrance to exit in the flow chamber, particle-tracking software was used to analyze and yield the rolling trajectories of the cells during the time when they were moving on a single receptor-patterned line. The trajectories were then examined to obtain distributions of cell rolling velocities and the edge tracking lengths for each cell for different patterns.
This protocol is useful for quantifying cell rolling trajectories on receptor patterns and relating these to engineering parameters such as pattern angle and shear stress. Such data will be useful for design of microfluidic devices for label-free cell separation and analysis.

We describe a protocol to observe and analyze cell rolling trajectories on asymmetric receptor-patterned substrates. The resulting data are useful for engineering of receptor-patterned substrates for label-free cell separation and analysis.

非対称受容体のパターンでセルローリング軌道を勉強

Lateral displacement of cells orthogonal to a flow stream by rolling on asymmetric receptor patterns presents an opportunity for development of new ...

生物工学

High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays (MEA)

The discovery of RNAi pathway in eukaryotes and the subsequent development of RNAi agents, such as siRNA and shRNA, have achieved a potent method for silencing specific genes1-8 for functional genomics and therapeutics. A major challenge involved in RNAi based studies is the delivery of RNAi agents to targeted cells. Traditional non-viral delivery techniques, such as bulk electroporation and chemical transfection methods often lack the necessary spatial control over delivery and afford poor transfection efficiencies9-12. Recent advances in chemical transfection methods such as cationic lipids, cationic polymers and nanoparticles have resulted in highly enhanced transfection efficiencies13. However, these techniques still fail to offer precise spatial control over delivery that can immensely benefit miniaturized high-throughput technologies, single cell studies and investigation of cell-cell interactions. 
Recent technological advances in gene delivery have enabled high-throughput transfection of adherent cells14-23, a majority of which use microscale electroporation. Microscale electroporation offers precise spatio-temporal control over delivery (up to single cells) and has been shown to achieve high efficiencies19, 24-26. Additionally, electroporation based approaches do not require a prolonged period of incubation (typically 4 hours) with siRNA and DNA complexes as necessary in chemical based transfection methods and lead to direct entry of naked siRNA and DNA molecules into the cell cytoplasm. As a consequence gene expression can be achieved as early as six hours after transfection27. Our lab has previously demonstrated the use of microelectrode arrays (MEA) for site-specific transfection in adherent mammalian cell cultures17-19. In the MEA based approach, delivery of genetic payload is achieved via localized micro-scale electroporation of cells. An application of electric pulse to selected electrodes generates local electric field that leads to electroporation of cells present in the region of the stimulated electrodes. The independent control of the micro-electrodes provides spatial and temporal control over transfection and also enables multiple transfection based experiments to be performed on the same culture increasing the experimental throughput and reducing culture-to-culture variability. 
Here we describe the experimental setup and the protocol for targeted transfection of adherent HeLa cells with a fluorescently tagged scrambled sequence siRNA using electroporation. The same protocol can also be used for transfection of plasmid vectors. Additionally, the protocol described here can be easily extended to a variety of mammalian cell lines with minor modifications. Commercial availability of MEAs with both pre-defined and custom electrode patterns make this technique accessible to most research labs with basic cell culture equipment.

High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays MEA

The article details the protocol for site-specific transfection of scrambled sequence of siRNA in an adherent mammalian cell culture using a microelectrode array (MEA).

微小電極アレイを用いたsiRNAの付着細胞への高効率、サイト固有のトランス体（MEA）

The discovery of RNAi pathway in eukaryotes and the subsequent development of RNAi agents, such as siRNA and shRNA, have achieved a potent method for ...

Sealable Femtoliter Chamber Arrays for Cell-free Biology

Cell-free systems provide a flexible platform for probing specific networks of biological reactions isolated from the complex resource sharing (e.g., global gene expression, cell division) encountered within living cells. However, such systems, used in conventional macro-scale bulk reactors, often fail to exhibit the dynamic behaviors and efficiencies characteristic of their living micro-scale counterparts. Understanding the impact of internal cell structure and scale on reaction dynamics is crucial to understanding complex gene networks. Here we report a microfabricated device that confines cell-free reactions in cellular scale volumes while allowing flexible characterization of the enclosed molecular system. This multilayered poly(dimethylsiloxane) (PDMS) device contains femtoliter-scale reaction chambers on an elastomeric membrane which can be actuated (open and closed). When actuated, the chambers confine Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) reactions expressing a fluorescent protein, allowing for the visualization of the reaction kinetics over time using time-lapse fluorescent microscopy. Here we demonstrate how this device may be used to measure the noise structure of CFPS reactions in a manner that is directly analogous to those used to characterize cellular systems, thereby enabling the use of noise biology techniques used in cellular systems to characterize CFPS gene circuits and their interactions with the cell-free environment.

A microfabricated device with sealable femtoliter-volume reaction chambers is described. This report includes a protocol for sealing cell-free protein synthesis reactants inside these chambers for the purpose of understanding the role of crowding and confinement in gene expression.

無細胞生物学のための密封可能なフェムトリットル商工配列

Cell-free systems provide a flexible platform for probing specific networks of biological reactions isolated from the complex resource sharing (e.g., ...

Ligand Nano-cluster Arrays in a Supported Lipid Bilayer

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological studies. In the past years, it has become increasingly clear that living cells respond, not only to the biochemical nature of the molecules presented to them but also to the way these molecules are presented. Creating protein micro-patterns is therefore now standard in many biology laboratories; nano-patterns are also more accessible. However, in the context of cell-cell interactions, there is a need to pattern not only proteins but also lipid bilayers. Such dual proteo-lipidic patterning has so far not been easily accessible. We offer a facile technique to create protein nano-dots supported on glass and propose a method to backfill the inter-dot space with a supported lipid bilayer (SLB). From photo-bleaching of tracer fluorescent lipids included in the SLB, we demonstrate that the bilayer exhibits considerable in-plane fluidity. Functionalizing the protein dots with fluorescent groups allows us to image them and to show that they are ordered in a regular hexagonal lattice. The typical dot size is about 800 nm and the spacing demonstrated here is 2 microns. These substrates are expected to serve as useful platforms for cell adhesion, migration and mechano-sensing studies.

We present a protocol to functionalize glass with nanometric protein patches surrounded by a fluid lipid bilayer. These substrates are compatible with advanced optical microscopy and are expected to serve as platform for cell adhesion and migration studies.

サポートされている脂質二重層中のリガンドナノクラスター配列

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological ...

Interfacing Microfluidics with Microelectrode Arrays for Studying Neuronal Communication and Axonal Signal Propagation

Microelectrode arrays (MEAs) are widely used to study neuronal function in vitro. These devices allow concurrent non-invasive recording/stimulation of electrophysiological activity for long periods. However, the property of sensing signals from all sources around every microelectrode can become unfavorable when trying to understand communication and signal propagation in neuronal circuits. In a neuronal network, several neurons can be simultaneously activated and can generate overlapping action potentials, making it difficult to discriminate and track signal propagation. Considering this limitation, we have established an in vitro setup focused on assessing electrophysiological communication, which is able to isolate and amplify axonal signals with high spatial and temporal resolution. By interfacing microfluidic devices and MEAs, we are able to compartmentalize neuronal cultures with a well-controlled alignment of the axons and microelectrodes. This setup allows recordings of spike propagation with a high signal-to-noise ratio over the course of several weeks. Combined with specialized data analysis algorithms, it provides detailed quantification of several communication related properties such as propagation velocity, conduction failure, firing rate, anterograde spikes, and coding mechanisms.
This protocol demonstrates how to create a compartmentalized neuronal culture setup over substrate-integrated MEAs, how to culture neurons in this setup, and how to successfully record, analyze and interpret the results from such experiments. Here, we show how the established setup simplifies the understanding of neuronal communication and axonal signal propagation. These platforms pave the way for new in vitro models with engineered and controllable neuronal network topographies. They can be used in the context of homogeneous neuronal cultures, or with co-culture configurations where, for example, communication between sensory neurons and other cell types is monitored and assessed. This setup provides very interesting conditions to study, for example, neurodevelopment, neuronal circuits, information coding, neurodegeneration and neuroregeneration approaches.

This protocol aims to demonstrate how to combine in vitro microelectrode arrays with microfluidic devices for studying action potential transmission in neuronal cultures. Data analysis, namely the detection and characterization of propagating action potentials, is performed using a new advanced, yet user-friendly and freely available, computational tool.

神経細胞のコミュニケーションと軸索の信号伝搬特性を研究するためマイクロ電極アレイとのインタ フェース

Microelectrode arrays (MEAs) are widely used to study neuronal function in vitro. These devices allow concurrent non-invasive recording/stimulation of ...

Human iPSC-Derived Cardiomyocyte Networks on Multiwell Micro-electrode Arrays for Recurrent Action Potential Recordings

Cardiac safety screening is of paramount importance for drug discovery and therapeutics. Therefore, the development of novel high-throughput electrophysiological approaches for hiPSC-derived cardiomyocyte (hiPSC-CM) preparations is much needed for efficient drug testing. Although multielectrode arrays (MEAs) are frequently employed for field potential measurements of excitable cells, a recent publication by Joshi-Mukherjee and colleagues described and validated its application for recurrent action potential (AP) recordings from the same hiPSC-CM preparation over days. The aim here is to provide detailed step-by-step methods for seeding CMs and for measuring AP waveforms via electroporation with high precision and a temporal resolution of 1 &#181;s. This approach addresses the lack of easy-to-use methodology to gain intracellular access for high-throughput AP measurements for reliable electrophysiological investigations. A detailed work flow and methods for plating of hiPSC-CMs on multiwell MEA plates are discussed emphasizing critical steps wherever relevant. In addition, a custom-built MATLAB script for rapid data handling, extraction and analysis is reported for comprehensive investigation of the waveform analysis to quantify subtle differences in morphology for various AP duration parameters implicated in arrhythmia and cardiotoxicity.

This article contains a set of protocols for the development of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocyte (hiPSC-CM) networks cultured on multiwell MEA plates to reversibly electroporate the cell membrane for action potential measurements. High-throughput recordings are obtained from the same cell sites repeatedly over days.

再発作用ポテンシャル記録のためのマルチウェルマイクロ電極アレイ上のヒトiPSC由来心筋細胞ネットワーク

Cardiac safety screening is of paramount importance for drug discovery and therapeutics. Therefore, the development of novel high-throughput ...

Fabrication of Ti3C2 MXene Microelectrode Arrays for In Vivo Neural Recording

Implantable microelectrode technologies have been widely used to elucidate neural dynamics at the microscale to gain a deeper understanding of the neural underpinnings of brain disease and injury. As electrodes are miniaturized to the scale of individual cells, a corresponding rise in the interface impedance limits the quality of recorded signals. Additionally, conventional electrode materials are stiff, resulting in a significant mechanical mismatch between the electrode and the surrounding brain tissue, which elicits an inflammatory response that eventually leads to a degradation of the device performance. To address these challenges, we have developed a process to fabricate flexible microelectrodes based on Ti3C2 MXene, a recently discovered nanomaterial that possesses remarkably high volumetric capacitance, electrical conductivity, surface functionality, and processability in aqueous dispersions. Flexible arrays of Ti3C2 MXene microelectrodes have remarkably low impedance due to the high conductivity and high specific surface area of the Ti3C2 MXene films, and they have proven to be exquisitely sensitive for recording neuronal activity. In this protocol, we describe a novel method for micropatterning Ti3C2 MXene into microelectrode arrays on flexible polymeric substrates and outline their use for in vivo micro-electrocorticography recording. This method can easily be extended to create MXene electrode arrays of arbitrary size or geometry for a range of other applications in bioelectronics and it can also be adapted for use with other conductive inks besides Ti3C2 MXene. This protocol enables simple and scalable fabrication of microelectrodes from solution-based conductive inks, and specifically allows harnessing the unique properties of hydrophilic Ti3C2 MXene to overcome many of the barriers that have long hindered the widespread adoption of carbon-based nanomaterials for high-fidelity neural microelectrodes.

Fabrication of Ti3C2 MXene Microelectrode Arrays for In Vivo Neural Recording

We describe here a method for fabricating Ti3C2 MXene microelectrode arrays and utilizing them for in vivo neural recording.

インビボニューラル記録のためのTi3C2 MXene微小電極アレイの作製

Implantable microelectrode technologies have been widely used to elucidate neural dynamics at the microscale to gain a deeper understanding of the neural ...

Substructure Analyzer: A User-Friendly Workflow for Rapid Exploration and Accurate Analysis of Cellular Bodies in Fluorescence Microscopy Images

The last decade has been characterized by breakthroughs in fluorescence microscopy techniques illustrated by spatial resolution improvement but also in live-cell imaging and high-throughput microscopy techniques. This led to a constant increase in the amount and complexity of the microscopy data for a single experiment. Because manual analysis of microscopy data is very time consuming, subjective, and prohibits quantitative analyses, automation of bioimage analysis is becoming almost unavoidable. We built an informatics workflow called Substructure Analyzer to fully automate signal analysis in bioimages from fluorescent microscopy. This workflow is developed on the user-friendly open-source platform Icy and is completed by functionalities from ImageJ. It includes the pre-processing of images to improve the signal to noise ratio, the individual segmentation of cells (detection of cell boundaries) and the detection/quantification of cell bodies enriched in specific cell compartments. The main advantage of this workflow is to propose complex bio-imaging functionalities to users without image analysis expertise through a user-friendly interface. Moreover, it is highly modular and adapted to several issues from the characterization of nuclear/cytoplasmic translocation to the comparative analysis of different cell bodies in different cellular sub-structures. The functionality of this workflow is illustrated through the study of the Cajal (coiled) Bodies under oxidative stress (OS) conditions. Data from fluorescence microscopy show that their integrity in human cells is impacted a few hours after the induction of OS. This effect is characterized by a decrease of coilin nucleation into characteristic Cajal Bodies, associated with a nucleoplasmic redistribution of coilin into an increased number of smaller foci. The central role of coilin in the exchange between CB components and the surrounding nucleoplasm suggests that OS induced redistribution of coilin could affect the composition and the functionality of Cajal Bodies.

We present a freely available workflow built for rapid exploration and accurate analysis of cellular bodies in specific cell compartments in fluorescence microscopy images. This user-friendly workflow is designed on the open-source software Icy and also uses ImageJ functionalities. The pipeline is affordable without knowledge in image analysis.

サブ構造アナライザー:蛍光顕微鏡画像における細胞体の迅速な探査と正確な分析のためのユーザフレンドリーなワークフロー

The last decade has been characterized by breakthroughs in fluorescence microscopy techniques illustrated by spatial resolution improvement but also in ...

High-Dimensionality Flow Cytometry for Immune Function Analysis of Dissected Implant Tissues

The success of implanting laboratory-grown tissue or a medical device in an individual is subject to the immune response of the recipient host. Considering an implant as a foreign body, a hostile and dysregulated immune response may result in the rejection of the implant, while a regulated response and regaining of homeostasis can lead to its acceptance. Analyzing the microenvironments of implants dissected out under in vivo or ex vivo&#160;settings can help in understanding the pattern of immune response, which can ultimately help in developing new generations of biomaterials. Flow cytometry is a well-known technique for characterizing immune cells and their subsets based on their cell surface markers. This review describes a protocol based on manual dicing, enzymatic digestion, and filtration through a cell strainer for the isolation of uniform cell suspensions from dissected implant tissue. Further, a multicolor flow cytometry staining protocol has been explained, along with steps for initial cytometer settings to characterize and quantify these isolated cells by flow cytometry.

Isolation of cells from dissected implants and their characterization by flow cytometry can significantly contribute to understanding the pattern of immune response against implants. This paper describes a precise method for the isolation of cells from dissected implants and their staining for flow cytometric analysis.

解剖されたインプラント組織の免疫機能解析のための高次元フローサイトメトリー

The success of implanting laboratory-grown tissue or a medical device in an individual is subject to the immune response of the recipient host. ...

Fabrication of 3D Cardiac Microtissue Arrays using Human iPSC-Derived Cardiomyocytes, Cardiac Fibroblasts, and Endothelial Cells

Generation of human cardiomyocytes (CMs), cardiac fibroblasts (CFs), and endothelial cells (ECs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) has provided a unique opportunity to study the complex interplay among different cardiovascular cell types that drives tissue development and disease. In the area of cardiac tissue models, several sophisticated three-dimensional (3D) approaches use induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (iPSC-CMs) to mimic physiological relevance and native tissue environment with a combination of extracellular matrices and crosslinkers. However, these systems are complex to fabricate without microfabrication expertise and require several weeks to self-assemble. Most importantly, many of these systems lack vascular cells and cardiac fibroblasts that make up over 60% of the nonmyocytes in the human heart. Here we describe the derivation of all three cardiac cell types from iPSCs to fabricate cardiac microtissues. This facile replica molding technique allows cardiac microtissue culture in standard multi-well cell culture plates for several weeks. The platform allows user-defined control over microtissue sizes based on initial seeding density and requires less than 3 days for self-assembly to achieve observable cardiac microtissue contractions. Furthermore, the cardiac microtissues can be easily digested while maintaining high cell viability for single-cell interrogation with the use of flow cytometry and single-cell RNA sequencing (scRNA-seq). We envision that this in vitro model of cardiac microtissues will help accelerate validation studies in drug discovery and disease modeling.

Here, we describe an easy-to-use methodology to generate 3D self-assembled cardiac microtissue arrays composed of pre-differentiated human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes, cardiac fibroblasts, and endothelial cells. This user-friendly and low cell requiring technique to generate cardiac microtissues can be implemented for disease modeling and early stages of drug development.

ヒトiPSC由来心筋細胞、心臓線維芽細胞、内皮細胞を用いた3次元心臓ミクロ組織アレイの作製

Generation of human cardiomyocytes (CMs), cardiac fibroblasts (CFs), and endothelial cells (ECs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) has provided ...