Die Autoren danken den Mitgliedern des Veraksa-Labors für hilfreiche Kommentare zum Manuskript und Vorschläge für Protokollverbesserungen. AV wurde von den NIH-Stipendien GM105813 und NS096402 unterstützt. LY wurde von der University of Massachusetts Boston Sanofi Genzyme Doctoral Fellowship unterstützt.

1. Vorbereitung von 5 L Fliegenkäfigen (um 15 cm Platten zu passen) <ol><li> Erhalten Sie die benötigten Materialien: 5-Liter (4,7-L) Behälter mit Deckel (Abbildung 1A ), Nylongewebe und Rasierklinge. </li><li> Markieren Sie einen Kreis von 12 cm Durchmesser und schneiden Sie ein Loch in der Unterseite des Behälters mit dem Rasierklinge (Abbildung 1B ). Schneiden Sie ein Loch von 15 cm Durchmesser in den Deckel ( Abbildung 1C ). </li><li> Nylongewebe in 25 x 25 cm Quadrate schneiden. </li><li> Legen Sie das Netz über den oberen Rand des Behälters und drücken Sie mit dem Deckel nach unten (Abbildung 1C ). Stellen Sie sicher, dass das Netz fest ist und der Deckel nicht gekippt ist. Der Käfig ist bereit, mit Fliegen bevölkert zu werden (siehe Schritt 5.3). </li></ol> 2. Vorbereitung von 1 L Fliegenkäfigen (zur Anpassung von 10 cm Platten) <ol><li> Erhalten Sie die benötigten Materialien: einen Elektrobohrer, ein 3 Zoll (76 mm) Schneidwerkzeug (Abbildung 1E und FIgure 1F), ein geradliniges 1 l Plastikgefäß mit Deckel, Nylongewebe, Rasierklinge, Sandpapier, Schutzbrille und Arbeitshandschuhe. </li><li> Schneiden Sie 3 Zoll (76 mm) Löcher in den Boden und den Deckel des Plastikgefäßes (Abbildung 1G ), wobei der Deckel während des Bohrens fest auf den Behälter geschraubt wurde. Positionieren Sie das Schneidwerkzeug in der Mitte des Kreises, wenn Sie beginnen, ein Loch zu machen. Achtung: Bei diesem Schritt Augenschutz und Arbeitshandschuhe tragen. </li><li> Die Kanten der Löcher mit einem Rasierklinge und Sandpapier glätten. </li><li> Nylongewebe in 18 x 18 cm Quadrate schneiden. </li><li> Legen Sie das Netz über den oberen Rand des Gefäßes und ziehen Sie es fest, indem Sie den Deckel anziehen ( Abbildung 1G ). Stellen Sie sicher, dass das Netz fest ist und der Deckel nicht gekippt ist. Der Käfig ist bereit, mit Fliegen bevölkert zu werden (siehe Schritt 5.3). </li></ol> 3. Vorbereitung der Apfelsaft (AJ) Platten <ol><li> 19 g Agar und 1 l 18,2 MΩ · cm Wasser in einen 2 l-Kolben geben.Fügen Sie einen Rührstab hinzu und mischen Sie kurz. </li><li> Autoklav für 30 min. Mittlerweile konzentrieren sich 100% Apfelsaft aus gefrorenem Stamm und bereiten 10 ml 10% (Gewicht / Volumen) Methyl-4-hydroxybenzoat-Lösung in Ethanol vor. </li><li> Nach dem Autoklavieren mischen Sie den Agar auf eine Rührplatte und fügen Sie 80 ml 100% iges Apfelsaftkonzentrat und 10 ml 10% (Gewicht / Volumen) Methyl-4-hydroxybenzoat-Lösung in den Kolben ein. Bei Raumtemperatur bei konstantem Mischen abkühlen lassen. </li><li> Gießen Sie 15 cm Petrischalen (für 5 l Käfige) oder 10 cm Petrischalen (für 1 l Käfige), so dass der Grad des Agars in jeder Schale etwa 5 mm dick ist. Erlauben Sie bei Raumtemperatur zu verfestigen und wickeln Sie in Plastiktüten ein. AJ-Platten können bei 4 ° C für zwei Wochen gelagert werden. Hinweis: Petrischalen können gewaschen und wiederverwendet werden. </li><li> Bereiten Sie nasse Hefepaste vor: Gießen Sie einige aktive Trockenhefe in einen 100 ml-Behälter mit einem Deckel, der ein leichtes Mischen ermöglicht und Wasser in kleinen Mengen unter Rühren zugeben, um eine dicke, aber gründlich gemischte zu erhaltenPaste. Bei 4 ° C für bis zu 2 Wochen aufbewahren. </li></ol> 4. Vorbereitung von Lyse-Reagenzien <ol><li> Zubereitet 5x Lysepuffer: 250 mM Tris pH 7,5, 25% Glycerin, 1% Octylphenoxypoly (ethylenoxy) ethanol (IGEPAL CA-630), 7,5 mM MgCl 2 , 625 mM NaCl, 125 mM NaF, 5 mM Na 3 VO 4 . <ol><li> Zur Herstellung von 200 ml: 1 g NaF-Pulver und 184 mg Na 3 VO 4 -Pulver in 71 ml Wasser unter konstantem Rühren vollständig auflösen. Fügen Sie 50 ml 1 M Tris pH 7,5, 2 ml 100% IGEPAL, 1,5 ml 1 M MgCl 2 und 25 ml 5 M NaCl hinzu. Dann 50 ml Glycerin zugeben (zuletzt hinzufügen) und noch 1 h rühren lassen. </li><li> Filter-sterilisieren mit 250-ml-Filtereinheiten. Dieser Schritt kann langsam sein, aber das Filtern der Lösung ist wichtig, um unlösliche Partikel zu entfernen. Aliquot durch 10 ml in 50 ml Röhrchen und bei -80 ° C aufbewahren. </li></ol></li><li> 1 M Dithiothreitol (DTT) -Lösung in Wasser vorbereiten. Bei -20 ° C in 1 mL Aliquots lagern. </li><li> Erhalten Sie den SchutzAse-Inhibitor-Cocktail-Tabletten mit Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA). Bei 4 ° C aufbewahren. </li><li> Erhalten Sie 10 ml Spritzen und Spritzenfilter: 26 mm Durchmesser, Tensid-freie Celluloseacetat (SFCA) Membran, 0,45 μm Porengröße. </li></ol> 5. Sammlung von Fliegen-Embryonen <ol><li> Verstärken Sie die transgenen Fliegenschnüre, die das markierte Protein von Interesse in Flaschen (ungefähr 100 Fliegen pro Flasche) tragen, und übertragen Sie die Flaschen alle 2 Tage, bis 25-30 Flaschen für jede Fliegenschnur angesammelt werden. Verstärken Sie den Kontrollbestand ( zB die yw- Linie) in ähnlicher Weise. </li><li> Warm AJ Platten auf Raumtemperatur (ca. 1-2 Stunden, kann über Nacht gemacht werden). Mit einem behandschuhten Finger, verteilen Sie einige nasse Hefepaste in der Mitte der AJ-Platten, um eine ca. 6-cm-Kreis für eine 15 cm Platte und einen 4 cm-Kreis für eine 10 cm Platte. </li><li> Anästhesieren Sie die Fliegen mit einem Fluss von Kohlendioxid mit einem Standard Drosophila Bühnenaufbau und Transfer inDie Käfige (ca. 15 ausgewachsene Flaschen Fliegen pro 5 l Käfig, 5 Flaschen pro 1 l Käfig). <ol><li> Decken Sie den Käfigboden mit vorbereiteten AJ-Platten aus Schritt 5.2 ab und kleben Sie die AJ-Platte mit zwei Streifen Klebeband auf den Käfig ( Abb. 1D und 1H ). Es ist sinnvoll, die Spitzen des Bandes zu klappen, die über die Platte gehen, um ein leichtes Schälen beim Wechseln der Platten zu erzielen. </li><li> Nachdem die Fliegen sich von der Anästhesie erholen, halten Sie die Käfige mit den Platten an der Unterseite und mesh oben. Hinweis: Es ist wichtig zu warten, bis sich die Fliegen vollständig erholen, da sie sonst an der AJ-Platte und der Hefepaste haften bleiben. </li><li> Am Ende des Experiments, um den Käfig für die Reinigung vorzubereiten, legen Sie den Käfig in den Gefrierschrank für mehrere Stunden. Das Einweichen des Netzes in Wasser für ein paar Stunden erleichtert die Reinigung. </li></ol></li><li> Inkubieren Sie die Käfige mit Fliegen bei Raumtemperatur für 2-3 Tage und ändern AJ Platten zweimal täglich. Um die Teller zu wechseln, drehe den Käfig um,Schneide das Band von der Platte ab, halte aber den Teller an den Käfig, tippe den ganzen Käfig sanft auf die Bank und tausche schnell den alten Teller für einen neuen und versuche nicht, Fliegen zu entkommen. Anmerkung: Fliegen müssen sich an den Käfig anpassen und am besten ab dem 3. Tag liegen. Sie werden weiterhin ca. 4-5 Tage auf Höchststand legen. Zwei 5-l-Käfige bei oberer Verlegekapazität können bis zu 1 g Embryos in einer Übernacht-Sammlung produzieren. Verwenden Sie 1 L Käfige für kleinere Experimente. </li><li> Lassen Sie Fliegen Embryonen auf frischen AJ-Platten über Nacht (ca. 16 h) oder für jede andere gewünschte Zeitdauer. </li><li> Am nächsten Morgen, markieren und wiegen Mesh-Container für Embryo-Sammlung, eine pro Fliege Linie verwendet. </li><li> 4 Lysepuffer unter Verwendung von Reagenzien aus Abschnitt 4 vorbereiten (Hinweis: Der gebrauchsfertige 1x Lysepuffer muss vor der Extraktion vorbereitet werden): 40 ml Wasser zu 10 ml 5x konzentriertem Lysepuffer (bei -80 ° C gelagert) In einer 50 mL Röhre. <ol><li> 50 μl 1 MD zugebenTT bis zu einer Endkonzentration von 1 mM, gut vermischen und in zwei 50 ml Röhrchen, jeweils 25 ml, trennen. Zu einem der Röhrchen, füge eine Protease-Inhibitor-Tablette hinzu und drehe bei 4 ° C für 30 min. Während sich die Tablette auflöst, embryos sammeln und dechorionieren (Schritte 5.8 bis 6.6). Überprüfen Sie, um sicherzustellen, dass die Tablette vollständig aufgelöst ist, und halten Sie den Puffer auf Eis. Hinweis: Die zweite Röhre von 1x Puffer mit DTT kann bei -80 ° C gelagert werden und benötigt nur die Tablette vor dem nächsten Experiment. 25 ml Lysepuffer reichen für bis zu 2 Proben unter Berücksichtigung der nachfolgenden Waschungen während der Proteinreinigungsschritte aus. </li></ol></li><li> Markiere die AJ-Platten auf den Käfigen mit den Genotypen der Fliegenlinien und tausche die Teller für frische. Hinweis: Überschüssige Hefepaste kann bei diesem Schritt von der Platte abgeschabt werden. Embryos können auf den Platten bei 25 ° C oder Raumtemperatur gealtert werden, um das gewünschte Fenster der Entwicklungszeit zu erhalten. </li><li> Füge genug Wasser hinzu tO jede AJ-Platte abdecken. Die Embryonen vorsichtig mit einem weichen Pinsel (flacher Kopf ca. 10 mm breit gut für große Platten) ausziehen. Die Embryonen in den vorher gewogenen und markierten Netzbehälter gießen und überschüssiges Wasser abtropfen lassen. <ol><li> Wenn nötig, führen Sie eine zweite Spülung und Bürsten der Platte, um alle Embryonen zu entfernen. Kombinieren Sie die Embryonen aus der zusätzlichen Platte (n) für die gleiche Fliege Linie in den gleichen Mesh-Container. </li></ol></li><li> Das Netz auf Papierhandtücher kurz auftragen, um überschüssiges Wasser zu entfernen. </li></ol> 6. Embryo Dechorionierung <ol><li> Halbfill eine 6 cm Petrischale mit 50% Bleichmittel (vol / vol Lösung in Wasser). Anmerkung: Siehe wichtige Anmerkung über Bleichmittelmarke in der Tabelle der Materialien und Reagenzien. Achtung: Handschuhe tragen und Bleichmittel auf Kleidung vermeiden. </li><li> 2 größere Petrischalen mit Wasser zubereiten. </li><li> Tauchen Sie den Netzbehälter mit Embryonen in 50% Bleichmittel für 90 s ein. Tippen Sie das Ineinander greifen vorsichtig anBation ein paar Mal, um die Embryonen in der Bleichlösung zu suspendieren. </li><li> Am Ende der 90 s Inkubation, waschen Sie die Mesh-Container in jedem der 2 Gerichte mit Wasser für ca. 10 s. </li><li> Spülen Sie den Netzbehälter gründlich mit 18,2 MΩ · cm Wasser mit der Spritzflasche ab. Auch die Seiten und die Außenseite des Netzbehälters waschen. Hinweis: Nach einer gründlichen Wäsche sollte kein Bleichgeruch nachgewiesen werden. </li><li> Blättern Sie den Netzbehälter auf Papiertücher. Wiegen Sie den Maschenbehälter mit den Embryonen und subtrahieren Sie das Gewicht des in Schritt 5.6 erhaltenen leeren Behälters. Notieren Sie das resultierende Gewicht der Embryonen. Eine gute Menge an Embryonen zu erreichen ist 0,5 - 1 g. </li></ol> 7. Vorbereitung des Embryo-Extrakts <ol><li> Füge 1 ml Lysepuffer mit Protease-Inhibitoren (ab Schritt 5.7) zu einem Dounce-Glas-Homogenisator hinzu und halte ihn auf Eis. Übertragen Sie die Embryonen aus dem Netzbehälter in den Homogenisator. Anmerkung: Embryos können mit einem flachen Ende aufgenommen werden oFa Metallspatel oder Pinsel und direkt in den Puffer übertragen. Führen Sie alle Schritte in diesem Abschnitt auf Eis. </li><li> Die restlichen Embryos auf dem Netz mit einem zusätzlichen 1 ml Lysepuffer abwaschen und dem Material im Homogenisator zugeben. Lassen Sie die Embryos sich bis auf den Boden des Homogenisators niederlassen und sorgfältig den Überstand anstreben. </li><li> Fügen Sie Lysepuffer mit Protease-Inhibitoren (von Schritt 5.7) zum Homogenisator hinzu und zielen auf 5-6 ml Lysepuffer pro Gramm Embryos. </li><li> Homogenisieren Sie die Embryonen mit 4-6 Schlägen mit einer losen Passpistole. Hinweis: Während der ersten Striche gibt es mehr Widerstand. Versuchen Sie, die Stößel in einer kontinuierlichen Bewegung zu bewegen, um das Spritzen der Lösung zu vermeiden. </li><li> Homogenisieren Sie die Embryonen mit 8-10 Schlägen mit einer eng anliegenden Stößel. </li><li> Das Homogenat auf Eis für 20 min inkubieren. </li><li> Das Homogenat in Mikrozentrifugenröhrchen überführen und bei 4 ° C für 15 min bei Höchstgeschwindigkeit (ca. 13.000 xg) zentrifugieren. </li><li> AvoidiNg die Pellets und die sehr obere Lipidschicht, überführen die Überstände in frische Mikrozentrifugenröhrchen und zentrifugieren bei 4 ° C für 15 min bei Höchstgeschwindigkeit (ca. 13.000 xg). </li><li> Die Überstände sorgfältig mit 1 mL Spitze abspülen und in gekühlte 10 ml Spritzen mit 0,45 μm Filter auftragen (Aliquots der gleichen Probe in eine Spritze kombinieren). Schieben Sie die gesamte Lösung in ein markiertes 15-ml-Röhrchen auf Eis. Der Extrakt kann sofort für nachfolgende Proteinreinigungsexperimente verwendet oder in flüssigem Stickstoff eingefroren werden und bei -80 ° C für zukünftige Verwendung gehalten werden. Anmerkung: Es ist besser, die Extrakte eher als die Embryos einzufrieren, denn beim anschließenden Auftauen von Embryonen können Proteasen aktiviert und zum Proteinabbau führen. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Das hier vorgestellte Protokoll ist ein einfaches und allgemeines Verfahren für die Einrichtung von Drosophila- Populationskäfigen im mittleren Maßstab und die Herstellung von ganzzelligen Proteinextrakten aus Embryonen. Die resultierenden Extrakte können in einer Vielzahl von nachgeschalteten Anwendungen verwendet werden, wie die Reinigung von Proteinkomplexen auf Affinitätsharze. Es ist entscheidend, die Extraktionsschritte auf Eis durchzuführen und eine starke Proteasehemmung...

Genetische Bildschirme und in jüngster Zeit haben genomische Ansätze das Studium der biologischen Funktionen revolutioniert. Wichtige zelluläre Informationen sind jedoch in Proteinen und ihrem Ensemble von interagierenden Partnern codiert. Während traditionelle genetische Modifikatorbildschirme ratenbegrenzende Wegkomponenten identifizieren und indirekte Wechselwirkungen wiederherstellen können, liegt die Stärke der proteomischen Ansätze in ihrer Fähigkeit, vollständige unmittelbare Interaktionsnetze von interessanten Proteinen zu identifizieren. Proteomik ist also eine wertvolle orthogonale Methode, um biologische Systeme zu studieren und ergänzt Genomik, Transkriptomik und traditionelle genetische Bildschirme. Affinitätsreinigungs-Massenspektrometrie (AP-MS) hat sich als ein leistungsfähiger Ansatz zur Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen (PPIs) in ihrer nativen Umgebung in Zellen und Geweben 1 , 2 erwiesen. Diese Methode ermöglicht die Identifizierung von direkten oder indirekten Wechselwirkungen bei einer spezifischen EntwicklungAl-Stadien oder Gewebe-Kontexte, und wurde erfolgreich verwendet, um mehrere neuartige PPIs in einer Vielzahl von Entwicklungswegen zu identifizieren (siehe Referenz 1 ). Trotz des unbestrittenen Erfolgs von PPI-Studien wurden die meisten von ihnen in kultivierten Zellen durchgeführt, in denen die interessierenden &quot;Köder&quot; -Proteine ​​überexprimiert wurden. Es gibt zwei Probleme mit dem Studium von PPIs in der Zellkultur: Erstens kann eine spezifische Zelllinie keine vollständige Komplementierung von Wechselwirkungen aufgrund des Mangels an Expression bestimmter Proteine ​​liefern. Zweitens könnte eine hohe Überexpression, die gewöhnlich bei solchen Analysen verwendet wird, zu Artefakten führen, wie z. B. Proteinfehlfalten oder Identifizierung von falsch positiven Wechselwirkungen. Beide Einschränkungen können durch die Analyse von PPIs in vivo überwunden werden . Ein limitierender Schritt bei solchen Experimenten ist die Verfügbarkeit des Ausgangsmaterials zur Reinigung von Proteinkomplexen. Drosophila melanogaster ist seit langem als Modell für funktionelle Analyten verwendet wordenSis, und vor kurzem wurde auch gezeigt, dass es ein ausgezeichnetes System für das Studium von PPIs in vivo ist . Die Drosophila- Embryogenese stellt einen besonders attraktiven Gewebetyp dar, um PPIs zu untersuchen, da Embryonen leicht in großen Mengen gesammelt werden können und auch weil die meisten Gene (&gt; 88%) im Verlauf der Embryogenese exprimiert werden, so dass eine reiche in vivo- Umgebung für die Erkennung von relevanten Informationen bereitgestellt wird PPIs 3 Traditionell verwendeten biochemische Studien an Fliegen sehr große Embryosammlungen (100-150 g), wie sie für die Reinigung von funktionellen Transkriptionslysaten 4 , 5 notwendig sind . Bisherige AP-MS-Studien in Drosophila benötigten auch große Mengen an Embryonen (5-10 g), da sie sich auf einen zweistufigen Reinigungsansatz wie Tandem-Affinitätsreinigung (TAP) mit dem damit verbundenen Materialverlust bei jedem Schritt 6 stützten. Großes amounTs des Ausgangsmaterials erforderten die Einrichtung von Embryosammlungen in großen Populationskäfigen, die sowohl teuer sein können (wenn sie kommerziell gekauft werden) und zeitaufwändig, um 7 , 8 , 9 zu erhalten und zu reinigen. Jüngste Fortschritte bei der Entwicklung von Einstufen-Affinitätsreinigungsansätzen sowie die zunehmende Empfindlichkeit von Massenspektrometern haben die notwendige Menge an Ausgangsmaterial um eine Größenordnung reduziert. Unter Verwendung von Markierungen wie dem Streptavidin-bindenden Peptid (SBP) oder dem grün fluoreszierenden Protein (GFP) und ausgehend von weniger als 1 g Embryos ist es möglich, die Mengen des Köderproteins und die interagierenden Komponenten zu isolieren, die für die Identifizierung durch ausreichend sind Massenspektrometrie 10 , 11 . Das Ziel des hier vorgestellten Protokolls ist es, den Forschern Overco zu helfenMir eine wahrgenommene Barriere zur biochemischen Analyse von PPIs in vivo . Zu diesem Zweck stellen wir ein einfaches und kostengünstiges Verfahren zur Verfügung, um Drosophila- Embryos im mittleren Maßstab (0,5-1 g) zu sammeln, gefolgt von einer einstufigen Herstellung von ganzzelligen Proteinextrakten, die für die anschließende Analyse durch AP-MS oder andere Ansätze geeignet sind . Unsere Methode beruht auf der Verwendung von maßgeschneiderten 1-L- oder 5-L-Populationskäfigen, die von jedem Labor leicht hergestellt werden können. Weiterhin wurden die hier vorgestellten Extraktionsbedingungen in mehreren Studien sowohl in kultivierten Zellen als auch in vivo 10 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 validiert.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1384">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">Leaktite 5-Qt. Natural Multi Mix Container (Pack of 3)</td>
			<td style="width:183px;">Home Depot</td>
			<td style="width:119px;">209330</td>
			<td style="width:644px;">For making 5-L cages.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">Leaktite 5-Qt. Natural Multi Mix Lid (Pack of 3)</td>
			<td style="width:183px;">Home Depot</td>
			<td style="width:119px;">209320</td>
			<td style="width:644px;">Diameter 8.37 in. Lids for 5-L cages.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">Fisherbrand Petri dishes with clear lid, 100 x 15 mm</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">FB0875712</td>
			<td style="width:644px;">Material: Polystyrene. To be used with 1-L cages.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">Fisherbrand Petri dishes with clear lid, 150 x 15 mm</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">FB0875714</td>
			<td style="width:644px;">Material: Polystyrene. To be used with 5-L cages.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">Fisherbrand Petri dishes with clear lid, 60 x 15 mm</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">FB0875713A</td>
			<td style="width:644px;">Material: Polystyrene. Used during embryo dechorionation.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">Sefar NITEX nylon mesh</td>
			<td style="width:183px;">Sefar</td>
			<td style="width:119px;">03-180/44</td>
			<td style="width:644px;">180 micron, 44% open area, used for fly cages.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">Milwaukee 3 in. Hole Dozer Hole Saw with Arbor</td>
			<td style="width:183px;">Home Depot</td>
			<td style="width:119px;">49-56-9670</td>
			<td style="width:644px;">3 inch cutting tool for making 1-L cages.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:439px;">Nalgene Wide-Mouth Straight-Sided PMP Jars with White Polypropylene Screw Closure</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11-823-33</td>
			<td style="width:644px;">For making 1-L cages. Thermo Scientific cat # 21171000. Alternative 1-L containers can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">Red Star Active Dry Yeast, 2 pound pouch</td>
			<td style="width:183px;">Red Star&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:644px;">can be purchased from Amazon.com or other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">Frozen 100% Apple Juice Concentrate&#160;</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:644px;">can be purchased from a grocery store. Has to say &#34;100% apple juice&#34; on the can.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">Methyl 4-hydroxybenzoate</td>
			<td style="width:183px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:119px;">AC126965000</td>
			<td style="width:644px;">also known as methylparaben or Tegosept. Used as a preservative in AJ plates.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">IGEPAL CA-630 for molecular biology, 100 ml</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">I8896</td>
			<td style="width:644px;">used for preparing lysis buffer.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:439px;">Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with CN Membrane&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">09-740-2A</td>
			<td style="width:644px;">0.2 &#956;m pore size. Used for filtering 5x lysis buffer. Thermo Scientific cat # 1260020.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">CO-RO ROCHE cOmplete Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">11697498001</td>
			<td style="width:644px;">Vial of 20 tablets. Used for protease inhibition in lysis buffer.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">Corning SFCA syringe filters&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">09-754-21</td>
			<td style="width:644px;">SFCA membrane, diameter 26 mm, pore size 0.45 &#956;m. Used for filtering final extract samples.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">BD&#160;Luer-Lok Disposable Syringes without Needles</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14-823-2A</td>
			<td style="width:644px;">for filtering final extract samples. BD cat # 309604.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:439px;">Bleach</td>
			<td style="width:183px;">Clorox</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:644px;">used for embryo dechorionation at 50% (vol/vol) in water, can be purchased at any supermarket. It is important to use the Clorox brand, as other brands may result in incomplete dechorionation or may be toxic for embryos.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">Corning Costar Netwell Plates</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">07-200-213</td>
			<td style="width:644px;">mesh containers for embryo collections. 74 &#956;m mesh size, 6-well.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">Wheaton Dounce Tissue Grinders, capacity 15 ml</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">06-435B</td>
			<td style="width:644px;">homogenizer for embryos, with loose and tight pestles. Wheaton cat # 357544.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

medium-scale preparation of drosophila embryo extracts for proteomic experiments

Die Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen (PPIs) ist zu einem unverzichtbaren Ansatz geworden, um biologische Prozesse und Mechanismen wie Zell-Signalisierung, Organismusentwicklung und Krankheit zu untersuchen. Es ist oft wünschenswert, PPI-Informationen unter Verwendung von in vivo- Material zu erhalten, um die natürlichste und unvoreingenommenste Sicht auf die Interaktionsnetze zu gewinnen. Die Fruchtfliege Drosophila melanogaster ist eine hervorragende Plattform, um PPIs in vivo zu studieren, und eignet sich für einfache Ansätze zur Isolierung von Material für biochemische Experimente. Insbesondere stellen Fruchtfliege-Embryos eine bequeme Art von Gewebe dar, um PPIs zu untersuchen, aufgrund der Leichtigkeit des Sammelns von Tieren in diesem Entwicklungsstadium und der Tatsache, dass die Mehrheit der Proteine ​​in der Embryogenese exprimiert wird, wodurch eine relevante Umgebung bereitgestellt wird, um die meisten PPIs zu enthüllen. Hier stellen wir ein Protokoll für die Sammlung von Drosophila- Embryonen im mittleren Maßstab (0,5-1 g) vor, was eine ideale Menge für eine breite Palette vonProteomische Anwendungen, einschließlich der Analyse von PPIs durch Affinitätsreinigungs-Massenspektrometrie (AP-MS). Wir beschreiben unsere Entwürfe für 1 L und 5 L Käfige für Embryosammlungen, die in jedem Labor leicht und kostengünstig eingerichtet werden können. Wir bieten auch ein allgemeines Protokoll für Embryo-Sammlung und Proteinextraktion, um Lysate zu erzeugen, die direkt in nachgeschalteten Anwendungen wie AP-MS verwendet werden können. Unser Ziel ist es, allen Forschern ein zugängliches Mittel zu bieten, um die Analysen von PPIs in vivo durchzuführen.

Um die Verwendung dieses Protokolls in einem Protein-Komplex-Reinigungsexperiment zu veranschaulichen, erzeugten wir eine homozygote lebensfähige Fliegenlinie, Arm-EGFP-ERK , die EGFP- markierte Drosophila extrazelluläre signalregulierte Kinase (ERK, kodiert durch das gerollte Gen) unter der Kontrolle exprimiert Eines ubiquitisch ausgedrückten Gürteltier- ( Arm- ) Promotors 18 , <sup cla...

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Medium-scale Preparation of Drosophila Embryo Extracts for Proteomic Experiments

Ziel dieses Protokolls ist es, einen direkten und kostengünstigen Ansatz für die Sammlung von Drosophila- Embryonen im mittleren Maßstab (0,5-1 g) und die Herstellung von Proteinextrakten, die in nachgeschalteten proteomischen Anwendungen verwendet werden können, wie Affinitätsreinigungs-Massenspektrometrie (AP-MS ).

Mittelmaßnahme Vorbereitung von<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryoextrakte für Proteomversuche

Analysis of protein-protein interactions (PPIs) has become an indispensable approach to study biological processes and mechanisms, such as cell signaling, ...

medium-scale-preparation-drosophila-embryo-extracts-for-proteomic

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Medium-scale Preparation of Drosophila Embryo Extracts for Proteomic Experiments

7.8K Aufrufe.  University of Massachusetts Boston.  Ziel dieses Protokolls ist es, einen direkten und kostengünstigen Ansatz für die Sammlung von Drosophila- Embryonen im mittleren Maßstab (0,5-1 g) und die Herstellung von Proteinextrakten, die in nachgeschalteten proteomischen Anwendungen verwendet werden können, wie Affinitätsreinigungs-Massenspektrometrie (AP-MS ). 

Serie: Medium-scale Preparation of Drosophila Embryo Extracts for Proteomic Experiments

Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic conservation, as well as similarities in cellular, molecular, and physiological processes, with other vertebrates including humans. During early ontogeny, zebrafish embryos are optically transparent, allowing researchers to visualize the dynamics of organogenesis using a simple stereomicroscope. Microbead implantation is a method that enables tissue manipulation through the alteration of factors in local environments. This allows researchers to assay the effects of any number of signaling molecules of interest, such as secreted peptides, at specific spatial and temporal points within the developing embryo. Here, we detail a protocol for how to manipulate and implant beads during early zebrafish development.

The zebrafish is an excellent model system for genetic and developmental studies. Bead implantation is a valuable tissue manipulation technique that can be used to interrogate developmental mechanisms by introducing alterations in local cellular environments. This protocol describes how to perform microbead implantation in the zebrafish embryo.

Microbead Implantation im Zebrafischembryo

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Preparation of Mitochondrial Enriched Fractions for Metabolic Analysis in Drosophila

Since mitochondria play roles in amino acid metabolism, carbohydrate metabolism and fatty acid oxidation, defects in mitochondrial function often compromise the lives of those who suffer from these complex diseases. Detecting mitochondrial metabolic changes is vital to the understanding of mitochondrial disorders and mitochondrial responses to pharmacological agents. Although mitochondrial metabolism is at the core of metabolic regulation, the detection of subtle changes in mitochondrial metabolism may be hindered by the overrepresentation of other cytosolic metabolites obtained using whole organism or whole tissue extractions. 
Here we describe an isolation method that detected pronounced mitochondrial metabolic changes in Drosophila that were distinct between whole-fly and mitochondrial enriched preparations. To illustrate the sensitivity of this method, we used a set of Drosophila harboring genetically diverse mitochondrial DNAs (mtDNA) and exposed them to the drug rapamycin. Using this method we showed that rapamycin modifies mitochondrial metabolism in a mitochondrial-genotype-dependent manner. However, these changes are much more distinct in metabolomics studies when metabolites were extracted from mitochondrial enriched fractions. In contrast, whole tissue extracts only detected metabolic changes mediated by the drug rapamycin independently of mtDNAs.

Preparation of Mitochondrial Enriched Fractions for Metabolic Analysis in Drosophila

Mitochondria play central roles in the regulation of metabolism and homeostasis. Subtle changes in mitochondrial metabolism that affect organismal physiology could be difficult to detect in whole organism metabolomics studies. Here we describe an isolation method that enhances the detection of subtle metabolic shifts in Drosophila melanogaster.

Vorbereitung der Mitochondrial angereicherten Fraktionen für die Stoffwechselanalyse in<em&gt; Drosophila</em

Since mitochondria play roles in amino acid metabolism, carbohydrate metabolism and fatty acid oxidation, defects in mitochondrial function often ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

Imaging subzellulärer Strukturen in der Living Zebrafischembryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. Various propositions claim to have been important contributions to the understanding of the mechanical properties of cells and tissues in their spatiotemporal organization in different developmental and morphogenetic processes. However, due to the lack of reliable and accessible tools to measure material properties and tensional parameters in vivo, validating these hypotheses has been difficult. Here we present methods employing atomic force microscopy (AFM) and particle tracking with the aim of quantifying the mechanical properties of the intact zebrafish embryo yolk cell during epiboly. Epiboly is an early conserved developmental process whose study is facilitated by the transparency of the embryo. These methods are simple to implement, reliable, and widely applicable since they overcome intrusive interventions that could affect tissue mechanics. A simple strategy was applied for the mounting of specimens, AFM recording, and nanoparticle injections and tracking. This approach makes these methods easily adaptable to other developmental times or organisms.

The lack of tools to measure material properties and tensional parameters in vivo prevents validating their roles during development. We employed atomic force microscopy (AFM) and nanoparticle-tracking to quantify mechanical features on the intact zebrafish embryo yolk cell during epiboly. These methods are reliable and widely applicable avoiding intrusive interventions.

AFM und Microrheology in den Zebrafish Embryos Eigelb Zelle

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. ...

Effectiveness of the Air Stripping in Two Salmonid Fish, Rainbow Trout (Oncorhynchus Mykiss) and Brown Trout (Salmo Trutta Morpha fario)

Egg collection is one of the most crucial procedures during fish reproduction in salmonid hatcheries. Classic methods involve the use of hand massage on fish abdomens to expel the eggs. An alternative method uses the pressure of gas injected into the body cavity, which causes the subsequent release of the eggs. This method is believed to have less negative effects on both the welfare and egg quality of the broodstocks. Herein, we compare the results of air and hand stripping methods with respect to one-year survival and egg quantity and quality in two salmonid fish, rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) and brown trout (Salmo trutta morpha fario). Our results indicate that air stripping yielded a better quality of eggs and higher one-year survival rate in rainbow trout. In addition, air stripping resulted in lower mortality rate than the group subjected to hand stripping (25% vs. 35%). The pH and hatching rate of the hand stripped group was lower than those of the air stripped group. In the case of brown trout, the quality of eggs obtained by both hand and air-stripping methods was similar; however, the one-year losses in fish were higher in air stripped group (15% compared to 0% in hand stripped fish). Although the advantages of air stripping method over hand stripping in terms of egg quality might not be observed in all salmonid species, the air-stripping procedure might be a promising option to be adopted in hatcheries as it ensures a high level of reproducibility and efficiency.

Effectiveness of the Air Stripping in Two Salmonid Fish, Rainbow Trout Oncorhynchus Mykiss and Brown Trout Salmo Trutta Morpha fario

The principal aim of this study is to standardize and test the pneumatic method (air stripping) of collecting eggs in rainbow trout and brown trout. This method allows effective and simple collection of the eggs without the necessity of fish abdomen massage.

Wirksamkeit der Luft Stripping in zwei Lachsfische Fisch Regenbogenforelle (Oncorhynchus Mykiss) und Bachforelle (Salmo Trutta Morpha Fario)

Egg collection is one of the most crucial procedures during fish reproduction in salmonid hatcheries. Classic methods involve the use of hand massage on ...

Preparation of Drosophila Larval Samples for Gas Chromatography-Mass Spectrometry (GC-MS)-based Metabolomics

Recent advances in the field of metabolomics have established the fruit fly Drosophila melanogaster as a powerful genetic model for studying animal metabolism. By combining the vast array of Drosophila genetic tools with the ability to survey large swaths of intermediary metabolism, a metabolomics approach can reveal complex interactions between diet, genotype, life-history events, and environmental cues. In addition, metabolomics studies can discover novel enzymatic mechanisms and uncover previously unknown connections between seemingly disparate metabolic pathways. In order to facilitate more widespread use of this technology among the Drosophila community, here we provide a detailed protocol that describes how to prepare Drosophila larval samples for gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS)-based metabolomic analysis. Our protocol includes descriptions of larval sample collection, metabolite extraction, chemical derivatization, and GC-MS analysis. Successful completion of this protocol will allow users to measure the relative abundance of small polar metabolites, including amino acids, sugars, and organic acids involved in glycolysis and the TCA cycles.

Preparation of Drosophila Larval Samples for Gas Chromatography-Mass Spectrometry GC-MS-based Metabolomics

This protocol describes how to prepare Drosophila larvae for GC-MS-based metabolomic analysis.

Vorbereitung von Drosophila Larven Proben für Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS)-basierte Metabolomik

Recent advances in the field of metabolomics have established the fruit fly Drosophila melanogaster as a powerful genetic model for studying animal ...

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

Morphogenesis requires coordination between genetic patterning and mechanical forces to robustly shape the cells and tissues. Hence, a challenge to understand morphogenetic processes is to directly measure cellular forces and mechanical properties in vivo during embryogenesis. Here, we present a setup of optical tweezers coupled to a light sheet microscope, which allows to directly apply forces on cell-cell contacts of the early Drosophila embryo, while imaging at a speed of several frames per second. This technique has the advantage that it does not require the injection of beads into the embryo, usually used as intermediate probes on which optical forces are exerted. We detail step by step the implementation of the setup, and propose tools to extract mechanical information from the experiments. By monitoring the displacements of cell-cell contacts in real time, one can perform tension measurements and investigate cell contacts&#39; rheology.

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

We present a setup of optical tweezers coupled to a light sheet microscope, and its implementation to probe cell mechanics without beads in the Drosophila embryo.

Prüfende Zelle Mechanik mit Wulst-freie optische Pinzetten in Drosophila Embryos

Morphogenesis requires coordination between genetic patterning and mechanical forces to robustly shape the cells and tissues. Hence, a challenge to ...

Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal and postnatal consequences. To ensure the innocuousness of ART applications, studies in animal models are necessary. In addition, as a last step, embryo development studies require evaluation of their capacity to develop full-term healthy offspring. Here, embryo transfer to the uterus is indispensable to perform any ARTs-related experiment.
The rabbit has been used as a model organism to study mammalian reproduction for over a century. In addition to its phylogenetic proximity to the human species and its small size and low maintenance cost, it has important reproductive characteristics such as induced ovulation, a chronology of early embryonic development similar to humans and a short gestation that allow us to study the consequences of ART application easily. Moreover, ARTs (such as intracytoplasmic sperm injection, embryo culture, or cryopreservation) are applied with suitable efficiency in this species.
Using the laparoscopic embryo transfer technique and the cryopreservation protocol presented in this article, we describe 1) how to transfer embryos through an easy, minimally invasive technique and 2) an effective protocol for long-term storage of rabbit embryos to provide time-flexible logistical capacities and the ability to transport the sample. The outcomes obtained after transferring rabbit embryos at different developmental stages indicate that morula is the ideal stage for rabbit embryo recovery and transfer. Thus, an oviductal embryo transfer is required, justifying the surgical procedure. Furthermore, rabbit morulae are successfully vitrified and laparoscopically transferred, proving the effectiveness of the described techniques.

Assisted reproductive techniques (ARTs) are in continuous evaluation to improve outcomes and reduce the associated risks. This manuscript describes a minimally invasive embryo transfer procedure with an efficient cryopreservation protocol that allows the use of rabbits as an ideal animal model of human reproduction.

Minimal invasiven Embryotransfer und Embryo-Vitrifizierung auf der Optimal-Botn-Bühne im Kaninchenmodell

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits are required to control this behavior. Failure to produce the rhythmic pattern of contractions can be indicative of neurological abnormalities. We previously found that defects in protein O-mannosylation, a posttranslational protein modification, affect the axon morphology of sensory neurons and result in abnormal coordinated muscle contractions in embryos. Here, we present a relatively simple method for recording and analyzing the pattern of peristaltic muscle contractions by live imaging of late stage embryos up to the point of hatching, which we used to characterize the muscle contraction phenotype of protein O-mannosyltransferase mutants. Data obtained from these recordings can be used to analyze muscle contraction waves, including frequency, direction of propagation and relative amplitude of muscle contractions at different body segments. We have also examined body posture and taken advantage of a fluorescent marker expressed specifically in muscles to accurately determine the position of the embryo midline. A similar approach can also be utilized to study various other behaviors during development, such as embryo rolling and hatching.

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Here, we present a method to record embryonic muscle contractions in Drosophila embryos in a non-invasive and detail-oriented manner.

Live Imaging und Analyse von Muskelkontraktionen im Drosophila-Embryo

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the number of novel cell lines is expected to increase. The DGRC aims to familiarize researchers with using Drosophila cell lines as an experimental tool to complement and drive their research agenda. Procedures for working with a variety of Drosophila cell lines with distinct characteristics are provided, including protocols for thawing, culturing, and cryopreserving cell lines. Importantly, this publication demonstrates the best practices required to work with Drosophila cell lines to minimize the risk of contaminations from adventitious microorganisms or from other cell lines. Researchers who become familiar with these procedures will be able to delve into the many applications that use Drosophila cultured cells including biochemistry, cell biology and functional genomics.

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Drosophila cell lines are important reagents for both fundamental and biomedical research. This article provides protocols for thawing, subculturing, and the cryopreservation of commonly used Drosophila cell lines to assist researchers in incorporating the use of these reagents in their research.

Auftauen, Kultivierung und Cryopreserving Drosophila -Zell-Linien

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...