Los autores agradecen a los miembros del laboratorio de Veraksa comentarios útiles sobre el manuscrito y sugerencias para mejorar el protocolo. AV fue apoyado por el NIH subvenciones GM105813 y NS096402. LY recibió el apoyo de la Universidad de Massachusetts Boston Sanofi Genzyme Doctoral Fellowship.

1. Preparación de jaulas para moscas de 5 litros (para colocar placas de 15 cm) <ol><li> Obtenga los materiales necesarios: recipiente de 5 cuartos de galón (4.7-L) con tapa ( Figura 1A ), malla de nylon y una cuchilla de afeitar. </li><li> Marque un círculo de 12 cm de diámetro y corte un agujero en la parte inferior del recipiente usando la cuchilla de afeitar ( Figura 1B ). Corte un agujero de 15 cm de diámetro en la tapa ( Figura 1C ). </li><li> Corte la malla de nylon en cuadrados de 25 x 25 cm. </li><li> Coloque la malla sobre el borde superior del recipiente y presione hacia abajo con la tapa ( Figura 1C ). Asegúrese de que la malla esté apretada y la tapa no esté inclinada. La jaula está lista para ser poblada con moscas (vea el paso 5.3). </li></ol> 2. Preparación de jaulas de mosca de 1 L (para colocar placas de 10 cm) <ol><li> Obtenga los materiales necesarios: un taladro eléctrico, una herramienta de corte de 3 pulgadas (76 mm) ( Figura 1E y FFigura 1F), una jarra de plástico de 1 L de recto con tapa, malla de nylon, una hoja de afeitar, papel de lija, gafas y guantes de trabajo. </li><li> Corte los agujeros de 3 pulgadas (76 mm) en el fondo y la tapa del frasco de plástico ( Figura 1G ), con la tapa firmemente atornillada en el recipiente mientras se perfora. Coloque la herramienta de corte en el centro del círculo al comenzar a hacer un agujero. Precaución: Use protección para los ojos y guantes de trabajo durante este paso. </li><li> Suavizar los bordes de los agujeros con una hoja de afeitar y papel de lija. </li><li> Corte la malla de nylon en cuadrados de 18 x 18 cm. </li><li> Coloque la malla sobre el borde superior de la jarra y apriete atornillando la tapa ( Figura 1G ). Asegúrese de que la malla esté apretada y la tapa no esté inclinada. La jaula está lista para ser poblada con moscas (vea el paso 5.3). </li></ol> 3. Preparación de placas de jugo de manzana (AJ) <ol><li> Añadir 19 g de agar y 1 L de 18,2 MΩ · cm de agua en un matraz de 2 l.Añadir una barra de agitación, y mezclar brevemente. </li><li> Autoclave durante 30 min. Mientras tanto, descongelar el concentrado de jugo de manzana al 100% a partir de caldo congelado y preparar 10 ml de solución de 4-hidroxibenzoato de metilo al 10% (peso / volumen) en etanol. </li><li> Después de la esterilización en autoclave, comenzar a mezclar el agar sobre una placa de agitación, y agregar 80 ml de concentrado de jugo de manzana al 100% y 10 ml de solución de 4-hidroxibenzoato de metilo al 10% (peso / volumen) al matraz. Dejar enfriar a temperatura ambiente con mezcla constante. </li><li> Vierta platos de Petri de 15 cm (para jaulas de 5 L) o de Petri de 10 cm (para jaulas de 1 L) de manera que el nivel de agar en cada plato sea de aproximadamente 5 mm de espesor. Dejar solidificar a temperatura ambiente, y envolver en bolsas de plástico. Las placas AJ se pueden almacenar a 4 ° C durante dos semanas. Nota: Las placas de Petri se pueden lavar y reutilizar. </li><li> Preparar la pasta de levadura húmeda: verter una levadura seca activa en un recipiente de 100 ml con una tapa que permita una fácil mezcla y añadir agua en pequeñas cantidades mientras se agita, para obtener una mezcla gruesa pero bien mezcladapegar. Conservar a 4 ° C durante un máximo de 2 semanas. </li></ol> 4. Preparación de reactivos de lisis <ol><li> Preparar 5x tampón de lisis: 250 mM Tris pH 7,5, 25% glicerol, 1% octilfenoxi poli (etilenoxi) etanol (IGEPAL CA-630), 7,5 mM MgCl2, 625 mM NaCl, 125 mM NaF, 5 mM Na3VO4. <ol><li> Para hacer 200 mL: disolver completamente 1 g de polvo de NaF y 184 mg de Na3VO4 en polvo en 71 mL de agua con agitación constante. Añadir 50 ml de Tris 1 M a pH 7,5, 2 ml de IGEPAL al 100%, 1,5 ml de MgCl $ ₂ $ 1 M y 25 ml de NaCl 5 M. A continuación, añadir 50 ml de glicerol (añadir en último lugar) y seguir agitando durante 1 h. </li><li> Filtrar-esterilizar utilizando unidades de filtro de 250 ml. Este paso puede ser lento, pero la filtración de la solución es importante para eliminar las partículas insolubles. Alícuota de 10 ml en tubos de 50 ml y almacenar a -80 ° C. </li></ol></li><li> Preparar 1 M de ditiotreitol (DTT) en agua. Almacenar a -20 ° C en alícuotas de 1 ml. </li><li> Obtener proteAse, con ácido etilendiaminotetraacético (EDTA). Almacenar a 4 ° C. </li><li> Obtenga jeringas y filtros de jeringa de 10 ml: diámetro de 26 mm, membrana de acetato de celulosa libre de tensioactivos (SFCA), tamaño de poro de 0,45 μm. </li></ol> 5. Recolección de embriones mosca <ol><li> Ampliar las líneas de moscas transgénicas que llevan la proteína marcada de interés en botellas (aproximadamente 100 moscas por botella), y transferir las botellas cada 2 días hasta que se acumulen 25-30 botellas por cada línea de mosca. Ampliar el stock de control ( por ejemplo, la línea yw ) de una manera similar. </li><li> Se calientan las placas de AJ a temperatura ambiente (aproximadamente 1-2 h, se pueden hacer durante la noche). Utilizando un dedo enguantado, esparza una pasta de levadura húmeda en el centro de las placas de AJ, para hacer un aprox. Círculo de 6 cm para una placa de 15 cm y un círculo de 4 cm para una placa de 10 cm. </li><li> Anestesiar las moscas con un flujo de dióxido de carbono usando una configuración estándar de Drosophila y transferirlas aLas jaulas (aproximadamente 15 botellas bien cultivadas de moscas por jaula de 5 litros, 5 botellas por jaula de 1 litro). <ol><li> Cubra el fondo de la jaula con las placas AJ preparadas de la etapa 5.2 y tape la placa AJ en la jaula usando dos tiras de cinta ( Figuras 1D e 1H ). Es útil doblar sobre las puntas de la cinta que van sobre la placa para pelar fácil al cambiar las placas. </li><li> Después de que las moscas se recuperen de la anestesia, mantener las jaulas con las placas en la parte inferior y la malla en la parte superior. Nota: Es importante esperar hasta que las moscas se recuperen completamente, ya que de lo contrario se pegarán a la placa de AJ y pasta de levadura. </li><li> Al final del experimento, para preparar la jaula para la limpieza, coloque la jaula en el congelador durante varias horas. El remojo de la malla en agua durante unas horas facilitará la limpieza. </li></ol></li><li> Incubar las jaulas con moscas a temperatura ambiente durante 2-3 días y cambiar las placas AJ dos veces al día. Para cambiar las placas, gire la jaula boca abajo,Pelar la cinta de la placa, pero sostener el plato a la jaula, toque la jaula entera suavemente en el banco, y rápidamente cambiar el plato viejo por uno nuevo, tratando de no permitir que las moscas para escapar. Nota: Las moscas necesitan ajustarse a la jaula y pondrán mejor a partir del día 3. Seguirán poniéndose en el nivel máximo durante unos 4-5 días. Dos jaulas de 5 litros en capacidad máxima de colocación pueden producir hasta 1 g de embriones en una colección durante la noche. Utilizar jaulas de 1 L para experimentos de menor escala. </li><li> Permita que las moscas depositen embriones en placas frescas de AJ durante la noche (aproximadamente 16 horas), o para cualquier otro período de tiempo deseado. </li><li> A la mañana siguiente, marcar y pesar los contenedores de malla para la recolección de embriones, uno por cada línea de mosca utilizada. </li><li> Preparar un tampón de lisis 1x, utilizando los reactivos de la sección 4 (Nota: antes de la extracción se debe preparar un tampón de lisis listo para su uso): añadir 40 ml de agua a 10 ml de tampón de lisis concentrado 5x (almacenado a -80 ° C) En un tubo de 50 ml. <ol><li> Añadir 50 μl de 1 MDTT hasta una concentración final de 1 mM, mezclar bien y separar en dos tubos de 50 mL, 25 mL en cada uno. A uno de los tubos, añadir un comprimido de inhibidor de la proteasa y girar a 4 ° C durante 30 min. Mientras la tableta se está disolviendo, recoja y decocine los embriones (pasos 5.8 a 6.6). Compruebe que la tableta se haya disuelto completamente y mantenga el buffer en hielo. Nota: El segundo tubo de tampón 1x con DTT puede almacenarse a -80 ° C y sólo requerirá la adición de la tableta antes del siguiente experimento. 25 ml de tampón de lisis es suficiente para hasta 2 muestras, teniendo en cuenta los lavados posteriores durante las etapas de purificación de proteínas. </li></ol></li><li> Marque las placas de AJ en las jaulas con los genotipos de las líneas de mosca utilizadas, y cambie las placas por otras nuevas. Nota: El exceso de pasta de levadura se puede raspar de la placa en este paso. Los embriones se pueden envejecer en las placas a 25 ° C oa temperatura ambiente para obtener la ventana deseada de tiempo de desarrollo. </li><li> Añadir suficiente agua tO cubrir cada placa de AJ. Suavemente desalojar los embriones de la placa con un cepillo de pintura suave (cabeza plana de aproximadamente 10 mm de ancho funciona bien para placas grandes). Verter los embriones en el recipiente de malla previamente pesado y marcado, y drenar el exceso de agua. <ol><li> Si es necesario, realice un segundo enjuague y cepillado de la placa para eliminar todos los embriones. Combine los embriones de placas adicionales para la misma línea de mosca en el mismo recipiente de malla. </li></ol></li><li> Baje brevemente la malla sobre toallas de papel para eliminar el exceso de agua. </li></ol> 6. Dechorionation del embrión <ol><li> Llenar a medias una placa de Petri de 6 cm con un 50% de lejía (solución vol / vol en agua). Nota: Véase un comentario importante sobre la marca de blanqueador en la Tabla de Materiales y Reactivos. Precaución: Use guantes y evite que se leque la ropa. </li><li> Prepare 2 platos Petri más grandes con agua. </li><li> Sumerja el contenedor de malla con embriones en lejía al 50% durante 90 s. Toque suavemente la malla durante el incuUn par de veces para suspender los embriones en la solución de lejía. </li><li> Al final de la incubación de los 90 s, lavar el recipiente de malla en cada uno de los 2 platos con agua durante aproximadamente 10 s. </li><li> Enjuague bien el recipiente de malla con 18,2 MΩ · cm de agua usando la botella de chorros. También, lave los lados y el exterior del contenedor de malla. Nota: No se debe detectar ningún olor a blanqueo después de un lavado cuidadoso. </li><li> Seque el recipiente de malla sobre toallas de papel. Pesar el recipiente de malla con los embriones y restar el peso del recipiente vacío obtenido en el paso 5.6. Registre el peso resultante de los embriones. Una buena cantidad de embriones para apuntar es 0.5 - 1 g. </li></ol> 7. Preparación del extracto de embrión <ol><li> Añadir 1 ml de tampón de lisis con inhibidores de proteasa (del paso 5.7) a un homogeneizador de vidrio dounce y mantenerlo sobre hielo. Transferir los embriones del contenedor de malla al homogeneizador. Nota: Los embriones pueden ser recogidos con un extremo plano.Fa espátula de metal o un cepillo y se transfiere directamente en el buffer. Realice todos los pasos de esta sección en hielo. </li><li> Lavar los embriones restantes en la malla con un tampón de lisis adicional de 1 ml y agregar al material en el homogeneizador. Deje que los embriones se establezcan hasta el fondo del homogeneizador, y aspiren cuidadosamente el sobrenadante. </li><li> Añadir tampón de lisis con inhibidores de proteasa (del paso 5.7) al homogeneizador, con el objetivo de 5-6 ml de tampón de lisis por gramo de embriones. </li><li> Homogeneizar los embriones por 4-6 golpes con un pilón de ajuste holgado. Nota: Durante los primeros golpes, habrá más resistencia. Trate de mover el mazo en un movimiento continuo para evitar salpicar la solución. </li><li> Homogeneizar los embriones de 8-10 golpes con un mazo de ajuste apretado. </li><li> Incubar el homogeneizado en hielo durante 20 min. </li><li> Transferir el homogeneizado en tubos de microcentrífuga y centrifugar a 4 ° C durante 15 minutos a velocidad máxima (aproximadamente 13.000 xg). </li><li> EvitaLos gránulos y la capa lipídica superior, transferir los sobrenadantes a tubos de microcentrífuga frescos y centrifugar a 4 ° C durante 15 minutos a velocidad máxima (aproximadamente 13.000 xg). </li><li> Aspirar cuidadosamente los sobrenadantes con una punta de 1 ml y cargarlos en jeringas refrigeradas de 10 ml con filtros de 0,45 μm unidos (combinar alícuotas de la misma muestra en una jeringa). Empuje toda la solución en un tubo de 15 ml marcado sobre hielo. El extracto puede utilizarse inmediatamente para experimentos subsiguientes de purificación de proteínas o congelarse instantáneamente en nitrógeno líquido y mantenerse a -80 ° C para uso futuro. Nota: Es mejor congelar los extractos en lugar de los embriones, porque durante la descongelación posterior de los embriones las proteasas pueden activarse y provocar la degradación de las proteínas. </li></ol>

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Los autores no tienen nada que revelar.

El protocolo presentado aquí es un procedimiento simple y general para establecer jaulas de población de Drosophila a escala media y hacer extractos de proteína de células enteras de embriones. Los extractos resultantes pueden usarse en una variedad de aplicaciones aguas abajo, tales como la purificación de complejos de proteínas sobre resinas de afinidad. Es crítico realizar los pasos de extracción en hielo y utilizar una fuerte inhibición de la proteasa, para minimizar la degradación de la proteína...

Las pantallas genéticas y, más recientemente, los enfoques genómicos han revolucionado el estudio de las funciones biológicas. Sin embargo, la información celular importante se codifica en proteínas y su conjunto de socios que interactúan. Mientras que las pantallas modificadoras genéticas tradicionales pueden identificar componentes de vías limitantes y recuperar interacciones indirectas, la fortaleza de los enfoques proteómicos reside en su capacidad para identificar redes de interacción inmediata completas de proteínas de interés. La proteómica es, pues, un valioso método ortogonal para estudiar los sistemas biológicos y complementa la genómica, la transcriptómica y las pantallas genéticas tradicionales. La purificación de afinidad-espectrometría de masas (AP-MS) ha demostrado ser un poderoso enfoque para estudiar las interacciones proteína-proteína (IPP) en su entorno nativo en las células y tejidos [ 1 , 2] . Este método permite la identificación de interacciones directas o indirectas en un desarrollo específicoAl estadios o contextos de tejido, y se ha utilizado con éxito para identificar múltiples nuevos PPIs en una variedad de vías de desarrollo (revisado en la referencia 1 ). A pesar del éxito indiscutible de los estudios de PPI, la mayoría de ellos se han llevado a cabo en células cultivadas, en las que se sobreexpresaron las proteínas de &quot;cebo&quot; de interés. Hay dos problemas con el estudio de los IBP en el cultivo de células: en primer lugar, una línea celular específica puede no proporcionar un complemento completo de interacciones debido a la falta de expresión de ciertas proteínas. En segundo lugar, la sobreexpresión alta normalmente empleada en tales análisis podría conducir a artefactos tales como el replanteo de proteínas o la identificación de interacciones positivas falsas. Ambas limitaciones pueden ser superadas analizando PPI in vivo . Un paso limitante en tales experimentos es la disponibilidad del material de partida para purificar complejos de proteínas. Drosophila melanogaster se ha utilizado durante mucho tiempo como un modelo para el análisis funcionalSis, y recientemente también se ha demostrado ser un excelente sistema para el estudio de PPIs in vivo . La embriogénesis de Drosophila representa un tipo de tejido particularmente atractivo para estudiar los IBP, ya que los embriones pueden ser fácilmente recolectados en grandes cantidades, y también porque la mayoría de los genes (&gt; 88%) se expresan durante la embriogénesis, proporcionando así un rico entorno in vivo para detectar IPP 3 . Tradicionalmente, los estudios bioquímicos en moscas utilizaron colecciones de embriones a gran escala (100-150 g), como las necesarias para purificar los lisados ​​transcripcionales funcionales [ 4 , 5] . Estudios previos de AP-MS en Drosophila también requerían grandes cantidades de embriones (5-10 g), porque dependían de un enfoque de purificación en dos etapas como la purificación de afinidad en tándem (TAP), con la consiguiente pérdida de material en cada paso 6 . Gran cantidadSt de material de partida requirió la creación de colecciones de embriones en grandes jaulas de población, que pueden ser costosas (cuando se compran comercialmente) y consumir mucho tiempo para mantener y limpiar 7 , 8 , 9 . Los avances recientes en el desarrollo de enfoques de purificación por afinidad de un solo paso, así como la sensibilidad creciente de espectrómetros de masas, han reducido la cantidad necesaria de material de partida en un orden de magnitud. Usando etiquetas tales como el péptido de unión a la estreptavidina (SBP) o la proteína fluorescente verde (GFP) y partiendo de menos de 1 g de embriones, es posible aislar las cantidades de la proteína cebo y los componentes interactivos que serían suficientes para la identificación por Espectrometría de masas 10 , 11 . El objetivo del protocolo presentado aquí es ayudar a los investigadores aMe una barrera percibida para el análisis bioquímico de PPIs in vivo . Con este fin, proporcionamos un procedimiento sencillo y económico para recoger embriones de Drosophila a escala media (0,5-1 g), seguido de una etapa de preparación de extractos de proteínas de células enteras que son adecuados para el análisis posterior por AP-MS u otros enfoques . Nuestro método se basa en el uso de jaulas personalizadas de 1-L o 5-L que pueden ser producidas fácilmente por cualquier laboratorio. Además, las condiciones de extracción presentadas aquí han sido validadas en varios estudios, tanto en células cultivadas como in vivo 10 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 .

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1384">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">Leaktite 5-Qt. Natural Multi Mix Container (Pack of 3)</td>
			<td style="width:183px;">Home Depot</td>
			<td style="width:119px;">209330</td>
			<td style="width:644px;">For making 5-L cages.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">Leaktite 5-Qt. Natural Multi Mix Lid (Pack of 3)</td>
			<td style="width:183px;">Home Depot</td>
			<td style="width:119px;">209320</td>
			<td style="width:644px;">Diameter 8.37 in. Lids for 5-L cages.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">Fisherbrand Petri dishes with clear lid, 100 x 15 mm</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">FB0875712</td>
			<td style="width:644px;">Material: Polystyrene. To be used with 1-L cages.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">Fisherbrand Petri dishes with clear lid, 150 x 15 mm</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">FB0875714</td>
			<td style="width:644px;">Material: Polystyrene. To be used with 5-L cages.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">Fisherbrand Petri dishes with clear lid, 60 x 15 mm</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">FB0875713A</td>
			<td style="width:644px;">Material: Polystyrene. Used during embryo dechorionation.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">Sefar NITEX nylon mesh</td>
			<td style="width:183px;">Sefar</td>
			<td style="width:119px;">03-180/44</td>
			<td style="width:644px;">180 micron, 44% open area, used for fly cages.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">Milwaukee 3 in. Hole Dozer Hole Saw with Arbor</td>
			<td style="width:183px;">Home Depot</td>
			<td style="width:119px;">49-56-9670</td>
			<td style="width:644px;">3 inch cutting tool for making 1-L cages.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:439px;">Nalgene Wide-Mouth Straight-Sided PMP Jars with White Polypropylene Screw Closure</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11-823-33</td>
			<td style="width:644px;">For making 1-L cages. Thermo Scientific cat # 21171000. Alternative 1-L containers can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">Red Star Active Dry Yeast, 2 pound pouch</td>
			<td style="width:183px;">Red Star&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:644px;">can be purchased from Amazon.com or other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">Frozen 100% Apple Juice Concentrate&#160;</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:644px;">can be purchased from a grocery store. Has to say &#34;100% apple juice&#34; on the can.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">Methyl 4-hydroxybenzoate</td>
			<td style="width:183px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:119px;">AC126965000</td>
			<td style="width:644px;">also known as methylparaben or Tegosept. Used as a preservative in AJ plates.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">IGEPAL CA-630 for molecular biology, 100 ml</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">I8896</td>
			<td style="width:644px;">used for preparing lysis buffer.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:439px;">Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with CN Membrane&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">09-740-2A</td>
			<td style="width:644px;">0.2 &#956;m pore size. Used for filtering 5x lysis buffer. Thermo Scientific cat # 1260020.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">CO-RO ROCHE cOmplete Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">11697498001</td>
			<td style="width:644px;">Vial of 20 tablets. Used for protease inhibition in lysis buffer.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">Corning SFCA syringe filters&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">09-754-21</td>
			<td style="width:644px;">SFCA membrane, diameter 26 mm, pore size 0.45 &#956;m. Used for filtering final extract samples.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">BD&#160;Luer-Lok Disposable Syringes without Needles</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14-823-2A</td>
			<td style="width:644px;">for filtering final extract samples. BD cat # 309604.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:439px;">Bleach</td>
			<td style="width:183px;">Clorox</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:644px;">used for embryo dechorionation at 50% (vol/vol) in water, can be purchased at any supermarket. It is important to use the Clorox brand, as other brands may result in incomplete dechorionation or may be toxic for embryos.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">Corning Costar Netwell Plates</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">07-200-213</td>
			<td style="width:644px;">mesh containers for embryo collections. 74 &#956;m mesh size, 6-well.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">Wheaton Dounce Tissue Grinders, capacity 15 ml</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">06-435B</td>
			<td style="width:644px;">homogenizer for embryos, with loose and tight pestles. Wheaton cat # 357544.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

medium-scale preparation of drosophila embryo extracts for proteomic experiments

El análisis de las interacciones proteína-proteína (IPP) se ha convertido en un enfoque indispensable para estudiar los procesos y mecanismos biológicos, como la señalización celular, el desarrollo del organismo y las enfermedades. A menudo es deseable obtener información PPI utilizando material in vivo , para obtener la visión más natural e imparcial de las redes de interacción. La mosca de la fruta Drosophila melanogaster es una excelente plataforma para estudiar PPIs in vivo , y se presta a enfoques sencillos para aislar material para experimentos bioquímicos. En particular, los embriones de mosca de la fruta representan un tipo conveniente de tejido para estudiar los IBP, debido a la facilidad de recolección de animales en esta etapa de desarrollo y el hecho de que la mayoría de las proteínas se expresan en embriogénesis, proporcionando un entorno relevante para revelar la mayoría de los IBP. Aquí presentamos un protocolo para la recogida de embriones Drosophila a escala media (0,5-1 g), que es una cantidad ideal para una amplia gama deAplicaciones proteómicas, incluyendo análisis de PPIs por purificación por afinidad-espectrometría de masas (AP-MS). Describimos nuestros diseños para jaulas de 1 L y 5 L para colecciones de embriones que pueden ser instaladas fácil y económicamente en cualquier laboratorio. También proporcionamos un protocolo general para la recolección de embriones y la extracción de proteínas para generar lisados ​​que pueden ser utilizados directamente en aplicaciones descendentes como AP-MS. Nuestro objetivo es proporcionar un medio accesible para que todos los investigadores lleven a cabo los análisis de los IPP in vivo .

Para ilustrar el uso de este protocolo en un experimento de purificación de complejos de proteínas, se generó una línea de mosca viable homocigótica, brazo-EGFP-ERK , que expresa EGFP marcado con Drosophila extracelular señal regulada quinasa (ERK, codificado por el rollo de genes) bajo el control De un promotor de armadillo ( brazo ) expresado de forma ubicua 18 , 19 . El promot...

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Medium-scale Preparation of Drosophila Embryo Extracts for Proteomic Experiments

El objetivo de este protocolo es proporcionar un enfoque sencillo y barato para recolectar embriones de Drosophila a escala media (0,5-1 g) y preparar extractos de proteínas que pueden ser utilizados en aplicaciones proteómicas aguas abajo, tales como la purificación por afinidad-espectrometría de masas (AP-MS ).

Preparación a mediano plazo de<em&gt; Drosophila</em&gt; Extractos de embriones para experimentos proteómicos

Analysis of protein-protein interactions (PPIs) has become an indispensable approach to study biological processes and mechanisms, such as cell signaling, ...

medium-scale-preparation-drosophila-embryo-extracts-for-proteomic

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Medium-scale Preparation of Drosophila Embryo Extracts for Proteomic Experiments

7.8K vistas.  University of Massachusetts Boston.  El objetivo de este protocolo es proporcionar un enfoque sencillo y barato para recolectar embriones de Drosophila a escala media (0,5-1 g) y preparar extractos de proteínas que pueden ser utilizados en aplicaciones proteómicas aguas abajo, tales como la purificación por afinidad-espectrometría de masas (AP-MS ). 

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Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic conservation, as well as similarities in cellular, molecular, and physiological processes, with other vertebrates including humans. During early ontogeny, zebrafish embryos are optically transparent, allowing researchers to visualize the dynamics of organogenesis using a simple stereomicroscope. Microbead implantation is a method that enables tissue manipulation through the alteration of factors in local environments. This allows researchers to assay the effects of any number of signaling molecules of interest, such as secreted peptides, at specific spatial and temporal points within the developing embryo. Here, we detail a protocol for how to manipulate and implant beads during early zebrafish development.

The zebrafish is an excellent model system for genetic and developmental studies. Bead implantation is a valuable tissue manipulation technique that can be used to interrogate developmental mechanisms by introducing alterations in local cellular environments. This protocol describes how to perform microbead implantation in the zebrafish embryo.

Microbead Implantación en el embrión de pez cebra

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Preparation of Mitochondrial Enriched Fractions for Metabolic Analysis in Drosophila

Since mitochondria play roles in amino acid metabolism, carbohydrate metabolism and fatty acid oxidation, defects in mitochondrial function often compromise the lives of those who suffer from these complex diseases. Detecting mitochondrial metabolic changes is vital to the understanding of mitochondrial disorders and mitochondrial responses to pharmacological agents. Although mitochondrial metabolism is at the core of metabolic regulation, the detection of subtle changes in mitochondrial metabolism may be hindered by the overrepresentation of other cytosolic metabolites obtained using whole organism or whole tissue extractions. 
Here we describe an isolation method that detected pronounced mitochondrial metabolic changes in Drosophila that were distinct between whole-fly and mitochondrial enriched preparations. To illustrate the sensitivity of this method, we used a set of Drosophila harboring genetically diverse mitochondrial DNAs (mtDNA) and exposed them to the drug rapamycin. Using this method we showed that rapamycin modifies mitochondrial metabolism in a mitochondrial-genotype-dependent manner. However, these changes are much more distinct in metabolomics studies when metabolites were extracted from mitochondrial enriched fractions. In contrast, whole tissue extracts only detected metabolic changes mediated by the drug rapamycin independently of mtDNAs.

Preparation of Mitochondrial Enriched Fractions for Metabolic Analysis in Drosophila

Mitochondria play central roles in the regulation of metabolism and homeostasis. Subtle changes in mitochondrial metabolism that affect organismal physiology could be difficult to detect in whole organism metabolomics studies. Here we describe an isolation method that enhances the detection of subtle metabolic shifts in Drosophila melanogaster.

Preparación de mitocondriales enriquecidos fracciones de Análisis metabólico en<em&gt; Drosophila</em

Since mitochondria play roles in amino acid metabolism, carbohydrate metabolism and fatty acid oxidation, defects in mitochondrial function often ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

La formación de imágenes estructuras subcelulares en el embrión vivo de pez cebra

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. Various propositions claim to have been important contributions to the understanding of the mechanical properties of cells and tissues in their spatiotemporal organization in different developmental and morphogenetic processes. However, due to the lack of reliable and accessible tools to measure material properties and tensional parameters in vivo, validating these hypotheses has been difficult. Here we present methods employing atomic force microscopy (AFM) and particle tracking with the aim of quantifying the mechanical properties of the intact zebrafish embryo yolk cell during epiboly. Epiboly is an early conserved developmental process whose study is facilitated by the transparency of the embryo. These methods are simple to implement, reliable, and widely applicable since they overcome intrusive interventions that could affect tissue mechanics. A simple strategy was applied for the mounting of specimens, AFM recording, and nanoparticle injections and tracking. This approach makes these methods easily adaptable to other developmental times or organisms.

The lack of tools to measure material properties and tensional parameters in vivo prevents validating their roles during development. We employed atomic force microscopy (AFM) and nanoparticle-tracking to quantify mechanical features on the intact zebrafish embryo yolk cell during epiboly. These methods are reliable and widely applicable avoiding intrusive interventions.

AFM y Microrheology en la celda de yema de embrión de pez cebra

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. ...

Effectiveness of the Air Stripping in Two Salmonid Fish, Rainbow Trout (Oncorhynchus Mykiss) and Brown Trout (Salmo Trutta Morpha fario)

Egg collection is one of the most crucial procedures during fish reproduction in salmonid hatcheries. Classic methods involve the use of hand massage on fish abdomens to expel the eggs. An alternative method uses the pressure of gas injected into the body cavity, which causes the subsequent release of the eggs. This method is believed to have less negative effects on both the welfare and egg quality of the broodstocks. Herein, we compare the results of air and hand stripping methods with respect to one-year survival and egg quantity and quality in two salmonid fish, rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) and brown trout (Salmo trutta morpha fario). Our results indicate that air stripping yielded a better quality of eggs and higher one-year survival rate in rainbow trout. In addition, air stripping resulted in lower mortality rate than the group subjected to hand stripping (25% vs. 35%). The pH and hatching rate of the hand stripped group was lower than those of the air stripped group. In the case of brown trout, the quality of eggs obtained by both hand and air-stripping methods was similar; however, the one-year losses in fish were higher in air stripped group (15% compared to 0% in hand stripped fish). Although the advantages of air stripping method over hand stripping in terms of egg quality might not be observed in all salmonid species, the air-stripping procedure might be a promising option to be adopted in hatcheries as it ensures a high level of reproducibility and efficiency.

Effectiveness of the Air Stripping in Two Salmonid Fish, Rainbow Trout Oncorhynchus Mykiss and Brown Trout Salmo Trutta Morpha fario

The principal aim of this study is to standardize and test the pneumatic method (air stripping) of collecting eggs in rainbow trout and brown trout. This method allows effective and simple collection of the eggs without the necessity of fish abdomen massage.

Eficacia de la extracción de aire en dos peces salmónidos, trucha arco iris (Oncorhynchus Mykiss) y trucha (Salmo Trutta Morpha fario)

Egg collection is one of the most crucial procedures during fish reproduction in salmonid hatcheries. Classic methods involve the use of hand massage on ...

Preparation of Drosophila Larval Samples for Gas Chromatography-Mass Spectrometry (GC-MS)-based Metabolomics

Recent advances in the field of metabolomics have established the fruit fly Drosophila melanogaster as a powerful genetic model for studying animal metabolism. By combining the vast array of Drosophila genetic tools with the ability to survey large swaths of intermediary metabolism, a metabolomics approach can reveal complex interactions between diet, genotype, life-history events, and environmental cues. In addition, metabolomics studies can discover novel enzymatic mechanisms and uncover previously unknown connections between seemingly disparate metabolic pathways. In order to facilitate more widespread use of this technology among the Drosophila community, here we provide a detailed protocol that describes how to prepare Drosophila larval samples for gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS)-based metabolomic analysis. Our protocol includes descriptions of larval sample collection, metabolite extraction, chemical derivatization, and GC-MS analysis. Successful completion of this protocol will allow users to measure the relative abundance of small polar metabolites, including amino acids, sugars, and organic acids involved in glycolysis and the TCA cycles.

Preparation of Drosophila Larval Samples for Gas Chromatography-Mass Spectrometry GC-MS-based Metabolomics

This protocol describes how to prepare Drosophila larvae for GC-MS-based metabolomic analysis.

Preparación de muestras de larvas de Drosophila para cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS)-base metabolómica

Recent advances in the field of metabolomics have established the fruit fly Drosophila melanogaster as a powerful genetic model for studying animal ...

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

Morphogenesis requires coordination between genetic patterning and mechanical forces to robustly shape the cells and tissues. Hence, a challenge to understand morphogenetic processes is to directly measure cellular forces and mechanical properties in vivo during embryogenesis. Here, we present a setup of optical tweezers coupled to a light sheet microscope, which allows to directly apply forces on cell-cell contacts of the early Drosophila embryo, while imaging at a speed of several frames per second. This technique has the advantage that it does not require the injection of beads into the embryo, usually used as intermediate probes on which optical forces are exerted. We detail step by step the implementation of the setup, and propose tools to extract mechanical information from the experiments. By monitoring the displacements of cell-cell contacts in real time, one can perform tension measurements and investigate cell contacts&#39; rheology.

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

We present a setup of optical tweezers coupled to a light sheet microscope, and its implementation to probe cell mechanics without beads in the Drosophila embryo.

Sondeo de la célula mecánica con pinzas ópticas libres de grano en el embrión de Drosophila

Morphogenesis requires coordination between genetic patterning and mechanical forces to robustly shape the cells and tissues. Hence, a challenge to ...

Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal and postnatal consequences. To ensure the innocuousness of ART applications, studies in animal models are necessary. In addition, as a last step, embryo development studies require evaluation of their capacity to develop full-term healthy offspring. Here, embryo transfer to the uterus is indispensable to perform any ARTs-related experiment.
The rabbit has been used as a model organism to study mammalian reproduction for over a century. In addition to its phylogenetic proximity to the human species and its small size and low maintenance cost, it has important reproductive characteristics such as induced ovulation, a chronology of early embryonic development similar to humans and a short gestation that allow us to study the consequences of ART application easily. Moreover, ARTs (such as intracytoplasmic sperm injection, embryo culture, or cryopreservation) are applied with suitable efficiency in this species.
Using the laparoscopic embryo transfer technique and the cryopreservation protocol presented in this article, we describe 1) how to transfer embryos through an easy, minimally invasive technique and 2) an effective protocol for long-term storage of rabbit embryos to provide time-flexible logistical capacities and the ability to transport the sample. The outcomes obtained after transferring rabbit embryos at different developmental stages indicate that morula is the ideal stage for rabbit embryo recovery and transfer. Thus, an oviductal embryo transfer is required, justifying the surgical procedure. Furthermore, rabbit morulae are successfully vitrified and laparoscopically transferred, proving the effectiveness of the described techniques.

Assisted reproductive techniques (ARTs) are in continuous evaluation to improve outcomes and reduce the associated risks. This manuscript describes a minimally invasive embryo transfer procedure with an efficient cryopreservation protocol that allows the use of rabbits as an ideal animal model of human reproduction.

Transferencia de embriones mínimamente invasiva y vitrificación de embriones en la etapa óptima del embrión en el modelo Rabbit

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits are required to control this behavior. Failure to produce the rhythmic pattern of contractions can be indicative of neurological abnormalities. We previously found that defects in protein O-mannosylation, a posttranslational protein modification, affect the axon morphology of sensory neurons and result in abnormal coordinated muscle contractions in embryos. Here, we present a relatively simple method for recording and analyzing the pattern of peristaltic muscle contractions by live imaging of late stage embryos up to the point of hatching, which we used to characterize the muscle contraction phenotype of protein O-mannosyltransferase mutants. Data obtained from these recordings can be used to analyze muscle contraction waves, including frequency, direction of propagation and relative amplitude of muscle contractions at different body segments. We have also examined body posture and taken advantage of a fluorescent marker expressed specifically in muscles to accurately determine the position of the embryo midline. A similar approach can also be utilized to study various other behaviors during development, such as embryo rolling and hatching.

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Here, we present a method to record embryonic muscle contractions in Drosophila embryos in a non-invasive and detail-oriented manner.

Imagen en vivo y análisis de contracciones musculares en Drosophila Embryo

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the number of novel cell lines is expected to increase. The DGRC aims to familiarize researchers with using Drosophila cell lines as an experimental tool to complement and drive their research agenda. Procedures for working with a variety of Drosophila cell lines with distinct characteristics are provided, including protocols for thawing, culturing, and cryopreserving cell lines. Importantly, this publication demonstrates the best practices required to work with Drosophila cell lines to minimize the risk of contaminations from adventitious microorganisms or from other cell lines. Researchers who become familiar with these procedures will be able to delve into the many applications that use Drosophila cultured cells including biochemistry, cell biology and functional genomics.

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Drosophila cell lines are important reagents for both fundamental and biomedical research. This article provides protocols for thawing, subculturing, and the cryopreservation of commonly used Drosophila cell lines to assist researchers in incorporating the use of these reagents in their research.

Descongelación, cultivo y criopreservación de líneas de células de Drosophila

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...