Name: purification of viral dna for the identification of associated viral and cellular proteins
Uploaded: 2017-08-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
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我々 は、この原稿の準備で助けをハンナ フォックスを認めます。この作品は、NIH によって支えられた R01AI030612 を付与します。

1。 細胞培養、ウイルス感染および EdC ラベリング ( 図 1) 次のプロトコル ウイルスの作業が含まれます。あなたの機関を参照してください &#39; ウイルスやその他の生物学的製剤の安全な取り扱いに関する s バイオ安全プロトコル。このプロトコルは、ピッツバーグ大学の制度上の審査委員会によって承認されました。
<ol><li>Trypsinize MRC 5 セルの合流 150 cm 2 培養フラスコ、100 mL DMEM プラス 10% を含む 600 cm 2 組織培養プレートにセルを転送 FBS。合流と静止した段階に到達する 3-4 日間 5% CO 2 の存在下で 37 ° C で孵化させなさい。合流 600 cm 2 皿には、7 ~ 10 の 7 セル x が含まれています。条件ごとに 1 プレートと各対応する否定的な制御のための 1 のプレートを準備します 。
	注: 電池がその唯一の vDNA ラベル付けされて後続のステップで精製できるように細胞の DNA 複製を阻害する静止した段階に達する必要があります 。
	注: 各サンプルが必要です無料同じ感染条件と EdC 添加せず時間ポイントを使用したネガティブ コントロールをラベルします 。
	注: スケール ダウン バージョンのこの実験は行われるべきに匹敵する増殖、感染症の分類の条件、EdC を用いたイメージングによる細胞 DNA の分類のためのテスト時間ポイント (手順 2 を参照).</li>
	<li>希釈 7 × 10 8 7 mL PFU HSV 1 冷 Tris-Buffered 生理食塩水 (TBS)。成長培地を取り除き、37 ° C で保存感染 MRC 5 セルに 7 mL 希釈ウイルスを追加し、室温で 1 時間ロックします。吸着、次接種を取り外し、50 mL 室温 TBS、すすぎおよび元の成長培地を交換します。5% CO 2 の存在下で 37 ° C で孵化させなさい。この手順を各実験条件と負のコントロールの実施必要があります 。
	注: 増加 EdC のラベリングを実現できますウイルス dUTPase (UL50 遺伝子) および/またはウラシル グリコシラーゼ (UL2 遺伝子) 発現の HSV-1 欠損変異株を用いたします。HSV-1 dUTPase、低い基質特異性がありいくつかヌクレオシド類似体 25 , 27 の活性化を減らすことができます</li>。
	EdC と <li>ラベルのウイルスのゲノム。着信ゲノム (1.3.1) ゲノム (1.3.2)、またはウイルスの複製フォーク (1.3.3) 複製のラベルに指示に従ってください 。
	注: 唯一のステップ 1.3.1、1.3.2、または 1.3.3 実施されなければならない受信ゲノム、レプリケートされたゲノムまたは複製フォークがそれぞれ以降の手順で分析するかどうかに応じてします 。
	注: エドゥや f ara エドゥは、EdC の代わりできます。ヌクレオシド類縁体の毒性を監視され、最小化する必要があります。
	<ol><li>使用 prelabeled ステップ 1.2 で感染を行い、ステップ 2 に進んでくださいする株式または 4 h 以内 3 投稿レプリケートされていない vDNA ( 図 1 a) を調査する感染 (hpi). 
		注: は、prelabeled ウイルス 25 上記プロトコルを使用して株式を準備します。ウイルス株は、任意の残留 EdC を削除する G-25 列を介して渡す必要があります</li>。
		<li>ラベル 5 〜 25 μ M を追加しての複製 vDNA 2 4 時間 ( 図 1 b) 感染細胞の細胞培養液に EdC。追加すると、前に成長培地 1 mL で EdC を希薄化します</li>。
		VDNA レプリケーションの発症後ウイルスの複製フォークのラベルに <li>(&#8805; 4 hpi)、パルス ラベル 5-25 μ m vDNA を複製する EdC 5 ~ 20 分。追いかける、追いかける培 25 100 μ M 2´deoxycytidine で 3 x をすすいでください (deoxyC)、さらに 20-40 分 ( 図 1) チェイス媒体の存在下でインキュベーションしてと。 。
		注: パルスとチェイスの媒体は使用前に CO 2 を 37 ° C、5% に平衡する必要があります 。
		注: パルス追跡する実験、それはセルを入力し、彼らは複製 DNA に組み込まれることができる前にリン酸化されるヌクレオシドにかかる時間の量を考慮することが重要。これは経験的に定められる必要があります 。
		注: パルス追跡する実験の解像度を調べるには、使用される実験条件下でウイルスの複製率を計算します。これは一歩成長時間コース 26 中にウイルスのゲノムの量的な PCR によって決定できる 。
		注: ウイルスのゲノムのイメージングのためステップ 2 に進み、ウイルス ゲノムの浄化のためには、ステップ 3 に進みます</li>。
	</ol></li></ol> 2。EdC のイメージング標識 DNA ( 図 2 a) 注: 細胞 DNA が実験でラベルはありませんを確認するウイルスのゲノムの精製法とタンデムでイメージングを実行すると便利です。画像は、ラベル付き vDNA の性質を視覚化し、プロテオミクス データを検証にも使えます。細胞やウイルスの DNA が染色パターンの例として、 図 3 に示す.
<ol><li>感染を行い成長培地 1 mL を含む 12 ウェル培養皿に coverslips に条件 EdC ラベル以外を使用して手順 1 で示されているように縮小します</li>。
	室温 15 分 1 × PBS の <li>修正セル 1 mL 3.7% パラホルムアルデヒド固定後、リンス細胞 2 倍の PBS で 1 mL 3 %bsa で 。
	注意: パラホルムアルデヒドは深刻なまたは永続的な損傷を引き起こすことができます。安全上の注意に従ってください 。
	注: プロトコルをここで一時停止できるし、coverslips 第 2 洗浄の 4 ° C で保存できる 3 日間</li>。
	<li>1 mL 透過バッファーとセルを permeabilize [材料表 を見る] ロッキングしながら室温で 20 分間です</li>。
	<li>揺動中 3 %bsa をし、室温で 30 分間 PBS で 1 mL 3 %bsa を用いたブロック 1 mL でリンスします</li>。
	<li>クリック反応カクテルの 1 つの mL を追加 [材料表 を見る] 共有 Alexa Fluor 488 を共役に coverslips に edc のアジ化が分類される DNA。揺動中 30 分間室温でインキュベートします。吸引、1 mL の PBS で 2 回すすいでください</li>。
	<li>1 ml の揺動中室温で 30 分間 PBS のヘキストの 1:2,000 の希釈の細胞 DNA を染色します。吸引、1 mL の PBS で 2 回すすいでください</li>。
	<li>染色標準に従って第一次および二次抗体と間接蛍光抗体法 25 のプロトコルします 。
	注: ラベル付き vDNA colocalizes ICP8、ICP4、または UL42 と細胞標識 DNA colocalizes ヘキスト染色</li>。
	<li>スライド coverslips をマウントし、イメージの蛍光顕微鏡を用いた細胞 。
	注: スライド格納できる 4 ° C で数週間</li>。
</ol> 3。VDNA と関連タンパク質の精製 注: このプロトコルのいくつかの側面は、レオン ら から適応されています。 22 注: すべてのバッファーおよび試薬を使用する前に氷の上冷蔵する必要があり、すべてのステップべきである氷の上特に明記しない限り。
<ol><li>核を収穫します 。
	注: 前の核の隔離、に、ホルムアルデヒドは DNA に架橋蛋白質に使用できます。厳しい洗浄条件は、ストレプトアビジンをコートしたビーズで DNA 精製時に使用できます。Crosslinking、洗浄条件を参照してください Sirbu et al. 21. <ol><li>20 ml の核抽出バッファー (NEB) 成長培地を交換し、時折ロッキング 4 ° C で 20 分間インキュベートします。核が顕微鏡で見えるようになります</li>。
		<li>細胞スクレーパーを使用してプレートから核をこすりし、50 mL の円錐管に転送します。核をペレット、上澄みを廃棄に 4 ° C で 2,500 x g で 10 分間遠心します 。
		注: トリパン ブルー染色は細胞から核の分離を確認する使用できます</li>。
		<li>そっと 10 mL の PBS、15 mL の円錐管に転送に核ペレットを取り除くし、4 ° c. 完全に削除 PBS で 2,500 x g で 10 分間遠心分離によってペレットします 。
		注: 核を凍結することができます、プロトコルをこの時点で一時停止することができます。これを行うには、穏やかで再懸濁します核ペレット 500 μ L 凍結バッファーし、エタノール/ドライ氷浴でチューブを孵化させなさい。-80 ° C で凍結核を格納します。使用前に室温で核を解凍、氷、10 mL の PBS、ミックス、4 ° C で 2,500 x g で 10 分間の遠心分離でペレットに優しくロックを追加にすばやく転送、PBS を完全に削除します。低収量があります核凍結します</li>。
	</ol></li> <li>EdC に共役したビオチン アジ ラベル vDNA。
	<ol><li>10 mL クリック反応における核ペレット ミックス [材料表 を見る] 上下に軽くピペッティングして 5 回 10 mL のピペットを使い、再懸濁します 。
		注: クリック反応混合物に含まれる試薬が指定された順序で追加されていることが重要です</li>。
		4 ° C で 1 時間の <li>を回転させる回転しながら準備し、バッファーの B1、B2、および B3 [材料表 を見る] を寒さ</li>。
		<li>ペレット 4 ° c. 完全に削除で 2,500 x g で 10 分間遠心分離核反作用の組合せをクリックし、優しく 4 で 2,500 x g で 10 分間遠心分離 10 mL の PBS に再してペレットを洗浄 ° C</li>
		<li>には、1 mL の PBS に核ペレットと大口径のピペット チップを使用して 1.5 mL および microfuge の管への転送軽く再懸濁します。2,500 x 4 ° c. 完全に削除 PBS で g と液体窒素で凍結で 10 分間遠心分離によって核をペレットします 。
		注:、プロトコルがこの時点で一時停止にできる、核は、同じ日にステップ 3.3 に赴く際にも冷凍フラッシュする勧めしますので、後続の換散を-80 ° C 凍結融解で凍結核を格納できます</li>。
	</ol></li> <li>核を溶解し、DNA のフラグメントします。
	<ol><li>は、氷の上の核を解凍し、500 μ L ではバッファー B1 上下ピペッティングによって再懸濁します。45 分の氷の上を孵化</li>
		<li>Sonicate サンプル 6 回の 30 s 各 3 mm マイクロ探針プローブを用いた 40% 振幅で。30 の氷のサンプルを場所パルス間 s。明確な曇りない超音波処理、サンプルが表示されます 。
		注: 超音波照射条件は、個々 の sonicators を最適化する必要があります。超音波照射条件を最適化する方法の詳細についてレオン ら を参照してください。 22.</li> <li>4 ° C で 10 分間 14,000 × g で遠心分離によって細胞の残骸をペレットペレットのサイズが大幅に減少します。100 μ M の細胞のストレーナーで上清をフィルターし、流れを保持します</li>。
		<li>追加 500 μ L 3.4.2 の手順でこのサンプルのフィルター処理された上澄み 900 μ l にバッファー B2 を使用されます。</li>。
		<li>DNA の隔離 (50 μ L または 1/20 ボリューム) の各条件の因数を取るし、x SDS 重曹液 50 μ l 添加 2 [材料の表 を参照してください]。DNA の隔離のプロトコル (手順 3.6) に進みます</li>。
		<li>入力蛋白質 (50 μ L または 1/20 ボリューム) の各条件の因数を取ると 50 μ L 2 x 塩化物イオン サンプルバッファーを追加、液体窒素で凍結、-80 デパート ° C. 3.5.6 の手順で使用します</li>。
	</ol></li> <li>バインド ビオチン化 DNA にストレプトアビジン コーティング ビーズ。
	<ol><li>ビーズ スラリーの 300 μ L を 1.5 mL および microfuge の管に転送することによって磁気ビーズをストレプトアビジン T1 の準備します。サンプルあたりのビーズの 1 つの管を準備します。洗うビーズ 1 ml バッファー B2 に再懸濁しますボルテックス、ビーズを分離する磁石を適用し、吸引洗浄バッファーで 3 x. 
		注: は、最大収量と最小限の背景結合条件結果のバインドを最適化されています。ストレプトアビジン T1 磁気ビーズが大きく結合能と他のストレプトアビジン ビーズと同様、アガロース ビーズより背景結合ストレプトアビジン C1 ビーズよりも小さいであることが決定された実験的 ( 図 4 a).</li>
		<li>ステップ 3.3.4 からサンプルの追加 900 μ L. ビーズを洗浄し、回転の 4 泊 ° C 
		注: それらに追加するサンプルにない渦ビーズをしないでください 。
		注: 大量の DNA やタンパク質を分離するラベルのない否定的な制御で、このステップ減らすことができます一晩から背景の結合を減らすために 4 h にします</li>。
	</ol></li> <li>ビーズを洗浄し、vDNA と関連するタンパク質を溶出します 。
	注: 残りの手順にフィルターのヒントを使用することをお勧めします。
	<ol><li>磁気および microfuge の管ラック、削除上清に場所サンプルは優しく 1 mL バッファー B2、4 ° C で回転 5 分で再懸濁します</li>
		<li>手順を繰り返します 3.5.1 3 回</li>。
		<li>磁気および microfuge の管ラックにサンプルを置き、上清を除去、優しく 1 mL バッファー B3 で再懸濁します、4 ° C、5 分で回転</li>
		<li>転送 100 μ L ビーズ混合 (1/10 th 容積) バインドされた DNA の隔離のための新しい管へ。マグネットにこのチューブを適用、上清を除去、100 μ L 1 x SDS 重曹液でビーズを再懸濁します、DNA の隔離のプロトコル (手順 3.6) に進みます</li>。
		<li>ステップ 3.5.3 から残り 900 μ L ビーズの混合物を含んでいる管を適用、磁石に培養上清を削除し、50 μ l 2 x 蛋白質および DNA 蛋白質の複合体を溶出する塩化物イオン サンプル バッファーでビーズを再懸濁します。</li>。
		<li>15 95 ° C で沸騰サンプル分、渦、すぐに、および microfuge のスピンし、磁石を適用します。溶出液を新しいチューブ、フラッシュ凍結し-80 で店に転送 ° C 
		注意: 沸騰中オープンされているチューブがポップしないように使用キャップ ロックします 。
		注: プロトコルをこの時点で一時停止できるし、サンプルは数週間-80 ° C で保存できます</li>。
		<li>ブルー染色、西部のしみが付くこと、または標準的な手順 25 質量分析による蛋白質のサンプルを分析します。代表的な結果を 図 4 および 図 5 に示します 。
		注意: 蛋白質収量が質量分析法のために十分であるかどうか、各サンプルの 7.5 μ L が使用する分析用ブルー染色および代表的なウイルスのゲノムのウェスタンブロッティング用 7.5 μ L 関連蛋白質 (ICP4、ICP8、または UL42)。3.3.6 のステップからの lysates の同じボリューム。入力蛋白質のレベルのコントロールと一緒にを実行されます。質量 (35 μ L) の残りのサンプルが分析され、 25 を前述のように分析します</li>。
	</ol></li> <li>DNA の隔離 <ol><li>3.3.5 の手順からサンプルをインキュベートしますと 3.5.4。 必要に応じて磁気ビーズからサンプル 4-16 h. 削除 65 ° C で。</li>。
		<li>150 μ L フェノール: クロロホルム: イソアミル アルコール (PCI) のサンプルを抽出し、新しい管に水相を転送します</li>。
		<li>100 μ L で残りの PCI を抽出トリス EDTA (TE) し、新しい管に水相を追加</li>。
		<li>200 μ L クロロホルム: イソアミル アルコール (24:1) とサンプルを抽出します</li>。
		<li>浄化水性相は、メーカーによると PCR 精製キットを使用して &#39; s プロトコル 。
		注: バッファー PB で pH 指示薬はサンプルに追加されたときに紫色になります。10 ・ # を追加します。181;L 3 M NaOAc pH 5.0 のサンプルの pH が低下する</li>。
		<li>を決定する DNA 濃度を蛍光光度計を使用しています 。
		注: このプロトコルは通常、100-400 ng ビード区切 DNA を生みます。手順 1.3 EdC の追加がされませんでしたネガティブ コントロールの溶出 DNA は検出されませんする必要があります</li>。
		<li>低 DNA 結合に DNA を格納できる 4 または - 20 ° C のチューブし、リアルタイム PCR または高スループット シーケンス解析に使用できます</li>。
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
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O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dUTPases+from+herpes+simplex+virus+type+1+and+mouse+mammary+tumour+virus+are+less+specific+than+the+Escherichia+coli+enzyme.">The dUTPases from herpes simplex virus type 1 and mouse mammary tumour virus are less specific than the Escherichia coli enzyme.</a> J Gen Virol. 77 (Pt 12), 3107-3111 (1996).</li><li>Chiou, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-+and+protein-scission+activities+of+ascorbate+in+the+presence+of+copper+ion+and+a+copper-peptide+complex.">DNA- and protein-scission activities of ascorbate in the presence of copper ion and a copper-peptide complex.</a> J Biochem. 94, 1259-1267 (1983).</li><li>Kennedy, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+consequences+of+copper+complexes+used+to+catalyze+bioorthogonal+click+reactions.">Cellular consequences of copper complexes used to catalyze bioorthogonal click reactions.</a> J Am Chem Soc. 133, 17993-18001 (2011).</li><li>Snel, B., Lehmann, G., Bork, P., Huynen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STRING:+a+web-server+to+retrieve+and+display+the+repeatedly+occurring+neighbourhood+of+a+gene.">STRING: a web-server to retrieve and display the repeatedly occurring neighbourhood of a gene.</a> Nucleic Acids Res. 28, 3442-3444 (2000).</li></ol>

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このプロトコルには、慎重に、従わない場合に大幅に削減蛋白質収量または細胞の DNA の混入を引き起こすことがある複数の手順が含まれています。定置型電池を使用すべての実験細胞の DNA はないラベル、精製したことを確認することが重要です。これは、HSV-1 はゲノム合成細胞の DNA ポリメラーゼを利用しないので蛋白質のサンプルの細胞の DNA ポリメラーゼの不在によって確認できます?...

ウイルスは、重要な機能を遂行し、したがって感染症ウイルス遺伝子発現、レプリケーション、修理、再結合、輸送などの重要な側面を促進する宿主因子に依存する限られた能力を持っています。これらの宿主因子の活動がエンコードされたウイルス蛋白質によって補強されること。さらに、ウイルスはウイルス感染に対する細胞応答の検出と干渉を避ける必要があります。したがって、ウイルス ホスト相互作用は、感染症の結果を左右します。最も重要のウイルスがウイルスのプロセスを容易にする細胞の機械に合わせて携帯電話の環境を変更する方法を理解されています。特別な関心の感染サイクルを通してウイルスのゲノムに関する法律のどの要因とプロセスで識別します。
単純ヘルペス ウイルス タイプ 1 (HSV-1) は、二本鎖 DNA ウイルスは人間の人口のかなりの割合が感染します。感染の最初の 1 時間内でウイルスのゲノムはウイルスの遺伝子発現の順序付けされたカスケードがウイルス DNA (vDNA) レプリケーション1との連携ですさまじい核を入力します。核のゲノムはエピジェネティック制御は予告、修復と組換えを受けるし、6 時間未満内最初の子孫ウイルス粒子を生産するように、カプシドに包まれます。感染症のコース全体を通じて関連付けられているウイルスのゲノム蛋白質の包括的な評価、ウイルス ゲノムに関する法律、どのウイルスおよび細胞の要因を理解するためのプロセスの分子の詳細を調べるに土台を築く感染症のさまざまな段階に関与しています。
ウイルス感染に関与する宿主因子の調査のための以前の方法は、関連する細胞蛋白質2,3,4、5の分析のためのウイルス蛋白質の親和性の浄化,6,7,8,9. これらの試金は抗ウイルスのホストの応答としてウイルス性クロマチンの修飾、遺伝子発現に関与する細胞因子の同定のため尽力されているし、DNA 修復します。ただし、vDNA との関連付けに依存する相互作用プロテオミクスのみ特定ウイルス因子の関数として発生する相互作用への洞察力を提供するかどうかを確認することは困難です。クロマチン免疫沈降 (チップ) は、特定のウイルスおよび細胞の蛋白質がウイルスのゲノム10、11,12,13,14にバインドを識別するために使用されています,15と蛍光そのままの交配 (魚) 併用免疫細胞化学は vDNA16,17,18,と colocalize の細胞の要因の可視化が有効になっています。19,20します。 これらの試時空間解析を可能にします。ただし、制限は、特異性の高い抗体、限られた感度とウイルスの宿主に以前の洞察力のための必要性の必要性を含めます。そこで iPOND (初期の DNA に蛋白質の分離)21に基づく方法と感染ウイルスのゲノムの公平な識別のため細胞の選択的にラベルを付けから vDNA を浄化する aniPOND (加速ネイティブ iPOND)22質量分析法によるタンパク質関連。iPOND は、細胞複製フォーク力学の調査のために尽力されています。
感染細胞からのウイルスのゲノムの選択的浄化、5-エチニル-2´-デオキシウリジン (EdU) または 5-エチニル-2´-デオキシシチジン (EdC) (図 1)、共有結合に続いて変更エチニル ヌクレオシドとラベルは vDNA を複製します。経由でビオチン アジ化する共役は、ウイルス ゲノムおよびストレプトアビジン コーティング ビーズ (図 2 b) に関連付けられているタンパク質の 1 つのステップ精製を容易にするために化学をクリックします。重要なは、感染症は、vDNA の特殊にラベリングを有効にする細胞の DNA 複製に従事しない定置型電池で実行されます。さらに、HSV-1 感染により、細胞周期の停止と細胞の DNA 複製23,24を抑制します。ウイルスを受信ウイルス ゲノム (図 1 a) に関連付けられている蛋白質の分析のための感染前に prelabeled または新たに合成された vDNA (図 1 b) に関連付けられている蛋白質の分析のための DNA 複製時にラベルすることができます。25します。 さらに、パルス チェイス分析はウイルス複製フォーク (図 1)26に関連付けられているタンパク質の性質を調査する使用できます。また、エチニル変更 vDNA は、空間におけるタンパク質ダイナミクス (図 2 aおよび図 3) の蛍光体にした共役系します。イメージングは、vDNA の直接可視化は、vDNA 蛋白質の相互作用を検証するための無料のアプローチで、感染でウイルスのゲノムをトラックに適応することができます。ヤマメ感染、遅延、再活性化などのあらゆる側面を研究し、他の DNA ウイルスを研究、これらのアプローチがさらに変更することができると期待しています。また、5 エチニル ウリジンとラベリング (EU) により、RNA のウイルスのゲノムの分析のため。

<table><tbody><tr><td>MRC-5 cells</td><td>ATCC</td><td>CCL-171</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Gibco</td><td>26140-179</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>12800-082</td><td>Substituted with 10% FBS, 2 mM L-glutamine, 12 mM&amp;nbsp; (for growth in flasks) or 30 mM (for growth in dishes) sodium-bicarbinate</td></tr><tr><td>600 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; tissue culture dish</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>166508</td><td></td></tr><tr><td>Tris Buffered Saline (TBS), pH 7.4</td><td></td><td></td><td>137 mM NaCl, 5 mM KCl, 491 mM MgCl, 680 mM CaCl, 25.1 mM Tricine</td></tr><tr><td>HSV-1 stock</td><td></td><td></td><td>Stocks with titers greater than 1x10&lt;sup&gt;9&lt;/sup&gt; PFU/mL work best</td></tr><tr><td>Sephadex G-25&amp;nbsp; column (PD-10 Desalting Column)</td><td>GE Healthcare</td><td>17085101</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D128-1</td><td></td></tr><tr><td>5&amp;acute;-Ethynyl-2&amp;acute;-deoxycytidine (EdC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T511307</td><td>Dissolve in DMSO to prepare 40 mM stock, aliquot, and store at -20 &amp;deg;C&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>2&amp;acute;-deoxycytidine (deoxyC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D3897</td><td>Dissolve in water to prepare 40 mM stock, aliquot, and store at -20 &amp;deg;C&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Nuclear Extraction Buffer (NEB)</td><td></td><td></td><td>Prepare fresh (20 mM Hepes pH 7.2, 50 mM NaCl, 3 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 300 mM Sucrose, 0.5% Igepal)</td></tr><tr><td>Cell scraper</td><td>Bellco glass</td><td>7731-22000</td><td>Autoclave before use</td></tr><tr><td>Trypan blue solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7.2 (10x)</td><td></td><td></td><td>1.37 M NaCl, 27 mM KCl, 100 mM Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 18 mM KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (dilute to 1x in sterile water before use)</td></tr><tr><td>Copper (II) sulfate pentahydrate (CuSO4-5H2O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C489</td><td>Prepare 100 mM stock and store at 4 &amp;deg;C for up to 1 month</td></tr><tr><td>(+) Sodium L-ascorbate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4034</td><td>Freshly prepare 100 mM stock and store on ice until use</td></tr><tr><td>Biotin azide</td><td>Invitrogen</td><td>B10184</td><td>Prepare 10 mM stock in DMSO, aliquot, and store at -20 &amp;deg;C for up to 1 year&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Click Reaction Mix</td><td></td><td></td><td>Prepare immediately before use by adding reagents in the indicated order (10 mL: 8.8 mL 1x PBS, 200 mL 100 mM CuSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 25mL 10 mM Biotin Azide, 1 mL 100 mM sodium ascorbate)&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Complete Protease Inhibitor Cocktail</td><td>Roche</td><td>11697498001</td><td>Dissolve in 1 mL water to prepare 50x stock, can store at 4 &amp;deg;C for up to 1 week, or directly add 1 pill to 50 mL buffer</td></tr><tr><td>Freezing buffer</td><td></td><td></td><td>Prepare fresh (7 mL 100% glycerol, 3 mL NEB, 200 &amp;mu;L 50x protease inhibitor)</td></tr><tr><td>Buffer B1</td><td></td><td></td><td>Prepare fresh (25 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1% Igepal, 1x protease inhibitor)</td></tr><tr><td>Buffer B2</td><td></td><td></td><td>Prepare fresh (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 0.5% Igepal, 1x protease inhibitor)</td></tr><tr><td>Buffer B3</td><td></td><td></td><td>Prepare fresh (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1x protease inhibitor)</td></tr><tr><td>Vibra Cell Ultra Sonic Processer equipped with a 3 mm microtip probe</td><td>Sonics</td><td>VCX 130</td><td></td></tr><tr><td>Cell strainer</td><td>Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptavidin T1</td><td>Life Technologies</td><td>65601</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2 Magnet</td><td>Life Technologies</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Tube Rotator</td><td>Fisher Scientific</td><td>260750F</td><td></td></tr><tr><td>2x Laemmli sample buffer</td><td></td><td></td><td>Mix 400 mg of SDS, 2 mL 100% glycerol, 1.25 mL of 1 M Tris (pH 6.8), and 10 mg of bromophenol blue in 8 mL water. Store at 4&amp;nbsp; &amp;deg;C for up to 6 months. Before use add 1 M DTT to a final concentration of 200 mM.</td></tr><tr><td>Cap locks for 1.5 mL tube</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9679153</td><td></td></tr><tr><td>Standard western blotting reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NOVEX Colloidal Blue Staining Kit</td><td>Invitrogen</td><td>LC6025</td><td></td></tr><tr><td>12-well tissue culture dish</td><td>Corning</td><td>3513</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-100</td><td>Autoclave before use</td></tr><tr><td>Microscope slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-552-5</td><td></td></tr><tr><td>16% paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>Dilute to 3.7% in 1x PBS before use</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1605</td><td>Prepare 3% in 1x PBS</td></tr><tr><td>Permeabilization buffer (0.5% Triton-X 100)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Prepare 0.5% Triton-X 100 in 1x PBS</td></tr><tr><td>Click reaction cocktail - Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit</td><td>Molecular Probes</td><td>C10337</td><td>Prepare according to manufactorer&#039;s protocol</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H1399</td><td>Prepare 10 mg/mL in water, can store at 4 &amp;deg;C for up to 1 year</td></tr><tr><td>Mouse anti-ICP8 primary antibody</td><td>Abcam</td><td>ab20194</td><td>Use a 1:200 dilution in 1x PBS</td></tr><tr><td>Mouse anti-UL42 primary antibody (2H4)</td><td>Abcam</td><td>ab19311</td><td>Use a 1:200 dilution in 1x PBS</td></tr><tr><td>Goat anti-mouse 594-conjugated secondary antibody</td><td>Life Technologies</td><td>a11005</td><td>Use a 1:500 dilution in 1x PBS</td></tr><tr><td>Immu-mount</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>9990402</td><td></td></tr><tr><td>2x SDS-bicarb solution</td><td></td><td></td><td>2% SDS, 200 mM NaHCO3</td></tr><tr><td>Phenol:chloroform:isoamyl alcohol</td><td></td><td></td><td>Mix 25:24:1 at least 1 day before use, store at 4 &amp;deg;C in the dark</td></tr><tr><td>chloroform:isoamyl alcohol</td><td></td><td></td><td>Mix 24:1 at least 1 day before use, store at room temperature in the dark</td></tr><tr><td>10x Tris EDTA (TE), pH 8.0</td><td></td><td></td><td>100 mM Tris, 10 mM EDTA (dilute to 1x before use)</td></tr><tr><td>Qiaquick PCR purification kit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>3 M sodium acetate pH 5.2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0 Fluorometer</td><td>Invitrogen</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>Invitrogen</td><td>Q32851</td><td></td></tr><tr><td>Qubit assay tubes</td><td>Invitrogen</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence microscope equipped with imaging software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge for 1.5 mL tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tabletop centrifuge for 15 and 50 mL tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell culture incubator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biosafety cabinet</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heat blocks</td><td></td><td></td><td>65 &amp;deg;C and 95 &amp;deg;C</td></tr></tbody></table>

purification of viral dna for the identification of associated viral and cellular proteins

このプロトコルの目標は感染した細胞の同定 (HSV-1) DNA 関連ウイルス単純ヘルペス ウイルス 1 型を分離する、細胞タンパク質質量分析法。ウイルスのゲノムと相互作用するタンパク質を担う感染症の結果を決定する上で主要な役割が、関連付けられているウイルスのゲノムのタンパク質の網羅的解析は以前は不可能だった。ここで我々 は、感染細胞からの HSV-1 ゲノムの直接浄化を可能にするメソッドを示します。ウイルス DNA を複製する選択的にアルキン官能を含む修正されたヌクレオチドにラベル付けされています。標識 DNA、特に不可逆的なタグ、ビオチン アジ化銅 (I) 経由での共有添付ファイルを介して-アジ化物アルキンの環化付加反応やクリックの反応を触媒。ストレプトアビジン コーティング ビーズにビオチン標識 DNA が浄化され、関連付けられているタンパク質の溶出し質量分析によって識別されます。このメソッドには、選択的ターゲティングと HSV 1 複製フォークまたは複雑な生物的環境から全体のゲノムの分離ができます。さらに、このアプローチの適応は他の DNA ウイルスのゲノムの検査と同様に、ウイルス感染症の様々 な側面の調査のためになります。

クリックケミストリーのセルからの DNA の精製用は iPOND 法21によって初めて達成されました。IPOND の目的は、関連付けられているタンパク質の同定のため細胞複製フォークを浄化することです。我々 は、特に感染時 vDNA 蛋白質の相互作用の研究にこの手法を適応しています。選択分離そして vDNA の個別集団の調査のため同期感染症と組み合わせる EdC...

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Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins

このプロトコルの目標は、具体的にはタグし、関連付けられているウイルスのゲノムのタンパク質のキャラクタリゼーションのため感染細胞からウイルス DNA を選択的に分離することです。

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.4K ビュー.  University of Pittsburgh School of Medicine. このプロトコルの目標は、具体的にはタグし、関連付けられているウイルスのゲノムのタンパク質のキャラクタリゼーションのため感染細胞からウイルス DNA を選択的に分離することです。

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Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. Several downstream applications require large quantities of pure viral DNA, which is provided by this protocol. These applications include viral genome sequencing, where the removal of host DNA is crucial to optimize data output for viral sequences, and the production of new viral recombinant strains, where co-transfection of purified plasmid and linear viral DNA facilitates recombination.1,2,3 
This procedure utilizes a combination of extractions and density-based centrifugation to isolate purified linear herpesvirus nucleocapsid DNA from infected cells.4,5 The initial purification steps aim to isolate purified viral capsids, which contain and protect the viral DNA during the extractions and centrifugation steps that remove cellular proteins and DNA. Lysis of nucleocapsids then releases viral DNA, and two final phenol-chloroform steps remove remaining proteins. The final DNA captured from solution is highly concentrated and pure, with an average OD260/280 of 1.90. Depending on the quantity of infected cells used, yields of viral DNA range from 150-800 &mu;g or more. The purity of this DNA makes it stable during long-term storage at 4C. This DNA is thus ideally suited for high-throughput sequencing, high fidelity PCR reactions, and transfections. 
Prior to beginning the protocol, it is important to know the average number of cells per dish (e.g. an average of 8 x 106 PK-15 cells in a confluent 15 cm dish), and the titer of the viral stock to be used (e.g. 1 x 108 plaque-forming units per ml). These are necessary to calculate the appropriate multiplicity of infection (MOI) for the protocol.6 For instance, to infect one 15 cm dish of PK-15 cells with the above viral stock, at an MOI of 5, you would use 400 &mu;l of viral stock and dilute it with 3.6 ml of medium (total inoculation volume of 4 ml for one 15 cm plate).
Multiple viral DNA preparations can be prepared at the same time. The number of simultaneous preparations is limited only by the number of tubes held by the ultracentrifuge rotor (one per virus; see step 3.9 below). Here we describe the procedure as though being done for one virus.

We describe the process of isolating high purity herpesvirus nucleocapsid DNA from infected cells. The final DNA captured from solution is of high concentration and purity, making it ideally suited for high-throughput sequencing, high fidelity PCR reactions, and transfections to produce new viral recombinants.

ヌクレオカプシドからウイルスDNAの調製

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. ...

免疫・感染学

Isolation and Genome Analysis of Single Virions using 'Single Virus Genomics'

Whole genome amplification and sequencing of single microbial cells enables genomic characterization without the need of cultivation 1-3. Viruses, which are ubiquitous and the most numerous entities on our planet 4 and important in all environments 5, have yet to be revealed via similar approaches. Here we describe an approach for isolating and characterizing the genomes of single virions called 'Single Virus Genomics' (SVG). SVG utilizes flow cytometry to isolate individual viruses and whole genome amplification to obtain high molecular weight genomic DNA (gDNA) that can be used in subsequent sequencing reactions.

Single Virus Genomics (SVG) is a method to isolate and amplify the genomes of single virons. Viral suspensions of a mixed assemblage are sorted using flow cytometry onto a microscope slide with discrete wells containing agarose, thereby capturing the virion and reducing genome shearing during downstream processing. Whole genome amplification is achieved using multiple displacement amplification (MDA) resulting in genomic material that is suitable for sequencing.

&#39;シングルウイルスゲノミクス&#39;を使用してシングルビリオンの単離とゲノム解析

Whole genome amplification and sequencing of single microbial cells enables genomic characterization without the need of cultivation 1-3. Viruses, which ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the single-stranded genome is encapsidated by the nucleoprotein (NP), and associated with the trimeric polymerase complex consisting of the PA, PB1, and PB2 subunits. However, in contrast to most RNA viruses, influenza viruses perform viral RNA synthesis in the nuclei of infected cells. Interestingly, viral mRNA synthesis uses cellular pre-mRNAs as primers, and it has been proposed that this process takes place on chromatin1. Interactions between the viral polymerase and the host RNA polymerase II, as well as between NP and host nucleosomes have also been characterized1,2.
Recently, the generation of recombinant influenza viruses encoding a One-Strep-Tag genetically fused to the C-terminus of the PB2 subunit of the viral polymerase (rWSN-PB2-Strep3) has been described. These recombinant viruses allow the purification of PB2-containing complexes, including vRNPs, from infected cells. To obtain purified vRNPs, cell cultures are infected, and vRNPs are affinity purified from lysates derived from these cells. However, the lysis procedures used to date have been based on one-step detergent lysis, which, despite the presence of a general nuclease, often extract chromatin-bound material only inefficiently. 
Our preliminary work suggested that a large portion of nuclear vRNPs were not extracted during traditional cell lysis, and therefore could not be affinity purified. To increase this extraction efficiency, and to separate chromatin-bound from non-chromatin-bound nuclear vRNPs, we adapted a step-wise subcellular extraction protocol to influenza virus-infected cells. Briefly, this procedure first separates the nuclei from the cell and then extracts soluble nuclear proteins (here termed the "nucleoplasmic" fraction). The remaining insoluble nuclear material is then digested with Benzonase, an unspecific DNA/RNA nuclease, followed by two salt extraction steps: first using 150 mM NaCl (termed "ch150"), then 500 mM NaCl ("ch500") (Fig. 1). These salt extraction steps were chosen based on our observation that 500 mM NaCl was sufficient to solubilize over 85% of nuclear vRNPs yet still allow binding of tagged vRNPs to the affinity matrix.
After subcellular fractionation of infected cells, it is possible to affinity purify PB2-tagged vRNPs from each individual fraction and analyze their protein and RNA components using Western Blot and primer extension, respectively. Recently, we utilized this method to discover that vRNP export complexes form during late points after infection on the chromatin fraction extracted with 500 mM NaCl (ch500)3.

Influenza viruses replicate their RNA genome in association with host-cell chromatin. Here, we present a method to purify intact viral ribonucleoprotein complexes from the chromatin of infected cells. Purified viral complexes can be analyzed by both Western blot and primer extension of protein and RNA content, respectively.

感染細胞のクロマチンからのインフルエンザウイルスのリボ核タンパク質複合体のアフィニティ精製

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Purification and Visualization of Influenza A Viral Ribonucleoprotein Complexes

The influenza A viral genome consists of eight negative-sense, single stranded RNA molecules, individually packed with multiple copies of the influenza A nucleoprotein (NP) into viral ribonulceoprotein particles (vRNPs). The influenza vRNPs are enclosed within the viral envelope. During cell entry, however, these vRNP complexes are released into the cytoplasm, where they gain access to the host nuclear transport machinery. In order to study the nuclear import of influenza vRNPs and the replication of the influenza genome, it is useful to work with isolated vRNPs so that other components of the virus do not interfere with these processes. Here, we describe a procedure to purify these vRNPs from the influenza A virus. The procedure starts with the disruption of the influenza A virion with detergents in order to release the vRNP complexes from the enveloped virion. The vRNPs are then separated from the other components of the influenza A virion on a 33-70% discontinuous glycerol gradient by velocity sedimentation. The fractions obtained from the glycerol gradient are then analyzed on via SDS-PAGE after staining with Coomassie blue. The peak fractions containing NP are then pooled together and concentrated by centrifugation. After concentration, the integrity of the vRNPs is verified by visualization of the vRNPs by transmission electron microscopy after negative staining. The glycerol gradient purification is a modification of that from Kemler et al. (1994)1, and the negative staining has been performed by Wu et al. (2007).2

The genome of the influenza A virus consists of eight separate complexes of RNA and proteins, termed viral ribonucleoprotein complexes (vRNPs). This paper describes the glycerol gradient purification and transmission electron microscopy visualization of influenza A vRNPs.

インフルエンザウイルスリボ核タンパク質複合体の精製と可視化

The influenza A viral genome consists of eight negative-sense, single stranded RNA molecules, individually packed with multiple copies of the influenza A ...

生物学

Isolation of Viral Replication Compartment-enriched Sub-nuclear Fractions from Adenovirus-infected Normal Human Cells

During infection of human cells by adenovirus (Ad), the host cell nucleus is dramatically reorganized, leading to formation of nuclear microenvironments through the recruitment of viral and cellular proteins to sites occupied by the viral genome. These sites, called replication compartments (RC), can be considered viral-induced nuclear domains where the viral genome is localized and viral and cellular proteins that participate in replication, transcription and post-transcriptional processing are recruited. Moreover, cellular proteins involved in the antiviral response, such as tumor suppressor proteins, DNA damage response (DDR) components and innate immune response factors are also co-opted to RC. Although RC seem to play a crucial role to promote an efficient and productive replication cycle, a detailed analysis of their composition and associated activities has not been made. To facilitate the study of adenoviral RC and potentially those from other DNA viruses that replicate in the cell nucleus, we adapted a simple procedure based on velocity gradients to isolate Ad RC and established a cell-free system amenable to conduct morphological, functional and compositional studies of these virus-induced subnuclear structures, as well as to study their impact on host-cell interactions.

We provide a novel strategy to isolate viral replication compartments (RC) from adenovirus (Ad)-infected human cells. This approach represents a cell-free system that can help to elucidate the molecular mechanisms regulating viral genome replication and expression as well as regulation of viral-host interactions established at the RC.

アデノウイルスに感染したヒト正常細胞からのウイルス複製コンパートメントに富むサブ核画分の単離

During infection of human cells by adenovirus (Ad), the host cell nucleus is dramatically reorganized, leading to formation of nuclear microenvironments ...

Combining Analysis of DNA in a Crude Virion Extraction with the Analysis of RNA from Infected Leaves to Discover New Virus Genomes

This metagenome approach is used to identify plant viruses with circular DNA genomes and their transcripts. Often plant DNA viruses that occur in low titers in their host or cannot be mechanically inoculated to another host are difficult to propagate to achieve a greater titer of infectious material. Infected leaves are ground in a mild buffer with optimal pH and ionic composition recommended for purifying most bacilliform Para retroviruses. Urea is used to break up inclusion bodies that trap virions and to dissolve cellular components. Differential centrifugation provides further separation of virions from plant contaminants. Then proteinase K treatment removes the capsids. Then the viral DNA is concentrated and used for next-generation sequencing (NGS). The NGS data are used to assemble contigs which are submitted to NCBI-BLASTn to identify a subset of virus sequences in the generated dataset. In a parallel pipeline, RNA is isolated from infected leaves using a standard column-based RNA extraction method. Then ribosome depletion is carried out to enrich for a subset of mRNA and virus transcripts. Assembled sequences derived from RNA sequencing (RNA-seq) were submitted to NCBI-BLASTn to identify a subset of virus sequences in this dataset. In our study, we identified two related full-length badnavirus genomes in the two datasets. This method is preferred to another common approach which extracts the aggregate population of small RNA sequences to reconstitute plant virus genomic sequences. This latter metagenomic pipeline recovers virus related sequences that are retro-transcribing elements inserted into the plant genome. This is coupled to biochemical or molecular assays to further discern the actively infectious agents. The approach documented in this study, recovers sequences representative of replicating viruses that likely indicate active virus infection.

Here we present a new approach to identify plant viruses with double-strand DNA genomes. We use standard methods to extract DNA and RNA from infected leaves and carry out next-generation sequencing. Bioinformatic tools assemble sequences into contigs, identify contigs representing virus genomes and assign genomes to taxonomic groups.

新しいウイルスのゲノムを発見する感染葉からの RNA の解析とウイルス粒子粗抽出 DNA の結合解析

This metagenome approach is used to identify plant viruses with circular DNA genomes and their transcripts. Often plant DNA viruses that occur in low ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein partners. There are many approaches that allow the identification of interacting partners, including the yeast two hybrid system, as well as pull down assays using recombinant proteins and immunoprecipitation of endogenous proteins followed by mass spectrometry identification1. Recent studies have highlighted the utility of double-affinity tag mediated purification, coupled with two specific elution steps in the identification of interacting proteins. This approach, termed Tandem Affinity Purification (TAP), was initially used in yeast2,3 but more recently has been adapted to use in mammalian cells4-8.
As proof-of-concept we have established a tandem affinity purification (TAP) method using the well-characterized eukaryotic translation initiation factor eIF4E9,10.The cellular translation factor eIF4E is a critical component of the cellular eIF4F complex involved in cap-dependent translation initiation10. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence8. To forgo the need for the generation of clonal cell lines, we developed a rapid system that relies on the expression of the TAP-tagged bait protein from an episomally maintained plasmid based on pMEP4 (Invitrogen). Expression of tagged murine eIF4E from this plasmid was controlled using the cadmium chloride inducible metallothionein promoter.
Lysis of the expressing cells and subsequent affinity purification via binding to rabbit IgG agarose, TEV protease cleavage, binding to streptavidin linked agarose and subsequent biotin elution identified numerous proteins apparently specific to the eIF4E pull-down (when compared to control cell lines expressing the TAP tag alone). The identities of the proteins were obtained by excision of the bands from 1D SDS-PAGE and subsequent tandem mass spectrometry. The identified components included the known eIF4E binding proteins eIF4G and 4EBP-1. In addition, other components of the eIF4F complex, of which eIF4E is a component were identified, namely eIF4A and Poly-A binding protein. The ability to identify not only known direct binding partners as well as secondary interacting proteins, further highlights the utility of this approach in the characterization of proteins of unknown function.

Tandem affinity purification is a robust approach for the identification of protein binding partners. As proof of concept, this methodology was applied to the well-characterized translation initiation factor eIF4E to co-precipitate the host cell factors involved in translation initiation. This method is easily adapted to any cellular or viral protein.

タンデムアフィニティー精製を用いたタンパク質相互作用するパートナーの識別

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

In Vitro Selection of Aptamers to Differentiate Infectious from Non-Infectious Viruses

Virus infections have a major impact on society; most methods of detection have difficulties in determining whether a detected virus is infectious, causing delays in treatment and further spread of the virus. Developing new sensors that can inform on the infectability of clinical or environmental samples will meet this unmet challenge. However, very few methods can obtain sensing molecules that can recognize an intact infectious virus and differentiate it from the same virus that has been rendered non-infectious by disinfection methods. Here, we describe a protocol to select aptamers that can distinguish infectious viruses vs non-infectious viruses using systematic evolution of ligands by exponential enrichment (SELEX). We take advantage of two features of SELEX. First, SELEX can be tailor-made to remove competing targets, such as non-infectious viruses or other similar viruses, using counter selection. Additionally, the whole virus can be used as the target for SELEX, instead of, for example, a viral surface protein. Whole virus SELEX allows for the selection of aptamers that bind specifically to the native state of the virus, without the need to disrupt of the virus. This method thus allows recognition agents to be obtained based on functional differences in the surface of pathogens, which do not need to be known in advance.

We provide a protocol that can be generally applied to select aptamers that bind to infectious viruses only and not to viruses that have been rendered non-infectious by a disinfection method or to any other similar viruses. This opens the possibility of determining infectivity status in portable and rapid tests.

感染性ウイルスと非感染性ウイルスを区別するためのアプタマーのin vitro選択

Virus infections have a major impact on society; most methods of detection have difficulties in determining whether a detected virus is infectious, ...

生物工学

<meta charset="utf8"></head><body>デュアルレポーターおよびマルチプレックス技術を用いたSARS-CoV-2の解析

Profiling of Surface Protein Epitopes on Viral Particles by Multiplex Dual-Reporter Strategy

Membrane proteins on enveloped viruses play an important role in many biological functions involving virus attachment to target cell receptors, fusion of viral particles to host cells, host-virus interactions, and disease pathogenesis. Furthermore, viral membrane proteins on virus particles and presented on host cell surfaces have proven to be excellent targets for antivirals and vaccines. Here, we describe a protocol to investigate surface proteins on intact severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) particles using the dual-reporter flow cytometric system. The assay exploits multiplex technology to obtain a triple detection of viral particles by three independent affinity reactions. Magnetic beads conjugated to recombinant human angiotensin-converting enzyme-2 (ACE2) were used to capture viral particles from the supernatant of cells infected with SARS-CoV-2. Then, two detection reagents labeled with R-phycoerythrin (PE) or Brilliant Violet 421 (BV421) were applied simultaneously. As a proof-of-concept, antibody fragments targeting different epitopes of the SARS-CoV-2 surface protein Spike (S1) were used. The detection of viral particles by three independent affinity reactions provides strong specificity and confirms the capture of intact virus particles. Dose-dependency curves of SARS-CoV-2 infected cell supernatant were generated with replicate coefficient variances (mean/SD) &#706;14%. Good assay performance in both channels confirmed that two virus surface target protein epitopes are detectable in parallel. The protocol described here could be applied for (i) high-multiplex, high-throughput profiling of surface proteins expressed on enveloped viruses; ii) detection of active intact viral particles; and (iii) assessment of specificity and affinity of antibodies and antiviral drugs for surface epitopes of viral antigens.The application can be potentially extended to any type of extracellular vesicles and bioparticles, exposing surface antigens in body fluids or other liquid matrices.

<meta charset="utf8"></head><body>著者スポットライト:新しい免疫捕捉および質量分析技術による抗ウイルス戦略の進歩

Here, we describe a newly developed multiplex fluorescent immunoassay that uses a dual-reporter flow cytometric system to concurrently detect two unique spike protein epitopes on intact severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) viral particles that had been captured by angiotensin-converting enzyme-2-coupled magnetic microspheres.

マルチプレックスデュアルレポーター法によるウイルス粒子上の表面タンパク質エピトープのプロファイリング

Membrane proteins on enveloped viruses play an important role in many biological functions involving virus attachment to target cell receptors, fusion of ...

関連付けられているウイルスおよび細胞タンパク質の同定のウイルス DNA の精製

要約

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ヌクレオカプシドからウイルスDNAの調製

'シングルウイルスゲノミクス'を使用してシングルビリオンの単離とゲノム解析

感染細胞のクロマチンからのインフルエンザウイルスのリボ核タンパク質複合体のアフィニティ精製

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新しいウイルスのゲノムを発見する感染葉からの RNA の解析とウイルス粒子粗抽出 DNA の結合解析

タンデムアフィニティー精製を用いたタンパク質相互作用するパートナーの識別

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マルチプレックスデュアルレポーター法によるウイルス粒子上の表面タンパク質エピトープのプロファイリング

マルチプレックスデュアルレポーター法によるウイルス粒子上の表面タンパク質エピトープのプロファイリング