著者は、このビデオの記事を生成すると彼女の助けのために博士ビルギットヴェルナーに感謝します。この研究は、NSFのキャリア賞によって資金を供給された。

その1：実験の準備カブトガニで行わ実験手順は、ボストン大学の動物実験使用の委員会によって承認されている。動物は規制の明暗サイクルにさらさ​​れた部屋で海洋生物学研究所（ウッズホール、マサチューセッツ州）または他のベンダーから購入し、通気海水槽に収容されています。照明のレジメンは、カニの体内時計を同調し、その日中および夜間の状態の間、毎日目を入れ直すために重要である。直ちに侵襲的処置を開始する前にその動きを遅くして、前体部とopisthosomaの2つに挿入された2つのステンレス製ビスを木製の台に固定されるまで、動物は10〜15分間氷のバケツで冷却される。それが水に沈むように、プラットフォームは花崗岩で下に重み付けされます。ターミナル実験の後、動物は再び氷スラリーに浸漬し、メスで、口の上にある脳を、ピッシングにより安楽死されています。 パート2：ソリューションカブトガニリンゲル溶液は430 mMのNaCl、9.56 mMの塩化カリウム、9.52 mMの塩化カルシウム、9.97 mMのMgCl 2、21.05 mMの硫酸マグネシウム、50μMTES、50μMHEPES、および10ミリリットル/ Lペン-球菌ミックス（ペニシリン - ストレプトマイシン、10000単位/ ml）で構成されています。 パート3：網膜電図記録この手順に必要な工具はプラスドライバー、ワセリン、リンゲル溶液、転送ピペット、緑色LED、録音室、ステンレス鋼製ねじ、と綿棒が含まれています。 <ol><li>手作りのチャンバーは、ERG（図1A）を記録するために使用されます。チャンバ本体は、眼に接触して生理食塩水タンクを保持するために設計されています。蓋にはLEDを収容できるサイズにアンプと小さな穴に導電性溶液を結合するための塩化銀のワイヤーが含まれています。 520nm付近のピーク発光を有するLED超高輝度が最適に動作します。 </li><li>起動するには、チャンバーの下側は、石油ゼリーでコーティングし、2本のネジで眼を介して固定されています。 </li><li>チャンバーは、生理食塩水を充填し、蓋で覆われている。 </li><li>チャンバーの添付ファイルの後にカニは鰓以上海水で満たされたタンクの遮光ケージに入れています。 </li><li> LEDケーブルをチャンバーの蓋に挿入されます。 </li><li>信号リードは、塩化線にクリップされており、基準リードを注入ネジの1つにクリップされます。 </li><li>両方のリード線は、10Hz未満の周波数を渡すために設定されている信号の増幅とアンプのフィルタのためにハイインピーダンスの差動アンプ（X -セル3x4の、FHC社）のヘッドステージに接続されています。 </li><li>アンプの出力は、コンピュータの分析と保管のために鑑賞するためにオシロスコープとデータ集録ボードに供給されます。 </li><li>セットアップ後にケージのドアは、動物に達することから、部屋の明かりを遮断するために閉じている。 </li><li>データは、LabVIEWで記述されたカスタムプログラムで収集されます。プログラムは、LEDを点滅誘発ERG信号を記録し、ピークツーピーク応答振幅を測定します。フラッシュパラダイムの選択は、実験目的によって異なります。例えば、5Vの短い（100ミリ）パルスは、LEDへの10分ごとに視感度の概日変化を監視する際に明順応の影響を回避して適用。 </li></ol>パート4：視神経の記録この手順に必要な工具はドライバー、スレッド、トレパン、リンゲル溶液、rongeurs、vannasのはさみ、録音室、曲がったピンセット、細針プローブ、鈍いメス、手術用はさみ、および吸引電極を含む。 <ol><li>手作りのチャンバーは、視神経の応答（図1B）を記録するために使用されます。チャンバーの内部には神経を収容し、周囲組織から分離するために底壁の薄い半円形の溝開口部を有する2センチメートル-直径開いてもです。 </li><li>チャンバーの添付ファイルの前に16ゲージの針が心臓にヒンジ筋肉の間に挿入され、血液の〜20ccは、動物から排出される。瀉血は必要ではありませんが、視神経の解剖が容易になります。 </li><li>視神経の位置は、甲羅の側面と中央の目の間にわずかに曲線を描画することによって推定される。 </li><li>円形の穴は、トレパンと甲羅にカットされます。穴は、穴のチャンバーと同じ直径です。穴の中心は側眼と神経がよくの腹部分に沿って実行されるように、ラインにわずかに背側前方に2〜3センチメートルに位置しています。 </li><li>神経が完全に表示し、周囲組織と根底にあるから自由になるまで、結合組織はクリアされます。 </li><li>スレッドのストランドは、神経の周りにループと下部にあるスロットを通ってチャンバに取り込まれます。この同じ開口部を介して神経を穏やかに文字列を引っ張って、チャンバー内に導かれる。同時に、チャンバーはよく穴に挿入されます。チャンバーは、甲羅に貼付されていますネジと同様にリンゲル溶液で満たされている。 </li><li>チャンバーの添付ファイルの後に動物は鰓を介し海水で満たされたタンク内の遮光ケージに入れています。 </li><li>よくは、ステレオスコープ（SMZ - 168、ジェドペラ社）と綿をチャンバーの外に、生理食塩水、血液の漏出を防ぐために底の開口部の周囲にパディングされている下で可視化です。 </li><li>神経の周り残留結合組織は、微細なハサミとピンセットで除去され、そしてチャンバーは新鮮なリンゲル液を再充填される。 </li><li>ニックネームは、神経をカプセル化し、この開口を介して神経を注意深く細かいハサミ、ピンセット、そして針プローブを用いてその長さに沿ってdesheathedている血管で作られています。 </li><li>小さな繊維束は、求心性繊維の記録のためにと遠心性繊維の記録のための目に最も近い端の目から最も遠い端にプローブとカットを使用して、神経から分離されている。ビデオでの求心性繊維の記録のための端がカットされます。 </li><li>リンガー液で満たされたmicrosuction電極（AMシステムズ社）は、視神経のレコーディングに使用されます。電極の先端は、キャピラリー直径1mmのホウケイ酸ガラスの端を研磨火災による神経束に取り付けられています。 </li><li>電極の先端を手動マニピュレーター（WPI社）とウェルチャンバーに低下し、カットの繊維束は、先端に吸い込まれる。吸引は、チューブを介して電極に接続さGilmontの注射器によって提供されます。 </li><li> BNC接続は、信号リードを提供し、ノイズを低減するために電極に巻き付け塩化銀線は、基準リードを提供します。 2本のリード線は、信号増幅やノイズフィルタ（X -セル3x4の、FHC社）用の差動アンプのヘッドステージに接続されています。アンプの出力は、コンピュータの分析と保管のための表示とデータ集録カード用オシロスコープに送信されます。 </li><li>データは、LabVIEWで記述されたカスタムプログラムで収集されます。プログラムは、デジタルビデオプロセッサを介して光の刺激を制御する（ビット+ +、ケンブリッジリサーチシステムズ社）とスパイクを記録するデジタルスパイク弁別器（APM、FHC社）とのインターフェイス。光は、コンピューター制御のビデオディスプレイを介して光ファイバライトパイプを介して、または全体の目には目の中に単一の細胞に送達することができます。 </li></ol>パート5：網膜内記録この手順に必要な工具はドライバー、ネジのネジ穴とL字型のルーサイトのプラットフォーム、ガラスピペットを用いて微小電極ホルダー、ステンレス鋼製ねじ、ピンセット、そして素晴らしいメスが含まれています。 <ol><li>プリセットネジ穴と手作りルーサイトのプレートは、細胞内応答を記録するために使用されます。穴は電動マイクロマニピュレーター（PPM5000、WPI社）を取り付けるために離間している。プレートは2つの側面のネジと上部に1つで動物に添付されます。 </li><li>プレートの付着した後、動物は、鰓を介し海水で満たされたタンク内の遮光ケージに入れています。 </li><li> micropositionerは眼を介して合わせながら、可動アームで、プレートにねじ込まれている。 </li><li>ガラスのマイクロピペットのバッチは、1 mmのODホウケイ酸ガラスから引き出されているとヒントは、3M KCl溶液の小さいバイアルにピペットを配置することにより、毛細管現象を介して充填されています。 </li><li>ピペットの残りは、塩溶液を使用して手動で充填し、電極ホルダに挿入されます。 </li><li>電極ホルダーはmicropositionerアームに固定された細胞内のアンプのヘッドステージ（IR - 283、シグナステクノロジー株式会社）に接続されています。 </li><li>網膜の小さなセクション（〜1平方ミリメートル）はカミソリの刃で角膜のインタフェースを離れて切断することによって公開されます。 </li><li>リンゲル溶液の液滴が乾燥し、マイクロピペットの先端が網膜組織への開口部を通って進められるのを防ぐために露出網膜上に配置されます。 </li><li>先端が溶液に入ると、細胞内のアンプの電流注入モードが係合され、電極インピーダンスを測定する。 20から70 MWの範囲外のインピーダンスを持つマイクロピペットは破棄されます。この範囲内のものは、ミクロンステップで進んでおり、電子的または機械的にピペットの先端を振動させて細胞内にimpaledされています。 </li><li>細胞の3種類の眼に発生する可能性があります。 Retinular細胞が光にのみ脱分極応答を示し、偏心細胞は脱分極応答に乗って活動電位の列車を示し、色素細胞は、まったく光の応答を示していない。 </li><li>データは、LabVIEWで記述されたカスタムプログラムで収集されます。プログラムは、デジタルビデオプロセッサ（ビット+ +、ケンブリッジリサーチシステム）を経由して光刺激を制御します。刺激は、光ファイバーパイプまたはビデオディスプレイとimpaled細胞に送達されています。電圧の応答は、オシロスコープで観察し、コンピュータにプログラムによってデジタル化されています。 </li></ol>パート6：代表的な結果代表的なERGは、図2Aに示されています。波形は、合計の電気を表します主に受光retinular細胞の光に反応し、彼らは非常にエキセントリックな細胞数を上回ると電気的にそれらに結合される。哺乳類のERGと同じように別の網膜細胞型から複数の波形成分が不足しています。カブトガニの脳内の時計から概日フィードバックは、時間（1）の経過とともに変化するERGの振幅と時間の経過を引き起こし、日常的に網膜細胞の生理学的特性を調節する。図2Bに示すように、ERGの振幅は主観的な日中は動物の主観的な夜と最低の時に最高です。 光への単一の視神経線維の応答の代表的なトレースを図3に示されています。エキセントリックな細胞は、すべての持続的なレベルに減衰が続くスパイクの吐出量の一過性増加を示し、ほぼ同じように動作します。速度の減衰は、偏心細胞（2）で明順応とスパイクに依存する自己阻害の複合作用を反映している。このような速度での光依存性の減少など、他のスパイクパターンは、カブトガニの脳ではなく目（3）で見られている。 光への色素細胞、retinular細胞、および偏心セルの電圧応答の代表的なトレースを図4に示されています。だけ後者の二つの網膜細胞の種類は視覚的です。彼らの応答の振幅と時間の経過は、記録の質と細胞内の電極の位置によって異なります。通常、電極は、サイズが大きいためと数字の色素細胞やretinular細胞を貫通している。後者の、持続的なレベルに減衰する一過性脱分極が記録されている場合。崩壊はretinular細胞による光適応（2）によるものです。電極が偏心のセルを入力した場合、大規模な活動電位は軸索（40 - 70mVの）と相馬の近くに脱分極波形（&lt;25mVの）に乗って小さな活動電位に記録されます。 <img src="/files/ftp_upload/1384/1384fig1.jpg" alt="図1" /> 図1。網膜電図記録（A）と視神経の記録（B）に使用するチャンバーの模式図。バーは、Bのは、5mmで7ミリメートルのequals <img src="/files/ftp_upload/1384/1384fig2.jpg" alt="図2" /> 100msの間で誘発リムルスERGの図2。トレース例では、暗闇の中で、5Vのパルス（）と一定の暗さ（B）の経時的なERG振幅のピークツーピーク変動のLED。闇は白い三角形で指定された時間に開始された。黒の三角形で示された時間を通じて、ERG振幅の成長は、暗闇の中で目の感度を増加させる光順応、によるものです。 ERG振幅の周期的な変動は、その後、動物の内部体内時計によるものです。 Bの時点では、毎5分です。 <img src="/files/ftp_upload/1384/1384fig3.jpg" alt="図3" /> シングルommatidial受容体にフラッシュ光に視神経線維の応答の図3。トレース例。トレース上の波形は、刺激のタイミングを示します。その軸索は神経線維を生じさせる偏心細胞は、すべての実験（完全な暗闇で5秒フラッシュ）の照明条件の下でこのように焼成の類似したパターンを示しています。スパイクと網膜のコーディングは、プロパティのカブトガニは、他の脊椎動物とは異なり、哺乳類と共通しているです。 <img src="/files/ftp_upload/1384/1384fig4.jpg" alt="図4" /> 色素細胞（）、retinular細胞（B）、及び偏心セル（C）：カブトガニ側眼に存在する3種類の細胞の光に対する電圧応答の図4の例のトレース。最初のセルは非ビジュアルです。後者の二つは、光のフラッシュ時に脱分極。彼らは光を伝達し、エキセントリックな細胞にギャップ結合を介して信号を送信するため脱分極は、道に沿っていくつかの損失で、retinularセルについて最大です。偏心細胞では、軸索によってトリガーされるアクションの電位は細胞体に起因するスパイクのバックプロパゲーションへの脱分極に乗って見られている。活動電位の振幅は、脱分極性の良い表示のための図で減衰されています。細胞の静止電位が- 50mVです。

<ol>
	<li>Barlow, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+rhythms+in+the+Limulus+visual+system.">Circadian rhythms in the Limulus visual system.</a> J. Neurosci. 3, 856-870 (1983).</li><li>Passaglia, C. L., Dodge, F. A., Barlow, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+based+model+of+the+Limulus+lateral+eye.">Cell based model of the Limulus lateral eye.</a> J. Neurophysiol. 80, 1800-1815 (1998).</li><li>Snodderly, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+visual+inputs+by+the+brain+of+Limulus.">Processing of visual inputs by the brain of Limulus.</a> J. Neurophysiol. 34, 588-611 (1971).</li><li>Passaglia, C., Dodge, F., Herzog, E., Jackson, S., Barlow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+a+neural+code+for+vision.">Deciphering a neural code for vision.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 94, 12649-12654 (1997).</li><li>Barlow, R. B., Kaplan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limulus+lateral+eye:+properties+of+receptor+units+in+the+unexcised+eye.">Limulus lateral eye: properties of receptor units in the unexcised eye.</a> Science. 174, 1027-1029 (1971).</li><li>Bolbecker, A. R., Lewis, A. R., Swan, A. A., Carlson, K., Fleet, J. R., Beck, K. E., Wasserman, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+Bellows+Cup+Electrode+Demonstrates+Low-frequency+Properties+of+Long-term+Electroretinographic+Recordings+in+the+Limulus+Lateral+Eye.">Stable Bellows Cup Electrode Demonstrates Low-frequency Properties of Long-term Electroretinographic Recordings in the Limulus Lateral Eye.</a> J. Neurosci. Meth. 159, 252-260 (2007).</li></ol>

我々は、生体内でのカブトガニのERG記録、視神経の録音、および網膜内の録音を実行する方法を説明しました。記録技術は、それぞれのビジョンの神経基盤にさまざまな洞察を提供し、それらはすべてカニの大きな目、ハード甲羅に生きている動物のおかげで網膜機能を研究するために使用することができます。視神経の活動であっても自由に電極を適切に構築する（4）と海で動物を振る舞...

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>LED</td>
<td>Light source</td>
<td>Newark Inc</td>
<td>33C1292</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Suction electrode</td>
<td>Electrode</td>
<td>A-M Systems, Inc</td>
<td>573000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>XCell 3*4-Channel Extracellular Amplifier</td>
<td>Amplifier</td>
<td>FHC Inc.</td>
<td>40-40-8B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Intracellular Recording</td>
<td>Amplifier</td>
<td>Cygnus</td>
<td>IR-283A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>APM</td>
<td>Neural Spike Discriminator</td>
<td>FHC Inc.</td>
<td>APM</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bits++</td>
<td>Video Board</td>
<td>Cambridge Research Systems Inc</td>
<td>Bits++</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Piezopatch Manipulator</td>
<td>Micropositioner</td>
<td>WPI Inc</td>
<td>PPM5000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Square Pulse Stimulator</td>
<td>Nerve Stimulator</td>
<td>Grass Instrument Division, Astro-Med, Inc.</td>
<td>Model S48</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>P-97</td>
<td>Micropipette Puller</td>
<td>Sutter Instruments</td>
<td>Model P-97</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Borosilicate Glass Capillary</td>
<td>Electrode glass</td>
<td>WPI Inc</td>
<td>1B150-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Horseshoe crab (Limulus polyphemus)</td>
<td>Animal</td>
<td>Marine Biological Laboratories</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micropipette Puller</td>
<td>Glass Puller</td>
<td>Sutter Instruments</td>
<td>P-97</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Zoom Stereoscope</td>
<td>Microscope</td>
<td>Jed Pella Inc.</td>
<td>SMZ-168</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

using the horseshoe crab, limulus polyphemus, in vision research

アメリカカブトガニ、 カブトガニポリフェムスは地球上で最古の生き物の一つであり、動物は生物医学研究に不可欠な役割を果たしている。だけでなく、彼らの血は、科学者が当社の医薬品でbacteriotoxinsを検出するために使用する特殊な細胞が含まれていますが、彼らの目はまた、明順応や側方抑制のような私たちの視覚システムで動作している生理的過程、について多くの洞察を提供している神経回路網が含まれていません。カブトガニは、動物が大型と無脊椎動物のための丈夫なので、その網膜の神経細胞が大きく、簡単にアクセス可能なビジョンの研究のための魅力的なモデルのまま、その視覚的なシステムは、コンパクトで広く研究されている、とその視覚的な動作は明確に定義されています。また、眼の構造と機能は、動物の脳の体内時計によって日常的に変調されています。一言で言えば、カブトガニの視覚システムは、興味深いものにするために十分な複雑なまだ理解できるほど簡単です。 このビデオでは、カブトガニとin vivoで行うことができるビジョンの神経基盤を調べるための3つの電気生理学的パラダイムを提示する。彼らは、網膜電図記録、視神経の記録、および網膜内記録です。表面と網膜電図（ERG）の記録測定は、光の点滅に眼内のすべてのセルの合計電気的応答を電極。彼らは時間の期間を延ばすために目の全体的な感度を監視するために使用することができます。視神経の録音は、細胞外microsuction電極を有する単一の神経線維のスパイク活動を測定する。彼らは、眼から脳だけでなく、脳から目にフィードバック概クロックメッセージを伝える視覚的メッセージを研究するために使用することができます。網膜内の録音は、細胞内微小電極と眼の個々の細胞で光によって誘起される電圧変動を測定する。それらは網膜処理の細胞メカニズムを解明するために使用することができます。

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Using the Horseshoe Crab, Limulus Polyphemus, in Vision Research

このビデオでは、アメリカカブトガニと網膜電図記録、視神経の記録、および網膜内記録を行う<em&gt;カブトガニポリフェムス</em&gt;。これらの電気生理学的パラダイムは、研究や教育研究所で視覚の神経基盤を調べるために使用することができます。

カブトガニを使用して、カブトガニポリフェムス</emビジョンの研究において>、

The American horseshoe crab, Limulus Polyphemus is one of the oldest creatures on earth, and the animal continues to play an indispensable role in ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Using the Horseshoe Crab, Limulus Polyphemus, in Vision Research

14.2K ビュー.  Boston University. このビデオでは、アメリカカブトガニと網膜電図記録、視神経の記録、および網膜内記録を行うカブトガニポリフェムス。これらの電気生理学的パラダイムは、研究や教育研究所で視覚の神経基盤を調べるために使用することができます。

ビデオ: Using the Horseshoe Crab, Limulus Polyphemus, in Vision Research

Blood Collection from the American Horseshoe Crab, Limulus Polyphemus

The horseshoe crab has the best-characterized immune system of any long-lived invertebrate. The study of immunity in horseshoe crabs has been facilitated by the ease in collecting large volumes of blood and from the simplicity of the blood. Horseshoe crabs show only a single cell type in the general circulation, the granular amebocyte. The plasma has the salt content of sea water and only three abundant proteins, hemocyanin, the respiratory protein, the C-reactive proteins, which function in the cytolytic destruction of foreign cells, including bacterial cells, and &alpha;2-macroglobulin, which inhibits the proteases of invading pathogens. Blood is collected by direct cardiac puncture under conditions that minimize contamination by lipopolysaccharide (a.k.a., endotoxin, LPS), a product of the Gram-negative bacteria. A large animal can yield 200 - 400 mL of blood. For the study of the plasma, blood cells are immediately removed from the plasma by centrifugation and the plasma can then be fractionated into its constituent proteins. The blood cells are conveniently studied microscopically by collecting small volumes of blood into LPS-free isotonic saline (0.5 M NaCl) under conditions that permit direct microscopic examination by placing one of more LPS-free coverglasses on the culture dish surface, then mounting those coverglasses in simple observation chambers following cell attachment. A second preparation for direct observation is to collect 3 - 5 mL of blood in a LPS-free embryo dish and then explanting fragments of aggregated amebocytes to a chamber that sandwiches the tissue between a slide and a coverglass. In this preparation, the motile amebocytes migrate onto the coverglass surface, where they can readily be observed. The blood clotting system involves aggregation of amebocytes and the formation of an extracellular clot of a protein, coagulin, which is released from the secretory granules of the blood cells. Biochemical analysis of washed blood cells requires that aggregation and degranulation does not occur, which can be accomplished by collecting blood into 0.1 volumes of 2% Tween-20, 0.5 M LPS-free NaCl, followed by centrifugation of the cells and washing with 0.5 M NaCl.

The American horseshoe crab, Limulus polyphemus, is arguably the most convenient source for large quantities of blood of any invertebrate. The blood is simple in composition, with only one cell-type in the general circulation, the granular amebocyte, and only three abundant proteins in the plasma, hemocyanin, the C-reactive proteins, and &alpha;2-macroglobulin. Blood is collected from the heart and the blood cells and plasma are separated by centrifugation.

アメリカカブトガニ、カブトガニポリフェムスから採血

The horseshoe crab has the best-characterized immune system of any long-lived invertebrate.  The study of immunity in horseshoe crabs has been facilitated ...

生物学

Brain Banking: Making the Most of your Research Specimens

Unbiased stereology is a method for accurately and efficiently estimating the total neuron number (or other cell type) in a given area of interest1. To achieve this goal 6-10 systematic sections should be probed covering the entire structure. Typically this involves processing 1/5 sections which leaves a significant amount of material unprocessed. In order to maximize the material, we propose an inexpensive method for preserving fixed tissue as part of a long-term storage research plan. As tissue is sliced and processed for the desired stain or antibody, alternate sections should be systematically placed in antigen preserve at -20&deg;C for future processing. Using 24-well plates, sections can be placed in order for future retrieval. Using this method, tissue can be stored and processed for immunohistochemistry over the course of years.

Brain banking and systematic sampling of biological material provides the basis for unbiased stereology and maximizes the potential data obtained from each specimen.

脳バンキング：あなたの研究の標本のほとんどを作る

Unbiased stereology is a method for accurately and efficiently estimating the total neuron number (or other cell type) in a given area of interest1.  To ...

Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term storage of biological materials such as blood, cells and tissues 1,2. The cryogenic nature of liquid nitrogen, while ideal for sample preservation, can cause rapid freezing of live tissues on contact - known as 'cryogenic burn'2, which may lead to severe frostbite in persons closely involved in storage and retrieval of samples from Dewars. Additionally, as liquid nitrogen evaporates it reduces the oxygen concentration in the air and might cause asphyxia, especially in confined spaces2.
In laboratories, biological samples are often stored in cryovials or cryoboxes stacked in stainless steel racks within the Dewar tanks1. These storage racks are provided with a long shaft to prevent boxes from slipping out from the racks and into the bottom of Dewars during routine handling. All too often, however, boxes or vials with precious samples slip out and sink to the bottom of liquid nitrogen filled tank. In such cases, samples could be tediously retrieved after transferring the liquid nitrogen into a spare container or discarding it. The boxes and vials can then be relatively safely recovered from emptied Dewar. However, the cryogenic nature of liquid nitrogen and its expansion rate makes sunken sample retrieval hazardous. It is commonly recommended by Safety Offices that sample retrieval be never carried out by a single person. Another alternative is to use commercially available cool grabbers or tongs to pull out the vials3. However, limited visibility within the dark liquid filled Dewars poses a major limitation in their use.
In this article, we describe the construction of a Cryotolerant DIY retrieval device, which makes sample retrieval from Dewar containing cryogenic fluids both safe and easy.

Here we present a low cost, durable cryotolerant device for sample retrieval from Dewar tanks filled with liquid nitrogen. The ease of construction and modular design of the device makes the process of sample retrieval from cryogenic tanks safe and easy.

凍結保存サンプルの回復のための日曜大工のデバイスが誤って低温貯蔵タンクに落とし

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

アポトーシス細胞のクリアランスのイメージング中に生きる<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;胚

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues. While this technique has been implemented for over 100 years, the versatility, simplicity and reproducibility of this assay helps it to remain an indispensable tool for pharmacologists and physiologists alike. Tissue bath systems are available in a wide array of shapes and sizes, allowing a scientist to evaluate samples as small as murine mesenteric arteries and as large as porcine ileum &#8211; if not larger. Central to the isolated tissue bath assay is the ability to measure concentration-dependent changes to isometric contraction, and how the efficacy and potency of contractile agonists can be manipulated by increasing concentrations of antagonists or inhibitors. Even though the general principles remain relatively similar, recent technological advances allow even more versatility to the tissue bath assay by incorporating computer-based data recording and analysis software. This video will demonstrate the function of the isolated tissue bath to measure the isometric contraction of an isolated smooth muscle (in this case rat thoracic aorta rings), and share the types of knowledge that can be created with this technique. Included are detailed descriptions of aortic tissue dissection and preparation, placement of aortic rings in the tissue bath and proper tissue equilibration prior to experimentation, tests of tissue viability, experimental design and implementation, and data quantitation. Aorta will be connected to isometric force transducers, the data from which will be captured using a commercially available analog-to-digital converter and bridge amplifier specifically designed for use in these experiments. The accompanying software to this system will be used to visualize the experiment and analyze captured data.

This protocol describes the measurement of isometric contraction in an isolated smooth muscle preparation, using an isolated tissue bath system and computer-based data acquisition.

薬理研究に単離された組織のバース·アプリケーションにおける平滑筋機能の測定

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...

The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a prerequisite for studying the physiology of the isolated organ and for many innovative applications that may be possible in the future, including perfusion decellularization for kidney bioengineering or the administration of anti-rejection or genome-editing drugs in high doses to prime the kidney for transplantation. During the time of the perfusion, the kidney can be manipulated, renal function can be assessed, and various pharmaceuticals administered. After the procedure, the kidney can be transplanted or processed for molecular biology, biochemical analysis, or microscopy.
This paper describes the perfusate and the surgical technique needed for the ex vivo perfusion of mouse kidneys. Details of the perfusion apparatus are given and data are presented showing the viability of the kidney&#39;s preparation: renal blood flow, vascular resistance, and urine data as functional, transmission electron micrographs of different nephron segments as morphological readouts, and western blots of transport proteins of different nephron segments as molecular readout.

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. The buffers and surgical technique are described in detail.

マウス単離された灌流腎臓テクニック

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a ...

A Protocol for Using Gene Set Enrichment Analysis to Identify the Appropriate Animal Model for Translational Research

Recent studies that compared transcriptomic datasets of human diseases with datasets from mouse models using traditional gene-to-gene comparison techniques resulted in contradictory conclusions regarding the relevance of animal models for translational research. A major reason for the discrepancies between different gene expression analyses is the arbitrary filtering of differentially expressed genes. Furthermore, the comparison of single genes between different species and platforms often is limited by technical variance, leading to misinterpretation of the con/discordance between data from human and animal models. Thus, standardized approaches for systematic data analysis are needed. To overcome subjective gene filtering and ineffective gene-to-gene comparisons, we recently demonstrated that gene set enrichment analysis (GSEA) has the potential to avoid these problems. Therefore, we developed a standardized protocol for the use of GSEA to distinguish between appropriate and inappropriate animal models for translational research. This protocol is not suitable to predict how to design new model systems a-priori, as it requires existing experimental omics data. However, the protocol describes how to interpret existing data in a standardized manner in order to select the most suitable animal model, thus avoiding unnecessary animal experiments and misleading translational studies.

We provide a standardized protocol for the use of gene set enrichment analysis of transcriptomic data to identify an ideal mouse model for translational research. 
This protocol can be used with DNA microarray and RNA sequencing data and can further be extended to other omics data if data are available.

遺伝子を使用するプロトコル設定トランスレーショナルリサーチの適切な動物モデルを識別するために濃縮分析

Recent studies that compared transcriptomic datasets of human diseases with datasets from mouse models using traditional gene-to-gene comparison ...

Study of Protein-protein Interactions in Autophagy Research

Protein-protein interactions are important for understanding cellular signaling cascades and identifying novel pathway components and protein dynamics. The majority of cellular activities require physical interactions between proteins. To analyze and map these interactions, various experimental techniques as well as bioinformatics tools were developed. Autophagy is a cellular recycling mechanism that allows the cells to cope with different stressors, including nutrient deprivation, chemicals, and hypoxia. In order to better understand autophagy-related signaling events and to discover novel factors that regulate protein complexes in autophagy, we performed protein-protein interaction screens. Validation of these screening results requires the use of immunofluorescence and immunoprecipitation techniques. In this system, specific autophagy-related protein-protein interactions that we discovered were tested in Neuro2A (N2A) and HEK293T cell lines. Details of the technical procedures used are explained in this visualized experiment paper.

Presented here are two antibody-based protein-protein interaction research techniques: immunofluorescence and immunoprecipitation. These techniques are suitable for studying physical interactions between proteins for the discovery of novel components of cellular signaling pathways and for understanding protein dynamics.

オートファジー研究でタンパク質間相互作用の研究

Protein-protein interactions are important for understanding cellular signaling cascades and identifying novel pathway components and protein dynamics. ...

Sample Preparation for Metabolic Profiling using MALDI Mass Spectrometry Imaging

Metabolomics, the study to identify and quantify small molecules and metabolites present in an experimental sample, has emerged as an important tool to investigate the biological activities during development and diseases. Metabolomics approaches&#160;are widely employed in the study of cancer, nutrition/diet, diabetes, and other physiological and pathological conditions involving metabolic processes. An advantageous tool that aids in metabolomic profiling advocated in this paper is matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry imaging (MALDI MSI). Its ability to detect metabolites in situ without labeling, structural modifications, or other specialized reagents, such as those used in immunostaining, makes MALDI MSI a unique tool in advancing methodologies relevant in the field of metabolomics. An appropriate sample preparation process is critical to yield optimal results and will be the focus of this paper.

The goal of this protocol is to provide detailed guidance on the sample preparation when planning for experiments using MALDI MSI to maximize metabolic and molecular detection in biological samples.

MALDI質量分析イメージングを用いた代謝プロファイリングのサンプル調製

Metabolomics, the study to identify and quantify small molecules and metabolites present in an experimental sample, has emerged as an important tool to ...

カブトガニを使用して、カブトガニポリフェムス、