Name: purification of viral dna for the identification of associated viral and cellular proteins
Uploaded: 2017-08-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
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Reconhecemos a Hannah Fox pela ajuda na preparação deste manuscrito. Este trabalho foi financiado pelo NIH conceder R01AI030612.

1. cultura celular, infecção Viral e rotulação de EdC ( Figura 1) o seguinte protocolo envolve trabalhar com vírus. Por favor, consulte sua instituição &#39; protocolos de biossegurança s sobre manipulação segura de vírus e outros agentes biológicos. Este protocolo foi aprovado pelo Conselho de revisão institucional da Universidade de Pittsburgh.
<ol><li>Trypsinize um frasco de cultura de tecidos confluente 150 cm 2 de MRC-5 células e as células de transferência para uma placa de cultura de tecido de 2 600 cm contendo 100 mL DMEM acrescido de 10% FBS. Incube a 37 ° C, na presença de 5% de CO 2 para 3-4 dias para chegar a fase estacionária e Confluencia. Um prato de 2 cm de 600 confluente contém ~ 7 x 10 7 células. Preparar 1 para cada condição e 1 chapa para cada controle negativo correspondente. 
	Nota: Células devem alcançar a fase estacionária para inibir a replicação do DNA celular para garantir que apenas vDNA é rotulado e purificada em etapas subsequentes. 
	Nota: Cada amostra requer uma cortesia unlabeled controlo negativo preparado usando as mesmas condições de infecção e ponto de tempo sem a adição de EdC. 
	Nota: A escala versão desta experiência deve ser efectuada em tandem para testar para a rotulagem do DNA celular por imagem utilizando o crescimento de células comparáveis, infecção, EdC rotulando as condições e pontos (consulte a etapa 2).</li>
	<li>Diluir 7 x 10 8 PFU HSV-1 em 7 mL salina de carbono frio (TBS). Remover o meio de crescimento e armazenar a 37 ° C. Para infectar, adicione o 7 mL vírus diluído para MRC-5 células e rock por 1h à temperatura ambiente. Após a adsorção, remover o inóculo, enxaguar com 50 mL temperatura TBS e substituir o original meio de crescimento. Incube a 37 ° C, na presença de 5% de CO 2. Esta etapa deve ser efectuada para cada condição experimental e controlo negativo. 
	Nota: Rotulagem de EdC aumento pode ser conseguido usando mutantes de HSV-1 defeituosos para a expressão do dUTPase viral (gene UL50) e/ou glycosylase uracil (UL2 gene). HSV-1 dUTPase tem baixa especificidade e pode diminuir a ativação de diversos nucleosídeos análogos 25 , 27.</li>
	<li>Genomas virais de rótulo com EdC. Siga as instruções para rotular os genomas de entrada (1.3.1.), replicação de genomas (1.3.2.), ou forquilhas de replicação viral (1.3.3).. 
	Nota: Só passo 1.3.1, 1.3.2 ou 1.3.3 deve ser realizado dependendo se entrada genomas, genomas replicadas ou forquilhas de replicação devem ser analisados em etapas subsequentes, respectivamente. 
	Nota: EdU ou f-ara EdU pode ser substituído por EdC. A toxicidade de análogos de nucleosídeos deve ser monitorizada e minimizada.
	<ol><li>Uso prelabeled ações para realizar a infecção na etapa 1.2 e vá para a etapa 2 ou 3 dentro de 4h pós infecção (hpi) para investigar replicada vDNA ( figura 1A). 
		Nota: Prepare o vírus prelabeled ações usando o protocolo descrito anteriormente, 25. Reservas de vírus devem ser passadas através de uma coluna de G-25 para remover qualquer residual EdC.</li>
		<li>Etiqueta vDNA replicação pela adição de 5-25 µM EdC para o meio de cultura celular de células infectadas para 2-4 h ( figura 1B). Antes de adicionar, diluir EdC em 1 mL de meio de crescimento.</li>
		<li>Para rotular as forquilhas de replicação viral, após o início da replicação vDNA (&#8805; 4 hpi), etiqueta de pulso replicando vDNA com 5-25 µM EdC para 5 a 20 min. Para perseguir, lavar 3x com meio de perseguição contendo 25-100 µM 2´deoxycytidine (deoxyC) e então incubar na presença de meio de perseguição por um adicional 20-40 min ( Figura 1). 
		Nota: Pulso e chase médio deve ser incubado a 37 ° C e 5% CO 2 antes do uso. 
		Nota: Para experiências de perseguição do pulso, é importante considerar a quantidade de tempo que leva para nucleosídeos entrar na célula e ser phosphorylated antes que eles podem ser incorporados em replicação de DNA. Isso deve ser determinado empiricamente. 
		Nota: Para determinar a resolução de experimentos de perseguição de pulso, calcule a taxa de replicação viral nas condições experimentais utilizadas. Isto pode ser determinado por PCR quantitativo de genomas virais durante uma única etapa crescimento tempo curso 26. 
		Nota: Para imagens de genomas virais prosseguir para a etapa 2 e para a purificação de genomas virais prossiga para o passo 3.</li>
	</ol></li></ol> 2. Imagem de EdC rotulado de DNA ( Figura 2A) Nota: é útil realizar imagens em conjunto com o método de purificação do genoma viral para verificar que o DNA celular não é rotulado em experimentos. Imagem também pode ser usada para visualizar a natureza de vDNA etiquetado e validar dados de proteômica. Exemplos de DNA viral e celular, os padrões de coloração são mostrados na Figura 3.
<ol><li>Realizar infecções e EdC rotulando como indicado na etapa 1, exceto usando reduzidas condições em lamelas em um prato de cultura de tecidos de 12 poços contendo 1 mL de meio de cultura.</li>
	<li>Correção de células com 1 mL 3,7% paraformaldeído em 1X PBS por 15 min no RT Após a fixação, enxaguar células 2x com 1ml 3% BSA em PBS. 
	Cuidado: Paraformaldehyde pode causar lesões graves ou permanentes. Siga as precauções de segurança. 
	Nota: O protocolo pode ser pausado aqui e lamelas podem ser armazenadas a 4 ° C, na segunda lavagem por até 3 dias.</li>
	<li>Permeabilize células com 1 mL de tampão de permeabilização [ver Tabela de materiais] por 20 min à temperatura ambiente enquanto balançando.</li>
	<li>Enxaguar com 1 mL de BSA 3% e, em seguida, bloco com BSA de 3% 1 mL de PBS durante 30 min à temperatura ambiente enquanto balançando.</li>
	<li>Adicione 1 mL da reação clique cocktail [ver Tabela de materiais] para lamelas covalentemente conjugar Alexa Fluor 488 azida de EdC rotulado de DNA. Incube a temperatura ambiente por 30 min, enquanto balançando. Aspirar e lavar duas vezes com 1 mL de PBS.</li>
	<li>Mancha DNA celular com 1 mL de uma diluição de 1:2,000 de Hoechst em PBS durante 30 min à temperatura ambiente enquanto balançando. Aspirar e lavar duas vezes com 1 mL de PBS.</li>
	<li>Mancha com anticorpos primários e secundários, de acordo com o padrão de imunofluorescência indirecta protocolos 25. 
	Nota: VDNA rotulado colocalizes com ICP8, ICP4 ou UL42 e rotulado celular DNA colocalizes com mancha de Hoechst.</li>
	<li>Montar lamelas em slides e imagem células usando um microscópio de fluorescência. 
	Nota: Slides podem ser armazenadas a 4 ° C durante várias semanas.</li>
</ol> 3. Purificação de proteínas associadas e vDNA Nota: vários aspectos deste protocolo foram adaptados de Leung et al. 22 Nota: todos os buffers e reagentes devem ser refrigerados no gelo antes da utilização e todas as etapas devem ser realizadas no gelo salvo indicação em contrário.
<ol><li>Colheita núcleos. 
	Nota: Antes de isolamento dos núcleos, formaldeído pode ser usado para a ligação cruzada proteínas para o DNA. Condições mais rigorosas de lavagem podem ser usadas durante a purificação de DNA em grânulos streptavidin-revestido. Para crcondições osslinking e lavagem ver Sirbu et al 21. <ol><li>substituir o meio de cultura com 20 mL de solução tampão de núcleos (NEB) e incube por 20 min a 4 ° C, com ocasionais de balanço. Núcleos se tornará visíveis no microscópio.</li>
		<li>Raspar núcleos da placa usando um raspador de célula e transfira para um tubo cónico de 50 mL. Centrifugação por 10min a 2.500 x g a 4 ° C para núcleos de Pelotas, descartar o sobrenadante. 
		Nota: Trypan coloração azul pode ser usado para verificar o isolamento dos núcleos de células.</li>
		<li>Suavemente desalojar a pelota nuclear em 10 mL de PBS, transferir para um tubo cônico de 15 mL, pelota e por centrifugação por 10min a 2.500 x g a 4 ° C. completamente remover PBS. 
		Nota: Núcleos podem ser congelados e o protocolo pode ser interrompido neste ponto. Para fazer isso, delicadamente Ressuspender o nuclear em 500 µ l de congelamento do buffer e incubar o tubo em um banho de gelo seco-etanol. Armazenar os núcleos congelados a-80 ° C. Antes da utilização, descongelar núcleos à temperatura ambiente, transferir rapidamente de gelo, adicionar 10 mL de PBS, pedra delicadamente para misturar, pelota por centrifugação por 10min a 2.500 x g a 4 ° C e remover completamente a PBS. Núcleos de congelamento pode resultar em rendimento reduzido.</li>
	</ol></li> <li>Covalentemente conjugado biotina-azida de EdC rotulado vDNA.
	<ol><li>Ressuspender o pellet nuclear na reação de 10ml clique misturar [ver Tabela de materiais] suavemente pipetando acima e para baixo 5 vezes com uma pipeta de 10 mL. 
		Nota: É importante que os reagentes incluídos no mix clique reação são adicionados na ordem indicada.</li>
		<li>Rode durante 1h a 4 ° C. Enquanto roda preparar e relaxar Buffers B1, B2 e B3 [ver Tabela de materiais].</li>
		<li>Núcleos de pelota por centrifugação por 10min a 2.500 x g a 4 ° C. completamente remover clique em mistura de reação e lavar o sedimento por suavemente resuspending em 10 mL de PBS e centrifugação por 10min a 2.500 x g a 4 ° C.</li>
		<li>Suavemente resuspenda o pellet nuclear em 1 mL de PBS e transferir para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL usando a ponta da pipeta um grande furo. Núcleos de pelotas por centrifugação durante 10 minutos a 2.500 x g a 4 ° C. completamente remover PBS e congelamento flash em azoto líquido. 
		Nota: O protocolo pode ser interrompido neste ponto e núcleos congelados podem ser armazenados no-80 ° C. Freeze degelo ajuda com Lise subsequente, por isso é recomendado que os núcleos ser flash congelado mesmo quando avançar para o passo 3.3 no mesmo dia.</li>
	</ol></li> <li>Lyse núcleos e fragmento de DNA.
	<ol><li>Descongelar núcleos no gelo e ressuspender em 500 µ l de Buffer B1 pipetando para cima e para baixo. Incubar no gelo por 45 min.</li>
		<li>Sonicate amostras 6 vezes por 30 s cada em amplitude de 40%, usando uma sonda de microtip de 3 mm. Colocar as amostras no gelo por 30 s entre pulsos. Depois sonication, amostras devem aparecer, claro, não nublado. 
		Nota: Condições Sonication devem ser otimizadas para sonicators individuais. Para obter instruções detalhadas sobre como otimizar condições sonication referir Leung et al. 22.</li> <li>os restos da célula de pelotas por centrifugação a 14.000 x g durante 10 minutos a 4 ° C. O tamanho da pelota deve diminuir substancialmente. Filtrar o sobrenadante através de filtro de célula 100 µM e manter o fluxo através de.</li>
		<li>Adicionar 500 µ l tampão B2 a filtrada sobrenadante. 900 µ l desta amostra será usado na etapa 3.4.2.</li>
		<li>Tomar uma alíquota de cada condição para isolamento de DNA (50 µ l ou volume 1/20th) e adicionar 50 µ l 2 x solução de SDS-bicarbonato [ver Tabela de materiais]. Prossiga para o protocolo de isolamento de DNA (passo 3.6).</li>
		<li>Tomar uma alíquota de cada condição para a entrada da proteína (50 µ l ou volume 1/20th) e adicionar 50 µ l 2 x amortecedor da amostra Laemmli, congelamento em nitrogênio líquido e armazene a -80 ° C. utilizar na etapa 3.5.6.</li>
	</ol></li> <li>Bind biotinilado DNA para streptavidin revestido grânulos.
	<ol><li>Preparar Streptavidin T1 grânulos magnéticos Transferindo 300 µ l de chorume grânulo para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Prepare um tubo de grânulos por amostra. Lavagem de contas 3 x 1 ml de tampão B2 num Vortex para Ressuspender, aplicando um ímã para separar as contas, e aspirando o tampão de lavagem. 
		Nota: Otimizado resultado de condições no rendimento maximizado e vinculação de fundo mínimo de vinculação. Determinou-se experimentalmente que grânulos magnéticos Streptavidin T1 têm uma capacidade de ligação significativamente maior do que grânulos de agarose, bem como outros grânulos de estreptavidina e menos fundo vinculação do Streptavidin C1 grânulos ( Figura 4A ).</li>
		<li>Adicionar 900 µ l da amostra da etapa 3.3.4. aos talões lavados e rodar durante a noite a 4 ° C. 
		Nota: Fazer grânulos de vórtice não, uma vez que a amostra é adicionada a eles. 
		Nota: Se uma quantidade significativa de DNA ou proteína está isolada no controle negativo sem rótulo, esta etapa pode ser reduzida de durante a noite a 4 h para reduzir a ligação fundo.</li>
	</ol></li> <li>Lave grânulos e eluir vDNA e proteínas associadas. 
	Nota: É recomendável usar filtro dicas para as etapas restantes.
	<ol><li>Amostras de lugar em uma cremalheira do tubo de microcentrífuga magnético, remover sobrenadante, Ressuspender delicadamente em 1 mL de tampão B2, rode a 4 ° C por 5 min.</li>
		<li>Repita o passo 3.5.1 três vezes.</li>
		<li>Colocar as amostras em um rack de tubo de microcentrífuga magnético, remover o sobrenadante, delicadamente Resuspenda em 1 mL de tampão B3 e rode a 4 ° C por 5 min.</li>
		<li>Mistura de grânulo transferir 100 µ l (volume de 1/10 th) para um tubo novo para isolamento de DNA acoplado. Aplicar este tubo ao ímã, remover o sobrenadante, resuspenda grânulos em 100 µ l 1 x solução de SDS-bicarbonato e prossiga para o protocolo de isolamento de DNA (passo 3.6).</li>
		<li>Aplicar o tubo contendo a mistura de grânulo de 900 µ l restantes da etapa 3.5.3. ao ímã, remover o sobrenadante e ressuspender grânulos em 50 µ l 2 x Laemmli tampão de amostra para eluir proteínas e complexos DNA-proteína.</li>
		<li>Amostras de ferver a 95 ° C por 15 min, vortex, rapidamente girar a microcentrífuga e aplicar o ímã. Eluato de transferência para um novo tubo, congelamento flash e loja a -80 ° C. 
		Nota: Bloqueios de tampão de uso para assegurar que os tubos não pop abrir enquanto ferver. 
		Nota: O protocolo pode ser interrompido neste ponto e as amostras podem ser armazenadas a-80 ° C durante várias semanas.</li>
		<li>Analisar amostras da proteína por azul de Coomassie mancha, mancha ocidental ou espectrometria de massa por procedimentos padrão 25. Resultados representativos são mostrados na Figura 4 e Figura 5. 
		Nota: Para determinar se o rendimento de proteína é suficiente para espectrometria de massa, 7,5 µ l de cada amostra é usado para análise pela coloração de azul de Coomassie e 7,5 µ l para a mancha ocidental de um representante do genoma viral associada da proteína (ICP4, ICP8 ou UL42). O mesmo volume de lysates da etapa 3.3.6. são executados ao lado de Controlarar para níveis de entrada de proteínas. A amostra restante (35 µ l) é então analisada por massa espectrometria conforme descrito anteriormente 25.</li>
	</ol></li> <li>Isolamento de DNA <ol><li>incubar as amostras da escadaria 3.3.5. e 3.5.4. a 65 ° C para 4-16 h Remove uma amostra de grânulos magnéticos, se necessário.</li>
		<li>Extrair amostras com álcool de fenol: clorofórmio: isoamílico 150 µ l (PCI) e transferir a fase aquosa para um tubo novo.</li>
		<li>Extrair o restante PCI com 100 µ l Tris-EDTA (TE) e adicionar a fase aquosa para um tubo novo.</li>
		<li>Extrair amostras com álcool de clorofórmio: isoamílico 200 µ l (24:1).</li>
		<li>Purificar a fase aquosa, usando o Kit de purificação de PCR de acordo com o fabricante &#39; protocolo de s. 
		Nota: O indicador de pH em Buffer PB ficará roxo quando adicionado à amostra. Adicionar 10 & #181; PH de NaOAc 3M L 5.0 para diminuir o pH da amostra.</li>
		<li>Concentração de DNA determinar usando um dados. 
		Nota: Este protocolo normalmente rende 100-400 ng grânulo-ligado DNA. Sem DNA deve ser detectado no eluído do controlo negativo no qual EdC não foi adicionado na etapa 1.3.</li>
		<li>DNA pode ser armazenado em uma baixa ligação DNA tube 4 ou - 20 ° C e pode ser usado para PCR em tempo real ou a análise do sequenciamento de alto rendimento.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
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B., Cortez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+the+spatiotemporal+dynamics+of+proteins+at+replication+forks+and+in+assembled+chromatin+using+isolation+of+proteins+on+nascent+DNA.">Monitoring the spatiotemporal dynamics of proteins at replication forks and in assembled chromatin using isolation of proteins on nascent DNA.</a> Nat Protoc. 7, 594-605 (2012).</li><li>Leung, K. H., Abou El Hassan, M., Bremner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+efficient+method+to+purify+proteins+at+replication+forks+under+native+conditions.">A rapid and efficient method to purify proteins at replication forks under native conditions.</a> BioTechniques. 55, 204-206 (2013).</li><li>Hobbs, W. E., DeLuca, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perturbation+of+cell+cycle+progression+and+cellular+gene+expression+as+a+function+of+herpes+simplex+virus+ICP0.">Perturbation of cell cycle progression and cellular gene expression as a function of herpes simplex virus ICP0.</a> J Virol. 73, 8245-8255 (1999).</li><li>Lomonte, P., Everett, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+type+1+immediate-early+protein+Vmw110+inhibits+progression+of+cells+through+mitosis+and+from+G(1)+into+S+phase+of+the+cell+cycle.">Herpes simplex virus type 1 immediate-early protein Vmw110 inhibits progression of cells through mitosis and from G(1) into S phase of the cell cycle.</a> J Virol. 73, 9456-9467 (1999).</li><li>Dembowski, J. A., DeLuca, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+recruitment+of+nuclear+factors+to+productively+replicating+herpes+simplex+virus+genomes.">Selective recruitment of nuclear factors to productively replicating herpes simplex virus genomes.</a> PLoS Pathog. 11, e1004939 (2015).</li><li>Dembowski, J. A., Dremel, S. E., DeLuca, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication-Coupled+Recruitment+of+Viral+and+Cellular+Factors+to+Herpes+Simplex+Virus+Type+1+Replication+Forks+for+the+Maintenance+and+Expression+of+Viral+Genomes.">Replication-Coupled Recruitment of Viral and Cellular Factors to Herpes Simplex Virus Type 1 Replication Forks for the Maintenance and Expression of Viral Genomes.</a> PLoS Pathog. 13, e1006166 (2017).</li><li>Bjornberg, O., Nyman, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dUTPases+from+herpes+simplex+virus+type+1+and+mouse+mammary+tumour+virus+are+less+specific+than+the+Escherichia+coli+enzyme.">The dUTPases from herpes simplex virus type 1 and mouse mammary tumour virus are less specific than the Escherichia coli enzyme.</a> J Gen Virol. 77 (Pt 12), 3107-3111 (1996).</li><li>Chiou, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-+and+protein-scission+activities+of+ascorbate+in+the+presence+of+copper+ion+and+a+copper-peptide+complex.">DNA- and protein-scission activities of ascorbate in the presence of copper ion and a copper-peptide complex.</a> J Biochem. 94, 1259-1267 (1983).</li><li>Kennedy, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+consequences+of+copper+complexes+used+to+catalyze+bioorthogonal+click+reactions.">Cellular consequences of copper complexes used to catalyze bioorthogonal click reactions.</a> J Am Chem Soc. 133, 17993-18001 (2011).</li><li>Snel, B., Lehmann, G., Bork, P., Huynen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STRING:+a+web-server+to+retrieve+and+display+the+repeatedly+occurring+neighbourhood+of+a+gene.">STRING: a web-server to retrieve and display the repeatedly occurring neighbourhood of a gene.</a> Nucleic Acids Res. 28, 3442-3444 (2000).</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Este protocolo inclui várias etapas que, se não seguido com atenção, podem resultar em rendimento de proteína significativamente reduzida ou contaminação com o DNA celular. É fundamental que células fixas são utilizadas para todas as experiências para garantir que o DNA celular não é rotulado e purificado. Isto pode ser confirmado pela ausência de polimerases de DNA celulares na amostra de proteína porque HSV-1 não utiliza DNA-polimerase celular para a síntese do genoma. Durante EdC rotulagem e núcleos ...

Vírus têm uma capacidade limitada para realizar funções essenciais e, portanto, dependem de fatores do hospedeiro para facilitar os aspectos críticos da infecção, incluindo transporte, replicação, reparo, recombinação e expressão gênica viral. As atividades desses fatores do hospedeiro são, muitas vezes acentuadas por proteínas virally codificadas. Além disso, o vírus devem evitar deteção e interferência por respostas celulares à infecção viral. Portanto, interações hospedeiro de vírus ditam o resultado da infecção. De suma importância é entender como vírus alteram o ambiente celular para adaptar-se a maquinaria celular para facilitar processos virais. De particular interesse é identificar quais fatores e processos atuam sobre genomas virais durante todo o ciclo infeccioso.
Vírus do herpes simplex tipo 1 (HSV-1) é que uma dupla encalhado DNA vírus que infecta uma parte substancial da população humana. Dentro da primeira hora de infecção, o genoma viral entra no núcleo, onde uma cascata ordenada da expressão dos genes virais resulta em coordenação com viral de replicação de DNA (vDNA)1. No núcleo, genomas estão sujeitos a regulamento epigenético, passam por reparo e recombinação, em são empacotados em capsids, tal que o primeiros virions descendentes são produzidos dentro de menos de seis horas. A avaliação abrangente das proteínas do genoma viral associada ao longo do curso da infecção vai estabelecer as bases para investigar os detalhes moleculares de processos que agem sobre genomas virais e irão fornecer insights sobre quais fatores virais e celulares estão envolvidas em vários estágios de infecção.
Métodos anteriores para a investigação de fatores do hospedeiro envolvidos na infecção viral incluem purificação da afinidade das proteínas virais para a análise de proteínas celulares associados2,3,4,5 , 6 , 7 , 8 , 9. estes ensaios têm sido fundamentais para a identificação de fatores celulares envolvidos em respostas antiviral de acolhimento, bem como a modificação de cromatina viral, expressão gênica, e reparo do DNA. No entanto, é difícil verificar se interações dependem da associação com vDNA e proteomics apenas fornecer insights sobre as interações que ocorrem em função de um fator viral específico. Imunoprecipitação da cromatina (ChIP) tem sido utilizada para identificar onde as proteínas virais e celulares específicas bind para genomas virais10,11,12,13,14 , 15 e hibridização fluorescente in situ (FISH) combinado com imunocitoquímica permitiu a visualização de fatores celulares que colocalize com vDNA16,17,18, 19 , 20. estes ensaios permitem análise espacial e temporal. No entanto, as limitações incluem a necessidade de anticorpos altamente específicos, sensibilidade limitada e a necessidade de anterior insight interações hospedeiro de vírus. Portanto, desenvolvemos um método baseado na iPOND (isolamento de proteínas DNA nascente)21 e aniPOND (iPOND nativo acelerada)22 para seletivamente rotular e purificar vDNA de infectados células para a imparcial identificação do genoma viral proteínas associadas por espectrometria de massa. iPOND tem sido fundamental para a investigação da dinâmica do garfo de replicação celular.
Para a purificação seletiva de genomas virais de células infectadas, replicar vDNA é rotulado com nucleosídeos ethynyl modificado, 5-ethynyl-2´-desoxiuridina (EdU) ou 5-ethynyl-2´-deoxycytidine (EdC) (Figura 1), seguido por ligações covalentes conjugação de azida de biotina, através do clique em química para facilitar a purificação de única etapa de genomas virais e proteínas associadas em grânulos streptavidin-revestido (Figura 2B). Importante, infecções são realizadas em células estacionárias, que não estão envolvidas na replicação do DNA celular para permitir a rotulagem específica de vDNA. Além disso, a infecção HSV-1 faz com que a detenção do ciclo celular e inibe de23,de replicação de DNA celular24. Vírus podem ser prelabeled antes da infecção para a análise de proteínas associadas com entrada genomas virais (figura 1A) ou rotulado durante a replicação do DNA para a análise de proteínas associadas com vDNA recém sintetizado (figura 1B) 25. Além disso, a análise de perseguição do pulso pode ser usado para investigar a natureza das proteínas associadas com replicação viral garfos (Figura 1)26. Além disso, ethynyl-modificado vDNA pode ser covalentemente conjugado com um fluoróforo para investigação espacial da dinâmica da proteína (Figura 2A e Figura 3). Imagem permite a visualização directa de vDNA é uma abordagem complementar para a validação das interações da proteína-vDNA e pode ser adaptada para controlar genomas virais durante a infecção. Nós antecipamos que essas abordagens podem ser mais modificadas para estudar qualquer aspecto da infecção herpética, incluindo latência e reativação e estudar outros vírus de DNA. Além disso, etiquetando com uridina 5-ethynyl (UE) pode permitir para a análise do genoma viral de RNA.

<table><tbody><tr><td>MRC-5 cells</td><td>ATCC</td><td>CCL-171</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Gibco</td><td>26140-179</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>12800-082</td><td>Substituted with 10% FBS, 2 mM L-glutamine, 12 mM&amp;nbsp; (for growth in flasks) or 30 mM (for growth in dishes) sodium-bicarbinate</td></tr><tr><td>600 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; tissue culture dish</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>166508</td><td></td></tr><tr><td>Tris Buffered Saline (TBS), pH 7.4</td><td></td><td></td><td>137 mM NaCl, 5 mM KCl, 491 mM MgCl, 680 mM CaCl, 25.1 mM Tricine</td></tr><tr><td>HSV-1 stock</td><td></td><td></td><td>Stocks with titers greater than 1x10&lt;sup&gt;9&lt;/sup&gt; PFU/mL work best</td></tr><tr><td>Sephadex G-25&amp;nbsp; column (PD-10 Desalting Column)</td><td>GE Healthcare</td><td>17085101</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D128-1</td><td></td></tr><tr><td>5&amp;acute;-Ethynyl-2&amp;acute;-deoxycytidine (EdC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T511307</td><td>Dissolve in DMSO to prepare 40 mM stock, aliquot, and store at -20 &amp;deg;C&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>2&amp;acute;-deoxycytidine (deoxyC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D3897</td><td>Dissolve in water to prepare 40 mM stock, aliquot, and store at -20 &amp;deg;C&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Nuclear Extraction Buffer (NEB)</td><td></td><td></td><td>Prepare fresh (20 mM Hepes pH 7.2, 50 mM NaCl, 3 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 300 mM Sucrose, 0.5% Igepal)</td></tr><tr><td>Cell scraper</td><td>Bellco glass</td><td>7731-22000</td><td>Autoclave before use</td></tr><tr><td>Trypan blue solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7.2 (10x)</td><td></td><td></td><td>1.37 M NaCl, 27 mM KCl, 100 mM Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 18 mM KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (dilute to 1x in sterile water before use)</td></tr><tr><td>Copper (II) sulfate pentahydrate (CuSO4-5H2O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C489</td><td>Prepare 100 mM stock and store at 4 &amp;deg;C for up to 1 month</td></tr><tr><td>(+) Sodium L-ascorbate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4034</td><td>Freshly prepare 100 mM stock and store on ice until use</td></tr><tr><td>Biotin azide</td><td>Invitrogen</td><td>B10184</td><td>Prepare 10 mM stock in DMSO, aliquot, and store at -20 &amp;deg;C for up to 1 year&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Click Reaction Mix</td><td></td><td></td><td>Prepare immediately before use by adding reagents in the indicated order (10 mL: 8.8 mL 1x PBS, 200 mL 100 mM CuSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 25mL 10 mM Biotin Azide, 1 mL 100 mM sodium ascorbate)&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Complete Protease Inhibitor Cocktail</td><td>Roche</td><td>11697498001</td><td>Dissolve in 1 mL water to prepare 50x stock, can store at 4 &amp;deg;C for up to 1 week, or directly add 1 pill to 50 mL buffer</td></tr><tr><td>Freezing buffer</td><td></td><td></td><td>Prepare fresh (7 mL 100% glycerol, 3 mL NEB, 200 &amp;mu;L 50x protease inhibitor)</td></tr><tr><td>Buffer B1</td><td></td><td></td><td>Prepare fresh (25 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1% Igepal, 1x protease inhibitor)</td></tr><tr><td>Buffer B2</td><td></td><td></td><td>Prepare fresh (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 0.5% Igepal, 1x protease inhibitor)</td></tr><tr><td>Buffer B3</td><td></td><td></td><td>Prepare fresh (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1x protease inhibitor)</td></tr><tr><td>Vibra Cell Ultra Sonic Processer equipped with a 3 mm microtip probe</td><td>Sonics</td><td>VCX 130</td><td></td></tr><tr><td>Cell strainer</td><td>Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptavidin T1</td><td>Life Technologies</td><td>65601</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2 Magnet</td><td>Life Technologies</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Tube Rotator</td><td>Fisher Scientific</td><td>260750F</td><td></td></tr><tr><td>2x Laemmli sample buffer</td><td></td><td></td><td>Mix 400 mg of SDS, 2 mL 100% glycerol, 1.25 mL of 1 M Tris (pH 6.8), and 10 mg of bromophenol blue in 8 mL water. Store at 4&amp;nbsp; &amp;deg;C for up to 6 months. Before use add 1 M DTT to a final concentration of 200 mM.</td></tr><tr><td>Cap locks for 1.5 mL tube</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9679153</td><td></td></tr><tr><td>Standard western blotting reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NOVEX Colloidal Blue Staining Kit</td><td>Invitrogen</td><td>LC6025</td><td></td></tr><tr><td>12-well tissue culture dish</td><td>Corning</td><td>3513</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-100</td><td>Autoclave before use</td></tr><tr><td>Microscope slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-552-5</td><td></td></tr><tr><td>16% paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>Dilute to 3.7% in 1x PBS before use</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1605</td><td>Prepare 3% in 1x PBS</td></tr><tr><td>Permeabilization buffer (0.5% Triton-X 100)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Prepare 0.5% Triton-X 100 in 1x PBS</td></tr><tr><td>Click reaction cocktail - Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit</td><td>Molecular Probes</td><td>C10337</td><td>Prepare according to manufactorer&#039;s protocol</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H1399</td><td>Prepare 10 mg/mL in water, can store at 4 &amp;deg;C for up to 1 year</td></tr><tr><td>Mouse anti-ICP8 primary antibody</td><td>Abcam</td><td>ab20194</td><td>Use a 1:200 dilution in 1x PBS</td></tr><tr><td>Mouse anti-UL42 primary antibody (2H4)</td><td>Abcam</td><td>ab19311</td><td>Use a 1:200 dilution in 1x PBS</td></tr><tr><td>Goat anti-mouse 594-conjugated secondary antibody</td><td>Life Technologies</td><td>a11005</td><td>Use a 1:500 dilution in 1x PBS</td></tr><tr><td>Immu-mount</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>9990402</td><td></td></tr><tr><td>2x SDS-bicarb solution</td><td></td><td></td><td>2% SDS, 200 mM NaHCO3</td></tr><tr><td>Phenol:chloroform:isoamyl alcohol</td><td></td><td></td><td>Mix 25:24:1 at least 1 day before use, store at 4 &amp;deg;C in the dark</td></tr><tr><td>chloroform:isoamyl alcohol</td><td></td><td></td><td>Mix 24:1 at least 1 day before use, store at room temperature in the dark</td></tr><tr><td>10x Tris EDTA (TE), pH 8.0</td><td></td><td></td><td>100 mM Tris, 10 mM EDTA (dilute to 1x before use)</td></tr><tr><td>Qiaquick PCR purification kit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>3 M sodium acetate pH 5.2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0 Fluorometer</td><td>Invitrogen</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>Invitrogen</td><td>Q32851</td><td></td></tr><tr><td>Qubit assay tubes</td><td>Invitrogen</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence microscope equipped with imaging software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge for 1.5 mL tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tabletop centrifuge for 15 and 50 mL tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell culture incubator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biosafety cabinet</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heat blocks</td><td></td><td></td><td>65 &amp;deg;C and 95 &amp;deg;C</td></tr></tbody></table>

purification of viral dna for the identification of associated viral and cellular proteins

O objetivo do presente protocolo é de isolar o vírus do herpes simplex tipo 1 (HSV-1) de DNA de células infectadas para a identificação de associado viral e proteínas celulares por espectrometria de massa. Apesar de proteínas que interagem com genomas virais desempenham papéis importantes na determinação do resultado da infecção, uma análise abrangente das proteínas do genoma viral associado não foi anteriormente possível. Aqui vamos demonstrar um método que permite a purificação direta do HSV-1 genomas de células infectadas. Replicação de DNA viral seletivamente é rotulado com nucleotídeos modificados que contêm um grupo funcional de alquino. Rotulado de DNA é então especificamente e irreversivelmente com a tag através a ligação covalente de azida de biotina, através de um de cobre (I)-catalisada reação de cicloadição ou clique azida-alquino. Biotina-tag DNA purified em grânulos streptavidin-revestido e proteínas associadas são eluídas e identificadas por espectrometria de massa. Este método permite a seleção de alvos e isolamento de forquilhas de replicação do HSV-1 ou toda genomas de ambientes biológicos complexos. Além disso, a adaptação desta abordagem permitirá para a investigação de vários aspectos da infecção herpética, bem como o exame dos genomas de outros vírus de DNA.

O uso da química clique para a purificação do DNA de células primeiro foi realizado pelo iPOND método21. O objetivo do iPOND é purificar forquilhas de replicação celular, para a identificação de proteínas associadas. Nós adaptamos essa técnica para estudar especificamente as interações da proteína vDNA durante a infecção. Manipulação da abordagem de rotular genomas virais com EdC (Figura 1), combinadas com infecçõ...

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Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins

O objetivo do presente protocolo é especificamente tag e seletivamente isolar o DNA viral de células infectadas para caracterização de proteínas do genoma viral associada.

Purificação de DNA Viral para a identificação de proteínas Viral e celulares associadas

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.4K visualizações.  University of Pittsburgh School of Medicine. O objetivo do presente protocolo é especificamente tag e seletivamente isolar o DNA viral de células infectadas para caracterização de proteínas do genoma viral associada.

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Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. Several downstream applications require large quantities of pure viral DNA, which is provided by this protocol. These applications include viral genome sequencing, where the removal of host DNA is crucial to optimize data output for viral sequences, and the production of new viral recombinant strains, where co-transfection of purified plasmid and linear viral DNA facilitates recombination.1,2,3 
This procedure utilizes a combination of extractions and density-based centrifugation to isolate purified linear herpesvirus nucleocapsid DNA from infected cells.4,5 The initial purification steps aim to isolate purified viral capsids, which contain and protect the viral DNA during the extractions and centrifugation steps that remove cellular proteins and DNA. Lysis of nucleocapsids then releases viral DNA, and two final phenol-chloroform steps remove remaining proteins. The final DNA captured from solution is highly concentrated and pure, with an average OD260/280 of 1.90. Depending on the quantity of infected cells used, yields of viral DNA range from 150-800 &mu;g or more. The purity of this DNA makes it stable during long-term storage at 4C. This DNA is thus ideally suited for high-throughput sequencing, high fidelity PCR reactions, and transfections. 
Prior to beginning the protocol, it is important to know the average number of cells per dish (e.g. an average of 8 x 106 PK-15 cells in a confluent 15 cm dish), and the titer of the viral stock to be used (e.g. 1 x 108 plaque-forming units per ml). These are necessary to calculate the appropriate multiplicity of infection (MOI) for the protocol.6 For instance, to infect one 15 cm dish of PK-15 cells with the above viral stock, at an MOI of 5, you would use 400 &mu;l of viral stock and dilute it with 3.6 ml of medium (total inoculation volume of 4 ml for one 15 cm plate).
Multiple viral DNA preparations can be prepared at the same time. The number of simultaneous preparations is limited only by the number of tubes held by the ultracentrifuge rotor (one per virus; see step 3.9 below). Here we describe the procedure as though being done for one virus.

We describe the process of isolating high purity herpesvirus nucleocapsid DNA from infected cells. The final DNA captured from solution is of high concentration and purity, making it ideally suited for high-throughput sequencing, high fidelity PCR reactions, and transfections to produce new viral recombinants.

Preparação de DNA viral a partir nucleocapsids

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. ...

Imunologia e Infecção

Isolation and Genome Analysis of Single Virions using 'Single Virus Genomics'

Whole genome amplification and sequencing of single microbial cells enables genomic characterization without the need of cultivation 1-3. Viruses, which are ubiquitous and the most numerous entities on our planet 4 and important in all environments 5, have yet to be revealed via similar approaches. Here we describe an approach for isolating and characterizing the genomes of single virions called 'Single Virus Genomics' (SVG). SVG utilizes flow cytometry to isolate individual viruses and whole genome amplification to obtain high molecular weight genomic DNA (gDNA) that can be used in subsequent sequencing reactions.

Single Virus Genomics (SVG) is a method to isolate and amplify the genomes of single virons. Viral suspensions of a mixed assemblage are sorted using flow cytometry onto a microscope slide with discrete wells containing agarose, thereby capturing the virion and reducing genome shearing during downstream processing. Whole genome amplification is achieved using multiple displacement amplification (MDA) resulting in genomic material that is suitable for sequencing.

Isolamento e Análise do Genoma do vírus da única usando &#39;Genomics vírus simples&#39;

Whole genome amplification and sequencing of single microbial cells enables genomic characterization without the need of cultivation 1-3. Viruses, which ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the single-stranded genome is encapsidated by the nucleoprotein (NP), and associated with the trimeric polymerase complex consisting of the PA, PB1, and PB2 subunits. However, in contrast to most RNA viruses, influenza viruses perform viral RNA synthesis in the nuclei of infected cells. Interestingly, viral mRNA synthesis uses cellular pre-mRNAs as primers, and it has been proposed that this process takes place on chromatin1. Interactions between the viral polymerase and the host RNA polymerase II, as well as between NP and host nucleosomes have also been characterized1,2.
Recently, the generation of recombinant influenza viruses encoding a One-Strep-Tag genetically fused to the C-terminus of the PB2 subunit of the viral polymerase (rWSN-PB2-Strep3) has been described. These recombinant viruses allow the purification of PB2-containing complexes, including vRNPs, from infected cells. To obtain purified vRNPs, cell cultures are infected, and vRNPs are affinity purified from lysates derived from these cells. However, the lysis procedures used to date have been based on one-step detergent lysis, which, despite the presence of a general nuclease, often extract chromatin-bound material only inefficiently. 
Our preliminary work suggested that a large portion of nuclear vRNPs were not extracted during traditional cell lysis, and therefore could not be affinity purified. To increase this extraction efficiency, and to separate chromatin-bound from non-chromatin-bound nuclear vRNPs, we adapted a step-wise subcellular extraction protocol to influenza virus-infected cells. Briefly, this procedure first separates the nuclei from the cell and then extracts soluble nuclear proteins (here termed the "nucleoplasmic" fraction). The remaining insoluble nuclear material is then digested with Benzonase, an unspecific DNA/RNA nuclease, followed by two salt extraction steps: first using 150 mM NaCl (termed "ch150"), then 500 mM NaCl ("ch500") (Fig. 1). These salt extraction steps were chosen based on our observation that 500 mM NaCl was sufficient to solubilize over 85% of nuclear vRNPs yet still allow binding of tagged vRNPs to the affinity matrix.
After subcellular fractionation of infected cells, it is possible to affinity purify PB2-tagged vRNPs from each individual fraction and analyze their protein and RNA components using Western Blot and primer extension, respectively. Recently, we utilized this method to discover that vRNP export complexes form during late points after infection on the chromatin fraction extracted with 500 mM NaCl (ch500)3.

Influenza viruses replicate their RNA genome in association with host-cell chromatin. Here, we present a method to purify intact viral ribonucleoprotein complexes from the chromatin of infected cells. Purified viral complexes can be analyzed by both Western blot and primer extension of protein and RNA content, respectively.

Purificação por afinidade de Complexos de Influenza Virus ribonucleoproteína da cromatina de células infectadas

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Purification and Visualization of Influenza A Viral Ribonucleoprotein Complexes

The influenza A viral genome consists of eight negative-sense, single stranded RNA molecules, individually packed with multiple copies of the influenza A nucleoprotein (NP) into viral ribonulceoprotein particles (vRNPs). The influenza vRNPs are enclosed within the viral envelope. During cell entry, however, these vRNP complexes are released into the cytoplasm, where they gain access to the host nuclear transport machinery. In order to study the nuclear import of influenza vRNPs and the replication of the influenza genome, it is useful to work with isolated vRNPs so that other components of the virus do not interfere with these processes. Here, we describe a procedure to purify these vRNPs from the influenza A virus. The procedure starts with the disruption of the influenza A virion with detergents in order to release the vRNP complexes from the enveloped virion. The vRNPs are then separated from the other components of the influenza A virion on a 33-70% discontinuous glycerol gradient by velocity sedimentation. The fractions obtained from the glycerol gradient are then analyzed on via SDS-PAGE after staining with Coomassie blue. The peak fractions containing NP are then pooled together and concentrated by centrifugation. After concentration, the integrity of the vRNPs is verified by visualization of the vRNPs by transmission electron microscopy after negative staining. The glycerol gradient purification is a modification of that from Kemler et al. (1994)1, and the negative staining has been performed by Wu et al. (2007).2

The genome of the influenza A virus consists of eight separate complexes of RNA and proteins, termed viral ribonucleoprotein complexes (vRNPs). This paper describes the glycerol gradient purification and transmission electron microscopy visualization of influenza A vRNPs.

Purificação e Visualização de Influenza A complexos de ribonucleoproteínas Viral

The influenza A viral genome consists of eight negative-sense, single stranded RNA molecules, individually packed with multiple copies of the influenza A ...

Biologia

Isolation of Viral Replication Compartment-enriched Sub-nuclear Fractions from Adenovirus-infected Normal Human Cells

During infection of human cells by adenovirus (Ad), the host cell nucleus is dramatically reorganized, leading to formation of nuclear microenvironments through the recruitment of viral and cellular proteins to sites occupied by the viral genome. These sites, called replication compartments (RC), can be considered viral-induced nuclear domains where the viral genome is localized and viral and cellular proteins that participate in replication, transcription and post-transcriptional processing are recruited. Moreover, cellular proteins involved in the antiviral response, such as tumor suppressor proteins, DNA damage response (DDR) components and innate immune response factors are also co-opted to RC. Although RC seem to play a crucial role to promote an efficient and productive replication cycle, a detailed analysis of their composition and associated activities has not been made. To facilitate the study of adenoviral RC and potentially those from other DNA viruses that replicate in the cell nucleus, we adapted a simple procedure based on velocity gradients to isolate Ad RC and established a cell-free system amenable to conduct morphological, functional and compositional studies of these virus-induced subnuclear structures, as well as to study their impact on host-cell interactions.

We provide a novel strategy to isolate viral replication compartments (RC) from adenovirus (Ad)-infected human cells. This approach represents a cell-free system that can help to elucidate the molecular mechanisms regulating viral genome replication and expression as well as regulation of viral-host interactions established at the RC.

Isolamento de Frações Sub-nuclear Viral Replication Compartimento enriquecidas de Adenovirus-infectados células normais Humanos

During infection of human cells by adenovirus (Ad), the host cell nucleus is dramatically reorganized, leading to formation of nuclear microenvironments ...

Combining Analysis of DNA in a Crude Virion Extraction with the Analysis of RNA from Infected Leaves to Discover New Virus Genomes

This metagenome approach is used to identify plant viruses with circular DNA genomes and their transcripts. Often plant DNA viruses that occur in low titers in their host or cannot be mechanically inoculated to another host are difficult to propagate to achieve a greater titer of infectious material. Infected leaves are ground in a mild buffer with optimal pH and ionic composition recommended for purifying most bacilliform Para retroviruses. Urea is used to break up inclusion bodies that trap virions and to dissolve cellular components. Differential centrifugation provides further separation of virions from plant contaminants. Then proteinase K treatment removes the capsids. Then the viral DNA is concentrated and used for next-generation sequencing (NGS). The NGS data are used to assemble contigs which are submitted to NCBI-BLASTn to identify a subset of virus sequences in the generated dataset. In a parallel pipeline, RNA is isolated from infected leaves using a standard column-based RNA extraction method. Then ribosome depletion is carried out to enrich for a subset of mRNA and virus transcripts. Assembled sequences derived from RNA sequencing (RNA-seq) were submitted to NCBI-BLASTn to identify a subset of virus sequences in this dataset. In our study, we identified two related full-length badnavirus genomes in the two datasets. This method is preferred to another common approach which extracts the aggregate population of small RNA sequences to reconstitute plant virus genomic sequences. This latter metagenomic pipeline recovers virus related sequences that are retro-transcribing elements inserted into the plant genome. This is coupled to biochemical or molecular assays to further discern the actively infectious agents. The approach documented in this study, recovers sequences representative of replicating viruses that likely indicate active virus infection.

Here we present a new approach to identify plant viruses with double-strand DNA genomes. We use standard methods to extract DNA and RNA from infected leaves and carry out next-generation sequencing. Bioinformatic tools assemble sequences into contigs, identify contigs representing virus genomes and assign genomes to taxonomic groups.

Combinando a análise de DNA em uma extração do Virion bruto com a análise do RNA das folhas infectadas para descobrir novos vírus de genomas

This metagenome approach is used to identify plant viruses with circular DNA genomes and their transcripts. Often plant DNA viruses that occur in low ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein partners. There are many approaches that allow the identification of interacting partners, including the yeast two hybrid system, as well as pull down assays using recombinant proteins and immunoprecipitation of endogenous proteins followed by mass spectrometry identification1. Recent studies have highlighted the utility of double-affinity tag mediated purification, coupled with two specific elution steps in the identification of interacting proteins. This approach, termed Tandem Affinity Purification (TAP), was initially used in yeast2,3 but more recently has been adapted to use in mammalian cells4-8.
As proof-of-concept we have established a tandem affinity purification (TAP) method using the well-characterized eukaryotic translation initiation factor eIF4E9,10.The cellular translation factor eIF4E is a critical component of the cellular eIF4F complex involved in cap-dependent translation initiation10. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence8. To forgo the need for the generation of clonal cell lines, we developed a rapid system that relies on the expression of the TAP-tagged bait protein from an episomally maintained plasmid based on pMEP4 (Invitrogen). Expression of tagged murine eIF4E from this plasmid was controlled using the cadmium chloride inducible metallothionein promoter.
Lysis of the expressing cells and subsequent affinity purification via binding to rabbit IgG agarose, TEV protease cleavage, binding to streptavidin linked agarose and subsequent biotin elution identified numerous proteins apparently specific to the eIF4E pull-down (when compared to control cell lines expressing the TAP tag alone). The identities of the proteins were obtained by excision of the bands from 1D SDS-PAGE and subsequent tandem mass spectrometry. The identified components included the known eIF4E binding proteins eIF4G and 4EBP-1. In addition, other components of the eIF4F complex, of which eIF4E is a component were identified, namely eIF4A and Poly-A binding protein. The ability to identify not only known direct binding partners as well as secondary interacting proteins, further highlights the utility of this approach in the characterization of proteins of unknown function.

Tandem affinity purification is a robust approach for the identification of protein binding partners. As proof of concept, this methodology was applied to the well-characterized translation initiation factor eIF4E to co-precipitate the host cell factors involved in translation initiation. This method is easily adapted to any cellular or viral protein.

Identificação de parceiros de proteína Interagir utilizando Tandem purificação por afinidade

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

In Vitro Selection of Aptamers to Differentiate Infectious from Non-Infectious Viruses

Virus infections have a major impact on society; most methods of detection have difficulties in determining whether a detected virus is infectious, causing delays in treatment and further spread of the virus. Developing new sensors that can inform on the infectability of clinical or environmental samples will meet this unmet challenge. However, very few methods can obtain sensing molecules that can recognize an intact infectious virus and differentiate it from the same virus that has been rendered non-infectious by disinfection methods. Here, we describe a protocol to select aptamers that can distinguish infectious viruses vs non-infectious viruses using systematic evolution of ligands by exponential enrichment (SELEX). We take advantage of two features of SELEX. First, SELEX can be tailor-made to remove competing targets, such as non-infectious viruses or other similar viruses, using counter selection. Additionally, the whole virus can be used as the target for SELEX, instead of, for example, a viral surface protein. Whole virus SELEX allows for the selection of aptamers that bind specifically to the native state of the virus, without the need to disrupt of the virus. This method thus allows recognition agents to be obtained based on functional differences in the surface of pathogens, which do not need to be known in advance.

We provide a protocol that can be generally applied to select aptamers that bind to infectious viruses only and not to viruses that have been rendered non-infectious by a disinfection method or to any other similar viruses. This opens the possibility of determining infectivity status in portable and rapid tests.

Seleção In Vitro de Aptamers para Diferenciar Vírus Infecciosos de Não-Infecciosos

Virus infections have a major impact on society; most methods of detection have difficulties in determining whether a detected virus is infectious, ...

Bioengenharia

<meta charset="utf8"></head><body>Análise do SARS-CoV-2 usando a tecnologia Dual-Reporter e Multiplex

Profiling of Surface Protein Epitopes on Viral Particles by Multiplex Dual-Reporter Strategy

Membrane proteins on enveloped viruses play an important role in many biological functions involving virus attachment to target cell receptors, fusion of viral particles to host cells, host-virus interactions, and disease pathogenesis. Furthermore, viral membrane proteins on virus particles and presented on host cell surfaces have proven to be excellent targets for antivirals and vaccines. Here, we describe a protocol to investigate surface proteins on intact severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) particles using the dual-reporter flow cytometric system. The assay exploits multiplex technology to obtain a triple detection of viral particles by three independent affinity reactions. Magnetic beads conjugated to recombinant human angiotensin-converting enzyme-2 (ACE2) were used to capture viral particles from the supernatant of cells infected with SARS-CoV-2. Then, two detection reagents labeled with R-phycoerythrin (PE) or Brilliant Violet 421 (BV421) were applied simultaneously. As a proof-of-concept, antibody fragments targeting different epitopes of the SARS-CoV-2 surface protein Spike (S1) were used. The detection of viral particles by three independent affinity reactions provides strong specificity and confirms the capture of intact virus particles. Dose-dependency curves of SARS-CoV-2 infected cell supernatant were generated with replicate coefficient variances (mean/SD) &#706;14%. Good assay performance in both channels confirmed that two virus surface target protein epitopes are detectable in parallel. The protocol described here could be applied for (i) high-multiplex, high-throughput profiling of surface proteins expressed on enveloped viruses; ii) detection of active intact viral particles; and (iii) assessment of specificity and affinity of antibodies and antiviral drugs for surface epitopes of viral antigens.The application can be potentially extended to any type of extracellular vesicles and bioparticles, exposing surface antigens in body fluids or other liquid matrices.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor em destaque: Avançando estratégias antivirais por meio de novas técnicas de imunocaptura e espectrometria de massa

Here, we describe a newly developed multiplex fluorescent immunoassay that uses a dual-reporter flow cytometric system to concurrently detect two unique spike protein epitopes on intact severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) viral particles that had been captured by angiotensin-converting enzyme-2-coupled magnetic microspheres.

Perfil de epítopos de proteínas de superfície em partículas virais por estratégia de repórter duplo multiplex

Membrane proteins on enveloped viruses play an important role in many biological functions involving virus attachment to target cell receptors, fusion of ...

Purificação de DNA Viral para a identificação de proteínas Viral e celulares associadas

Resumo

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Capítulos neste vídeo

Preparação de DNA viral a partir nucleocapsids

Isolamento e Análise do Genoma do vírus da única usando 'Genomics vírus simples'

Purificação por afinidade de Complexos de Influenza Virus ribonucleoproteína da cromatina de células infectadas

Purificação e Visualização de Influenza A complexos de ribonucleoproteínas Viral

Isolamento de Frações Sub-nuclear Viral Replication Compartimento enriquecidas de Adenovirus-infectados células normais Humanos

Combinando a análise de DNA em uma extração do Virion bruto com a análise do RNA das folhas infectadas para descobrir novos vírus de genomas

Identificação de parceiros de proteína Interagir utilizando Tandem purificação por afinidade

Seleção In Vitro de Aptamers para Diferenciar Vírus Infecciosos de Não-Infecciosos

Perfil de epítopos de proteínas de superfície em partículas virais por estratégia de repórter duplo multiplex

Perfil de epítopos de proteínas de superfície em partículas virais por estratégia de repórter duplo multiplex