著者らは、Veraksaラボのメンバーに、原稿に関する有益なコメントとプロトコル改善の提案を感謝します。 AVは、NIHグラントGM105813およびNS096402によって支持された。 LYは、マサチューセッツ大学ボストンSanofi Genzyme博士号取得フェローシップの支援を受けました。

1. 5Lフライケージの調製（15cmプレートに適合する） <ol><li>必要な材料を入手してください：ふた付きの5クォート（4.7リットル）の容器、 図1Aのナイロンメッシュ、およびカミソリの刃。 </li><li>直径12cmの円に印を付け、カミソリの刃を使って容器の底に穴をあけます（ 図1B ）。蓋に直径15 cmの穴を切ってください（ 図1C ）。 </li><li> 25×25cmの正方形にナイロンメッシュをカットします。 </li><li>容器の上端にメッシュを置き、ふたで押し下げます（ 図1C ）。メッシュがきつく、ふたが傾いていないことを確認してください。ケージにはハエが植えられます（ステップ5.3を参照）。 </li></ol> 2. 1Lフライケージの調製（10cmプレートに適合する） <ol><li>必要な材料を入手する：電気ドリル、76mm（3インチ）の切削工具（ 図1EおよびFナイフメッシュ、カミソリ、サンドペーパー、ゴーグル、作業手袋を備えた直方体の1Lプラスティックジャー（igure 1F）。 </li><li>蓋をしっかりとねじ込みながら蓋をしっかりと締め、プラスチック製の瓶の底部とふたの3インチ（76 mm）の穴を切ってください（ 図1G ）。穴を開け始めるときに切削工具を円の中心に置く。 注意：この手順では目の保護具を着用し、手袋を着用してください。 </li><li>剃刀の刃とサンドペーパーで穴の端を滑らかにします。 </li><li> 18×18cmの正方形にナイロンメッシュを切ってください。 </li><li>瓶の上端にメッシュを置き、蓋をねじ込むことで締め付けます（ 図1G ）。メッシュがきつく、ふたが傾いていないことを確認してください。ケージにはハエが植えられます（ステップ5.3を参照）。 </li></ol> 3.リンゴジュース（AJ）プレートの調製<ol><li> 2Lフラスコに19gの寒天と1Lの18.2MΩ・cmの水を加えます。攪拌棒を加え、短時間混ぜる。 </li><li> 30分間オートクレーブ。一方、100％リンゴジュース濃縮物を凍結ストックから解凍し、10％（重量/体積）の4-ヒドロキシ安息香酸メチル溶液をエタノール中で10mL調製する。 </li><li>オートクレーブ後、攪拌プレート上で寒天を混合し、80％の100％リンゴジュース濃縮物および10％（重量/体積）の4-ヒドロキシ安息香酸メチル溶液10mLをフラスコに加える。一定の混合で室温で冷却する。 </li><li>各皿の寒天レベルが約5 mmになるように、15 cmペトリ皿（5 Lケージ用）または10 cmペトリ皿（1 Lケージ用）を注ぎます。室温で凝固させ、ビニール袋で包みます。 AJプレートは4℃で2週間保存できます。 注：ペトリ皿は洗って再利用することができます。 </li><li>湿った酵母ペーストを調製する：簡単な混合を可能にする蓋を備えた100mLの容器に活性乾燥酵母を注ぎ、少量の水を加えながら撹拌しながら、濃くて完全に混合するペースト。 4℃で最大2週間保管してください。 </li></ol> 4.溶解試薬の調製<ol><li> 250mMトリスpH7.5,25％グリセロール、1％オクチルフェノキシポリ（エチレンオキシ）エタノール（IGEPAL CA-630）、7.5mM MgCl 2,625mM NaCl、125mM NaF、5mM Na 3 VO 4を調製する。 <ol><li> 200mLを作るために：絶えず撹拌しながら、71mLの水中に1gのNaF粉末と184mgのNa 3 VO粉末を完全に溶解する。 1MトリスpH 7.5の50mL、100％IGEPALの2mL、1M MgClの1.5mL、および5M NaClの25mLを加える。次に50 mLのグリセロールを添加し（最後に加える）、1時間撹拌を続ける。 </li><li> 250mLフィルターユニットを使用してフィルター滅菌する。この工程は遅くなる可能性があるが、不溶性微粒子を除去するためには溶液を濾過することが重要である。 50 mLチューブで10 mLずつ分注し、-80°Cで保存します。 </li></ol></li><li>水中で1Mジチオスレイトール（DTT）溶液を調製する。 1 mLのアリコートで-20℃で保存する。 </li><li>プロテオームを得るエチレンジアミン四酢酸（EDTA）を用いたアゼイン阻害剤カクテル錠剤。 4℃で保存する。 </li><li> 10mLのシリンジおよびシリンジフィルター（直径26mm、界面活性剤を含まない酢酸セルロース（SFCA）膜、孔径0.45μm）を入手する。 </li></ol> 5.フライ胚の収集<ol><li>関心のあるタグ付きタンパク質を運ぶトランスジェニックフライラインをボトル（約100フライ/ボトル）で増幅し、フライラインごとに25〜30本のボトルが蓄積されるまで2日ごとにボトルを移す。同様の方法で制御在庫（ 例えば 、 ywライン）を増幅します。 </li><li> AJプレートを室温まで暖めます（約1〜2時間、一晩中行うことができます）。手袋をした指を使って、AJプレートの中央に若干の濡れた酵母ペーストを広げ、 15cmのプレートの場合は6cmの円、10cmのプレートの場合は4cmの円である。 </li><li> 標準的なショウジョウバエの段階設定を使用して、二酸化炭素の流れでハエを麻酔し、ケージ（5リットルのケージにつき約15のよく成長したハエのボトル、1リットルのケージあたり5ボトル）。 <ol><li>ステップ5.2の準備済みのAJプレートでケージの底を覆い、テープの2つのストリップを使用してAJプレートをケージにテープします（ 図1Dおよび1H ）。プレートを交換するときに簡単に剥がれるように、プレートの上にあるテープの先端を折り畳むと便利です。 </li><li>ハエが麻酔から回復した後、プレートを下にしてケージを保持し、上部に噛み合わせます。 注意：ハエが完全に回復するまで待つことが重要です。さもなければAJプレートと酵母ペーストに固執します。 </li><li>実験の終わりに、ケージを洗浄のために準備するために、ケージを数時間冷凍庫に入れる。メッシュを水に数時間浸すと、クリーニングが容易になります。 </li></ol></li><li>ケージをハエと室温で2〜3日間インキュベートし、AJプレートを1日2回交換する。プレートを交換するには、ケージを上下逆さまにして、テープをプレートからはがすが、プレートをケージに保持し、ベンチ上のケージ全体を静かにタップして、新しいプレートの交換を迅速に行い、ハエが逃げないようにする。 注：ハエはケージに適応する必要があり、3日目から始めるのが最善です。彼らはピークレベルで約4-5日間寝続けるでしょう。上の敷設能力で2つの5Lケージは、一晩の収集で1gまでの胚を産生することができる。小規模実験には1リットルのケージを使用します。 </li><li>ハエが新鮮なAJプレートに胚を一晩（約16時間）置くことを可能にするか、または任意の他の所望の時間長さに置く。 </li><li>翌朝、使用したフライラインごとに1つずつ、胚収集用のメッシュ容器をマーキングし、計量します。 </li><li> セクション4の試薬を使用して、1x溶解バッファーを調製します（注意：すぐに使用できる1x溶解バッファーは、抽出直前に調製しなければなりません）：10mLの5x濃縮溶解バッファー（-80℃で保存） 50mLのチューブに入れた。 <ol><li> 1 MDの50μLを加えるTTで1mMの最終濃度にし、十分に混合し、2つの50mL試験管に分け、各25mLを分取する。チューブの1つに、1つのプロテアーゼ阻害剤錠剤を加え、4℃で30分間回転させる。錠剤が溶解している間、胚を収集し、脱皮する（ステップ5.8〜6.6）。錠剤が完全に溶解していることを確認し、バッファーを氷上に置いてください。 注：DTTを含む1×バッファーの2番目のチューブは-80°Cで保存することができ、次の実験の前にタブレットの添加が必要になります。タンパク質精製工程中のその後の洗浄を考慮に入れて、2mLまでの溶解緩衝液25mLで十分である。 </li></ol></li><li>使用されたフライラインの遺伝子型を用いてケージ上のAJプレートに印を付け、新鮮なもののためにプレートを交換する。 注：この段階で過剰の酵母ペーストをプレートから掻き取ることができます。胚は、発育時間の所望のウィンドウを得るために、25℃または室温でプレート上で老化させることができる。 </li><li> 十分な水を加えるo各AJプレートをカバーする。柔らかいペイントブラシ（平らな頭部、約10mm幅）は、平らなプレートから胚を静かに取り除きます。先に計量してマークしたメッシュ容器に胚を注ぎ、余分な水を排水する。 <ol><li>必要に応じて、すべての胚を取り除くためにプレートの2回目のすすぎとブラッシングを行います。同じフライラインの追加プレートの胚を同じメッシュコンテナに結合する。 </li></ol></li><li>簡単にペーパータオルでメッシュを拭き取り、余分な水分を取り除きます。 </li></ol> 6.胚の脱皮<ol><li> 50％漂白剤を含む6cmのペトリ皿（水中のvol / vol溶液）を半分充填する。 注：Table of MaterialsおよびReagentsの漂白剤ブランドに関する重要なコメントを参照してください。 注意：手袋を着用し、衣類に漂白剤をつけないでください。 </li><li> 2つの大きなペトリ皿を水で準備する。 </li><li>胚を50％漂白剤で90秒間メッシュ容器に浸します。 incuの間にメッシュを静かにタップ漂白剤溶液中の胚を懸濁させるために2〜3回繰り返す。 </li><li> 90秒のインキュベーションの終わりに、2つの皿の各々のメッシュ容器を約10秒間水で洗浄する。 </li><li>噴霧ボトルを使用してメッシュ容器を18.2MΩ・cmの水で完全にすすぎます。また、メッシュコンテナの側面と外側を洗います。 注：徹底的な洗浄の後、漂白剤の臭いは検出されません。 </li><li>メッシュ容器をペーパータオルで汚す。胚でメッシュコンテナを計量し、ステップ5.6で得られた空のコンテナの重量を引く。胚の結果重量を記録する。目指すべき胚の量は0.5〜1gが良い。 </li></ol> 7.胚芽抽出物の調製<ol><li>プロテアーゼ阻害剤（ステップ5.7より）を含む溶解バッファー1 mLをdounceガラスホモジナイザーに加え、氷上に保ちます。胚をメッシュ容器からホモジナイザーに移す。 注：胚は、平らな末端で採取することができますファーメタルスパチュラまたはブラシに入れ、緩衝液に直接移した。このセクションのすべての手順を氷上で実行します。 </li><li>メッシュ上の残りの胚をさらに1mLの溶解緩衝液で洗い流し、ホモジナイザー中の材料に加える。胚をホモジナイザーの底まで沈降させ、上清を注意深く吸引する。 </li><li>プロテアーゼ阻害剤（ステップ5.7から）を含む溶解緩衝液をホモジナイザーに添加し、胚1グラムあたり5-6mLの溶解緩衝液を目標とする。 </li><li>緩やかなフィットの乳棒で4-6ストロークで胚を均質化する。 注：最初のストロークの間に、より多くの抵抗があります。溶液がはねられるのを避けるために、乳棒を連続的に動かすようにしてください。 </li><li>タイトフィットの乳棒で8-10ストロークだけ胚を均質化する。 </li><li>ホモジネートを氷上で20分間インキュベートする。 </li><li>ホモジネートをマイクロ遠心チューブに移し、最高速度（約13,000 xg）で15分間4℃で遠心分離します。 </li><li>避けるペレットと非常に上の脂質層を取り除き、上清を新鮮な微量遠心管に移し、4℃で15分間、最高速度（約13,000×g）で遠心分離する。 </li><li>慎重に1mLの先端で上清を吸引し、0.45μmのフィルターが取り付けられた冷却された10mLシリンジにロードする（同じサンプルのアリコートを1つのシリンジに合わせる）。氷上で標識した15 mLチューブにすべての溶液を押します。この抽出物は、その後のタンパク質精製実験にすぐに使用することができ、液体窒素中で急速冷凍し、将来の使用のために-80℃に保つことができる。 注：その後の胚の解凍中にプロテアーゼが活性化され、タンパク質分解を引き起こす可能性があるため、胚よりも抽出物を凍結する方がよい。 </li></ol>

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H., Peng, J., Mayor, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+strategy+to+isolate+ubiquitin+conjugates+reveals+wide+role+for+ubiquitination+during+neural+development.">A novel strategy to isolate ubiquitin conjugates reveals wide role for ubiquitination during neural development.</a> Mol Cell Proteomics. 10 (5), (2011).</li><li>Ramirez, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+Analysis+of+the+Ubiquitin+Landscape+in+the+Drosophila+Embryonic+Nervous+System+and+the+Adult+Photoreceptor+Cells.">Proteomic Analysis of the Ubiquitin Landscape in the Drosophila Embryonic Nervous System and the Adult Photoreceptor Cells.</a> PLoS One. 10 (10), 0139083 (2015).</li></ol>

著者は何も開示することはない。

ここに提示されたプロトコールは、 ショウジョウバエの集団ケージを中規模に設定し、胚から全細胞タンパク質抽出物を作製するための単純で一般的な手順である。得られた抽出物は、アフィニティー樹脂上のタンパク質複合体の精製など、様々な下流の用途に使用することができる。タンパク質分解を最小限に抑えるために、抽出工程を氷上で行い、強力なプロテアーゼ阻害を用い...

遺伝学的スクリーニング、そして最近では、ゲノムアプローチが生物学的機能の研究に革命をもたらしている。しかしながら、重要な細胞情報は、タンパク質および相互作用するパートナーの集合体にコードされている。伝統的な遺伝子改変スクリーニングは、律速経路成分を同定し、間接的な相互作用を回復することができるが、プロテオームアプローチの強さは、目的のタンパク質の完全な即時相互作用ネットワークを同定する能力にある。したがって、プロテオミクスは生物学的システムを研究する貴重な直交方法であり、ゲノミクス、トランスクリプトミクス、伝統的な遺伝子スクリーニングを補完するものです。 Affinity purification-mass spectrometry（AP-MS）は、細胞および組織1,2の固有環境におけるタンパク質 - タンパク質相互作用（PPI）を研究する強力なアプローチであることが証明されています。この方法は、特定の開発における直接的または間接的な相互作用の同定を可能にする様々な発生経路における複数の新規PPIを同定するために首尾よく使用されている（参考文献1で概説されている）。 PPI研究の明白な成功にもかかわらず、それらの大部分は、目的の「餌」タンパク質が過剰発現された培養細胞で実施されている。細胞培養においてPPIを研究することには2つの問題がある：第1に、特定の細胞株は、特定のタンパク質の発現の欠如のために完全な相補性を提供しない可能性がある。第二に、このような分析に通常用いられる高い過剰発現は、タンパク質の誤った折り畳みまたは誤った陽性の相互作用の同定のような人工物につながる可能性がある。 インビボで PPI を分析することによって、これらの制限の両方を克服することができる。そのような実験における限定的な工程は、タンパク質複合体を精製するための出発物質の利用可能性である。 ショウジョウバエmelanogasterは、機能解析のモデルとして長く使用されてきた最近、インビボで PPIを研究するための優れたシステムであることも示されています。 ショウジョウバエの胚発生は、胚を大量に容易に採取することができ、また胚発生の過程で大部分の遺伝子（&gt; 88％）が発現され、関連性の高いin vivo環境を提供するためPPIを研究するのに特に魅力的な組織型であるPPIs 3 。 伝統的に、ハエの生化学的研究は、機能的転写ライセートを精製するために必要なものなど、非常に大規模な胚コレクション（100〜150g）を利用している4,5。これまでのショウジョウバエの AP-MS研究では、タンデムアフィニティ精製（TAP）などの2ステップ精製手法に依存し、各ステップ6で材料が喪失したため、大量の胚が必要でした（5~10g）。大物高価な（商業的に購入された場合）および維持管理に時間がかかることがあり、7,8,9を清潔にすることができる、大きな集団ケージに胚コレクションを設置する必要があった。 シングルステップ親和性精製アプローチの開発における最近の進歩、ならびに質量分析計の高感度化は、出発物質の必要量を一桁減少させた。ストレプトアビジン結合ペプチド（SBP）または緑色蛍光タンパク質（GFP）などのタグを使用し、1g未満の胚から開始することにより、餌タンパク質および相互作用する成分の量を、質量分析10,11 。 ここに提示された議定書の目標は、研究者が過度に私はインビボでのPPIの生化学分析に対する認識された障壁となった。そのためには、 ショウジョウバエの胚を中程度（0.5〜1g）で採取するための簡単で安価な手順を提供し、続いてAP-MSまたは他のアプローチによる後の分析に適した全細胞タンパク質抽出物の一段階調製を行う。私たちの方法は、どの実験室でも簡単に作成できるカスタムメイドの1Lまたは5L集団ケージの使用に依存しています。さらに、ここに提示された抽出条件は、培養細胞およびインビボの両方において、10,12,13,14,15,16,17のいくつかの研究で検証されている。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1384">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">Leaktite 5-Qt. Natural Multi Mix Container (Pack of 3)</td>
			<td style="width:183px;">Home Depot</td>
			<td style="width:119px;">209330</td>
			<td style="width:644px;">For making 5-L cages.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">Leaktite 5-Qt. Natural Multi Mix Lid (Pack of 3)</td>
			<td style="width:183px;">Home Depot</td>
			<td style="width:119px;">209320</td>
			<td style="width:644px;">Diameter 8.37 in. Lids for 5-L cages.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">Fisherbrand Petri dishes with clear lid, 100 x 15 mm</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">FB0875712</td>
			<td style="width:644px;">Material: Polystyrene. To be used with 1-L cages.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">Fisherbrand Petri dishes with clear lid, 150 x 15 mm</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">FB0875714</td>
			<td style="width:644px;">Material: Polystyrene. To be used with 5-L cages.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">Fisherbrand Petri dishes with clear lid, 60 x 15 mm</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">FB0875713A</td>
			<td style="width:644px;">Material: Polystyrene. Used during embryo dechorionation.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">Sefar NITEX nylon mesh</td>
			<td style="width:183px;">Sefar</td>
			<td style="width:119px;">03-180/44</td>
			<td style="width:644px;">180 micron, 44% open area, used for fly cages.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">Milwaukee 3 in. Hole Dozer Hole Saw with Arbor</td>
			<td style="width:183px;">Home Depot</td>
			<td style="width:119px;">49-56-9670</td>
			<td style="width:644px;">3 inch cutting tool for making 1-L cages.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:439px;">Nalgene Wide-Mouth Straight-Sided PMP Jars with White Polypropylene Screw Closure</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11-823-33</td>
			<td style="width:644px;">For making 1-L cages. Thermo Scientific cat # 21171000. Alternative 1-L containers can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">Red Star Active Dry Yeast, 2 pound pouch</td>
			<td style="width:183px;">Red Star&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:644px;">can be purchased from Amazon.com or other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">Frozen 100% Apple Juice Concentrate&#160;</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:644px;">can be purchased from a grocery store. Has to say &#34;100% apple juice&#34; on the can.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">Methyl 4-hydroxybenzoate</td>
			<td style="width:183px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:119px;">AC126965000</td>
			<td style="width:644px;">also known as methylparaben or Tegosept. Used as a preservative in AJ plates.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">IGEPAL CA-630 for molecular biology, 100 ml</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">I8896</td>
			<td style="width:644px;">used for preparing lysis buffer.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:439px;">Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with CN Membrane&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">09-740-2A</td>
			<td style="width:644px;">0.2 &#956;m pore size. Used for filtering 5x lysis buffer. Thermo Scientific cat # 1260020.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">CO-RO ROCHE cOmplete Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">11697498001</td>
			<td style="width:644px;">Vial of 20 tablets. Used for protease inhibition in lysis buffer.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">Corning SFCA syringe filters&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">09-754-21</td>
			<td style="width:644px;">SFCA membrane, diameter 26 mm, pore size 0.45 &#956;m. Used for filtering final extract samples.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">BD&#160;Luer-Lok Disposable Syringes without Needles</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14-823-2A</td>
			<td style="width:644px;">for filtering final extract samples. BD cat # 309604.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:439px;">Bleach</td>
			<td style="width:183px;">Clorox</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:644px;">used for embryo dechorionation at 50% (vol/vol) in water, can be purchased at any supermarket. It is important to use the Clorox brand, as other brands may result in incomplete dechorionation or may be toxic for embryos.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">Corning Costar Netwell Plates</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">07-200-213</td>
			<td style="width:644px;">mesh containers for embryo collections. 74 &#956;m mesh size, 6-well.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">Wheaton Dounce Tissue Grinders, capacity 15 ml</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">06-435B</td>
			<td style="width:644px;">homogenizer for embryos, with loose and tight pestles. Wheaton cat # 357544.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

medium-scale preparation of drosophila embryo extracts for proteomic experiments

タンパク質 - タンパク質相互作用（PPI）の分析は、細胞シグナル伝達、生物発達、および疾患などの生物学的プロセスおよびメカニズムを研究するために欠かせないアプローチとなっている。相互作用ネットワークの最も自然で不偏なビューを得るために、生体内材料を用いて PPI情報を得ることがしばしば望ましい。ショウジョウバエDrosophila melanogasterは、 インビボで PPIを研究する優れたプラットフォームであり、生化学実験用の材料を単離するための直接的なアプローチに役立ちます。特に、ミバエの胚は、この発達段階で動物を集めるのが容易であり、タンパク質の大部分が胚発生において発現され、したがってほとんどのPPIを明らかにする関連する環境を提供するため、PPIを研究するのに便利なタイプの組織である。ここでは、 ショウジョウバエの胚を中規模（0.5〜1g）で採取するためのプロトコールを提示します。これは、アフィニティー精製 - 質量分析法（AP-MS）によるPPIの分析を含む、プロテオーム用途に適している。どの実験室でも簡単かつ安価に設置できる胚収集用の1Lおよび5Lケージの設計について説明します。我々は、AP-MSのような下流のアプリケーションで直接使用することができる溶解物を生成するための胚収集およびタンパク質抽出のための一般的なプロトコルも提供する。我々の目標は、すべての研究者がインビボで PPIの分析を実施するためのアクセス可能な手段を提供することである。

タンパク質複合体精製実験におけるこのプロトコールの使用を説明するために、本発明者らは、ホモ接合性生存フライライン、EGFPタグ化ショウジョウバエ細胞外シグナル調節キナーゼ（ ロール遺伝子によってコードされるERK）を対照下で発現するarm-EGFP-ユビキタスで表現されたアルマジロ （ arm ）プロモーターの18,19 。 <...

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Medium-scale Preparation of Drosophila Embryo Extracts for Proteomic Experiments

このプロトコールの目標は、中程度の規模（0.5〜1g）でショウジョウバエ胚を採取し、アフィニティー精製 - 質量分析法（AP-MS）のような下流のプロテオーム用途に使用できるタンパク質抽出物を調製するための、 ）。

中規模の<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;プロテオーム実験のための胚抽出物

Analysis of protein-protein interactions (PPIs) has become an indispensable approach to study biological processes and mechanisms, such as cell signaling, ...

medium-scale-preparation-drosophila-embryo-extracts-for-proteomic

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Medium-scale Preparation of Drosophila Embryo Extracts for Proteomic Experiments

7.8K ビュー.  University of Massachusetts Boston. このプロトコールの目標は、中程度の規模（0.5〜1g）でショウジョウバエ胚を採取し、アフィニティー精製 - 質量分析法（AP-MS）のような下流のプロテオーム用途に使用できるタンパク質抽出物を調製するための、 ）。 

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Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic conservation, as well as similarities in cellular, molecular, and physiological processes, with other vertebrates including humans. During early ontogeny, zebrafish embryos are optically transparent, allowing researchers to visualize the dynamics of organogenesis using a simple stereomicroscope. Microbead implantation is a method that enables tissue manipulation through the alteration of factors in local environments. This allows researchers to assay the effects of any number of signaling molecules of interest, such as secreted peptides, at specific spatial and temporal points within the developing embryo. Here, we detail a protocol for how to manipulate and implant beads during early zebrafish development.

The zebrafish is an excellent model system for genetic and developmental studies. Bead implantation is a valuable tissue manipulation technique that can be used to interrogate developmental mechanisms by introducing alterations in local cellular environments. This protocol describes how to perform microbead implantation in the zebrafish embryo.

ゼブラフィッシュ胚におけるマイクロビーズの移植

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

発生生物学

Preparation of Mitochondrial Enriched Fractions for Metabolic Analysis in Drosophila

Since mitochondria play roles in amino acid metabolism, carbohydrate metabolism and fatty acid oxidation, defects in mitochondrial function often compromise the lives of those who suffer from these complex diseases. Detecting mitochondrial metabolic changes is vital to the understanding of mitochondrial disorders and mitochondrial responses to pharmacological agents. Although mitochondrial metabolism is at the core of metabolic regulation, the detection of subtle changes in mitochondrial metabolism may be hindered by the overrepresentation of other cytosolic metabolites obtained using whole organism or whole tissue extractions. 
Here we describe an isolation method that detected pronounced mitochondrial metabolic changes in Drosophila that were distinct between whole-fly and mitochondrial enriched preparations. To illustrate the sensitivity of this method, we used a set of Drosophila harboring genetically diverse mitochondrial DNAs (mtDNA) and exposed them to the drug rapamycin. Using this method we showed that rapamycin modifies mitochondrial metabolism in a mitochondrial-genotype-dependent manner. However, these changes are much more distinct in metabolomics studies when metabolites were extracted from mitochondrial enriched fractions. In contrast, whole tissue extracts only detected metabolic changes mediated by the drug rapamycin independently of mtDNAs.

Preparation of Mitochondrial Enriched Fractions for Metabolic Analysis in Drosophila

Mitochondria play central roles in the regulation of metabolism and homeostasis. Subtle changes in mitochondrial metabolism that affect organismal physiology could be difficult to detect in whole organism metabolomics studies. Here we describe an isolation method that enhances the detection of subtle metabolic shifts in Drosophila melanogaster.

代謝分析のためのミトコンドリア富化画分の調製で<em&gt;ショウジョウバエ</em

Since mitochondria play roles in amino acid metabolism, carbohydrate metabolism and fatty acid oxidation, defects in mitochondrial function often ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

リビングゼブラフィッシュ胚における細胞内構造のイメージング

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. Various propositions claim to have been important contributions to the understanding of the mechanical properties of cells and tissues in their spatiotemporal organization in different developmental and morphogenetic processes. However, due to the lack of reliable and accessible tools to measure material properties and tensional parameters in vivo, validating these hypotheses has been difficult. Here we present methods employing atomic force microscopy (AFM) and particle tracking with the aim of quantifying the mechanical properties of the intact zebrafish embryo yolk cell during epiboly. Epiboly is an early conserved developmental process whose study is facilitated by the transparency of the embryo. These methods are simple to implement, reliable, and widely applicable since they overcome intrusive interventions that could affect tissue mechanics. A simple strategy was applied for the mounting of specimens, AFM recording, and nanoparticle injections and tracking. This approach makes these methods easily adaptable to other developmental times or organisms.

The lack of tools to measure material properties and tensional parameters in vivo prevents validating their roles during development. We employed atomic force microscopy (AFM) and nanoparticle-tracking to quantify mechanical features on the intact zebrafish embryo yolk cell during epiboly. These methods are reliable and widely applicable avoiding intrusive interventions.

原子間力顕微鏡とゼブラフィッシュ胚の卵黄細胞のレオロジー

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. ...

Effectiveness of the Air Stripping in Two Salmonid Fish, Rainbow Trout (Oncorhynchus Mykiss) and Brown Trout (Salmo Trutta Morpha fario)

Egg collection is one of the most crucial procedures during fish reproduction in salmonid hatcheries. Classic methods involve the use of hand massage on fish abdomens to expel the eggs. An alternative method uses the pressure of gas injected into the body cavity, which causes the subsequent release of the eggs. This method is believed to have less negative effects on both the welfare and egg quality of the broodstocks. Herein, we compare the results of air and hand stripping methods with respect to one-year survival and egg quantity and quality in two salmonid fish, rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) and brown trout (Salmo trutta morpha fario). Our results indicate that air stripping yielded a better quality of eggs and higher one-year survival rate in rainbow trout. In addition, air stripping resulted in lower mortality rate than the group subjected to hand stripping (25% vs. 35%). The pH and hatching rate of the hand stripped group was lower than those of the air stripped group. In the case of brown trout, the quality of eggs obtained by both hand and air-stripping methods was similar; however, the one-year losses in fish were higher in air stripped group (15% compared to 0% in hand stripped fish). Although the advantages of air stripping method over hand stripping in terms of egg quality might not be observed in all salmonid species, the air-stripping procedure might be a promising option to be adopted in hatcheries as it ensures a high level of reproducibility and efficiency.

Effectiveness of the Air Stripping in Two Salmonid Fish, Rainbow Trout Oncorhynchus Mykiss and Brown Trout Salmo Trutta Morpha fario

The principal aim of this study is to standardize and test the pneumatic method (air stripping) of collecting eggs in rainbow trout and brown trout. This method allows effective and simple collection of the eggs without the necessity of fish abdomen massage.

2 つのサケ科の魚で空気除去の有効性 (オンコルヒュンクス) レインボー ・ トラウトやブラウン ・ トラウト (タイセイヨウサケMorpha fario)

Egg collection is one of the most crucial procedures during fish reproduction in salmonid hatcheries. Classic methods involve the use of hand massage on ...

Preparation of Drosophila Larval Samples for Gas Chromatography-Mass Spectrometry (GC-MS)-based Metabolomics

Recent advances in the field of metabolomics have established the fruit fly Drosophila melanogaster as a powerful genetic model for studying animal metabolism. By combining the vast array of Drosophila genetic tools with the ability to survey large swaths of intermediary metabolism, a metabolomics approach can reveal complex interactions between diet, genotype, life-history events, and environmental cues. In addition, metabolomics studies can discover novel enzymatic mechanisms and uncover previously unknown connections between seemingly disparate metabolic pathways. In order to facilitate more widespread use of this technology among the Drosophila community, here we provide a detailed protocol that describes how to prepare Drosophila larval samples for gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS)-based metabolomic analysis. Our protocol includes descriptions of larval sample collection, metabolite extraction, chemical derivatization, and GC-MS analysis. Successful completion of this protocol will allow users to measure the relative abundance of small polar metabolites, including amino acids, sugars, and organic acids involved in glycolysis and the TCA cycles.

Preparation of Drosophila Larval Samples for Gas Chromatography-Mass Spectrometry GC-MS-based Metabolomics

This protocol describes how to prepare Drosophila larvae for GC-MS-based metabolomic analysis.

ガスクロマトグラフィー-質量分析法 (GC/MS) のためのショウジョウバエ幼虫サンプル準備-メタボロミクスをベース

Recent advances in the field of metabolomics have established the fruit fly Drosophila melanogaster as a powerful genetic model for studying animal ...

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

Morphogenesis requires coordination between genetic patterning and mechanical forces to robustly shape the cells and tissues. Hence, a challenge to understand morphogenetic processes is to directly measure cellular forces and mechanical properties in vivo during embryogenesis. Here, we present a setup of optical tweezers coupled to a light sheet microscope, which allows to directly apply forces on cell-cell contacts of the early Drosophila embryo, while imaging at a speed of several frames per second. This technique has the advantage that it does not require the injection of beads into the embryo, usually used as intermediate probes on which optical forces are exerted. We detail step by step the implementation of the setup, and propose tools to extract mechanical information from the experiments. By monitoring the displacements of cell-cell contacts in real time, one can perform tension measurements and investigate cell contacts&#39; rheology.

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

We present a setup of optical tweezers coupled to a light sheet microscope, and its implementation to probe cell mechanics without beads in the Drosophila embryo.

ショウジョウバエの胚のビーズ無料光ピンセット プローブ細胞力学

Morphogenesis requires coordination between genetic patterning and mechanical forces to robustly shape the cells and tissues. Hence, a challenge to ...

Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal and postnatal consequences. To ensure the innocuousness of ART applications, studies in animal models are necessary. In addition, as a last step, embryo development studies require evaluation of their capacity to develop full-term healthy offspring. Here, embryo transfer to the uterus is indispensable to perform any ARTs-related experiment.
The rabbit has been used as a model organism to study mammalian reproduction for over a century. In addition to its phylogenetic proximity to the human species and its small size and low maintenance cost, it has important reproductive characteristics such as induced ovulation, a chronology of early embryonic development similar to humans and a short gestation that allow us to study the consequences of ART application easily. Moreover, ARTs (such as intracytoplasmic sperm injection, embryo culture, or cryopreservation) are applied with suitable efficiency in this species.
Using the laparoscopic embryo transfer technique and the cryopreservation protocol presented in this article, we describe 1) how to transfer embryos through an easy, minimally invasive technique and 2) an effective protocol for long-term storage of rabbit embryos to provide time-flexible logistical capacities and the ability to transport the sample. The outcomes obtained after transferring rabbit embryos at different developmental stages indicate that morula is the ideal stage for rabbit embryo recovery and transfer. Thus, an oviductal embryo transfer is required, justifying the surgical procedure. Furthermore, rabbit morulae are successfully vitrified and laparoscopically transferred, proving the effectiveness of the described techniques.

Assisted reproductive techniques (ARTs) are in continuous evaluation to improve outcomes and reduce the associated risks. This manuscript describes a minimally invasive embryo transfer procedure with an efficient cryopreservation protocol that allows the use of rabbits as an ideal animal model of human reproduction.

ウサギモデルにおける最適胚期における低侵襲胚移植と胚ガラス化

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits are required to control this behavior. Failure to produce the rhythmic pattern of contractions can be indicative of neurological abnormalities. We previously found that defects in protein O-mannosylation, a posttranslational protein modification, affect the axon morphology of sensory neurons and result in abnormal coordinated muscle contractions in embryos. Here, we present a relatively simple method for recording and analyzing the pattern of peristaltic muscle contractions by live imaging of late stage embryos up to the point of hatching, which we used to characterize the muscle contraction phenotype of protein O-mannosyltransferase mutants. Data obtained from these recordings can be used to analyze muscle contraction waves, including frequency, direction of propagation and relative amplitude of muscle contractions at different body segments. We have also examined body posture and taken advantage of a fluorescent marker expressed specifically in muscles to accurately determine the position of the embryo midline. A similar approach can also be utilized to study various other behaviors during development, such as embryo rolling and hatching.

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Here, we present a method to record embryonic muscle contractions in Drosophila embryos in a non-invasive and detail-oriented manner.

ショウジョウバエ胚における筋収縮のライブイメージングと解析

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the number of novel cell lines is expected to increase. The DGRC aims to familiarize researchers with using Drosophila cell lines as an experimental tool to complement and drive their research agenda. Procedures for working with a variety of Drosophila cell lines with distinct characteristics are provided, including protocols for thawing, culturing, and cryopreserving cell lines. Importantly, this publication demonstrates the best practices required to work with Drosophila cell lines to minimize the risk of contaminations from adventitious microorganisms or from other cell lines. Researchers who become familiar with these procedures will be able to delve into the many applications that use Drosophila cultured cells including biochemistry, cell biology and functional genomics.

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Drosophila cell lines are important reagents for both fundamental and biomedical research. This article provides protocols for thawing, subculturing, and the cryopreservation of commonly used Drosophila cell lines to assist researchers in incorporating the use of these reagents in their research.

解凍、養殖、ショウジョウバエ細胞をトウキョウ

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...