Name: screening assays to characterize novel endothelial regulators involved in the inflammatory response
Uploaded: 2017-09-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 50 s
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이 작품은 정부의 드 Economía y Competitividad (MINECO) 및 Instituto de에 의해 지원 되었다 건배 카를로스 3 세 (ISCIII) (보조금 번호 IERPY 1149/16 앨 러 배 마; MPY 1410/09 S. Hortelano에); 의해 Fondo 드 Investigación en 건배 (FIS) (S. Hortelano PI11.0036-PI14.0055 번호 부여)을 통해 MINECO. S. Herranz IERPY 1149/16 ISCIII에서 지원 되었다.

1. 내 피 세포 배양 <ol><ol><li>코트 100 m m 조직 문화 접시 2.5 mL 젤라틴을 조직 배양 플레이트 취급 <li>솔루션 (증류수에 압력가 마로 소독, 0.1% 젤라틴) 37 ° C에서 30 분 동안,이 필요한 잘 형식으로 추정 될 수 있습니다. 발음 젤라틴 솔루션 및 조직 문화 후드에 건조를 접시에 두고.</li>
	</ol></li> <li>조직 배양 조건 <ol><li>(37 ° C, 습도 95%, 5% CO 2) 생물 인큐베이터 안에 MLEC 04 세포 배양. Dulbecco의 완전 한 미디어에 셀 성장 &#39; s 수정이 글 매체: 영양소 혼합 F-12 (DMEM/F-12) 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 및 100 단위/mL 페니실린과 100 µ g/mL 스 (P/S)와 보충.</li>
		<li>표준 Neubauer 챔버 메서드에서 셀의 개수 고 2-11 x 10 4 셀/c m 2의 낮은 밀도에서 완전 한 미디어 10 mL에서에서 100 m m 젤라틴 처리 번호판 MLEC 04 셀을 추가 합니다. 합류를 도달할 때 셀 1: 3을 분할. 
		참고: 일반적으로이 2 ~ 3 일 후에 문화 발생.</li>
		<li>Subculture 멸 균 인산 염 버퍼 염 분 (PBS) 2 mL 트립 신-EDTA 솔루션 (0.25 %trypsin, 5 mM EDTA)를 추가 하 여 다음와 37에 3 분 동안 품 어 10 mL와 함께 접시를 세척 하 여 셀 ° c.</li>
		<li>트립 신-EDTA 반응 중지 하 고 10 mL 전체 미디어를 추가 하 여 일시 중단 된 세포를 복구. 스핀 다운 셀 (300 x g, 5 분)는 상쾌한, 적절 하 게 완전 한 미디어와 subculture에 셀룰러 펠 릿 resuspend.</li>
	</ol></li></ol> 2. LPS 치료 및 중재자 <ol><li>접시 완전 한 미디어 다음 잘 형식으로 하위 합류 MLEC-04 셀: 셀/잘에 6-잘 접시와 2.5 10 5 셀/96 잘 접시에 잘 x 7 x 10 5.</li>
	<li>셀 인큐베이터 (37 ° C, 습도 95%, 5% CO 2)에서 6 h에 대 한 문화를 품 어. 셀 불완전 한 미디어 (DMEM F12, P/S)에 전환 하 고 동기화 하 고 세포의 활동을 줄일 (에) 하룻밤 두고.</li>
	<li>미디어를 제거 하 고 (또는 없이) 내 피 세포를 배양 하 여 새로운 약물 화합물을 테스트 마약 문제 (예: DT 10) 불완전 한 미디어 (30 분, 37 ° C)에 희석; 추가 1.4 mL/6 잘 플레이트 또는 0.14 잘 mL/잘 96 잘 접시).</li>
	<li>각 분석 결과에 지정 된 시간 동안 LPS 인큐베이션 미디어 (100 ng/mL, 최종 농도)를 추가 하 여 셀을 도전 한다. PBS를 사용 하 여 컨트롤.</li>
</ol> 3. 실시간 정량 Pcr에 의해 활성화 Endothelium에 Transcriptional 프로필의 평가 <ol><li>6 잘 문화에서 하위 합류에 시드 MLEC-04 셀 접시 (7 x 10 5 셀/잘). 6 h (37 ° C, 습도 95%, 5% CO 2)에 대 한 품 어 고 이후에 혈 청 기아 (에 품 어).</li>
	<li>미디어를 제거 하 고 치료 (또는) 내 피 세포의 약 문화 (30 분, 37 ° C를 품 어) 불완전 한 미디어에 희석; 1.4 mL을 추가/6 잘 플레이트 (30 분, 37 ° C)에 대 한 잘 취급 하지 않습니다.</li>
	<li>(2.3 단계에서 설명) 하는 대로 100 ng/mL LPS incubated 미디어를 추가 하 여 셀을 도전 6 h. 차가운 PBS로 두번 세척 하 여 반응을 중지에 품 어 하 고 샘플 처리까지-80 ° C에서 번호판을 유지.</li>
	<li>RNA 추출 <ol><li>판 해 동 고 1 mL/잘 RNA 추출 버퍼 (38% 페 놀 및 0.8 M guanidinium isothiocyanate; 자료의 표 참조)를 추가 합니다. 1.5 mL 튜브에 동요와 수집 homogenate에서 실 온 (RT)에서 30 분 두고.</li>
		<li>200 µ L 클로 프롬을 추가 하 고 부드럽게 RT 및 분리기 (11,600 g, 15 분, 4 ° C)에서 3 분 15 미 품에 대 한 선동.</li>
		<li>다른 1.5 mL 튜브에 수성 단계를 전송. 500 µ L 소 프로 파 놀 RT 한 다음 원심 분리 (11600 x g, 4 ° C)에서 10 분 부 화 뒤를 추가 하 여 RNA를 침전.</li>
		<li>는 상쾌한 삭제 하 고 소용돌이 동요와 다음 원심 분리 (7500 x g, 4 ° C)에 의해 75% 에탄올과 펠 릿을 세척.</li>
		<li>펠 릿 건조 하 고 25 µ L 순수한 H 2 O 샘플 처리까지-80 ° C에 55 ° C. 유지 RNA에서 10 분 동안 배양 하 여 RNA를 solubilize.</li>
	</ol></li> <li>수량 및 RNA의 순도 <ol><li>260에서 샘플의 흡 광도 측정 하 여 RNA 농도 계량 한 분 광 광도 계에 nm (재료의 표 참조).</li>
		<li>측정 230 nm 및 280 nm RNA의 순도 확인. 
		참고: 260/280에 비율은 단백질 또는 페 놀 오염을 나타냅니다. 2 가까운 비율 허용 됩니다. 260/230에서 비율 EDTA, 탄수화물 또는 페 놀 오염 물질을 나타냅니다. 2.0-2.2 사이의 값을 사용할 수 있습니다.</li>
	</ol></li> <li>검사 RNA 무결성 <ol><li>총 RNA는 RNA의 실행 2 µ g 1.5 %agarose 젤을 변성 시키기에 사다리, 젤 설명서 시스템에 시각화 (재료의 표 참조). 
		참고: 명확 하 고 날카로운 28S와 18S rRNA 밴드의 2:1 비율 그대로 RNA를 나타냅니다. 듯한 모양으로 RNA 해결을 부분적으로 저하.</li>
	</ol></li> <li>실시간 정량 <ol><li>보완 DNA (cDNA) 표준에 따라 단일 좌초 RNA에서 합성 프로토콜 (참조 테이블의 재료) 11.</li>
	</ol></li> <li>실시간 정량 평가 진 식 <ol><li>각 샘플에 대 한 반응 혼합물 준비: 믹스 2 µ L cDNA, 7 µ L 형광 화합물, 300 nM 앞으로 뇌관, 및 300 nM 역방향 뇌관 (표 1)는 13 µ L의 최종 볼륨 96-잘 반응 접시에 추가 하 고 (재료의 표 참조).</li>
		<li>광학 접착제 커버, 원심 분리기 (300 x g, 1 분)와 함께 접시를 봉인 하 고 실시간 PCR 시스템에 반응 실행 (뜨거운 시작 20 95 ° C s 40 주기 다음: 95 ° C 3 s와 30에 대 한 60 ° C에 대 한 s) (재료의 표 참조).</li>
		<li>상대적인 정량 비교 방법 2를 사용 하 여 결과 분석 -ΔΔCt 내부 관리 유전자 glyceraldehyde-3-인산 효소 (GAPDH) 또는 산 성 ribosomal phosphoprotein P0 (36B4) 12 .</li>
	</ol></li></ol> 4. Cytometry 내 피 정품 인증 평가 <ol><li>2 절에서 설명한 조건에 따라 MLEC 04 셀 고 cytometry에 의해 내 피 표면 단백질의 변화를 평가.</li>
	<li>분리 후 트립 신-EDTA 방법에 설명 된 LPS 자극의 6 h 셀 1.2.3, 단계 그리고 4 불완전 한 미디어와 함께 씻어 ° c.</li>
	<li>는 Neubauer 챔버 메서드를 사용 하 여 셀 고 10 x 10 4의 세포 u-하단 96 잘 접시 합니다. 원래 위치로 빠른 복구에 위에서 손목의 스냅 원심 분리기 (300 x g, 5 분) 및 180 °에 의해 표면에 뜨는 폐기.</li>
	<li>셀에 불완전 한 미디어 (10 µ g/mL, 최종 농도)에 희석 된 항 체의 50 µ L을 추가 하 고 (30 분, 4 ° C)를 품 어.</li>
	<li>씻어 두 번 w 셀ith에 설명 된 절차를 수행 하는 불완전 한 미디어 4.3, 단계 및 해당 이차 항 체의 10 µ g/mL에서 50 µ L로 품 어 결합 FITC 또는 유사한 켤레 (30 분, 어두운 공간에서 4 ° C).</li>
	<li>씻어 셀 한 번 PBS 세척 뒤 불완전 한 미디어. 1 mL 피 펫 팁을 사용 하 여 300 µ L PBS를 가진 세포를 복구 하 고 cytometry 튜브에.</li>
	<li>흐름 cytometry 시스템에 샘플을 평가 (재료의 표 참조). 앞으로 및 측면 산란 매개 변수 셀 인구를 조정 합니다. 게이트의 인구입니다. 게이츠 세포 isotype 컨트롤과 incubated에서 부정적인 컨트롤에 따라 조정 합니다. 분석 결과 긍정적인 세포의 백분율 또는 형광 강도 8 뜻.</li>
</ol> 5. 서쪽 오 점 내 피 정품 인증 평가 <ol><li>씨앗 6-잘 배양 배지 (7 x 10 5 셀/잘) 하위 합류에 있는 피 고 2에 설명 된 대로 LPS와 치료. 다음 서쪽 오 점 프로토콜에 의해 염증 성 단백질 표정 분석.</li>
	<li>내 피 응답의 다양 한 측면을 명료 하 게 다른 시간 지점에서 LPS 자극을 중지: <ol><li>LPS 자극의 6 h 후 염증 성 단백질 프로필 확인.</li>
		<li>60 분 기간을 통해 매 15 분을 신호 하는 셀을 결정.</li>
	</ol></li> <li>두 경우 모두, 차가운 PBS로 두번 세척 하 여 반응을 중지 하 고 샘플 처리까지-80 ° C에서 샘플을 저장할.</li>
	<li>Lyse 세포 및 단백질 추출 <ol><li>추가 200 µ L 세포의 용 해 버퍼 각 잘 (1% 비 이온 계면 활성, 10 mM Tris HCl, 1 mM EDTA, 염화 나트륨 150 m m, 30mm 나트륨 파이 인산, 50mm 나트륨 불 화물에서 2.1 m m 나트륨 orthovanadate를 pH 7.6, 프로 테아 제 억제 물 칵테일 보충) (자료의 표 참조).</li>
		<li>동요에서 4 ° C에서 15 분 웰 스 피 펫 팁을 긁 고 1.5 mL 튜브에 homogenate 수집을 품 어.</li>
		<li>11600 x g에서 튜브 4 원심 ° c.</li>
		<li>처리까지-80 ° C에서 깨끗 한 1.5 mL 튜브에는 상쾌한 저장.</li>
	</ol></li> <li>측정 bicinchoninic 산 분석 결과 표준 다음에 의해 단백질 농도 프로토콜 (재료의 표 참조) 13.</li>
	<li>는 0.1% 나트륨 라우릴 황산 염, 10 %polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (SDS-PAGE) 14의 표준 기술에 의해 총 단백질 각 샘플에 대 한 lysate의 30 µ g을 해결. 샘플 10 m m β-mercaptoethanol (줄이는 조건)와 함께 또는 없이 실행 (조건 비 감소) 관심사의 단백질을 검출 하는 데 사용 하는 항 체에 따라.</li>
	<li>표준 절차를 사용 하 여 0.45 µ m 기 공 크기와 polyvinylidene difluoride (PVDF) 전송 막 polyacrylamide 젤에서 분리 된 단백질 전송.</li>
	<li>전이, 후 막 PBS, 0.1% 폴-20 (PBS-T)로 두 번 세척 하 고 추가 20 mL 2% BSA PBS-T 검색된 phosphoproteins 또는 PBS-T 아래 동요 (90 분, 총 단백질에에서 5% 비 지방 건조 우유에에서 희석 하 여 불특정 바인딩 사이트 차단 RT).</li>
	<li>권장된 농도에서 적절 한 차단 버퍼의 10 mL에 선택 된 항 체를 희석 하 고 동요 (ON, 4 ° C)에서 막 품 어. 또는 막 밀폐 비닐 봉지에 놓고 희석된 항 체의 5 mL을 사용.</li>
	<li>다음 날 씻어 3 막 (초과 PBS-T, 15 분, RT) 번.</li>
	<li>동요 (30 분, RT) 10 mL와 함께 특 파 원 이차 항 체의 아래 막 양 고추냉이 과산화 효소 (HRP)는 적절 한 차단 버퍼에서 1:10,000에 희석에 바인딩된 품.</li>
	<li>동요 (초과 PBS-T, 15 분, RT) 아래 세 번 막 세척.</li>
	<li>과산화 효소 기질 강화 화학 (ECL)의 0.1 mL/c m 2으로 1 분 동안 막 품 어. 두 개의 투명 한 플라스틱 시트, 사이 물기 막 놓고 Charged-Coupled 장치 카메라 (CCD)를 포함 하는 화학 탐지 시스템에 삽입.
	<ol><li>CCD 카메라를 사용 하 여 신호 및 누적 프로그램과 이미지를 기록 하는 소프트웨어 검색 (이미지 표시 누적된 신호 마다 30 s 노출에서 총 15 분 동안).</li>
	</ol></li> <li>Densitometry 15 사용자 가이드 설명 된 프로토콜을 따르고 ImageJ 소프트웨어를 사용 하 여 밴드 강도 계량.
	<ol><li>ImageJ 소프트웨어에서 샘플을 열고 사각형 선택 도구와 관심의 밴드를 선택 합니다.</li>
		<li>첫 번째 레인과 언론 플롯 프로필 음모를 차선으로 선택.</li>
		<li>직선 선택과 봉우리의 영역 구분.</li>
		<li>각 피크의 내부를 클릭 하 여 각 밴드의 크기를 측정.</li>
		<li>단백질 제어 (β-말라, tubulin, 등)를 로드 관련 결과 나타냅니다.</li>
	</ol></li></ol> 6. 내 피 요소 접착 분석 실험에 의해 백혈구 활성화에서 발표 평가 <ol><li>내 피 조절된 미디어 얻기.
	<ol><li>섹션 2에에서 표시 된 대로 MLEC-04 세포를 치료 하 고 LPS 24 시간 자극 후 표면에 뜨는 문화 수집 (100 ng/mL).</li>
		<li>대우 MLEC-04 세포 분리기 (600 x g)에서 바른된 미디어를 수집합니다. 사용까지-80 ° C에서 0.5 mL aliquots에는 상쾌한 유지.</li>
	</ol></li> <li>백혈구 접착 분석 결과 <ol><li>50 µ L/잘 선택 된 세포 외 기질 단백질 (콜라겐, 0.1 m M 초 산에 희석)를 제외 하 고 PBS에 희석의 96 잘 접시 코트: fibronectin (1-10 µ g/mL ), laminin (1-10 µ g/mL)와 교원 질 유형 I (10-40 µ g/mL). 4 ° c.에 두고 ON</li>
		<li>코팅된 미디어를 삭제 하 고 150 µ L PBS, 1 %BSA 열 비활성화 (1 분, 100 ° C) 실시간에서 90 분으로 우물에 난다 바인딩 사이트 차단</li>
		<li>PBS로 두 번 우물을 세척 하 고 우물에 100 µ L 이전 수집의 내 피 조절 미디어 (6.1 단원)을 추가. 
		참고: 판 접착 시험을 수행 하기 위한 준비가.</li>
		<li>문화 (37 ° C, 습도 95%, 5% CO 2) 생물 인큐베이터에서 마우스 monocyte macrophage 셀 라인 J774와 로스웰 파크 기념 연구소 매체 (RPMI), 10 %FBS, 1 %P / s. 
		참고: J774 세포 성장 정지에서.</li>
		<li>15 mL 튜브 및 원심 분리기 (300 x g, 5 분)로 J774 셀을 수집합니다. 삭제는 상쾌한 고 10 mL 혈 청 자유로운 미디어와 셀룰러 펠 릿 resuspend. Neubauer 챔버에 세포를 계산 합니다. (300 x g, 5 분) 세포를 원심, 삭제는 상쾌한 고 50 µ L 미디어 당 15 x 10 4 J774 세포에서 혈 청 자유로운 미디어에 셀 resuspend.</li>
		<li>추가 15 x 10 4 J774 셀 각 50 µ L 세럼 무료 미디어에서 잘 하 고 CO 2 셀 인큐베이터에서 37 ° C에서 1 h 뒤에 4 ° C에서 15 분 동안 품 어.</li>
		<li>따뜻한 PBS를 추가 하 여 우물을 두 번, 부드럽게 씻어; 원심 (300 x g, 5 분) 하 고 원래 위치로 빠른 복구에 탑에서 손목의 180 ° 스냅 하 여 상쾌한 삭제. 연결 된 셀을 수정PBS에서 100 µ L/4 %paraformaldehyde (PFA)의 음을 추가 하 여 s (10 분, RT)을 품 어와.</li>
		<li>부드럽게 미디어를 삭제 하 고 부드럽게 실시간 삭제 미디어에서 2 분에 대 한 PBS에 2% 메탄올을 가진 세포를 permeabilize 90에 대 한 20% 메탄올에서 50 µ L / 0.5% 크리스탈 바이올렛의 우물을 추가 하 여 셀을 얼룩 실시간에 s</li>
		<li>풍부한 실행 물과 함께 접시를 세척, 초과 액체를 삭제 하 고 건조를 두고. 디지털 카메라는 가벼운 현미경에 결합에 의해 연결 된 셀을 보고.</li>
		<li>셀 100 µ L/0.1 M 나트륨 구 연산 염, 50% 에탄올의 우물을 추가 하 여 얼룩을 희석. 더 높은 리간드 농도와 코팅 545 nm 및 흡 광도 또는 세포 접착으로 100% 고려 하 여 접착의 비율의 임의의 단위로 결과 도달 우물에서 흡 광도 측정</li></ol></li></ol> 7. 백혈구 Endothelium 공동 접착 분석 결과 내 피 정품 인증 테스트 <ol><li>96 잘 접시에 MLEC-04 셀 섹션 2에에서 설명 된 대로 고 LPS (6, 37 ° C)와 품 어.</li>
	<li>J774 셀 Carboxyfluorescein Succinimidyl 에스테 르 (CSFE)와 라벨을 붙일.
	6.2.5에서 절차를 수행 하는 PBS에 <ol><li>워시는 J774 셀. 수는 Neubauer에 의해 셀 방법 챔버 1 x 10 6 셀/mL PBS, 0.1 %BSA resuspend.</li>
		<li>37 ° C. 추가 5 mL 불완전 한 미디어에서 20 분 (5 µ M, 최종 농도) CFSE와 셀을 품 어 고 (5 분, 4 ° C)를 품 어.</li>
		<li>6.2.5에 설명 된 대로 불완전 한 미디어로 한 번 씻어. 15 x 10 4 셀/100 µ L에서 resuspend, 공동 접착 시험 진행.</li>
	</ol></li> <li>Endothelium 치료 후 씻어 3 배 불완전 한 미디어와 우물. 내 피-코팅 잘 각 CFSE J774 셀 (15 x 10 4 셀/100 µ L)를 추가 합니다. 37에서 60 분 다음 4 ° C에서 10 분 동안 접시를 품 어 ° c.</li>
	<li>우물 6.2.7에 설명 된 대로, 부드럽게 세척., 따뜻하게 PBS를 사용 하 여 및 다음 두 가지 방법으로 내 피 레이어 J774 접착을 보고: <ol><li>0.1 M Tris HCl pH 8.8, 1 %SDS에서 세포를 Lyse (100 µ L/잘) 측정 하 고는 CFSE J774 신호 fluorometry (여기/방출 = 492 nm/517 nm). 형광 강렬의 임의 단위 또는 긍정적인 통제에 관하여 접착의 비율 결과 나타냅니다 (추가 총 세포에서 신호에 각 잘).</li>
		<li>형광 현미경 시각화 하 여 4 %PFA 및 보고서에 셀 endothelium CFSE J774 셀의 첨부 파일을 수정 (여기/방출 = 492 nm/517 nm).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
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저자는 공개 없다.

이 내 피 프로토콜 탐험 소설 메커니즘 염증 반응의 조절에 관여에 대 한 기초를 설정 하는 단계적 기술을 설명 합니다. 이러한 방식을 내 피 활동 LPS에 의해 자극된의 연구에 기초 하 고 특히 백혈구 신규 모집 선 동적인 응답 동안에 관련 된 중요 한 단계를 평가: cytokines 내 피, 내 피 접착 분자 표정 및 백혈구 접착 혈관 층에. 내 피 매개 변수가 설정 되 면 시스템 내 피 기능의 규정에 관련 된 소?...

염증은 병원 체를 제거 하 고 손상 된 조직을 복구 하는 주요 목적으로 전염 성 요원에 대 한 유익한 생물학 응답 이다. 만성 감염 또는 면역 질환과 같은 특정 조건에서 염증이 해결 되지 않습니다. 대신, 백혈구, 조직 손상, 섬유 증, 기능, 및 전반적인 손실, 장애 및 환자 일부의 경우 죽음에 리드 장기간된 면역 반응의 결과로의 지속적인 침투와 탈 선 반응이입니다. 이러한 인간의 장애, 염증 성 질환으로 카탈로그 모든 백혈구 넘쳐 흐름1,2의 컨트롤에 대 한 혈관 포함.
내 피 세포 백혈구 밀매를 제어 하 여 염증 반응의 규칙에 있는 근본적인 역할을 재생 합니다. 내 피 레이어 LPS 등 염증 성 중재자에 노출은, 휴식 endothelium 활성화 하 고 프로 염증 성 cytokines (Cxcl10 Cxcl5, Cxcl1, 등)와 접착 분자 (전자 selectin VCAM-1, ICAM-1)를 표현 하 고 그 은혜 순환 하는 백혈구는 감염의 사이트에 모집 다음 릴리스 cytokines에 의해 액 백혈구 중재 압 연 및 특 파 원 접착제 대응을 통해 내 피 레이어와 상호 작용: selectin, α4β1 integrin VCAM-1 및 αLβ2 integrin ICAM-1 PSGL-1. 마지막으로, 백혈구는 염증3의 초점으로 맥 관 구조에 걸쳐 마이그레이션합니다.
염증 반응 조절에 피 내 막의 필수적인 역할 유전자 LPS 수용 체, 통행세 같이 수용 체 4 (TLR4), 내 피 세포에만 표현 하기 위해 수정 된 쥐에 증명 되었습니다. 이 내 피 TLR4 동물 LPS 중재 염증 박테리아 접종 후 발생 하는 감염을 감지 하 고 대응 하 고 따라서 감염 확인 및 강포한 유형 쥐4 으로 비슷한 수준에서 생존을 달성할 수 있었다 , 5.
피 규제 염증 반응 통로 대 한 그것은 되었습니다 가정 하는 백혈구 내 피 상호 작용의 어떤 단계에서 저해 트랜스 내 피 마이그레이션에 대 한 더 나은 예 지의 감소 귀 착될 것입니다. 염증 관련 된 질병입니다. 사실, 내 피 활성화 및 백혈구 endothelium 상호 작용을 대상으로 하는 여러 전략 염증 성 장애6,7에 대 한 치료로 면역 세포의 넘쳐 흐름을 방해 하기 위하여 설계 되었습니다.
이 보고서에서 우리는 생체 외에서 기술 완벽 하 게 특성화 염증 성 자극 LPS에 내 피 활동 및 백혈구 활성화 및 혈관 층에 접착의 역할의 철저 한 그룹을 설명 합니다. 이 원고에 사용 되는 내 피 세포 모델은 마우스 폐 내 피 세포 라인 (MLEC-04), Hortelano 그 외 여러분 에 의해 설명 된 대로 8. 내 피 활성화9,10공부 하는 적절 한 시스템 문학에는 MLEC-04 셀 라인 검증 되었습니다. 연구 관심 분야에 따라, 이러한 접근 수 있습니다 쉽게 추정 될 어떤 내 피에 백혈구 시스템 및 염증 성 프로필 또는. 선택한 조건에 내 피 매개 변수를 정의한 후 시스템 혈관 활성화를 평가 하기 위해 제안 된 실험에 대 한 새로운 약물을 테스트할 수 있습니다. 이 염증 성 맥락에서 관심의 화합물과 테스트 내 피 세포는 세포의 제어 조건에 비교 될 수 있다 하 고 결과 차이 약물의 개발 및 염증의 진행에 전조 결과 알릴 수 있습니다. 결론, 우리는 염증 관련 질병에 대 한 소설 관련 혈관 치료의 디자인에 영향을 미칠 수 있는 내 피 세포에 새로운 약물 표적을 특성화 하기 위해 관련 시스템을 제안 합니다.

<table><tbody><tr><td>Gelatin</td><td>Sigma</td><td>G9391</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Lonza</td><td>BE12-719F</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Sigma</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin streptomycin</td><td>Lonza</td><td>DE17-602E</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>Lonza</td><td>BE17-160E</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>ED2SS</td><td></td></tr><tr><td>LPS</td><td>Sigma</td><td>L2880</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Sigma</td><td>T9424</td><td>RNA extraction buffer</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma</td><td>33539</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol absoluto</td><td>Panreac</td><td>1,310,861,612</td><td></td></tr><tr><td>Pure H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Qiagen</td><td>1017979</td><td>RNAse free</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Pronadisa</td><td>8020</td><td></td></tr><tr><td>Stain for agarose gels</td><td>Invitrogen</td><td>s33102</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III First-Strand Synth</td><td>Invitrogen</td><td>18080051</td><td>Reagents for RT-PCR</td></tr><tr><td>Fast SYBR Green Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4385610</td><td>Fluorescent stain for qPCR</td></tr><tr><td>MicroAmp Fast Optical 96-Well</td><td>Applied Biosystems</td><td>4346906</td><td>Plates for qPCR</td></tr><tr><td>U-bottom 96 well plates</td><td>Falcon</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>Cytometry tubes</td><td>Falcon</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>TX100</td><td>Panreac</td><td>212314</td><td>Non-ionic surfactant</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Panreac</td><td>1,319,401,211</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Merck</td><td>1,064,041,000</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyrophosphate</td><td>Sigma</td><td>221368</td><td></td></tr><tr><td>Sodium fluoride</td><td>Sigma</td><td>S7920</td><td></td></tr><tr><td>Sodium orthovanadate</td><td>sigma</td><td>13721-39-6</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail</td><td>sigma</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td><td>Pierce</td><td>23225</td><td>Reagents for bicinchoninic acid assay</td></tr><tr><td>&amp;beta;-mercaptoethanol</td><td>merck</td><td>805,740</td><td></td></tr><tr><td>PVDF Transfer Membrane, 0.45 &amp;micro;m</td><td>Thermo Scientific</td><td>88518</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Panreac</td><td>1,623,121,611</td><td>Polysorbate 20</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Lonza</td><td>BE17-515Q</td><td></td></tr><tr><td>ECL</td><td>Millipore</td><td>WBKLS0500</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Sigma</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>Collagen type I</td><td>Sigma</td><td>c8919</td><td></td></tr><tr><td>Acetic acid</td><td>Panreac</td><td>1,310,081,611</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Panreac</td><td>1,310,911,612</td><td></td></tr><tr><td>Crystal violet</td><td>Sigma</td><td>HT90132</td><td></td></tr><tr><td>Sodium citrate</td><td>Sigma</td><td>C7254</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 96%</td><td>Panreac</td><td>1,410,851,212</td><td></td></tr><tr><td>CFSE</td><td>Sigma</td><td>21888</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Lonza</td><td>BE12-115F</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0418</td><td></td></tr><tr><td>Infinite M200</td><td>Tecan</td><td>M200</td><td>Multi mode microplate reader</td></tr><tr><td>Gel Doc 2000</td><td>Bio-Rad</td><td>2000</td><td>Gel documentation system</td></tr><tr><td>StepOnePlus</td><td>Applied Biosystems</td><td>StepOnePlus</td><td>qPCR system</td></tr><tr><td>MACSQuant Analyzer 10</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Analyzer 10</td><td>Cytometry equipment</td></tr><tr><td>ChemiDoc MP</td><td>Bio-Rad</td><td>MP</td><td>Chemiluminescence detection system</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Antibodies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PECAM-1</td><td>BD Biosciences</td><td>553370</td><td>Use at 10 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>ICAM-2</td><td>Biolegend</td><td>1054602</td><td>Use at 10 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>E-selectin</td><td>BD Biosciences</td><td>553749</td><td>Use at 10 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>VCAM-1</td><td>BD Biosciences</td><td>553330</td><td>Use at 10 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>ICAM-1</td><td>Becton Dickinson</td><td>553250</td><td>Use at 10 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>anti-rat IgG-FITC</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>112-095-006</td><td>Use at 10 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>anti armenian hamster-FITC</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>127-095-160</td><td>Use at 10 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>Rat IgG isotyope control</td><td>Invitrogen</td><td>10700</td><td>Use at 10 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>Armenian hamster IgG isotype control</td><td>Invitrogen</td><td>PA5-33220</td><td>Use at 10 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>P-I&amp;kappa;&amp;Beta;-&amp;alpha;</td><td>Cell Signaling</td><td>2859</td><td>Use at 10 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>&amp;beta;-Actin</td><td>Sigma</td><td>A5441</td><td>Use at 10 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>P-ERK</td><td>Cell Signaling</td><td>9101</td><td>Use at 10 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>anti-mouse HRP</td><td>GE Healthcare</td><td>LNXA931/AE</td><td>Use at 1:10,000</td></tr><tr><td>anti-rabbit HRP</td><td>GE Healthcare</td><td>LNA934V/AG</td><td>Use at 1:10,000</td></tr><tr><td>anti-rat HRP</td><td>Santa Cruz</td><td>Sc-3823</td><td>Use at 1:10,000</td></tr></tbody></table>

screening assays to characterize novel endothelial regulators involved in the inflammatory response

내 피 층은 여러 가지 기능을 제어 하 여 신체의 항상성 유지 하기 위한 필수적입니다. 내 피 층에 의해 염증 반응의 규칙은 효율적으로 유해한 입력에 대 한 싸움과 손상 된 지역의 복구에 도움이 중요 합니다. 내 피 세포는 선 동적인 환경, 그람 음성 세균 막, lipopolysaccharide (LPS)의 외부 구성 요소에 노출 되 면 그들은 Ccl5, Cxcl1 등 Cxcl10, 수용 성 프로 염증 성 cytokines를 표현 하 고 방 아 쇠는 순환 하는 백혈구의 활성화입니다. 또한, 내 피 표면에 접착 분자 전자 selectin VCAM-1, ICAM-1의 식 상호 작용 및 접착 내 피 레이어, 그리고 결국 염증된 조직 향해 넘쳐 흐름을 활성화 된 백혈구의 수 있습니다. 이 시나리오에서는 내 피 기능 해야 합니다 엄격 하 게 규제 되어야 백혈구 신규 모집에 과도 한 또는 결함이 활성화 염증 관련 질환으로 이어질 수 있기 때문에. 이후 많은 이러한 장애의 효과적인 치료를 하지 않아도, 혈관 층에 초점을 맞춘 새로운 전략을 조사 해야 합니다. 우리 소설 내 피 레 귤 레이 터 백혈구 기능을 수정 하는 검색에 유용한 종합적인 분석 제안 합니다. 우리를 포함 한 여러 가지 기술로 특정 식 대상 (예: cytokines, 발산, 및 접착 분자) 백혈구 신규 모집에 참여를 사용 하 여 내 피 활성화 분석: 실시간 정량 중 합 효소 연쇄 반응 ( RT-qPCR), 서쪽 오 점, cytometry 및 접착 분석 흐름. 이러한 접근 염증 맥락에서 내 피 기능을 결정 하 고 소설 내 피 염증 성 레 귤 레이 터 설계 새로운 치료 전략에 대 한 잠재적으로 가치 있는 특징을 심사 분석을 수행 하는 매우 유용 합니다.

실시간 정량 Pcr에 의해 LPS 유발 내 피 세포 활성화의 평가
굶 어 혈 청 MLEC-04 셀 100 ng/mL LPS의 6 h에 의해 자극 되었다 그리고 내 피 유전자 발현 비교 활성화 마커 휴식 상태를 표현 하 여 실시간 정량 Pcr를 사용 하 여 평가 했다. 그림 1A같이 LPS incubated MLEC-04 세포 염증 반응 (전자 selectin VCAM-1, ICAM-1) 동안 백혈?...

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Screening Assays to Characterize Novel Endothelial Regulators Involved in the Inflammatory Response

혈관 내 피는 단단히 백혈구 신규 모집을 제어합니다. 부적당 한 백혈구 넘쳐 흐름 인간의 염증 성 질병에 기여 한다. 따라서, 내 피 활성화의 새로운 규제 요소에 대 한 검색은 염증 성 질환에 대 한 향상 된 치료를 디자인 해야 합니다. 여기, 우리는 포괄적인 방법론 소설 내 피 레 귤 레이 터 백혈구 중 염증 매매 하는 것을 수정할 수 있는 특성을 설명 합니다.

심사 분석 실험 소설 내 피 레 귤 레이 터 염증 반응에 관여 하

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory ...

screening-assays-to-characterize-novel-endothelial-regulators

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

6.5K 조회수.  Institute of Health Carlos III. 혈관 내 피는 단단히 백혈구 신규 모집을 제어합니다. 부적당 한 백혈구 넘쳐 흐름 인간의 염증 성 질병에 기여 한다. 따라서, 내 피 활성화의 새로운 규제 요소에 대 한 검색은 염증 성 질환에 대 한 향상 된 치료를 디자인 해야 합니다. 여기, 우리는 포괄적인 방법론 소설 내 피 레 귤 레이 터 백혈구 중 염증 매매 하는 것을 수정할 수 있는 특성을 설명 합니다....

비디오: Screening Assays to Characterize Novel Endothelial Regulators Involved in the Inflammatory Response

Assessing Endothelial Vasodilator Function with the Endo-PAT 2000

The endothelium is a delicate monolayer of cells that lines all blood vessels, and which comprises the systemic and lymphatic capillaries. By virtue of the panoply of paracrine factors that it secretes, the endothelium regulates the contractile and proliferative state of the underlying vascular smooth muscle, as well as the interaction of the vessel wall with circulating blood elements. Because of its central role in mediating vessel tone and growth, its position as gateway to circulating immune cells, and its local regulation of hemostasis and coagulation, the the properly functioning endothelium is the key to cardiovascular health. Conversely, the earliest disorder in most vascular diseases is endothelial dysfunction.
In the arterial circulation, the healthy endothelium generally exerts a vasodilator influence on the vascular smooth muscle. There are a number of methods to assess endothelial vasodilator function. The Endo-PAT 2000 is a new device that is used to assess endothelial vasodilator function in a rapid and non-invasive fashion. Unlike the commonly used technique of duplex ultra-sonography to assess flow-mediated vasodilation, it is totally non-operator-dependent, and the equipment is an order of magnitude less expensive. The device records endothelium-mediated changes in the digital pulse waveform known as the PAT ( peripheral Arterial Tone) signal, measured with a pair of novel modified plethysmographic probes situated on the finger index of each hand. Endothelium-mediated changes in the PAT signal are elicited by creating a downstream hyperemic response. Hyperemia is induced by occluding blood flow through the brachial artery for 5 minutes using an inflatable cuff on one hand. The response to reactive hyperemia is calculated automatically by the system. A PAT ratio is created using the post and pre occlusion values. These values are normalized to measurements from the contra-lateral arm, which serves as control for non-endothelial dependent systemic effects. Most notably, this normalization controls for fluctuations in sympathetic nerve outflow that may induce changes in peripheral arterial tone that are superimposed on the hyperemic response.
In this video we demonstrate how to use the Endo-PAT 2000 to perform a clinically relevant assessment of endothelial vasodilator function.

A noninvasive procedure to assess endothelial function is demonstrated using the Endo-PAT 2000.

엔도 - PAT 2000 내피 Vasodilator 기능을 평가

The endothelium is a delicate monolayer of cells that lines all blood vessels, and which comprises the systemic and lymphatic capillaries. By virtue of ...

연구

의학

On-Chip Endothelial Inflammatory Phenotyping

Atherogenesis is potentiated by metabolic abnormalities that contribute to a heightened state of systemic inflammation resulting in endothelial dysfunction. However, early functional changes in endothelium that signify an individual's level of risk are not directly assessed clinically to help guide therapeutic strategy. Moreover, the regulation of inflammation by local hemodynamics contributes to the non-random spatial distribution of atherosclerosis, but the mechanisms are difficult to delineate in vivo. We describe a lab-on-a-chip based approach to quantitatively assay metabolic perturbation of inflammatory events in human endothelial cells (EC) and monocytes under precise flow conditions. Standard methods of soft lithography are used to microfabricate vascular mimetic microfluidic chambers (VMMC), which are bound directly to cultured EC monolayers.1 These devices have the advantage of using small volumes of reagents while providing a platform for directly imaging the inflammatory events at the membrane of EC exposed to a well-defined shear field. We have successfully applied these devices to investigate cytokine-,2 lipid-3, 4 and RAGE-induced5 inflammation in human aortic EC (HAEC). Here we document the use of the VMMC to assay monocytic cell (THP-1) rolling and arrest on HAEC monolayers that are conditioned under differential shear characteristics and activated by the inflammatory cytokine TNF-&alpha;. Studies such as these are providing mechanistic insight into atherosusceptibility under metabolic risk factors.

Microfluidic flow chambers etched by photolithography and fabricated from PDMS are applied to probe functional outcomes associated with EC dysfunction and inflammation. In a representative experiment, the ability of differential shear stress to modulate monocytic cell adhesion to cytokine activated EC monolayers is demonstrated.

온칩 내피 염증성 Phenotyping

Atherogenesis is potentiated by metabolic abnormalities that contribute to a heightened state of systemic inflammation resulting in endothelial ...

생체공학

Facilitating Drug Discovery: An Automated High-content Inflammation Assay in Zebrafish

Zebrafish larvae are particularly amenable to whole animal small molecule screens1,2 due to their small size and relative ease of manipulation and observation, as well as the fact that compounds can simply be added to the bathing water and are readily absorbed when administered in a &lt;1% DMSO solution. Due to the optical clarity of zebrafish larvae and the availability of transgenic lines expressing fluorescent proteins in leukocytes, zebrafish offer the unique advantage of monitoring an acute inflammatory response in vivo. Consequently, utilizing the zebrafish for high-content small molecule screens aiming at the identification of immune-modulatory compounds with high throughput has been proposed3-6, suggesting inflammation induction scenarios e.g. localized nicks in fin tissue, laser damage directed to the yolk surface of embryos7 or tailfin amputation3,5,6. The major drawback of these methods however was the requirement of manual larva manipulation to induce wounding, thus preventing high-throughput screening. Introduction of the chemically induced inflammation (ChIn) assay8 eliminated these obstacles. Since wounding is inflicted chemically the number of embryos that can be treated simultaneously is virtually unlimited. Temporary treatment of zebrafish larvae with copper sulfate selectively induces cell death in hair cells of the lateral line system and results in rapid granulocyte recruitment to injured neuromasts. The inflammatory response can be followed in real-time by using compound transgenic cldnB::GFP/lysC::DsRED26,9 zebrafish larvae that express a green fluorescent protein in neuromast cells, as well as a red fluorescent protein labeling granulocytes.
In order to devise a screening strategy that would allow both high-content and high-throughput analyses we introduced robotic liquid handling and combined automated microscopy with a custom developed software script. This script enables automated quantification of the inflammatory response by scoring the percent area occupied by red fluorescent leukocytes within an empirically defined area surrounding injured green fluorescent neuromasts. Furthermore, we automated data processing, handling, visualization, and storage all based on custom developed MATLAB and Python scripts.
In brief, we introduce an automated HC/HT screen that allows testing of chemical compounds for their effect on initiation, progression or resolution of a granulocytic inflammatory response. This protocol serves a good starting point for more in-depth analyses of drug mechanisms and pathways involved in the orchestration of an innate immune response. In the future, it may help identifying intolerable toxic or off-target effects at earlier phases of drug discovery and thereby reduce procedural risks and costs for drug development.

Here we describe a novel high-content chemically induced inflammation assay aiming at the identification of immune-modulatory bioactives. We have successfully combined automated microscopy with custom developed software scripts enabling automated quantification of the inflammatory response as well as further data processing, analysis, mining, and storage.

촉진 약물 디스커버리 : Zebrafish의 자동화된 하이 컨텐츠 염증 분석

Zebrafish larvae are particularly amenable to whole animal small molecule screens1,2 due to their small size and relative ease of manipulation and ...

면역학 및 감염병학

The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro

Angiogenesis is a complex, highly regulated process responsible for providing and maintaining adequate tissue perfusion. Insufficient vasculature maintenance and pathological malformations can result in severe ischemic diseases, while overly abundant vascular development is associated with cancer and inflammatory disorders. A promising form of pro-angiogenic therapy is the use of angiogenic cell sources, which can provide regulatory factors as well as physical support for newly developing vasculature.
Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) are extensively investigated candidates for vascular regeneration due to their paracrine effects and their ability to detect and home to ischemic or inflamed tissues. In particular, first trimester human umbilical cord perivascular cells (FTM HUCPVCs) are a highly promising candidate due to their pericyte-like properties, high proliferative and multilineage potential, immune-privileged properties, and robust paracrine profile. To effectively evaluate potentially angiogenic regenerative cells, it is a requisite to test them in reliable and &#34;translatable&#34; pre-clinical assays. The aortic ring assay is an ex vivo angiogenesis model that allows for easy quantification of tubular endothelial structures, provides accessory supportive cells and extracellular matrix (ECM) from the host, excludes inflammatory components, and is fast and inexpensive to set up. This is advantageous when compared to in vivo models (e.g., corneal assay, Matrigel plug assay); the aortic ring assay can track the administered cells and observe intercellular interactions while avoiding xeno-immune rejection.
We present a protocol for a novel application of the aortic ring assay, which includes human MSCs in co-cultures with developing rat aortic endothelial networks. This assay allows for the analysis of the MSC contribution to tube formation and development through physical pericyte-like interactions and of their potency for actively migrating to sites of angiogenesis, and for evaluating their ability to perform and mediate ECM processing. This protocol provides further information on changes in MSC phenotype and gene expression following co-culture.

The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro

Here, we present a novel application of the aortic ring assay where prelabelled mesenchymal cells are co-cultured with rat aorta-derived endothelial networks. This novel method allows visualization of Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) homing and integration with endothelial networks, quantification of network properties, and evaluation of MSC immunophenotypes and gene expression.

대동맥 반지 공동 문화 분석 결과: Mesenchymal Stromal 세포에 생체 외에서 의 신생 잠재력을 평가 하는 편리한 도구

Angiogenesis is a complex, highly regulated process responsible for providing and maintaining adequate tissue perfusion. Insufficient vasculature ...

발생학

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

정량<em&gt; 체외</em정적 조건에서 활성화 된 기본 인간의 미세 혈관 내피 세포에 호중구 부착을 측정하는&gt; 분석

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

The majority of all known diseases are accompanied by disorders of the cardiovascular system. Studies into the complexity of the interacting pathways activated during cardiovascular pathologies are, however, limited by the lack of robust and physiologically relevant methods. In order to model pathological vascular events we have developed an in vitro assay for studying the interaction between endothelium and whole blood. The assay consists of primary human endothelial cells, which are placed in contact with human whole blood. The method utilizes native blood with no or very little anticoagulant, enabling study of delicate interactions between molecular and cellular components present in a blood vessel.
We investigated functionality of the assay by comparing activation of coagulation by different blood volumes incubated with or without human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). Whereas a larger blood volume contributed to an increase in the formation of thrombin antithrombin (TAT) complexes, presence of HUVEC resulted in reduced activation of coagulation. Furthermore, we applied image analysis of leukocyte attachment to HUVEC stimulated with tumor necrosis factor (TNF&#945;) and found the presence of CD16+ cells to be significantly higher on TNF&#945; stimulated cells as compared to unstimulated cells after blood contact. In conclusion, the assay may be applied to study vascular pathologies, where interactions between the endothelium and the blood compartment are perturbed.

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

The accessibility of reliable models to investigate vascular blood interactions in humans is lacking. We present an in vitro model of cultured primary human endothelial cells combined with human whole blood to investigate cellular interactions both in the blood (ELISA) and the vascular compartment (microscopy).

소설<em&gt; 시험관</em&gt; 인간의 전체 혈액과 내피 세포 사이의 상호 작용 유학을위한 모델

The majority of all known diseases are accompanied by disorders of the cardiovascular system. Studies into the complexity of the interacting pathways ...

Microfluidic Assay for the Assessment of Leukocyte Adhesion to Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Endothelial Cells (hiPSC-ECs)

Endothelial cells (ECs) are essential for the regulation of inflammatory responses by either limiting or facilitating leukocyte recruitment into affected tissues via a well-characterized cascade of pro-adhesive receptors which are upregulated on the leukocyte cell surface upon the inflammatory trigger. Inflammatory responses differ between individuals in the population and the genetic background can contribute to these differences. Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) have been shown to be a reliable source of ECs (hiPSC-ECs), thus representing an unlimited source of cells that capture the genetic identity and any genetic variants or mutations of the donor. hiPSC-ECs can therefore be used for modeling inflammatory responses in donor-specific cells. Inflammatory responses can be modeled by determining leukocyte adhesion to the hiPSC-ECs under physiological flow. This step-by-step protocol provides a detailed description of the experimental setup and data analysis for the assessment of inflammatory responses in hiPSC-ECs and the analysis of leukocyte adhesion under physiological flow.

Microfluidic Assay for the Assessment of Leukocyte Adhesion to Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Endothelial Cells hiPSC-ECs

This step-by-step protocol provides a detailed description of the experimental setup and data analysis for the assessment of inflammatory responses in hiPSC-ECs and the analysis of leukocyte adhesion under physiological flow.

미세 분석 결과 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 내 피 세포 (hiPSC-ECs)에 백혈구 접착의 평가 대 한

Endothelial cells (ECs) are essential for the regulation of inflammatory responses by either limiting or facilitating leukocyte recruitment into affected ...

Strategic Endothelial Cell Tube Formation Assay: Comparing Extracellular Matrix and Growth Factor Reduced Extracellular Matrix

Malignant tumors require a blood supply in order to survive and spread. These tumors obtain their needed blood from the patient's blood stream by hijacking the process of angiogenesis, in which new blood vessels are formed from existing blood vessels. The CXCR2 (chemokine (C-X-C motif) receptor 2) receptor is a transmembrane G-protein-linked molecule found in many cells that is closely associated with angiogenesis1. Specific blockade of the CXCR2 receptor inhibits angiogenesis, as measured by several assays such as the endothelial tube formation assay. The tube formation assay is useful for studying angiogenesis because it is an excellent method of studying the effects that any given compound or environmental condition may have on angiogenesis. It is a simple and quick in vitro assay that generates quantifiable data and requires relatively few components. Unlike in vivo assays, it does not require animals and can be carried out in less than two days. This protocol describes a variation of the extracellular matrix supporting endothelial tube formation assay, which tests the CXCR2 receptor.

This manuscript describes a tube formation assay to quantify the effects of a given compound or condition on angiogenesis by using endothelial cell tube formation in a controlled environment.

전략적 내피 세포 관 형성의 분석 : 감소 세포 외 매트릭스 세포 외 기질과 성장 인자를 비교

Malignant tumors require a blood supply in order to survive and spread. These tumors obtain their needed blood from the patient's blood stream by ...

Assessment of the Anticoagulant and Anti-inflammatory Properties of Endothelial Cells Using 3D Cell Culture and Non-anticoagulated Whole Blood

In vivo, endothelial cells are crucial for the natural anticoagulation of circulating blood. Consequently, endothelial cell activation leads to blood coagulation. This phenomenon is observed in many clinical situations, like organ transplantation in the presence of pre-formed anti-donor antibodies, including xenotransplantation, as well as in ischemia/reperfusion injury. In order to reduce animal experimentation according to the 3R standards (reduction, replacement and refinement), in vitro models to study the effect of endothelial cell activation on blood coagulation would be highly desirable. However, common flatbed systems of endothelial cell culture provide a surface-to-volume ratio of 1 - 5 cm2 of endothelium per mL of blood, which is not sufficient for natural, endothelial-mediated anticoagulation. Culturing endothelial cells on microcarrier beads may increase the surface-to-volume ratio to 40 - 160 cm2/mL. This increased ratio is sufficient to ensure the &#34;natural&#34; anticoagulation of whole blood, so that the use of anticoagulants can be avoided. Here an in vitro microcarrier-based system is described to study the effects of genetic modification of porcine endothelial cells on coagulation of whole, non-anticoagulated human blood. In the described assay, primary porcine aortic endothelial cells, either wild type (WT) or transgenic for human CD46 and thrombomodulin, were grown on microcarrier beads and then exposed to freshly drawn non-anticoagulated human blood. This model allows for the measurement and quantification of cytokine release as well as activation markers of complement and coagulation in the blood plasma. In addition, imaging of activated endothelial cell and deposition of immunoglobulins, complement- and coagulation proteins on the endothelialized beads were performed by confocal microscopy. This assay can also be used to test drugs which are supposed to prevent endothelial cell activation and, thus, coagulation. On top of its potential to reduce the number of animals used for such investigations, the described assay is easy to perform and consistently reproducible.

We present an in vitro model which allows the study and analysis of coagulation in whole, non-anticoagulated blood. Anticoagulation in the system depends on the natural anticoagulation effect of healthy endothelial cells and endothelial cell activation will result in clotting.

3D 세포 배양 및 비 anticoagulated 전 혈을 사용 하 여 내 피 세포의 항 응 혈 약 그리고 항 염증 제 속성에 대 한 평가

In vivo, endothelial cells are crucial for the natural anticoagulation of circulating blood. Consequently, endothelial cell activation leads to blood ...

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using this protocol, angiogenesis may be measured in vitro in a fast, quantifiable manner. Primary or immortalized endothelial cells are mixed with conditioned media and plated on basement membrane matrix. The endothelial cells form capillary like structures in response to angiogenic signals found in conditioned media. The tube formation occurs quickly with endothelial cells beginning to align themselves within 1&#160;hr and lumen-containing tubules beginning to appear within 2 hr. Tubes can be visualized using a phase contrast inverted microscope, or the cells can be treated with calcein AM prior to the assay and tubes visualized through fluorescence or confocal microscopy. The number of branch sites/nodes, loops/meshes, or number or length of tubes formed can be easily quantified as a measure of in vitro angiogenesis. In summary, this assay can be used to identify genes and pathways that are involved in the promotion or inhibition of angiogenesis in a rapid, reproducible, and quantitative manner.

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

The tube formation assay is a fast, quantifiable method for measuring in vitro angiogenesis. Endothelial cells are combined with conditioned media and plated on basement membrane extract. Tube formation occurs within hours and newly formed tubules easily quantified.

에 대한 내피 세포의 관 형성의 분석<em&gt; 체외</em&gt; 혈관 신생 연구

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using ...