この仕事に支えられた Ministerio デ Economía y Competitividad (MINECO)、セルバンテス ・ デ ・ サラッド カルロス III (ISCIII) (許可番号 IERPY 1149/16 アダムローリー; にMPY 1410/09 s. Hortelano に);で、フォンド ・ デ ・危惧サラッド (FIS) (S. Hortelano に番号 PI11.0036 および PI14.0055 を付与) を介して MINECO。S. エランス ・ ISCIII から IERPY 1149/16 に対応しました。

1 です血管内皮細胞培養 37 ° C で 30 分間 <ol><li><ol><li>2.5 mL ゼラチンでコート 100 mm 組織培養プレートを 培養処理板 のソリューション (蒸留水のオートクレーブ、ゼラチン 0.1%); これ。必要な井戸のフォーマットに推測することができます。ゼラチン溶液を吸引し、ティッシュ文化フードで風乾するプレートのままにします</li>。
	</ol></li> <li>組織培養条件 <ol><li>(37 ° C、湿度 95%、5% CO 2) 生物インキュベータ内 MLEC 04 細胞を養います。ダルベッコの完全なメディアのセルを育てる &#39; s 修正イーグル培地: 栄養混合物 F-12 (DMEM/F-12) 10% 胎仔ウシ血清 (FBS) と 100 単位/ml ペニシリン ストレプトマイシン 100 μ g/mL (P/S) と補完</li>。
		<li>標準ノイバウアー チャンバー法によるセルをカウントし、MLEC 04 セルを 10 mL の完全なメディア、2-11 × 10 4 セル/cm 2 の低密度で 100 mm のゼラチン処理版に追加します。合流点に達すると 1:3 のセルを分割します 。
		注: 通常これは文化で 2 〜 3 日後に発生します</li>。
		<li>サブカルチャー 10 ml 滅菌リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 2 mL のトリプシン-EDTA 溶液 (0.25% トリプシン、5 ミリメートルの EDTA) を追加することによって続いて、37 で 3 分間インキュベート プレートを洗浄することによりセル ° C</li>
		<li>は、トリプシン-EDTA 反応を停止し、10 mL の完全なメディアを追加することによって浮遊細胞を回復します。スピン ・ ダウン (300 × g、5 分) 細胞、上澄みを廃棄、適切に完全なメディアとサブカルチャーの細胞のペレットを再懸濁します</li>。
	</ol></li></ol> 2。LPS 処理とメディエーター <ol><li>プレートの次の井戸のフォーマットにサブの合流点での完全なメディアの MLEC 04 細胞: 細胞/ウェル 6 ウェル プレートで 2.5 10 5 細胞/ウェルの 96 ウェル プレート x 7 x 10 5</li>。
	<li>では、6 h (37 ° C、湿度 95%、5% CO 2) セルのインキュベーターでの培養を孵化させなさい。不完全なメディア (DMEM f12 キー、P/S) にセルを切り替え、同期して細胞の活動を抑える (上) 一晩を残しています</li>。
	<li>メディアを取り出し、培養内皮細胞 (またはしない) 新規の薬理学的化合物をテスト薬物問題の (例えば DT 10) 不完全なメディア (30 分、37 ° C) で希釈した; 1.4 mL を追加/6 ウェル プレートまたは 0.14 のよくmL/ウェルの 96 ウェル プレート).</li>
	<li>分析では各指定期間インキュベーション メディア (100 ng/mL、最終濃度) に組合を追加してセルに挑戦します。コントロールとして PBS を使用します</li>。
</ol> 3。RT qPCR による活性化血管内皮細胞の転写プロファイルの評価 <ol><li>6 も培養でサブの合流でシード MLEC 04 セル板 (7 x 10 5 細胞/ウェル)。(37 ° C、湿度 95%、5% CO 2) 6 時間インキュベートし、その後血清飢餓に進みます (の孵化).</li>
	<li>メディアを取り出し、興味の薬剤と文化 (37 ° C、30 分インキュベート) 不完全なメディアで希釈した; 1.4 mL を追加/6 ウェル プレート (30 分、37 ° C) にも血管内皮細胞を治療 (または治療しない).</li>
	<li>(2.3 の手順で説明) の培養メディアを 100 ng/mL LPS を追加することによって、細胞に挑戦し、孵化 6 h 冷 PBS で 2 回洗浄することにより反応を停止するため、サンプル処理まで-80 ° C でプレートを維持します</li>。
	<li>RNA の抽出 <ol><li>プレートを解凍し、1 mL/ウェル RNA 抽出バッファー (38% フェノールと 0.8 M ためイソチオ シアン酸; 材料の表を参照) を追加します。1.5 mL チューブ内の攪拌と収集ホモジネートの下で室温 (RT) で 30 分残す</li>。
		<li>200 μ L のクロロホルムを追加し、RT と遠心分離機 (11,600 × g、15 分間、4 ° C) で 3 分間 15 s. 加温のため軽く揺り動かす</li>。
		<li>は、別 1.5 mL チューブに液相を転送します。RT し遠心分離 (11,600 x g、4 ° C) で、10 分で 500 μ L のイソプロパノールを追加することによって RNA を沈殿します</li>。
		<li>上澄みを廃棄し、渦攪拌と (7,500 × g, 4 ° C)、遠心分離による 75% のエタノールの餌を洗浄します</li>。
		<li>ペレットを風乾、サンプル処理まで-80 ° c 55 ° C 続ける RNA で 10 分間インキュベートし、25 μ L 純粋な H 2 O の RNA を可溶化します</li>。
	</ol></li> <li>量と RNA の純度 <ol><li>260 でサンプルの吸光度を測定することにより RNA 濃度を定量化する nm の分光光度計 (材料の表 を参照してください).</li>
		<li>メジャー 230 nm と 280 nm の RNA の純度を決定する 。
		注: 260/280 の比率はタンパク質またはフェノールの汚染を示します。2 に近い比率は許容されます。260/230 では、EDTA、炭水化物またはフェノールの汚染物質を示します。2.0 2.2 までの値が許容します</li>。
	</ol></li> <li>RNA のチェックの整合性 <ol><li>総 RNA、RNA の実行 2 μ g agarose のゲルを変性剤濃度 1.5% のはしご; ゲルのドキュメンテーション システムの可視化 (材料の表 を参照してください). 
		注: 鮮明 28 s、18 s rRNA バンドの 2:1 の比率はそのまま RNA を示します。部分的にまみれて外観として RNA 解決を低下します</li>。
	</ol></li> <li>RT qPCR <ol><li>標準に従って一本鎖 RNA から相補的 DNA (cDNA) を合成プロトコル (参照 材料表) 11.</li>
	</ol></li> <li>RT qPCR による評価遺伝子発現 <ol><li>各サンプルの反応混合物の準備: ミックス 2 μ L cDNA、7 μ L 蛍光化合物、300 nM 前方プライマー、300 nM 逆プライマー (表 1) で、13 μ L の最終巻、96 ウェル リアクション プレートに追加 (材料の表 を参照してください).</li>
		<li>光学接着カバー、遠心分離機 (300 × g, 1 分) でプレートをシールし、リアルタイム PCR システムの反応を実行 (ホット スタート 95 ° C、20 s に続いて 40 サイクル: 95 ° C 3 s の 60 ° C、30 s) (材料の表 を参照してください).</li>
		<li>は、比較メソッド 2 を使用して相対定量による結果を分析 -ΔΔCt ハウスキーピング遺伝子グリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素 (GAPDH) または酸性リボソーム リン蛋白質 P0 (36B4) 12.</li>
	</ol></li></ol> 4。フローサイトメトリーによる内皮細胞の活性化を評価する <ol><li>以下のセクション 2 で説明されている条件 MLEC 04 細胞を治療し、フローサイトメトリーによる内皮細胞表面タンパク質の変化を評価します</li>。
	<li>デタッチ 6 h に記載されているトリプシン-EDTA による LPS 刺激後の細胞ステップ 1.2.3, と 4 で不完全なメディアで洗って ° C</li>
	<li>は、ノイバウアー チャンバー法を用いたセルをカウントし、u 下 96-ウェル プレートに 10 x 10 の 4 セルを配置します。遠心分離機 (300 × g、5 分) と 180 ° によって上澄み破棄下の元の位置を素早く回復に上から手首のスナップします</li>。
	<li>セルに不完全なメディア (10 μ G/ml、最終濃度) で希釈した選択した抗体の 50 μ L を追加し、(30 分、4 ° C) をインキュベートします</li>。
	<li>洗浄 2 回 w不完全なメディアに記載されている手順に従うステップ 4.3, と対応する二次抗体の 10 μ G/ml で 50 μ L で孵化させなさい ith FITC または類似した共役 (30 分、暗い空間で 4 ° C) に結合します</li>。
	<li>は、PBS 洗浄続いて不完全メディアで一度セルを洗ってください。1 mL ピペット チップを使用して 300 μ L の PBS のセルを回復し、フローサイトメトリー管を配置します</li>。
	<li>流れの cytometry 中のサンプルの評価 (材料の表 を参照してください)。前方および側散乱パラメーターによってセル人口を調整します。ゲート興味の人口。アイソタイプ コントロールと培養細胞から負の制御に基づくゲートを調整します。陽性細胞の割合として結果を分析または蛍光強度 8 を意味します</li>。
</ol> 5。西部のしみのによる内皮細胞の活性化を評価 <ol><li>6 ウェル培養皿 (7 x 10 5 細胞/ウェル) サブ合流で内皮細胞を播く、セクション 2 の説明に従って、LPS と扱います。次の西部のしみのプロトコルによって炎症性蛋白質の表現を分析します</li>。
	<li>内皮細胞応答のさまざまな側面を明らかにする異なる時点で lps を停止: <ol><li>LPS 刺激の 6 h 後炎症性蛋白質のプロファイルを確認します</li>。
		<li>セルシグナ リング 60 分の期間で 15 分毎を決定します</li>。
	</ol></li> <li>両方のケースで冷 PBS で 2 回洗浄することにより、反応を停止し、サンプル処理まで-80 ° c のサンプルを保存します</li>。
	各ウェル (1% 非イオン性界面活性剤、トリス-HCl、10 mM 1 mM EDTA、塩化ナトリウム 150 mM、30 mM ピロりん酸ナトリウム、フッ化ナトリウム 50 mM、2.1 mM ナトリウム バナジンで <li>Lyse 細胞や蛋白質の抽出 <ol><li>追加 200 μ L の換散バッファーpH 7.6, プロテアーゼ抑制剤のカクテルを補充) (資料の表を参照).</li>
		<li>動揺、4 ° C で 15 分ピペット チップと井戸をこすり、1.5 mL チューブの磨砕液を収集をインキュベートします</li>。
		<li>4 の 11,600 x g でチューブを遠心分離機 ° C</li>
		<li>処理まで-80 ° C できれいな 1.5 mL チューブに上清を保存します</li>。
	</ol></li> <li>標準に従ってビシンコニン酸法による蛋白質の集中のプロトコル (材料の表参照) のメジャー 13.</li>
	<li>は、10% ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE) 14 ドデシル硫酸ナトリウム 0.1% の標準法による総蛋白ライセート サンプルごとに 30 μ g を解決します。10 mM β-メルカプトエタノール (還元条件) 付きまたはなしサンプルを実行 (非還元条件) 興味の蛋白質を検出するために使用する抗体によって異なります</li>。
	<li>標準的な手順を使用して 0.45 μ m 孔径 (PVDF) 転送ブロッティングにポリアクリルアミドゲルから分けられた蛋白質を転送します</li>。
	<li>移転後、0.1% ポリソルベート 20 (PBS-T)、PBS で 2 回膜を洗浄し、PBS-T 検出されたリン蛋白質または撹拌 (90 分、下の総蛋白質のため PBS t 5% 脱脂乾燥したミルクの希釈 20 mL 2 %bsa を追加することで非特異的結合部位をブロックRT).</li>
	<li>10 mL の推奨濃度で適切なブロック バッファーで選択した抗体を希釈し、撹拌 (ON, 4 ° C) の下で膜を孵化させなさい。また、密封されたポリ袋の膜を配置し、5 mL の希釈を使用します</li>。
	<li>次の日、(余分な PBS ユニット-T、15 分、RT) 回 3 つの膜を洗浄する.</li>
	<li>1: 10,000 適切なブロック バッファー内で希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ (HRP) 行きの特派員の二次抗体の 10 ml (30 min, RT) 攪拌下膜加温します</li>。
	<li>3 回攪拌 (余分な PBS ユニット-T、15 分、RT) の下で膜の洗浄です</li>。
	<li>ペルオキシダーゼ基質強化化学発光 (ECL) の 0.1 mL/cm 2 で 1 分の膜を孵化させなさい。2 つの透明なプラスチック シートの間に排水膜を置き、Charged-Coupled デバイスのカメラ (CCD) を含む化学発光検出装置にそれを挿入します。
	<ol><li>CCD カメラを使用して、信号と累積プログラムで画像を記録するソフトウェアを検出 (画像は、合計 15 分間、すべての 30 秒露出で蓄積された信号を表示) します</li>。
	</ol></li> <li>デンシトメトリーによるユーザー ガイド 15 に記載されているプロトコルに従う ImageJ ソフトウェアを使用してバンド強度を定量化します。
	<ol><li>ImageJ ソフトウェアでサンプルを開き、長方形選択ツールで興味のバンドを選択します</li>。
		<li>最初のレーンとプレス プロットの輪郭のプロットを取得するレーンを選択します</li>。
		<li>直線の選択のピークの領域を区切るです</li>。
		<li>各ピークの内側をクリックして各バンドのサイズを測定します</li>。
		<li>制御タンパク質 (β-アクチン、チューブリン、等) の読み込みに関する結果を表します</li>。
	</ol></li></ol> 6。内皮因子は、付着の試金による白血球活性化からの解放を評価 <ol><li>内皮付きメディアを入手します。
	<ol><li>2 のセクションで示されているように、MLEC 04 細胞を扱うし、後 24 h LPS 刺激培養上清を収集 (100 ng/mL).</li>
		<li>は、扱われた MLEC 04 セルおよび遠心分離機 (600 x g) からエアコンのメディアを収集します。使用するまで-80 ° C で 0.5 ml の上澄みを維持します</li>。
	</ol></li> <li>白血球粘着試験 <ol><li>コート (0.1 M 酢酸の希釈はコラーゲン) を除いて PBS で希釈した選択した細胞外マトリックス蛋白質の 50 μ L/ウェルの 96 ウェル プレート: フィブロネクチン (1 ~ 10 μ g/mL)、ラミニン (1 〜 10 μ g/mL) とコラーゲン タイプ I (10-40 μ g/mL)。4 ° C でのままに</li>
		<li>コーティングされたメディアを破棄し 150 μ L の PBS、1 %bsa 熱不活化 (1 分、100 ° C)、90 分の室温で井戸の非特異的結合サイトをブロック</li>
		<li>PBS で 2 回洗浄し、井戸に 100 μ L の以前に収集された内皮付きメディア (セクション 6.1 を参照) を追加します 。
		注: プレート接着アッセイを実行する準備ができている</li>。
		<li>文化 (37 ° C、湿度 95%、5% CO 2) 生物のインキュベーターでマウスの単球マクロファージ細胞株 J774 とロズウェル パーク記念研究所メディア (RPMI)、10% 1% FBS P/s. 
		注: J774 細胞懸濁液に成長していく</li>。
		<li>は、15 mL の管および遠心分離機 (300 × g、5 分) に J774 細胞を収集します。上澄みを廃棄し、10 mL の血清無料メディアで細胞のペレットを再懸濁します。ノイバウアー区域のセルをカウントします。(300 × g、5 分) 細胞を遠心分離機、上澄みを廃棄し、50 μ L メディアあたり 15 × 10 4 J774 細胞血清自由な媒体の細胞を再懸濁します</li>。
		<li>追加 15 × 10 4 J774 セルそれぞれに 50 μ L の血清無料メディアでよく、CO 2 セル インキュベーターで 37 ° C で 1 時間後 4 ° C で 15 分間インキュベートします</li>。
		<li>は、暖かい PBS を追加することによって井戸を 2 回、軽く洗う; (300 x g、5 分) を遠心し、下の元の位置を素早く回復にトップから手首のスナップを 180 ° で上澄みを廃棄します。接続されたセルを修正します。PBS で 4% パラホルムアルデヒド (PFA) の 100 μ L/ウェルを追加することによって s (10 min, RT) を孵化と</li>。
		<li>優しくメディアを破棄、優しくした破棄メディアで 2 分間 PBS で 2% メタノールでセルを permeabilize し、90 の 20% メタノールで 0.5% クリスタル バイオレットの 50 μ L/ウェルを追加することによって、細胞を染色した s</li>
		<li>は豊富な実行している水を洗浄、余分な液体を破棄し、空気乾燥させておきます。デジタル カメラの光学顕微鏡に結合によって接続されたセルを報告します</li>。
		<li>では、0.1 M クエン酸ナトリウム、50% エタノールの 100 μ L/ウェルを追加することによって染色細胞を薄くしなさい。545 nm で吸光度または細胞接着として 100% を考慮した付着率の任意の単位として結果に井戸に到達を表す吸光度コーティング リガンド濃度の増加とともにメジャー</li></ol></li></ol> 7。白血球内皮共同接着アッセイによる内皮活性化をテスト <ol><li>セクション 2 の説明に従って、96 ウェルプレート上 MLEC 04 セルを扱うし、組合 (6 h、37 ° C) incubate</li>。
	<li>J774 細胞と Carboxyfluorescein 染色エステル (CSFE) の蛍光ラベルします。
	<ol><li>洗浄、J774 6.2.5 の手順に従って PBS のセルします。カウント、ノイバウアーによるセルの部屋の方法と 1 × 10 6 セル/mL の pbs は、0.1 %bsa で再懸濁します</li>。
		<li>37 ° c. を追加 5 mL 不完全メディアで 20 分 CFSE (5 μ M、最終濃度) で細胞をインキュベートし、(5 分、4 ° C) をインキュベートします</li>。
		<li>6.2.5 で説明したように、不完全なメディアで 1 回洗浄. 15 × 10 4 セル/100 μ L で再懸濁します、共同接着アッセイに進みます</li>。
	</ol></li> <li>内皮治療後不完全なメディアで 3 回洗浄します。内皮コートもそれぞれに CFSE J774 細胞 (15 × 10 4 セル/100 μ L) を追加します。37 で 60 分間続く 4 ° C で 10 分間プレートをインキュベート ° C</li>
	<li>6.2.7 で説明するよう、優しく洗浄します、温めた PBS を使用する、次の 2 つの方法によって内皮層に J774 接着のレポート: <ol><li>溶解 0.1 M トリス-HCl pH 8.8, 1% SDS のセル (100 μ l/ウェル) 測定と、。蛍光分析による CFSE J774 信号 (励起/蛍光 = 492 nm/517 nm)。蛍光強度の任意の単位または肯定的な制御に関して付着の割合として結果を表す (追加合計のセルから信号を各ウェル).</li>
		<li>蛍光顕微鏡下で可視化によって 4 %pfa とレポートのセル CFSE J774 細胞の内皮細胞への愛着を修正 (励起/蛍光 = 492 nm/517 nm).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
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著者が明らかに何もありません。

この内皮細胞のプロトコルでは、炎症反応の調節に関与する探索機構のための基礎を確立する段階的な技術について説明します。これらのアプローチ LPS 刺激血管内皮の活動の研究に基づいており、具体的には炎症性応答の間に白血球動員に関与する重要なステップの評価: 内皮細胞のサイトカインのリリースでは、内皮細胞の接着血管層に分子式と白血球接着。内皮のパラメーターを確立す...

炎症が感染性病原体、病原体を排除し、損傷した組織を修復する主要な目的に対して有益な生物学的反応です。炎症は慢性感染症や自己免疫疾患など、特定の条件下では解決しません。代わりに、連続浸潤白血球、組織の損傷、線維化、損失関数、および全体的な障害者と患者のいくつかの例の死につながる長期免疫応答の結果の異常な反応があります。これらの人間の疾患、炎症性疾患としてカタログ化すべては白血球の血管外漏出1,2の制御のための血管を含みます。
血管内皮細胞は、白血球が人身売買を制御することによって炎症反応の調節に基本的な役割を果たします。安静時の内皮をアクティブにし、炎症性サイトカイン(Cxcl10、Cxcl5、Cxcl1 等)と接着分子 (E セレクチン、VCAM 1 と icam-1) 表現内皮層が LPS など炎症性メディエーターにさらされて、その好意感染部位に白血球の循環の募集。リリースされたサイトカインによってプライミング白血球ローリングと特派員の接着対応による内皮層との相互作用を仲介する: セレクチン VCAM 1 α4β1 インテグリン、icam-1 へ αLβ2 インテグリン PSGL 1。最後に、白血球は炎症3の焦点に向かって血管間で移行します。
炎症性応答の調節における血管内皮細胞の重要な役割は、LPS 受容体、toll 様受容体 4 (TLR4) 内皮細胞でのみ表現する遺伝的に変更されたマウスで実証されています。これら内皮 TLR4 の動物が lps の炎症と菌接種後に生成される感染症を検出する対応し、その結果感染解像度と野生型マウス4と同等のレベルで生存を達成することができます。,5。
炎症性応答の内皮規制経路のためと仮定されている白血球の血管内皮細胞の相互作用のいくつかの段階で抑制が内皮の移行とのより良い予後の削減になること炎症関連疾患。実際には、炎症性疾患6、7のための治療として免疫細胞の血管外漏出を妨げるため内皮細胞活性化と白血球の血管内皮細胞の相互作用を対象とするいくつかの戦略を設計されています。
本報告では、炎症性刺激の lps 応答の内皮の活動と白血球の活性化と血管の層への接着におけるその役割を完全に特徴づける培養技術の徹底したグループを表します。Hortelano et al.による記述で、この原稿で使用される内皮細胞モデルはマウス肺血管内皮細胞ライン (MLEC-04)8.、MLEC 04 セルラインは内皮活性化9,10を勉強する適切なシステムであるため文献で検証されています。研究に基づいて、これらのアプローチが容易に推定する、血管内皮に白血球のシステムや炎症性プロファイル。選択した条件で血管内皮のパラメーターを定義した後、システムは血管の活性化を評価する提案の実験に新薬をテストできます。炎症性の中で、セルの条件を制御する目的の化合物をテストする内皮細胞を比較できます、任意の結果の違いは薬の開発と炎症の進行に予後の結果を通知可能性があります。最後に、血管内皮細胞炎症関連疾患に対する新規血管特定薬剤の設計に影響を与える新しい創薬ターゲットの特性に関連するシステムを提案する.

<table><tbody><tr><td>Gelatin</td><td>Sigma</td><td>G9391</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Lonza</td><td>BE12-719F</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Sigma</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin streptomycin</td><td>Lonza</td><td>DE17-602E</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>Lonza</td><td>BE17-160E</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>ED2SS</td><td></td></tr><tr><td>LPS</td><td>Sigma</td><td>L2880</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Sigma</td><td>T9424</td><td>RNA extraction buffer</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma</td><td>33539</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol absoluto</td><td>Panreac</td><td>1,310,861,612</td><td></td></tr><tr><td>Pure H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Qiagen</td><td>1017979</td><td>RNAse free</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Pronadisa</td><td>8020</td><td></td></tr><tr><td>Stain for agarose gels</td><td>Invitrogen</td><td>s33102</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III First-Strand Synth</td><td>Invitrogen</td><td>18080051</td><td>Reagents for RT-PCR</td></tr><tr><td>Fast SYBR Green Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4385610</td><td>Fluorescent stain for qPCR</td></tr><tr><td>MicroAmp Fast Optical 96-Well</td><td>Applied Biosystems</td><td>4346906</td><td>Plates for qPCR</td></tr><tr><td>U-bottom 96 well plates</td><td>Falcon</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>Cytometry tubes</td><td>Falcon</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>TX100</td><td>Panreac</td><td>212314</td><td>Non-ionic surfactant</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Panreac</td><td>1,319,401,211</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Merck</td><td>1,064,041,000</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyrophosphate</td><td>Sigma</td><td>221368</td><td></td></tr><tr><td>Sodium fluoride</td><td>Sigma</td><td>S7920</td><td></td></tr><tr><td>Sodium orthovanadate</td><td>sigma</td><td>13721-39-6</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail</td><td>sigma</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td><td>Pierce</td><td>23225</td><td>Reagents for bicinchoninic acid assay</td></tr><tr><td>&amp;beta;-mercaptoethanol</td><td>merck</td><td>805,740</td><td></td></tr><tr><td>PVDF Transfer Membrane, 0.45 &amp;micro;m</td><td>Thermo Scientific</td><td>88518</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Panreac</td><td>1,623,121,611</td><td>Polysorbate 20</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Lonza</td><td>BE17-515Q</td><td></td></tr><tr><td>ECL</td><td>Millipore</td><td>WBKLS0500</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Sigma</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>Collagen type I</td><td>Sigma</td><td>c8919</td><td></td></tr><tr><td>Acetic acid</td><td>Panreac</td><td>1,310,081,611</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Panreac</td><td>1,310,911,612</td><td></td></tr><tr><td>Crystal violet</td><td>Sigma</td><td>HT90132</td><td></td></tr><tr><td>Sodium citrate</td><td>Sigma</td><td>C7254</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 96%</td><td>Panreac</td><td>1,410,851,212</td><td></td></tr><tr><td>CFSE</td><td>Sigma</td><td>21888</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Lonza</td><td>BE12-115F</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0418</td><td></td></tr><tr><td>Infinite M200</td><td>Tecan</td><td>M200</td><td>Multi mode microplate reader</td></tr><tr><td>Gel Doc 2000</td><td>Bio-Rad</td><td>2000</td><td>Gel documentation system</td></tr><tr><td>StepOnePlus</td><td>Applied Biosystems</td><td>StepOnePlus</td><td>qPCR system</td></tr><tr><td>MACSQuant Analyzer 10</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Analyzer 10</td><td>Cytometry equipment</td></tr><tr><td>ChemiDoc MP</td><td>Bio-Rad</td><td>MP</td><td>Chemiluminescence detection system</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Antibodies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PECAM-1</td><td>BD Biosciences</td><td>553370</td><td>Use at 10 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>ICAM-2</td><td>Biolegend</td><td>1054602</td><td>Use at 10 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>E-selectin</td><td>BD Biosciences</td><td>553749</td><td>Use at 10 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>VCAM-1</td><td>BD Biosciences</td><td>553330</td><td>Use at 10 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>ICAM-1</td><td>Becton Dickinson</td><td>553250</td><td>Use at 10 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>anti-rat IgG-FITC</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>112-095-006</td><td>Use at 10 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>anti armenian hamster-FITC</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>127-095-160</td><td>Use at 10 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>Rat IgG isotyope control</td><td>Invitrogen</td><td>10700</td><td>Use at 10 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>Armenian hamster IgG isotype control</td><td>Invitrogen</td><td>PA5-33220</td><td>Use at 10 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>P-I&amp;kappa;&amp;Beta;-&amp;alpha;</td><td>Cell Signaling</td><td>2859</td><td>Use at 10 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>&amp;beta;-Actin</td><td>Sigma</td><td>A5441</td><td>Use at 10 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>P-ERK</td><td>Cell Signaling</td><td>9101</td><td>Use at 10 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>anti-mouse HRP</td><td>GE Healthcare</td><td>LNXA931/AE</td><td>Use at 1:10,000</td></tr><tr><td>anti-rabbit HRP</td><td>GE Healthcare</td><td>LNA934V/AG</td><td>Use at 1:10,000</td></tr><tr><td>anti-rat HRP</td><td>Santa Cruz</td><td>Sc-3823</td><td>Use at 1:10,000</td></tr></tbody></table>

screening assays to characterize novel endothelial regulators involved in the inflammatory response

内皮層は、多くの異なる機能を制御することによって体内の恒常性を維持するために不可欠です。内皮層による炎症反応の調節は、効率的に有害な入力との戦いや、被災地の回復の援助に不可欠です。Ccl5、Cxcl1、Cxcl10 など水溶性の炎症性サイトカインを表現してトリガー内皮細胞がリポ多糖 (LPS)、グラム陰性の細菌膜の外側のコンポーネントなど、炎症性の環境にさらされる、循環白血球の活性化。さらに、内皮細胞表面に接着分子 E セレクチン、VCAM 1 と icam-1 の発現は相互作用および内皮層と最終的に炎症を起こしている組織へ漏出する活性化白血球接着できます。このシナリオで、過剰なまたは欠陥のある活性化白血球動員は炎症関連疾患につながる可能性がため血管内皮機能はしっかりと調整されなければなりません。これらの疾患の多くは効果的な治療法はありません、ので血管の層を中心に新しい戦略を調べる必要があります。白血球機能を変更新規の内皮レギュレータの検索に有用な包括的な試金を提案します。含むいくつかのテクニック (など、サイトカイン、ケモカイン、および接着分子) 白血球動員に関与する特定の表現ターゲットを用いた内皮活性化分析: リアルタイムの量的なポリメラーゼの連鎖反応 (RT-qPCR)、西部のしみ方、フローサイトメトリーおよび接着アッセイの流れ。これらのアプローチは、炎症における血管内皮機能を決定して新しい治療戦略の設計の潜在的価値のある小説の内皮炎症性の規制当局を特徴付けるためのスクリーニングアッセイを実行する非常に便利です。

RT qPCR による内皮細胞の LPS 誘導性活性化の評価
飢えた血清 MLEC 04 細胞が 100 ng/mL LPS の 6 時間によって刺激され、内皮細胞の遺伝子発現は、休憩状態に活性化マーカーの発現を比較することによって RT qPCR を使用して査定されました。図 1 aのように、LP 培養 MLEC 04 細胞は炎症性応答 (E セレクチン、VCAM ...

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Screening Assays to Characterize Novel Endothelial Regulators Involved in the Inflammatory Response

血管内皮細胞は、しっかりと白血球動員を制御します。不十分な白血球の血管外漏出は、炎症性疾患に貢献します。したがって、内皮活性化の新しい規制要素の検索は、炎症性疾患の改善治療を設計する必要です。ここでは、白血球は炎症時に人身売買を変更できる新しい内皮調節を特徴付けるための包括的な方法論について述べる。

炎症反応に関与する新規血管内皮レギュレータを特徴付けるための試金をスクリーニング

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory ...

screening-assays-to-characterize-novel-endothelial-regulators

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

6.5K ビュー.  Institute of Health Carlos III. 血管内皮細胞は、しっかりと白血球動員を制御します。不十分な白血球の血管外漏出は、炎症性疾患に貢献します。したがって、内皮活性化の新しい規制要素の検索は、炎症性疾患の改善治療を設計する必要です。ここでは、白血球は炎症時に人身売買を変更できる新しい内皮調節を特徴付けるための包括的な方法論について述べる。

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Assessing Endothelial Vasodilator Function with the Endo-PAT 2000

The endothelium is a delicate monolayer of cells that lines all blood vessels, and which comprises the systemic and lymphatic capillaries. By virtue of the panoply of paracrine factors that it secretes, the endothelium regulates the contractile and proliferative state of the underlying vascular smooth muscle, as well as the interaction of the vessel wall with circulating blood elements. Because of its central role in mediating vessel tone and growth, its position as gateway to circulating immune cells, and its local regulation of hemostasis and coagulation, the the properly functioning endothelium is the key to cardiovascular health. Conversely, the earliest disorder in most vascular diseases is endothelial dysfunction.
In the arterial circulation, the healthy endothelium generally exerts a vasodilator influence on the vascular smooth muscle. There are a number of methods to assess endothelial vasodilator function. The Endo-PAT 2000 is a new device that is used to assess endothelial vasodilator function in a rapid and non-invasive fashion. Unlike the commonly used technique of duplex ultra-sonography to assess flow-mediated vasodilation, it is totally non-operator-dependent, and the equipment is an order of magnitude less expensive. The device records endothelium-mediated changes in the digital pulse waveform known as the PAT ( peripheral Arterial Tone) signal, measured with a pair of novel modified plethysmographic probes situated on the finger index of each hand. Endothelium-mediated changes in the PAT signal are elicited by creating a downstream hyperemic response. Hyperemia is induced by occluding blood flow through the brachial artery for 5 minutes using an inflatable cuff on one hand. The response to reactive hyperemia is calculated automatically by the system. A PAT ratio is created using the post and pre occlusion values. These values are normalized to measurements from the contra-lateral arm, which serves as control for non-endothelial dependent systemic effects. Most notably, this normalization controls for fluctuations in sympathetic nerve outflow that may induce changes in peripheral arterial tone that are superimposed on the hyperemic response.
In this video we demonstrate how to use the Endo-PAT 2000 to perform a clinically relevant assessment of endothelial vasodilator function.

A noninvasive procedure to assess endothelial function is demonstrated using the Endo-PAT 2000.

遠藤- PAT 2000で内皮血管拡張機能を評価する

The endothelium is a delicate monolayer of cells that lines all blood vessels, and which comprises the systemic and lymphatic capillaries. By virtue of ...

医学

On-Chip Endothelial Inflammatory Phenotyping

Atherogenesis is potentiated by metabolic abnormalities that contribute to a heightened state of systemic inflammation resulting in endothelial dysfunction. However, early functional changes in endothelium that signify an individual's level of risk are not directly assessed clinically to help guide therapeutic strategy. Moreover, the regulation of inflammation by local hemodynamics contributes to the non-random spatial distribution of atherosclerosis, but the mechanisms are difficult to delineate in vivo. We describe a lab-on-a-chip based approach to quantitatively assay metabolic perturbation of inflammatory events in human endothelial cells (EC) and monocytes under precise flow conditions. Standard methods of soft lithography are used to microfabricate vascular mimetic microfluidic chambers (VMMC), which are bound directly to cultured EC monolayers.1 These devices have the advantage of using small volumes of reagents while providing a platform for directly imaging the inflammatory events at the membrane of EC exposed to a well-defined shear field. We have successfully applied these devices to investigate cytokine-,2 lipid-3, 4 and RAGE-induced5 inflammation in human aortic EC (HAEC). Here we document the use of the VMMC to assay monocytic cell (THP-1) rolling and arrest on HAEC monolayers that are conditioned under differential shear characteristics and activated by the inflammatory cytokine TNF-&alpha;. Studies such as these are providing mechanistic insight into atherosusceptibility under metabolic risk factors.

Microfluidic flow chambers etched by photolithography and fabricated from PDMS are applied to probe functional outcomes associated with EC dysfunction and inflammation. In a representative experiment, the ability of differential shear stress to modulate monocytic cell adhesion to cytokine activated EC monolayers is demonstrated.

オンチップ·血管内皮の炎症性表現型

Atherogenesis is potentiated by metabolic abnormalities that contribute to a heightened state of systemic inflammation resulting in endothelial ...

生物工学

Facilitating Drug Discovery: An Automated High-content Inflammation Assay in Zebrafish

Zebrafish larvae are particularly amenable to whole animal small molecule screens1,2 due to their small size and relative ease of manipulation and observation, as well as the fact that compounds can simply be added to the bathing water and are readily absorbed when administered in a &lt;1% DMSO solution. Due to the optical clarity of zebrafish larvae and the availability of transgenic lines expressing fluorescent proteins in leukocytes, zebrafish offer the unique advantage of monitoring an acute inflammatory response in vivo. Consequently, utilizing the zebrafish for high-content small molecule screens aiming at the identification of immune-modulatory compounds with high throughput has been proposed3-6, suggesting inflammation induction scenarios e.g. localized nicks in fin tissue, laser damage directed to the yolk surface of embryos7 or tailfin amputation3,5,6. The major drawback of these methods however was the requirement of manual larva manipulation to induce wounding, thus preventing high-throughput screening. Introduction of the chemically induced inflammation (ChIn) assay8 eliminated these obstacles. Since wounding is inflicted chemically the number of embryos that can be treated simultaneously is virtually unlimited. Temporary treatment of zebrafish larvae with copper sulfate selectively induces cell death in hair cells of the lateral line system and results in rapid granulocyte recruitment to injured neuromasts. The inflammatory response can be followed in real-time by using compound transgenic cldnB::GFP/lysC::DsRED26,9 zebrafish larvae that express a green fluorescent protein in neuromast cells, as well as a red fluorescent protein labeling granulocytes.
In order to devise a screening strategy that would allow both high-content and high-throughput analyses we introduced robotic liquid handling and combined automated microscopy with a custom developed software script. This script enables automated quantification of the inflammatory response by scoring the percent area occupied by red fluorescent leukocytes within an empirically defined area surrounding injured green fluorescent neuromasts. Furthermore, we automated data processing, handling, visualization, and storage all based on custom developed MATLAB and Python scripts.
In brief, we introduce an automated HC/HT screen that allows testing of chemical compounds for their effect on initiation, progression or resolution of a granulocytic inflammatory response. This protocol serves a good starting point for more in-depth analyses of drug mechanisms and pathways involved in the orchestration of an innate immune response. In the future, it may help identifying intolerable toxic or off-target effects at earlier phases of drug discovery and thereby reduce procedural risks and costs for drug development.

Here we describe a novel high-content chemically induced inflammation assay aiming at the identification of immune-modulatory bioactives. We have successfully combined automated microscopy with custom developed software scripts enabling automated quantification of the inflammatory response as well as further data processing, analysis, mining, and storage.

ゼブラフィッシュで自動化されたハイコンテンツ炎症アッセイ：創薬を促進する

Zebrafish larvae are particularly amenable to whole animal small molecule screens1,2 due to their small size and relative ease of manipulation and ...

免疫・感染学

The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro

Angiogenesis is a complex, highly regulated process responsible for providing and maintaining adequate tissue perfusion. Insufficient vasculature maintenance and pathological malformations can result in severe ischemic diseases, while overly abundant vascular development is associated with cancer and inflammatory disorders. A promising form of pro-angiogenic therapy is the use of angiogenic cell sources, which can provide regulatory factors as well as physical support for newly developing vasculature.
Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) are extensively investigated candidates for vascular regeneration due to their paracrine effects and their ability to detect and home to ischemic or inflamed tissues. In particular, first trimester human umbilical cord perivascular cells (FTM HUCPVCs) are a highly promising candidate due to their pericyte-like properties, high proliferative and multilineage potential, immune-privileged properties, and robust paracrine profile. To effectively evaluate potentially angiogenic regenerative cells, it is a requisite to test them in reliable and &#34;translatable&#34; pre-clinical assays. The aortic ring assay is an ex vivo angiogenesis model that allows for easy quantification of tubular endothelial structures, provides accessory supportive cells and extracellular matrix (ECM) from the host, excludes inflammatory components, and is fast and inexpensive to set up. This is advantageous when compared to in vivo models (e.g., corneal assay, Matrigel plug assay); the aortic ring assay can track the administered cells and observe intercellular interactions while avoiding xeno-immune rejection.
We present a protocol for a novel application of the aortic ring assay, which includes human MSCs in co-cultures with developing rat aortic endothelial networks. This assay allows for the analysis of the MSC contribution to tube formation and development through physical pericyte-like interactions and of their potency for actively migrating to sites of angiogenesis, and for evaluating their ability to perform and mediate ECM processing. This protocol provides further information on changes in MSC phenotype and gene expression following co-culture.

The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro

Here, we present a novel application of the aortic ring assay where prelabelled mesenchymal cells are co-cultured with rat aorta-derived endothelial networks. This novel method allows visualization of Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) homing and integration with endothelial networks, quantification of network properties, and evaluation of MSC immunophenotypes and gene expression.

大動脈リング共培養アッセイ:体外間葉系間質細胞の血管新生の可能性を評価するために便利なツール

Angiogenesis is a complex, highly regulated process responsible for providing and maintaining adequate tissue perfusion. Insufficient vasculature ...

発生生物学

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

定量的な<em&gt;インビトロ</em静的な条件の下で活性化された初代ヒト微小血管内皮細胞への好中球の接着を測定するために&gt;アッセイ

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

The majority of all known diseases are accompanied by disorders of the cardiovascular system. Studies into the complexity of the interacting pathways activated during cardiovascular pathologies are, however, limited by the lack of robust and physiologically relevant methods. In order to model pathological vascular events we have developed an in vitro assay for studying the interaction between endothelium and whole blood. The assay consists of primary human endothelial cells, which are placed in contact with human whole blood. The method utilizes native blood with no or very little anticoagulant, enabling study of delicate interactions between molecular and cellular components present in a blood vessel.
We investigated functionality of the assay by comparing activation of coagulation by different blood volumes incubated with or without human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). Whereas a larger blood volume contributed to an increase in the formation of thrombin antithrombin (TAT) complexes, presence of HUVEC resulted in reduced activation of coagulation. Furthermore, we applied image analysis of leukocyte attachment to HUVEC stimulated with tumor necrosis factor (TNF&#945;) and found the presence of CD16+ cells to be significantly higher on TNF&#945; stimulated cells as compared to unstimulated cells after blood contact. In conclusion, the assay may be applied to study vascular pathologies, where interactions between the endothelium and the blood compartment are perturbed.

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

The accessibility of reliable models to investigate vascular blood interactions in humans is lacking. We present an in vitro model of cultured primary human endothelial cells combined with human whole blood to investigate cellular interactions both in the blood (ELISA) and the vascular compartment (microscopy).

小説<em&gt;インビトロ</em&gt;ヒト全血と内皮の間の相互作用を研究するためのモデル

The majority of all known diseases are accompanied by disorders of the cardiovascular system. Studies into the complexity of the interacting pathways ...

Microfluidic Assay for the Assessment of Leukocyte Adhesion to Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Endothelial Cells (hiPSC-ECs)

Endothelial cells (ECs) are essential for the regulation of inflammatory responses by either limiting or facilitating leukocyte recruitment into affected tissues via a well-characterized cascade of pro-adhesive receptors which are upregulated on the leukocyte cell surface upon the inflammatory trigger. Inflammatory responses differ between individuals in the population and the genetic background can contribute to these differences. Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) have been shown to be a reliable source of ECs (hiPSC-ECs), thus representing an unlimited source of cells that capture the genetic identity and any genetic variants or mutations of the donor. hiPSC-ECs can therefore be used for modeling inflammatory responses in donor-specific cells. Inflammatory responses can be modeled by determining leukocyte adhesion to the hiPSC-ECs under physiological flow. This step-by-step protocol provides a detailed description of the experimental setup and data analysis for the assessment of inflammatory responses in hiPSC-ECs and the analysis of leukocyte adhesion under physiological flow.

Microfluidic Assay for the Assessment of Leukocyte Adhesion to Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Endothelial Cells hiPSC-ECs

This step-by-step protocol provides a detailed description of the experimental setup and data analysis for the assessment of inflammatory responses in hiPSC-ECs and the analysis of leukocyte adhesion under physiological flow.

ひと誘導多能性幹細胞由来血管内皮細胞 (による ECs) へ白血球接着の評価のためのマイクロ流体アッセイ

Endothelial cells (ECs) are essential for the regulation of inflammatory responses by either limiting or facilitating leukocyte recruitment into affected ...

Strategic Endothelial Cell Tube Formation Assay: Comparing Extracellular Matrix and Growth Factor Reduced Extracellular Matrix

Malignant tumors require a blood supply in order to survive and spread. These tumors obtain their needed blood from the patient's blood stream by hijacking the process of angiogenesis, in which new blood vessels are formed from existing blood vessels. The CXCR2 (chemokine (C-X-C motif) receptor 2) receptor is a transmembrane G-protein-linked molecule found in many cells that is closely associated with angiogenesis1. Specific blockade of the CXCR2 receptor inhibits angiogenesis, as measured by several assays such as the endothelial tube formation assay. The tube formation assay is useful for studying angiogenesis because it is an excellent method of studying the effects that any given compound or environmental condition may have on angiogenesis. It is a simple and quick in vitro assay that generates quantifiable data and requires relatively few components. Unlike in vivo assays, it does not require animals and can be carried out in less than two days. This protocol describes a variation of the extracellular matrix supporting endothelial tube formation assay, which tests the CXCR2 receptor.

This manuscript describes a tube formation assay to quantify the effects of a given compound or condition on angiogenesis by using endothelial cell tube formation in a controlled environment.

戦略的な内皮細胞管形成アッセイ：細胞外マトリックスおよび成長因子の比較は、細胞外マトリックスを削減しました

Malignant tumors require a blood supply in order to survive and spread. These tumors obtain their needed blood from the patient's blood stream by ...

Assessment of the Anticoagulant and Anti-inflammatory Properties of Endothelial Cells Using 3D Cell Culture and Non-anticoagulated Whole Blood

In vivo, endothelial cells are crucial for the natural anticoagulation of circulating blood. Consequently, endothelial cell activation leads to blood coagulation. This phenomenon is observed in many clinical situations, like organ transplantation in the presence of pre-formed anti-donor antibodies, including xenotransplantation, as well as in ischemia/reperfusion injury. In order to reduce animal experimentation according to the 3R standards (reduction, replacement and refinement), in vitro models to study the effect of endothelial cell activation on blood coagulation would be highly desirable. However, common flatbed systems of endothelial cell culture provide a surface-to-volume ratio of 1 - 5 cm2 of endothelium per mL of blood, which is not sufficient for natural, endothelial-mediated anticoagulation. Culturing endothelial cells on microcarrier beads may increase the surface-to-volume ratio to 40 - 160 cm2/mL. This increased ratio is sufficient to ensure the &#34;natural&#34; anticoagulation of whole blood, so that the use of anticoagulants can be avoided. Here an in vitro microcarrier-based system is described to study the effects of genetic modification of porcine endothelial cells on coagulation of whole, non-anticoagulated human blood. In the described assay, primary porcine aortic endothelial cells, either wild type (WT) or transgenic for human CD46 and thrombomodulin, were grown on microcarrier beads and then exposed to freshly drawn non-anticoagulated human blood. This model allows for the measurement and quantification of cytokine release as well as activation markers of complement and coagulation in the blood plasma. In addition, imaging of activated endothelial cell and deposition of immunoglobulins, complement- and coagulation proteins on the endothelialized beads were performed by confocal microscopy. This assay can also be used to test drugs which are supposed to prevent endothelial cell activation and, thus, coagulation. On top of its potential to reduce the number of animals used for such investigations, the described assay is easy to perform and consistently reproducible.

We present an in vitro model which allows the study and analysis of coagulation in whole, non-anticoagulated blood. Anticoagulation in the system depends on the natural anticoagulation effect of healthy endothelial cells and endothelial cell activation will result in clotting.

3 D 細胞培養と非高血圧症全血を用いた血管内皮細胞の抗凝固および抗炎症作用の評価

In vivo, endothelial cells are crucial for the natural anticoagulation of circulating blood. Consequently, endothelial cell activation leads to blood ...

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using this protocol, angiogenesis may be measured in vitro in a fast, quantifiable manner. Primary or immortalized endothelial cells are mixed with conditioned media and plated on basement membrane matrix. The endothelial cells form capillary like structures in response to angiogenic signals found in conditioned media. The tube formation occurs quickly with endothelial cells beginning to align themselves within 1&#160;hr and lumen-containing tubules beginning to appear within 2 hr. Tubes can be visualized using a phase contrast inverted microscope, or the cells can be treated with calcein AM prior to the assay and tubes visualized through fluorescence or confocal microscopy. The number of branch sites/nodes, loops/meshes, or number or length of tubes formed can be easily quantified as a measure of in vitro angiogenesis. In summary, this assay can be used to identify genes and pathways that are involved in the promotion or inhibition of angiogenesis in a rapid, reproducible, and quantitative manner.

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

The tube formation assay is a fast, quantifiable method for measuring in vitro angiogenesis. Endothelial cells are combined with conditioned media and plated on basement membrane extract. Tube formation occurs within hours and newly formed tubules easily quantified.

のための内皮細胞チューブ形成アッセイ<em&gt;体外</em&gt;血管新生に関する研究

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using ...

炎症反応に関与する新規血管内皮レギュレータを特徴付けるための試金をスクリーニング

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