この方法は、ショウジョウバエ胚で起こる筋肉収縮や転動などの発達過程を分析する方法を取り上げる。この技術のいくつかの利点は、それが非侵襲的で非常に詳細であるが、それは比較的簡単に実行できるということです。我々の方法は、胚性筋肉収縮および他の発達過程に影響を与える新しい突然変異を単離し、分析するための高内容分析ベースのスクリーニングのためにさらに開発することができる。
筋肉の収縮を視覚化する場合、収縮は特定の発達段階でのみ始まるため、胚の採取を適切に時間を取ることが重要です。段階的な視覚実証は、発達過程の定量的分析に大いに役立ちます。取り付けられたショウジョウバエ胚のライブイメージングでは、胚を適度な排出フィルタを備えた蛍光顕微鏡とデジタルカメラのステージに置き、10倍の水浸し対物レンズを選択します。
次に、ライブビデオは、毎秒4フレームの取得率で約1〜2時間、適切な顕微鏡記録ソフトウェアを使用して胚を記録します。実験の最後に、録画したビデオを直接 ImageJ にエクスポートします。画像と作物を選択して、個々の胚の周りにボックスを描き、各胚の大きさにビデオ録画をトリミングします。
画像、変形、回転をクリックして、トリミングされた画像を回転させて、画面に対する胚の正中線の垂直位置を達成します。距離の計測値をマイクロメートルに設定するには、[分析とスケールの設定]をクリックし、顕微鏡の設定に対して既知のピクセル対ミクロン比変換係数を入力します。その後のすべての測定値はマイクロメートルで報告されます。
胚の転がりを解析するには、まず、後部と前端の間のビデオの最初のフレームで胚の一方または両方の気管の位置をマークし、[分析、ツール、および関心のある地域マネージャ]をクリックします。気管の周囲に約7マイクロメートル×7マイクロメートルのボックスを描き、キーボードのTキーをクリックしてこの位置をXY座標として記録します。目的の蠕動収縮後の気管の同じ領域の位置をマークし、キーボードのMをクリックして各ボックスの中心を結ぶ線を引き、収縮前位置から収縮後の位置までの距離を測定します。
蛍光筋マーカーを発現する胚を用いて胚筋収縮を解析するには、蛍光読み出しの記録を用いて、対象となる特定の身体セグメントの蛍光筋を中心とした対象領域を描く。対象地域マネージャーの「T を追加」タブを選択して、対象地域の位置を記録します。[対象地域マネージャーと測定] をクリックして、ビデオの各フレームに選択した対象領域ごとの平均蛍光強度を記録します。
ボックスを対象の他のボディ セグメントの中心に移動し、[T を追加]をクリックして、分析対象のすべてのボディ セグメントで同じサイズの関心のある領域を取得します。[対象地域マネージャー] で、コントロール キーを押しながら、XY 座標として記録されたすべての対象領域を選択します。[詳細とマルチメジャー] をクリックして、ビデオのすべてのフレームの対象領域ごとの平均蛍光強度を測定します。
これにより、テーブル内の各計測値が、対象領域ごとにテーブルの列として、各フレームが行として報告されます。その後、テーブルをスプレッドシートプログラムに転送して、さらに分析します。X軸上にフレーム番号、Y軸上の平均蛍光強度を持つグラフをプロットし、4フレーム/秒のフレームレートを使用してフレーム数を時間に変換します。
筋肉の収縮は、これらの収縮の間により多くの筋肉が引き込まれるにつれて、より多くのGFPを焦点領域の近くに持ち込むにつれて、GFPの強度を増加させる。筋収縮振幅を決定するために、ベースラインGFP強度をピーク間の領域の平均強度として推定する。次に、このベースラインに対するGFP蛍光強度の増加を評価する。
次に、対象の強度値のすべての領域をベースライン強度で割り、GFP の強度をベースラインに正規化します。筋肉収縮波の間の後部、内側および前部のセグメントで正規化されたGFP強度を比較して、波が伝播するにつれて筋肉収縮の程度の変化を調べ、波の方向を決定する。胚の左右の筋肉収縮を比較するには、胚の両側の同じセグメントのピーク強度を分析する。
収縮振幅とピークのタイミングを使用して、相違点がある場合、および蠕動筋収縮波の程度とタイミングを明らかにします。ここでは、野生型ショウジョウバエ胚における正常な蠕動筋収縮が示されている。野生型胚で転がるこのビデオでは、気管が胚がその殻の中で転がしたことを示している間、後部付属物は動かないことに注意してください。
この代表的な分析では、165〜178秒の期間の間に筋肉収縮ピークが単一の前方波を表す。この胚については、振幅と筋肉収縮時間の差を胚の左右で測定しなかった。蠕動収縮は、そのプロファイルが後部領域で最初に発生するピークを有する場合、前方タイプ1波として指定され、その後、中央および前領域でピークが続く。
後方タイプの 1 つの波は、最初に前方セグメントで発生し、次に後方領域に向かって伝播するピークです。2つの波は胚の一方の端から始まり、中間領域に向かって進み、反対側の端で再開始された掃引波として原点に戻ります。体態勢変異胚は、身体の胴体または回転表現型として指定された体の姿勢異常をもたらす2つの波の発生をタイプするタイプ1の異常な相対周波数を示す。
筋肉収縮パラメータの読み出しとして蛍光を使用するには、筋組織にレポーターと共に胚を使用することが不可欠です。この方法は、多くの胚の筋肉収縮の同時記録と、様々な刺激、薬物または環境変化に対する応答の評価に使用することができる。
