Name: induction and diagnosis of tumors in drosophila imaginal disc epithelia
Uploaded: 2017-07-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
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私たちは、原稿の批判的読解に対するJ.ヴォーゲンに感謝します。この研究は、日本学術振興会グラント番号26891025,15H01500およびYTへの武田科学財団研究助成金

1.フライクロスクローン誘導<ol><li>バイアルのハエを収集する前に、バイアル内のすべてのハエを12時間後に除去する。 </li><li>バイアル内のハエをCO 2ガスを注入して麻酔し、飛行船をCO 2フライパッドに置きます。 </li><li> CO 2フライパッドから10〜20匹の未処理の雌と10匹の雄を新鮮なバイアルに移し、25℃で1日間インキュベートする。 </li><li>これらのハエを新鮮なバイアルに移し、25℃で12時間インキュベートする。 注：最初の日に十分な卵を置いていないバージンの雌が最初のバイアルを捨てます。 </li><li>エンハンサー-GAL4系統については、成虫のハエを除去し、解剖まで25℃でバイアルをインキュベートする。 </li><li>フリップアウトGAL4によるモザイククローンの誘導のために、成虫のハエを除去し、バイアルを25℃で2〜4日間インキュベートする。熱ショック前のインキュベーション時間は、実験目的に依存する。卵の沈着の2日後の熱ショック（AED）は、未成熟の第2期にモザイククローンを生成する想像上皮を始める。 3または4日後の熱ショックAEDは、分化した早期から中期の第3齢の上皮上皮においてモザイククローンを生成する。 注：腫瘍原性表現型に対する熱ショックタイミングの変化の影響を調べることが重要である。 </li><li>フリップアウト-GAL4によるモザイククローンの誘導のために、バイアルを37℃の水浴中に10〜45分間浸漬し、25℃で2〜3日間インキュベートすることによってバイアルを熱ショックする。 注：各実験における熱ショック時間、タイミング、およびインキュベーション時間の情報は、図の凡例に示されています。 </li></ol> 2.幼虫の解剖<ol><li>蛍光立体顕微鏡下で適切な蛍光マーカー（ 例えば 、EGFP）で遺伝子型を木製スティックまたは鈍い鉗子で放浪している第3齢の幼虫を収集し、PBS（リン酸緩衝食塩水）を含む解剖皿に入れる。 </li><li> 2mLのプラスチックトランスファーピペットでピペッティングすることにより、PBS中の幼虫を洗浄する。 </li><li>1つの鉗子で幼虫の中心をピンチし、他の鉗子で半分に体を裂く。 </li><li> 1つの鉗子で前半の口のフックを挟み、他の鉗子で体に向かって口を押して、体を裏返しにします。 </li><li>唾液腺や脂肪体など不要な物質を鉗子で取り除きます。 </li></ol> 3.固定および抗体染色<ol><li>幼虫体の解剖学的前半部（imaginal wing discsを含む）を1.5mLプラスチックチューブに移し、穏やかに回転させながら暗所で室温で10分間Fix溶液（PBS中4％ホルムアルデヒド）1mLを固定する。 注意：ホルムアルデヒドは有毒で発癌性があります。皮膚に接触しないよう保護手袋と衣類を着用する。 注意：この部分では、特に明記されていない限り、すべてのステップは暗所で室温でナッターで行われます。 </li><li> Fixソリューションを削除して破棄します。組織を1mLのPBT（0.3％TritPBS中のX-100）上で3回、各15分間。 </li><li> PBTを除去し、ブロッキングのためにPBTG（0.2％ウシ血清アルブミンおよび5％正常ヤギ血清）1mLを添加し、室温で1時間または4℃で一晩インキュベートする。 </li><li> PBTGを除去し、PBTG（ 材料表を参照）で適切に希釈した一次抗体溶液を加え、4℃で一晩インキュベートする。 </li><li>一次抗体溶液を除去し、1mLのPBTで組織を3回、それぞれ15分間洗浄する。 </li><li> PBTを除去し、PBTG（1：400）で適切に希釈した二次抗体溶液を加える。室温で2時間、または4℃で一晩、ナットする。 </li><li>二次抗体溶液を除去し、1mLのPBTで組織を2回、それぞれ15分間洗浄する。 </li><li> F-アクチンを染色するために、PBTを除去し、PBS（1:40）で適切に希釈したPhalloidin溶液を加える。次に20分間寝かせる。ファロイジン溶液を除去し、1mLのPBTで組織を2回、それぞれ15分間洗浄する。 </li><li>核DNAを対比染色するために、PBTを除去し、DAPI（4 &#39;、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール）溶液（PBS中0.5μg/ mLのDAPI）を加える。その後、10分間ナットする。 注意：DAPIは発癌性があります。皮膚に接触しないよう保護手袋と衣類を着用する。 </li><li> DAPI溶液を除去し、1mLのPBTで組織を2回、それぞれ15分間洗浄する。 </li><li>室温で10分間、1mLのPBSで1回すすいでください。 </li><li> PBSを除去し、プレマウント培地として500μLの100％グリセロールを添加する。 </li></ol> 4.顕微鏡スライドへの取り付け<ol><li> 2mLのプラスチックトランスファーピペットを用いて顕微鏡スライド上に染色した組織を置く。 </li><li>鉗子で別の顕微鏡スライド上のマウント媒体の滴に組織を転送します。 </li><li> 1つの鉗子で解剖組織の終わりを押さえ、脳と目の触角円板を他の鉗子で引き離します。 注：脳を翼の想像上のディスクの近くに置くように切開したままにしておきます。頭脳は、カバーガラスが羽の想像上のディスクを粉砕するのを防ぐプラットフォームとして機能する。 </li><li>翼の想像上のディスクを隔離するには、解剖された組織の端を1つの鉗子で押さえ、体の壁を静かに引っ掻き、他の鉗子で椎間板を引き裂く。 注：羽の想像上のディスクを見つけることが困難な場合は、後部から前側に気管を剥がします。ウィングの想像上の円板は気管にくっついている。 </li><li>穏やかにカバーガラスでイーガルディスクを覆い、マニキュアでシールします。 4℃で保存する。 </li></ol> 5.共焦点顕微鏡法<ol><li>発光波長の範囲、レーザ強度、ゲイン、オフセット、走査速度と画像サイズ24を含む共焦点顕微鏡設定された画像取得パラメータを用いた共焦点画像を取得します。 注：画像取得設定の詳細な手順については、各顕微鏡メーカーが提供する取扱説明書を参照してください。 </li><li>単一の共同をキャプチャするにはウイングイメージディスク全体の非焦点部分には、20倍の対物レンズを使用します。 </li><li> 40倍または60倍のレンズを使用して、0.5〜1.0μmのステップサイズでzスタックスキャンによって3次元画像を取得します。 注：細胞の表現型を高解像度で解析するには、画像サイズが512 x 512ピクセルより大きくなければなりません。 </li></ol> 6. ImageJを用いた画像解析<ol><li>共焦点zスタック画像を取得し、分析するために、フィジー、生体画像分析（https://fiji.sc/）25に集中オープンソースのImageJソフトウェアを使用します。 </li><li>垂直セクションを取得するには、ImageJでzスタックイメージを開き、メニューアイテム &quot;Image / Stacks / Reslice&quot;を選択します。 注：XZ軸またはYZ軸のいずれかは、[再分割]メニューで選択できます。垂直断面は、zスタック画像上に直線または矩形を描くことによって任意の方向に得ることもできる。 </li></ol> 7.新生物表現型の診断<ol><li>垂直を開く1組のz-スタック画像から得られた切片（XZまたはYZ軸）を分析し、形態学的表現型および抗体染色を分析する。 </li><li> （1）ノックダウンクローンを含む細胞塊が主上皮層から逸脱する場合、（2）接合細胞タンパク質の細胞内局在がこの細胞塊で変化した場合、腫瘍表現型の診断のために、 、および（3）この細胞塊の直径が4細胞より大きい場合。 </li><li> 図1に示すフローチャートに従って、腫瘍表現型を分類する。 </li></ol>

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著者は何も開示することはない。

GAL4-UASシステムは、 ショウジョウバエ 26の標的遺伝子発現のための最も強力な遺伝子ツールの1つであり、in vivoで腫瘍細胞の誘導と解析を大いに容易にします4 。このシステムは、野生型上皮組織内の腫瘍抑制遺伝子のノックダウンまたは癌遺伝子の過剰発現を有するクローンの生成を可能にする。これは、形質転換された前腫瘍細胞が正常?...

上皮組織は、発達および細胞代謝回転を通じて組織を維持する顕著なホメオスタシス能力を有する高度に組織化されたシステムである。しかしながら、この堅牢な自己組織化システムは、腫瘍発生の間に次第に破壊される。腫瘍発生の開始時に、腫瘍遺伝子活性化または腫瘍抑制遺伝子不活性化から生じる個々の変異細胞が上皮層内に出現する。この形質転換された「プロ腫瘍細胞」が抑制的環境を回避し、上皮組織を破壊し、制御されない増殖を開始すると、腫瘍形成が起こる1 。過去数十年の間に、遺伝学および分子生物学における優れた技術的進歩は、がん研究において顕著な進歩を遂げました。特に、FLP-FRT（フリッパーゼリコンビナーゼ/フリッパーゼリコンビナーゼ標的）有糸分裂組換え体のようなショウジョウバエメラノガスターにおける遺伝的モザイク分析ツールを用いた最近の研究エーション2とフリップアウト-GAL4-UAS（上流活性化配列）システム3、大幅に良好腫瘍4、5、6の形成および転移に関与する遺伝的メカニズムを理解することに貢献しています。 保存されたショウジョウバエ腫瘍サプレッサー遺伝子、 致死性の巨大幼虫 （ lgl ）、 大型ディスク （ dlg ）、 落書き （ scrib ）の研究は、これらの遺伝子が重要な役割を果たすため、上皮組織の消失と腫瘍発生の重要な関係を明らかにした上皮組織7で、頂端-基底細胞極性および細胞増殖の調節インチショウジョウバエの原始椎間板は通常単層上皮であるが、これらの3つの遺伝子のいずれかのホモ接合突然変異は、細胞が構造および極性を失い、過剰増殖し、​​最終的に隣接する組織と融合する多層アモルファス塊を形成する7 。同様に、哺乳動物におけるこれらの遺伝子の破壊は、悪性腫瘍8,9の開発に関与しています。変異体組織によって示される腫瘍性表現型は、保存、新生物、腫瘍抑制遺伝子（nTSGs）として、これら三つの遺伝子の分類7,8につながっています。ホモ接合nTSG変異細胞は散発的にFLP-FRT媒介有糸分裂組換えを使用して、野生型の成虫を開発する際に生成される場合しかし、変異細胞はc-Jun N末端キナーゼ（JNK）依存性アポトーシス10、11を介して組織から除去されます、12、13、14、15、押出し</sup&gt; 、 16 、または隣人による貪食および食作用17 。この遺伝的にモザイク上皮では、アポトーシスは主に隣接する正常細胞はnTSG変異細胞10、11、12、18のアポトーシスを引き起こすことを示唆し、クローンの境界に位置nTSG変異体細胞において検出されます。哺乳動物細胞における最近の研究では、プロの腫瘍細胞のこの細胞競争依存除去は癌19、20、21、22、23に対する進化的に保存された上皮の自己防御機構であることを確認しました。 しかし、最近のショウジョウバエの成虫の研究では、モザイクのnTSGノックダウンクローンが腫瘍性腫瘍を特異的に誘導することが示されています翼の想像上のディスクのIC領域16 。初期の腫瘍形成は末梢「ヒンジ」領域に常に見られ、ウイングディスク上皮の​​中央「ポーチ」領域では決して観察されず、nTSGノックダウン細胞の腫瘍形成能は局所環境に依存することが示唆された。中央ポーチ領域は、プロ腫瘍細胞が形成異常増殖を示さない一方で、周辺ヒンジ領域が「腫瘍ホットスポット」として振る舞う「腫瘍コールドスポット」として機能する16 。 「コールドスポット（cold spot）」ポーチ領域では、nTSG-ノックダウン細胞は基底面から剥離し、アポトーシスを起こす。対照的に、「ホットスポット」ヒンジ細胞は基底面に頑強な細胞骨格構造のネットワークを持っているため、nTSGノックダウン細胞は上皮の頂端側から剥離し、腫瘍原性の過増殖を開始する16 。したがって、原始椎間板における腫瘍表現型の解析には、注意深い検討が必要である腫瘍形成刺激に対する領域特異的感受性の低下。 ここでは、正常なウイングディスク上皮においてnTSGノックダウン細胞が生成されるGAL4-UAS- RNAiシステムを利用して、 ショウジョウバエのウイングのヘルニア椎間板に腫瘍性腫瘍形成を誘導するためのプロトコールについて説明する。これらの実験系は癌の初期段階を研究するのに有用であるが、椎間板上皮における腫瘍進行の段階を評価するための明確な分類方法はこれまで明らかにされていない。したがって、我々はまた、ウイングディスク上皮に誘導された前腫瘍クローン表現型を3つのカテゴリーに分類する診断法を提案する：過形成（増殖が増加した正常数の細胞の過剰な蓄積）、異形成（異常に出現する前悪性組織細胞）、および新生物（異常な外観および異常な増殖パターンを有する細胞からなる良性または悪性の腫瘍）。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS)</td><td>Wako</td><td>162-19321</td><td></td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Wako</td><td>168-11805</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Wako</td><td>064-00406</td><td></td></tr><tr><td>bovine serum albumin</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>normal goat serum</td><td>Sigma</td><td>G6767</td><td></td></tr><tr><td>mounting medium, Vectashield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>mouse-anti-Dlg 4F3</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>4F3 anti-discs large, RRID:AB_528203</td><td>dilute in PBTG, 1:40</td></tr><tr><td>mouse-anti-MMP1</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>3A6B4, RRID:AB_579780</td><td>3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40</td></tr><tr><td>mouse-anti-MMP1</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>3B8D12, RRID:AB_579781</td><td>3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40</td></tr><tr><td>mouse-anti-MMP1</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>5H7B11, RRID:AB_579779</td><td>3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40</td></tr><tr><td>mouse-anti-&lt;span class=&quot;font13&quot;&gt;a&lt;/span&gt;&lt;span class=&quot;font8&quot;&gt;tubulin&lt;/span&gt;</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>AA4.3, RRID:AB_579793</td><td>dilute in PBTG, 1:100</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 Phalloidin</td><td>Molecular probes</td><td>A22283</td><td>dilute in PBS, 1:40</td></tr><tr><td>goat anti-mouse IgG antibody, Alexa Fluor 546</td><td>Molecular probes</td><td>A11030</td><td>dilute in PBTG, 1:400</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Fly strains&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;sd-Gal4&lt;/em&gt;</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#8609</td><td>recombined with &lt;em&gt;&lt;span class=&quot;font11&quot;&gt;UAS-EGFP&lt;/span&gt;&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;upd-Gal4&lt;/em&gt;</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#26796</td><td>recombined with &lt;em&gt;&lt;span class=&quot;font11&quot;&gt;UAS-EGFP&lt;/span&gt;&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;UAS-lgl-RNAi&lt;/em&gt;</td><td>Vienna Drosophila RNAi center</td><td>#51247</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;UAS-scrib-RNAi&lt;/em&gt;</td><td>Vienna Drosophila RNAi center</td><td>#105412</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;UAS-Ras&lt;span class=&quot;font12&quot;&gt;&lt;sup&gt;V12&lt;/sup&gt;&lt;/span&gt;&lt;/em&gt;</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#64196</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;UAS-Yki&lt;span class=&quot;font12&quot;&gt;&lt;sup&gt;3SA&lt;/sup&gt;&lt;/span&gt;&lt;/em&gt;</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#28817</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;hsFLP&lt;/em&gt;</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#6</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Act&gt;CD2&gt;GAL4 (flip-out GAL4)&lt;/em&gt;</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#4780</td><td>recombined with &lt;em&gt;&lt;span class=&quot;font11&quot;&gt;UAS-EGFP&lt;/span&gt;&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;UAS-EGFP&lt;/em&gt;</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#5428</td><td>X chromosome</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;UAS-EGFP&lt;/em&gt;</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#6658</td><td>third chromosome</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;UAS-Dicer2&lt;/em&gt;</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#24650</td><td>second chromosome</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;UAS-Dicer2&lt;/em&gt;</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#24651</td><td>third chromosome</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;vkg-GFP&lt;/em&gt;</td><td>Morin et al. 2001</td><td></td><td>GFP protein trap</td></tr></tbody></table>

induction and diagnosis of tumors in drosophila imaginal disc epithelia

癌の初期段階では、形質転換された突然変異細胞は細胞学的異常を示し、制御されない過増殖を開始し、組織組織化を漸進的に破壊する。 Drosophila melanogasterは、腫瘍発生の遺伝的メカニズムおよび細胞メカニズムを研究するために、癌生物学における一般的な実験モデルシステムとして登場しました。特に、 ショウジョウバエ （ Drosophila） imaginal disc（幼生の上皮発生）のための遺伝的ツールは、正常な上皮組織内で形質転換された前腫瘍細胞の生成を可能にする。これはヒト癌の初期段階と同様の状況である。しかし、 ショウジョウバエの翅の椎間板の腫瘍形成に関する最近の研究では、腫瘍の開始は組織固有の細胞構造および局所微小環境に依存することが示され、imaginalの腫瘍表現型を評価する際の腫瘍原性刺激に対する領域特異的感受性を考慮することが重要であるディスク。腫瘍進行の表現型分析を容易にするためにGAL4-UASシステムを用いた遺伝子実験のプロトコールについて説明します。この実験では、翅の椎間板に腫瘍性腫瘍を誘導します。以前には報告されていなかった腫瘍の進行の様々な段階（肥厚、形成異常または腫瘍形成）を識別するための明確な分類方法として、想像上皮に誘発されたクローン病変の表現型を分類するための診断方法をさらに紹介する。これらの方法は、 ショウジョウバエの種々の臓器における腫瘍表現型のクローン分析に広く適用可能であろう。

ショウジョウバエのウイング上の椎間板におけるRNAi媒介性のnTSGノックダウンによって実験的に誘導された腫瘍形成を実証するために、3種の異なるGAL4ドライバを用いてlglまたはscribに対するUAS-RNAiを発現さ せた ：（1） sd-GAL4ウィングポーチ、およびヒンジ領域における軽度の発現（ 図2およ...

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Induction and Diagnosis of Tumors in Drosophila Imaginal Disc Epithelia

ショウジョウバエの上椎間板上皮におけるモザイククローン解析は、腫瘍形成の遺伝的メカニズムおよび細胞メカニズムを研究するための強力なモデルシステムです。ここでは、GAL4-UASシステムを用いて、 ショウジョウバエの翅の椎間板に腫瘍を誘導するプロトコールについて説明し、腫瘍の表現型を分類するための診断法を紹介する。

腫瘍の誘導および診断<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt; Imaginal Disc Epithelia

In the early stages of cancer, transformed mutant cells show cytological abnormalities, begin uncontrolled overgrowth, and progressively disrupt tissue ...

induction-diagnosis-tumors-drosophila-imaginal-disc

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Induction and Diagnosis of Tumors in Drosophila Imaginal Disc Epithelia

14.8K ビュー.  SOKENDAI.  ショウジョウバエの上椎間板上皮におけるモザイククローン解析は、腫瘍形成の遺伝的メカニズムおよび細胞メカニズムを研究するための強力なモデルシステムです。ここでは、GAL4-UASシステムを用いて、 ショウジョウバエの翅の椎間板に腫瘍を誘導するプロトコールについて説明し、腫瘍の表現型を分類するための診断法を紹介する。 

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Next Generation Sequencing for the Detection of Actionable Mutations in Solid and Liquid Tumors

As our understanding of the driver mutations necessary for initiation and progression of cancers improves, we gain critical information on how specific molecular profiles of a tumor may predict responsiveness to therapeutic agents or provide knowledge about prognosis. At our institution a tumor genotyping program was established as part of routine clinical care, screening both hematologic and solid tumors for a wide spectrum of mutations using two next-generation sequencing (NGS) panels: a custom, 33 gene hematological malignancies panel for use with peripheral blood and bone marrow, and a commercially produced solid tumor panel for use with formalin-fixed paraffin-embedded tissue that targets 47 genes commonly mutated in cancer. Our workflow includes a pathologist review of the biopsy to ensure there is adequate amount of tumor for the assay followed by customized DNA extraction is performed on the specimen. Quality control of the specimen includes steps for quantity, quality and integrity and only after the extracted DNA passes these metrics an amplicon library is generated and sequenced. The resulting data is analyzed through an in-house bioinformatics pipeline and the variants are reviewed and interpreted for pathogenicity. Here we provide a snapshot of the utility of each panel using two clinical cases to provide insight into how a well-designed NGS workflow can contribute to optimizing clinical outcomes.

This manuscript describes clinical protocols for two next-generation sequencing panels. One panel interrogates hematologic malignancies while the other panel targets genes commonly mutated in solid tumors. Molecular classification of driver mutations in human malignancies offers valuable prognostic and predictive information.

固体と液体の腫瘍におけるアクショナブル変異の検出のための次世代シーケンシング

As our understanding of the driver mutations necessary for initiation and progression of cancers improves, we gain critical information on how specific ...

がん研究

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the context of a whole organism. Sophisticated techniques to generate genetic mosaics facilitate induction of visually marked, genetically defined clones surrounded by normal tissue. The clones can be analyzed through diverse molecular, cellular and omics approaches. This study describes how to generate fluorescently labeled clonal tumors of varying malignancy in the eye/antennal imaginal discs (EAD) of Drosophila larvae using the Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. It describes procedures how to recover the mosaic EAD and brain from the larvae and how to process them for simultaneous imaging of fluorescent transgenic reporters and antibody staining. To facilitate molecular characterization of the mosaic tissue, we describe a protocol for isolation of total RNA from the EAD. The dissection procedure is suitable to recover EAD and brains from any larval stage. The fixation and staining protocol for imaginal discs works with a number of transgenic reporters and antibodies that recognize Drosophila proteins. The protocol for RNA isolation can be applied to various larval organs, whole larvae, and adult flies. Total RNA can be used for profiling of gene expression changes using candidate or genome-wide approaches. Finally, we detail a method for quantifying invasiveness of the clonal tumors. Although this method has limited use, its underlying concept is broadly applicable to other quantitative studies where cognitive bias must be avoided.

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

This protocol demonstrates how to generate fluorescently marked, genetically defined clonal tumors in the Drosophila eye/antennal imaginal discs (EAD). It describes how to dissect the EAD and brain from the third instar larvae and how to process them to visualize and quantify gene expression changes and tumor invasiveness.

ザ<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;成虫盤腫瘍モデル：遺伝的モザイクを用いた遺伝子発現と腫瘍侵襲性の可視化と定量化

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Dissection of Imaginal Discs from 3rd Instar Drosophila Larvae

This protocol demonstrates the dissection technique used for isolating imaginal discs from drosophila larvae at the 3rd instar stage. Methods for fixing the tissue after saying and removing the wing, leg, and eye discs are demonstrated directly on a microscope slide for subsequent visualization.

3齢幼虫ショウジョウバエの幼虫から成虫ディスクの解剖

生物学

Development of a Human Preclinical Model of Osteoclastogenesis from Peripheral Blood Monocytes Co-cultured with Breast Cancer Cell Lines

The crosstalk between tumor cells and bone cells in the bone microenvironment is crucial to understanding the mechanism of bone metastasis formation. We developed an in vitro fully human preclinical model of a co-culture of breast cancer cells and monocytes undergoing differentiation towards osteoclasts. We optimized a model of osteoclastogenesis starting from a sample of peripheral blood collected from healthy donors. Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were first separated by density gradient centrifugation, seeded at a high density and induced to differentiate by adding two growth factors (GFs): receptor activator of nuclear factor-&#954;B ligand (RANKL) and macrophage colony-stimulating factor (MCSF). The cells were left in culture for 14 days and then fixed and analyzed by downstream analysis. In osteolytic bone metastases, one of the effects of cancer cell arrival in bone is the induction of osteoclastogenesis. We thus challenged our model with co-cultures of breast cancer cells to study the differentiation power of cancer cells with respect to GFs. A straightforward way of studying cancer cell-osteoclast interaction is to perform indirect co-cultures based on the use of conditioned medium collected from breast cancer cell cultures and mixed with fresh medium. This mixture is then used to induce osteoclast differentiation. We also optimized a method of direct co-culture in which cancer cells and monocytes undergoing differentiation share the medium and exchange secreted factors. This is a significant improvement over the original indirect co-culture method as researchers can observe the reciprocal interactions of the two cell types and perform downstream analyses for both cancer cells and osteoclasts. This method enables us to study the effect of drugs on the metastatic bone microenvironment and to seed cell lines other than those derived from breast cancer. The model can also be used to study other diseases such as osteoporosis or other bone conditions.

This protocol describes development of an in vitro human preclinical model of osteoclastogenesis from peripheral blood monocytes cultured with breast cancer cell lines to mimic the cancer cell-osteoclast interaction. The model could be used to further our understanding of bone metastasis formation and improve therapeutic options.

破骨細胞形成乳房癌細胞と共培養末梢血単球からの人間の前臨床モデルの開発

The crosstalk between tumor cells and bone cells in the bone microenvironment is crucial to understanding the mechanism of bone metastasis formation. We ...

Establishment of a Primary Culture of Patient-derived Soft Tissue Sarcoma

Soft tissue sarcomas (STS) represent a spectrum of heterogeneous malignancies with a difficult diagnosis, classification, and management. To date, more than 50 histological subtypes of these rare solid tumors have been identified. Thus, due to their extraordinary diversity and low incidence, our understanding of the biology of these tumors is still limited. Patient-derived cultures represent the ideal platform to study STS pathophysiology and pharmacology. We thus developed a human preclinical model of STS starting from tumor specimens harvested from patients undergoing surgical resection. Patient-derived STS cell cultures were obtained from the surgical specimens by collagenase digestion and isolated by filtration. Cells were counted, seeded, and left for 14 days in standard monolayer cultures and then processed by downstream analysis. Before performing molecular or pharmaceutical analyses, the establishment of STS primary cultures was confirmed through the evaluation of cytomorphologic features and, when available, immunohistochemical markers. This method represents a useful tool 1) to study the natural history of these poorly explored malignancies and 2) to test the effects of different drugs in an effort to learn more about their mechanisms of action.

The following protocol focuses on the establishment of a primary culture of patient-derived soft tissue sarcoma (STS). This model could help us to better understand the molecular background and pharmacological profile of these rare malignancies and could represent a starting point for further research aimed at improving STS management.

患者由来の軟部肉腫の主な文化の確立

Soft tissue sarcomas (STS) represent a spectrum of heterogeneous malignancies with a difficult diagnosis, classification, and management. To date, more ...

A Protocol for Genetic Induction and Visualization of Benign and Invasive Tumors in Cephalic Complexes of Drosophila melanogaster

Drosophila has illuminated our understanding of the genetic basis of normal development and disease for the past several decades and today it continues to contribute immensely to our understanding of complex diseases 1-7. Progression of tumors from a benign to a metastatic state is a complex event 8 and has been modeled in Drosophila to help us better understand the genetic basis of this disease 9. Here I present a simple protocol to genetically induce, observe and then analyze the progression of tumors in Drosophila larvae. The tumor induction technique is based on the MARCM system 10 and exploits the cooperation between an activated oncogene, RasV12 and loss of cell polarity genes (scribbled, discs large and lethal giant larvae) to generate invasive tumors 9. I demonstrate how these tumors can be visualized in the intact larvae and then how these can be dissected out for further analysis. The simplified protocol presented here should make it possible for this technique to be utilized by investigators interested in understanding the role of a gene in tumor invasion.

A Protocol for Genetic Induction and Visualization of Benign and Invasive Tumors in Cephalic Complexes of Drosophila melanogaster

Cooperation between an activated oncogene like RASV12 and mutations in cell polarity genes like scribbled, result in tumor growth in Drosophila where tumor cells also display invasive behaviors. Here a simple protocol for the induction and observation of the benign and invasive tumors is presented.

遺伝的誘導との頭部の複合体における良性および浸潤性腫瘍の可視化のためのプロトコル<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

Drosophila has illuminated our  understanding of the genetic basis of normal development and disease for the  past several decades and today it continues ...

医学

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A remarkable example is given by sensory epithelia, where cells of the same or distinct identities are brought together via cell-cell adhesion showing highly organized planar patterns. Cells align to one another in the same direction and display equivalent polarity over large distances. This organization of the mature epithelia is established over the course of morphogenesis. To understand how the planar arrangement of the mature epithelia is achieved, it is crucial to track cell orientation and growth dynamics with high spatiotemporal fidelity during development in vivo. Robust analytical tools are also essential to identify and characterize local-to-global transitions. The Drosophila pupa is an ideal system to evaluate oriented cell shape changes underlying epithelial morphogenesis. The pupal developing epithelium constitutes the external surface of the immobile body, allowing long-term imaging of intact animals. The protocol described here is designed to image and analyze cell behaviors at both global and local levels in the pupal abdominal epidermis as it grows. The methodology described can be easily adapted to the imaging of cell behaviors at other developmental stages, tissues, subcellular structures, or model organisms.

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

This protocol is designed for the imaging and analysis of the dynamics of cell orientation and tissue growth in the Drosophila abdominal epithelia as the fruit fly undergoes metamorphosis. The methodology described here can be applied to the study of different developmental stages, tissues, and subcellular structures in Drosophila or other model organisms.

プパル期のショウジョウバエ上皮の組織オリエンテーションと成長ダイナミクスのイメージングと解析

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A ...

発生生物学

Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

The Drosophila pupal abdomen is an established model system for the study of epithelial morphogenesis and the development of sexually dimorphic morphologies 1-3. During pupation, which spans approximately 96 hours (at 25 &deg;C), proliferating populations of imaginal cells replace the larval epidermis to generate the adult abdominal segments. These imaginal cells, born during embryogenesis, exist as lateral pairs of histoblast nests in each abdominal segment of the larvae. Four pairs of histoblast nests give rise to the adult dorsal cuticle (anterior and posterior dorsal nests), the ventral cuticle (ventral nests) and the spiracles associated with each segment (spiracle nests) 4. Upon puparation, these diploid cells (distinguishable by size from the larger polyploid larval epidermal cells- LECs) begin a stereotypical process of proliferation, migration and replacement of the LECs. Various molecular and genetic tools can be employed to investigate the contributions of genetic pathways involved in morphogenesis of the adult abdomen. Ultimate adult phenotypes are typically analyzed following dissection of adult abdominal cuticles. However, investigation of the underlying molecular processes requires immunohistochemical analyses of the pupal epithelium, which present unique challenges. Temporally dynamic morphogenesis and the interactions of two distinct epithelial populations (larval and imaginal) generate a fragile tissue prone to excessive cell loss during dissection and subsequent processing. We have developed methods of dissection, fixation, mounting and imaging of the Drosophila pupal abdominem epithelium for immunohistochemical studies that generate consistent high quality samples suitable for confocal or standard fluorescent microscopy.

Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

Antibody staining of the Drosophila pupae can enhance genetic analyses of adult abdominal developmental genetics. We present our protocol for dissection, fixation and antibody staining of staged Drosophila pupal abdomen.

ショウジョウバエの蛹の腹部の免疫組織化学

The Drosophila pupal abdomen is an established model system for the study of epithelial morphogenesis and the development of sexually dimorphic ...

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called imaginal discs. These discs give rise to a high percentage of adult structures that are found within the adult fly. Here we describe a protocol that has been optimized to recover these discs and prepare them for analysis with antibodies, transcriptional reporters and protein traps. This procedure is best suited for thin tissues like imaginal discs, but can be easily modified for use with thicker tissues such as the larval brain and adult ovary. The written protocol and accompanying video will guide the reader/viewer through the dissection of third instar larvae, fixation of tissue, and treatment of imaginal discs with antibodies. The protocol can be used to dissect imaginal discs from younger first and second instar larvae as well. The advantage of this protocol is that it is relatively short and it has been optimized for the high quality preservation of the dissected tissue. Another advantage is that the fixation procedure that is employed works well with the overwhelming number of antibodies that recognize Drosophila proteins. In our experience, there is a very small number of sensitive antibodies that do not work well with this procedure. In these situations, the remedy appears to be to use an alternate fixation cocktail while continuing to follow the guidelines that we have set forth for the dissection steps and antibody incubations.

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

The adult structures of Drosophila are derived from sac-like structures called imaginal discs. Analysis of these discs provides insight into many developmental processes including tissue determination, compartment boundary establishment, cell proliferation, cell fate specification, and planar cell polarity. This protocol is used to prepare imaginal discs for light/fluorescent microscopy.

解剖や成虫の免疫染色から<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called ...

Drosophila Larva Imaginal Disc Dissection: A Method to Observe Developing Epithelia

Source: Morimoto, K. and Tamori, Y. <a href="https://www.jove.com/video/55901/" target="_blank">Induction and Diagnosis of Tumors in Drosophila Imaginal Disc Epithelia</a>. J. Vis. Exp. (2017).
When staining Drosophila imaginal discs, often a rough dissection is performed where the discs are exposed but remain attached to the body. Once stained, the discs of interest are isolated and mounted. The example protocol demonstrates a procedure for wing imaginal disc dissection and mounting.

ショウジョウバエ幼虫の想像上板解剖:発達中の上皮を観察する方法

Source: Morimoto, K. and Tamori, Y. Induction and Diagnosis of Tumors in Drosophila Imaginal Disc Epithelia. J. Vis. Exp. (2017).
When staining Drosophila ...

腫瘍の誘導および診断

要約

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