この方法は、ポリヌクレオチドキナーゼとして知られている酵素の特別なクラスによるDNAまたはRNA分子の5素端のリン酸化に関する重要な質問に答えることができます。この技術の主な利点は、DNAおよびRNA基質の非常に小さな変化を検出する分解能を有することである。まず、RNA酵素キナーゼ反応を調製します。
反応ごとに、500ナノモルRNA基質の1マイクロリットルを組み合わせます。8.3マイクロリットルの130ナノモル最後の1、GRC 3と5ミリモルEDTAの0.2マイクロリットル。ヒートブロックを摂氏37度に設定します。
その後、濃度系列からATPサブストックの0.5マイクロリットルを1つのRNA酵素混合物と混合し、熱ブロックに反応を置きます。反応を混合し続け、10秒間隔でヒートブロックに置きます。ヒートブロックに60分間インキュベーションした後、10マイクロリットルの尿素負荷染料でスパイクして各反応を焼き付けます。
直ちに下流解析を行うか、後日分析するマイナス20°Cで反応を保存します。15%変性アクリルアミドゲル溶液を調製するには、22.5ミリリットルのプレコンプド40%29をアクリルアミド/ビスアクリルアミド溶液1個に組み合わせます。10 x TBEの6ミリリットル。
尿素の28.8グラム。そして、RNaseは59ミリリットルの総容量に水を解放する。その後、溶液を軽くかき混ぜます。
電子レンジで溶液を20秒間加熱します。かき混ぜて、すぐにさらに20秒間電子レンジに戻します。尿素が完全に溶解するまで溶液を軽くかき混ぜます。
冷たい水を含む浅い水浴にガラスビーカーを入れ、ガラスビーカーを取り巻く冷たい水のレベルがガラスビーカー内の溶液のレベルを上回っていることを確認します。溶液が冷たい場合は、0.2マイクロメートルの使い捨て濾過ユニットでフィルター処理し、ガスを除去し、微粒子や微視的な気泡を除去します。短くて長いガラス板を石鹸と水で洗い、各プレートに95%エタノールを吹き付け、ガラスを拭いて水分を取り除きます。
ボックスの上に置くことによってベンチトップから長いプレートを高めます。次に、プレートの長いエッジに沿って 0.4 ミリメートルスペーサーを配置します。長いプレートの上に短いプレートを置き、短いプレート、長いプレート、スペーサーのエッジが揃っていることを確認します。
次に、各側に3つの均等な間隔の金属クランプをクランプします。24マイクロリットルのTEMEDをアクリルアミド溶液に加え、混ぜます。その後、10%APSの600マイクロリットルを加え、すぐにガラスプレートの間に溶液を注ぎます。
ガラス板サンドイッチの間にアクリルアミド溶液を注ぐことは本当に困難なことができます。気泡を避けるために、溶液を注いでいる間にガラス板サンドイッチをタップします。ガラス板サンドイッチの上部に清潔な32ウェルコームを慎重に追加します。
そして、アクリルアミドを30分間重合させる。ゲルを実行するには、ヒートブロックを摂氏75度に設定します。金属クランプを取り外します。
そして、ガラス板サンドイッチを十分に洗って乾燥させます。プレートサンドイッチとゲル装置を前向きのショートプレートに置き、10 X TBEの100ミリリットルとRNaseフリー水1.9リットルを組み合わせて0.5 X TBEランニングバッファを調製します。装置の上下の部屋にランニングバッファーの600ミリリットルを加えます。
ジェルからくしをそっと取り出し、シリンジで井戸を十分に洗いすめます。ゲルを50ワットで30分間事前に実行します。その後、もう一度井戸をすすいします。
ポストはクエンチ反応を回転させ、摂氏75度で3分間インキュベートします。パルス回転を繰り返し、すぐに各サンプルの10マイクロリットルをゲルにロードします。その後、50ワットで3時間ゲルを実行します。
走行が終了したら、電源をオフにして装置の上部チャンバーを排出します。ガラス板サンドイッチの外側を洗って乾かします。その後、ホイルでそれをカバーし、イメージングのためのレーザースキャナに転送します。
ガラス板サンドイッチをレーザースキャナーのステージに取り付けます。希望の床の励起波長と発光波長を設定し、ゲルを画像化します。ここに示されているのは、最後の1つのGRC3複合体の固定量を有するATPの滴定の代表的な成功した変性ゲルである。
酵素の付加は、サッカロミセスセレビシエITS 2 RNA基質の最後の1つの媒介RNA切断をもたらし、定義されたRNA断片をもたらした。ATPを添加すると、C2 RNA断片をGrC3 PNKによりリン酸化した。C2 RNA断片のリン酸化を可視化するために、非リン酸化およびリン酸化されたC2RNAの相対量をATP濃度に対してプロットした。
私たちの代表的な失敗した変性ゲルはここに示されています。21塩基RNA基質には分解物が含まれており、リン酸化産物と重なり合い、リン酸化を正確に定量することが不可能となった。対照的に、ゲルのこの領域には、リン酸化された相手の正確な定量化を妨げる追加のRNA種が含まれていないため、最短のRNA分解産物の分析に成功しました。
このプロトコルを試す際に覚えておかねばなることは、サンプルのローディングを確実にするためにゲルのウェルをすすいでください。この手順に従って、RNAターンオーバー実験を行うことができる。RNA分解率を測定するために、リン酸化はしばしばRNA分解のシグナル開始を示します。
この技術は、ポリヌクレオチドキナーゼの活動特異性および運動に関する詳細な質問に答える道を開きます。
