このプロトコルは、動的共有結合相互作用によるオリゴマー配列の情報指向アセンブリを可能にし、核酸の配列選択的ハイブリダイゼーションを真に模倣するが、インタストランド結合強度を高める。動的共有アセンブリは、通常、債券の再配置とエラー修正のための限られた容量のために、単純なアーキテクチャに制限されています。対照的に、ルイス酸の濃度に沿って結合解離に影響を与え、その後触媒結合の再配列に影響を及ぼすことによって、この技術は、自己集合体系の一般的な運動トラップ限界を緩和する。
この方法は、極めて低い欠陥率を有する共有有機フレームワークから、組織基質の継続的な改造を適応し、収容することができる生体材料組織界にまで、共有結合の再配置反応を利用する様々な分野で採用することができる。この技術を初めて実行すると、長時間のアニーリング時間後でも、個人はキネチックに閉じ込められたアセンブリを見つけることができます。初めてのユーザーは、アルデヒドのみを持つオリゴマーと排他的にアミン残基の間でハイブリダイゼーションを試み、コードされた情報を簡素化し、ハイブリダイゼーションを行うことをお勧めします。
この手順を開始するには、FMOCフォトラビ固体支持樹脂の0.125グラムを重量を量り、フリット自動シンセサイザー反応容器に加えます。シンセサイザーのマイクロ波部分に容器を挿入します。DMFと脱保護ボトルで主溶媒ボトルを20%4-メチルピペリジンの溶液で満たし、廃棄物を空にします。
次に、DMF中のブロモ酢酸およびDICの1つのモル溶液を、配列内の各残留物に対して1.5ミリリットル、酢酸無水物0.47ミリリットルをDMFの4.53ミリリットルにして5ミリリットルのキャッピング溶液を作ります。NMPで使用する各一次アミンの0.5モル溶液を準備します。各溶液の総容積は、適切な第一アミンの各残留物に加えて2.5ミリリットルを加えた2.5ミリリットルであるべきである。
すべてのソリューションを自動シンセサイザーマニホールドに追加します。自動化されたペプチドシンセサイザーを用いて、樹脂を膨らみ、FMOC基を切断し、テキストプロトコルに概説した変位反応を行う。この後、DCEの5%ジクロロジメチルシランの溶液で上部にそれを充填することによって、3ウェイストップコックを装備したフリットガラス反応容器の壁を分化します。
30分間座らせてから、容器を排水し、DCEとメタノールで洗います。容器が乾燥したら、樹脂を転写します。1つの腕を通して窒素ガスでバブリングし、別の腕で真空を引っ張りながら、洗浄ごとに5ミリリットルを使用してDCMで樹脂を3回洗浄します。
樹脂と付属のオリゴペプトイドを脱保護および切断するまで乾燥保存します。続行する準備ができたら、5ミリリットルのDMFを10分間バブリングして1日以上保存した場合は、樹脂を再膨らませます。容器を排出し、ガラスペプチド容器に小さな磁気攪拌棒と乾燥DCMの3ミリリットルを追加します。
パラジウム触媒の0.1当量およびアロック基当たりフェニルシラン当たり25当量を量る。クランプを使用して、樹脂が溶媒に懸濁したまま穏やかな攪拌を受け、DCMが蒸発するのを防ぐために容器をキャップするように、攪拌プレートの上の角度で反応容器を配置します。1時間後、溶液をろ過し、洗浄ごとに5ミリリットルを使用してDCMで3回洗浄します。
その後、もう一度、オロック脱保護を繰り返します。次に、メタノールとDCMで樹脂を順次に2回リンスし、樹脂と磁気攪拌棒を20ミリリットルのバイアルに移します。テキストプロトコルに記載されているように、DMFに樹脂を水没させ、攪拌し、切断します。
次に、シリンジフィルターを使用して、解放されたオリゴペプトイドを樹脂から分離し、真空下で溶媒を除去する。水とアセトニトリルの50-50混合物でペプトイドを再構成し、逆相分理化HPLCで精製する。精製された分画を組み合わせ、凍結し、凍結乾燥させてオフホワイト粉末を生成します。
ESIおよびMALDI質量分析法で粉末を分析します。純度を評価するために、精製されたオリゴペプトイドの分析HPLCを行う。まず、自己集合に用いるオリゴペプトイド配列10ミリモルのストック液と、無水アセトニトリル中のスカンジウムトリフレートの10ミリモルストック溶液を調製する。
各ペプトイドストック溶液の20マイクロリットルを、磁気攪拌棒を装備した3ミリリットルバイアルに加えます。ストック溶液から潜在的アミン結合当たりのスチャンジウムトリフレート溶液の1.5当量を加え、2%の水とアセトニトリル溶液の200マイクロリットルを形成するのに十分な水とアセトニトリルを加えます。アルデヒドのアセチル脱保護とすべてのストランドの解離のために、摂氏70度で2時間静かにかき混ぜます。
この後、200マイクロリットルのクロロホルムと2ミリリットルの水でバイアルを充電します。バイアルを軽く振ります。混合物を少なくとも15分間放置します。
完全な相分離の際、有機層をマイクロリットルシリンジで抽出します。有機層を新しいバイアルに移し、通常6時間かかるオリゴマーアニールのために摂氏70度でかき混ぜます。情報コードされたペプトイドが分子ラダーに配列選択的動的共有体自己集合を受ける能力を実証するために、代表的な鎖を合成し、その相補的なペプトイド配列でハイブリダイズする。
モノマーNPAMとNPALは、最終的な自己組立製品の溶解性を助けるNEEEとの動的共有反応体ペアとして採用されています。固相サブモノマー合成が完了すると、アロック基が除去される。脱保護の前と後に、樹脂の一部を405ナノメートル光下で切断し、エレクトロスプレーイオン化質量分析によって特徴づけられた。
この配列は、HPLCの準備によって精製され、次いで凍結乾燥してオフホワイト粉末を達成し、その純度が分析的なHPLCで確認される。オリゴペプトイドは、その後、MALDI-MSによって確認されたレジストリ内のはしごを買うために、その相補的なシーケンスとハイブリダイズされます。この手順を行う場合、水性分画が透明になるまで層が完全に分離するのに十分な時間を確保することを忘れずに、十分な触媒抽出を確実にするために少なくとも15分。
この組み立て手順を完了した後、質量分析を行い、ハイブリダイゼーションの程度を決定する必要があります。さらに、誘導結合血漿質量分析法またはフッ素NMRを使用して、抽出後のスカンジウム濃度を評価することができる。この技術は最近開発されましたが、私たちの研究に記載されているバイオミメティックアプローチは、複雑なナノ構造の将来の設計と情報指向の組み立てを導くのに役立つことを期待しています。
ここで使用される試薬のいくつかは危険です。これらの薬品やその他の化学物質の取り扱いには注意してください。すべての個人的な保護具を着用し、ヒュームフードの内部のすべての実験を行います。
