Name: assessment of antibody-based drugs effects on murine bone marrow and peritoneal macrophage activation
Uploaded: 2017-12-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Antibody-based Drugs Effects on Murine Bone Marrow and Peritoneal Macrophage Activation at JoVE.com

L.K. は、ブリティッシュ ・ コロンビアの大学 4 年間奨学金 (4YF) 大学院学生の身分賞の受信者です。L.M.S. は消化器のカナダの協会の受信者/クローン病、大腸炎カナダされて新しい調査官給与賞/健康研究、生物医学学者マイケル ・ スミス財団。この作品は、(# CIHR2016 LS を付与) 健康研究のカナダの協会と共同でカナダの血サービスからプロジェクトの助成金によって支えられました。

ここで説明するすべての方法は、制度的動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) ブリティッシュ ・ コロンビアの大学のによって承認されています。
1. 骨髄マクロファージ導出と抗体で活性化
<ol>
	<li>CO2窒息を使用して安楽死を実行します。<ol>
		<li>誘導チャンバー内にマウスを置く。不動と呼吸はゆっくりと深くまで、60-90 s のための 5% イソフルレン麻酔とマウスを安楽死させます。</li>
		<li>イソフルラン麻酔を切りマウスが呼吸を停止するまで 6 ~ 8 リットル/分の CO2を管理します。マウスを残す CO2に、少なくともあと 5 分確認心拍か呼吸が不要になったこと。死を確保するための頚部転位を実行します。 注: 8-12 週古いマウスのマクロファージの最高収量を提供します。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>70% エタノール スプレー マウス足と腕と発泡ボードの上に仰臥位で伸ばして脚を固定します。はさみと皮膚を保持するための鉗子で、後脚のそれぞれの面から皮膚や毛を削除する浅いカット (0.2 cm) を作る。 注: は、無菌フードでこのプロシージャとすべての培養操作を実行します。</li>
	<li>脛骨と大腿骨を表示する筋肉をトリムします。脛骨と大腿骨を骨と足首から股関節のすぐ下の筋肉を切断することによって削除します。可能な限りとして多くの筋肉を切り落とします。</li>
	<li>70% エタノールで骨をスプレーし、蒸発、その後骨フラッシュ媒体 (Iscove の変更ダルベッコ媒体 (IMDM) 10% 牛胎児血清 (FBS)) の 6 ウェル プレートに配置するために 1 分を待ちます。</li>
	<li>骨空洞を露出するように 0.1 cm 足首や大腿骨の一番上の骨を切断することによって骨の両端をトリミングします。骨髄が表示されて 26 ゲージの針は骨の空洞に配置できることを確認します。</li>
	<li>骨と脛骨と大腿骨、膝関節から分離する筋肉をカットします。空洞に 10 mL の注射器に接続されている 26 ゲージの針を挿入します。フラッシュ中骨の 5 mL と 50 mL の円錐管に骨髄をフラッシュします。各 50 mL チューブに 2 つの脛骨と 1 つのマウスからの 2 つの大腿骨をフラッシュします。</li>
	<li>上下にいくつかの時間または渦塊を優しく分散する低速で骨髄をピペットします。骨髄の文字列は、骨髄の小型 (0.5 mm 以下) の斑点に分割する必要があります。フラッシュ中の骨付きを 50 mL の円錐管を埋めます。75 cm2組織培養に円錐形の管のピペット内容はフラスコを扱われ、37 ° c、5% CO2 1 時間孵化させなさい。 注: 成熟マクロファージ、間葉系細胞になるフラスコに付着し必要な造血前駆細胞の懸濁液のまま破棄します。</li>
	<li>造血前駆細胞と培地の 50 mL の円錐管にピペットします。常温 5 分破棄 300 x g でチューブに上清を遠心し、マクロファージコロニー刺激因子 (MCSF) 培養液 5 mL にペレットを再懸濁します (IMDM、10 %fbs、5 ng/mL MCSF、100 U/mL ペニシリン/ストレプトマイシン、および 150 μ Mmonothioglycerol (MTG))。</li>
	<li>検定18を使用してセルをカウントします。中長期 0.5 106セル/mL、30 ml 中の 10 の7セル/フラスコ × 1.5 倍の濃度に細胞を再懸濁し、優しく上下にピペットを追加します。新 75 cm2処理培養フラスコに懸濁液 30 mL のピペットします。</li>
	<li>1.9 のステップで初期培養後 7 日目の 4 日目、細胞が付着し少し分岐逆相明視野顕微鏡を使用することを確認します。非付着性細胞を含む培地を破棄します。IMDM とセルを洗浄して 1 回、MCSF 培養液 30 mL を追加します。</li>
	<li>セルが 10 日で成熟した (&#62; F4/80 の Mac 1 肯定的な 95%)、再度セルがあることを確認付着とわずかに。</li>
	<li>刺激のための細胞をプレート、フラスコから培養液を削除し 8 mL の酵素無料、EDTA を用いた細胞解離バッファー (資材表) を追加します。セル 5% CO2、37 ° C で 5 分間インキュベートします。</li>
	<li>無菌細胞スクレーパーを使用して、圧力の量が少ない細胞を優しくこすり。細胞がフラスコ表面から切断した顕微鏡で確認します。50 mL の円錐管にピペットの解離細胞。3 回 IMDM の 5 mL のフラスコを洗い、収穫された細胞と洗浄液をプールします。5 分間室温で 300 x g で細胞を遠心します。</li>
	<li>MCSF 培地 50 mL の円錐管あたりの 3 mL の細胞ペレットを再懸濁します。検定18を使用して実行可能なセルを数える。96 ウェル組織文化、底が平らなプレートのウェルあたり 1 x 10 の6セル/mL とプレート 100 μ 細胞懸濁液 (1 x 105細胞/ウェル) の濃度で細胞を再懸濁します。 注: 1 つのマウスの骨 100 基の井戸に十分なセルが生成されます。必要な場合は、6 ウェル プレート (組織培養処理、フラット下) でセルの 1 mL をめっきすることが。セル (1 x 10 の6セル) の大きい数は西部のしみの分析の役に立つかもしれません。</li>
	<li>一度付着、帳票の写し井戸各 10 ng/ml の IMDM、IVIg、または IVIg + 組合の 30 mg/mL LP を刺激します。LPS や IVIg の投与量は、応答を最適化する滴定することができます。些細コントロールとして帳票の写しの井戸を残します。24 時間 (37 ° C、5% CO2) それらを孵化させなさい。 注: 再めっきされたセルは、1 時間以内の組織培養井戸に従う必要があります。</li>
	<li>個々 の 1.7 mL 遠心チューブに各ウェルから細胞培養上清を収集し、5 分 10,000 x g で回して任意の粒子状物質を削除します。</li>
	<li>細胞培養上清を取り外して、ペレットを妨害しません。滅菌遠心チューブに上清明らかにセルを配置します。 注: 細胞培養上清がサイトカイン、IL-10、およびサイトカイン サブユニット、IL-12/23 p 40 の酵素免疫測定法 (ELISA)、すぐにによって試金または長期的に-80 ° C で保存します。市販のキット (材料表) から ELISA のプロトコルに従ってください。その他の炎症性サイトカインが試金する、il-6, TNF など IVIg 共同処理による低減 + LPS 刺激と比較すると、単独で LPS 刺激。刺激後、西部にしみが付くことや量的なポリメラーゼの連鎖反応 (PCR-Q) 19,20技術の付着性のセルを用意できます。</li>
</ol>
2. マウスIn Vivo IVIg と腹腔マクロファージを収穫に挑戦
<ol>
	<li>各マウスの重量を量る。</li></ol>IVIg (100 mg/mL のストック濃度) 各マウスの体重 2.5 g/kg の最終的な投与量を提供するために必要な量を計算します。 注: たとえば、20 g のマウスでは、IVIg の 500 μ L 必要です。
	<li>IVIg の必要量を 1 mL の滅菌注射器に滅菌 26 装備描画ゲージの針。IVIg を受け取らないコントロール マウス、滅菌リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)、IVIg ではなく pH 7.4 の等価線量ボリュームを管理します。</li>
	<li>親指と人差し指で首の後ろの皮をつかむと、尾と後ろ足を残りの指で片方の手でマウスの首筋。地面に向かって体を傾けてください。</li>
	<li>右下の象限に、マウスの腹部を基準にして 30-40 ° の角度で針を配置、ベベル、1.5 cm の針を挿入します。IVIg または PBS を腹腔内に挿入します。1 時間を待ちます。</li>
	<li>6-8 L/分 CO2窒息に続いて 5% イソフルレン麻酔とマウスを安楽死させる (1.1.1 - 1.1.2 の手順を参照)、または機関の倫理的なガイドラインによると。</li>
	<li>四肢が広げ、発泡ボードにマウスを固定します。70% のエタノールの部分をスプレーします。 注: は、無菌フードの手順を実行します。</li>
	<li>腹腔内の切断を避けるために、マウスの正中線に沿ってはさみで皮膚 0.2 cm の浅いカットを作る。そのまま腹腔壁のライニングが表示されるので、鉗子を使用してマウスの腹の腹部皮を引き出します。</li>
	<li>滅菌 PBS (pH 7.4) の 5 mL と 5 mL のシリンジを入力します。25 または 27 ゲージの針のベベルとマウスの中心に向かって右側または左側のいずれかからのキャビティの上部に針をします。 注: 置き針慎重にマウスで、臓器が腹膜腔にではなく、PBS を挿入しません。</li>
	<li>液を腹腔内に押し込みます。針を抜く空洞と 10 の腹膜をマッサージいずれかのセルを除去する s。空洞の上部に針を挿入し、臓器を避けてください。収集し、氷の上の 15 mL の円錐管に復元された洗浄液を配置します。 注: 流体注入毎の 5 Ml、約 3.75 mL がリカバリされます。</li>
	<li>注入および回復 (2.8 2.9 の手順) を繰り返して合計で洗浄液 15 mL を回復する (20 mL の総注入量)、回以上 3。それぞれのマウスから別の 15 mL の円錐管に洗浄を収集します。 メモ: 最終的な投与後があります簡単液が蓄積してきたマウスのところ左と右の側面から流体を抽出すること。臓器はこの位置に針が少なくをなります。</li>
	<li>4 ° C で 5 分間 300 x g でセルをスピンダウンします。500 μ L のめっき中で細胞を再懸濁します (IMDM、10 %fbs と 100 U/mL ペニシリン/ストレプトマイシン) フラッシュ マウスあたり。検定18を使用して実行可能なマクロファージをカウントします。 注: マクロファージは他の腹膜の細胞よりも少し大きめになります。典型的な収量は 5 x 105 - 1 × 106マクロファージ/マウス野生型 c57bl/6 マウスを使用です。 オプション: 細胞ペレットに赤血球の数が多いがある場合は、製造元の指示に従って 1 x 赤血球細胞の換散バッファーを使用して、それらを削除する溶解手順を実行します。</li>
	<li>播種で 1 × 106マクロファージ/mL の培地で細胞を再懸濁します、96 ウェル平底処理組織培養プレートのウェルあたり 100 μ L をプレートします。 注: プールが必要になる場合がありますトリプリケート井戸や覚醒剤の滴定の実験を使用して場合の 1 つ以上のマウスから細胞。たとえば、1 つのマウスは、5 x 105マクロファージを持っていた、めっき中の 500 μ L は必要になります。5 井戸または 1 実験 1 LPS 投与で、重複での十分なセルがあります。</li>
	<li>細胞大食細胞になることを許可するように 5% CO2 37 ° C で 1 時間インキュベート付着。付着性のセルは、腹腔マクロファージです。細胞培養上清、非付着性のセルを削除します。200 μ L IMDM (37 ° C に加温) で 2 回井戸を洗い流し、10 を待つ s プレートをゆっくりと傾ける。メッキ媒体を交換してください。37 ° C、5% CO2刺激前に 30 分で細胞を孵化させなさい。</li>
	<li>10 ng/ml の IMDM、LP のマクロファージを刺激するかコントロールとして、安静のまま。24 時間インキュベートを収集し、明確に elisa 法による IL 10 サイトカイン解析のためのセル清 (1.16 1.17 の手順を参照してください)。市販のキット (材料表) から ELISA のプロトコルに従ってください。 注: 刺激後付着性のセルは西部のしみや PCR などの手法を用意できます。</li>

3. マウスin Vivo IVIg + LPS および腹腔マクロファージを収穫に挑戦
<ol>
	<li>各マウスの重量を量る。IVIg (100 mg/mL のストック濃度) 体重 2.5 g/kg の最終的な投与量を提供するために必要な量を計算します。0.2 μ g/g の体重の最終的な投与量を提供するために必要な LP (IMDM ストック濃度 100 μ g/mL) の量を計算します。 注: たとえば、20 g のマウスでは、IVIg 原液を 500 μ l 添加し、LPS の 100 μ g/mL 溶液 40 μ L 必要です。</li>
	<li>IVIg の必要量を描画し、1 mL の滅菌注射器滅菌 26 装備に LPS ゲージの針。IVIg を受け取らないコントロール マウス、滅菌 PBS pH 7.4 の IVIg の相当量を交換してください。</li>
	<li>親指と人差し指で首の後ろの皮をつかむと、尾と後ろ足を残りの指で片方の手でマウスの首筋。地面に向かって体を傾けてください。</li>
	<li>針マウスの腹部、右下の象限を基準にして 30-40 ° の角度で、ベベルし 1.5 cm。 挿入、IVIg + LP、または PBS + LP を挿入、腹腔と手順で 2.4 の場所。</li>
	<li>1 時間後 2.5 2.10 の手順を実行することによって腹腔マクロファージを収穫します。</li>
	<li>4 ° C で 5 分間 300 x g でセルをスピンダウンします。回復された洗浄液の 1 mL を削除製造元の指示に従って IL-10 と IL-12/23 p 40 elisa 法による解析に使用したり、将来分析-80 ° C で凍結します。 注意: 洗浄液サイトカイン解析する試験治療間の比較を正確にするにはに、腹腔内の 5 mL flushs が 15 mL の最終巻の 4 回実行します。すべての流体は、各フラッシュから回復されます。</li>
	<li>2.11 の手順を再懸濁しますそして実行可能なマクロファージをカウントします。 注: マクロファージは他の腹膜の細胞よりも少し大きめになります。</li></ol>典型的な収量は 5 x 105 - 1 × 106マクロファージ/マウス野生型 c57bl/6 マウスを使用です。 オプション: 細胞ペレットに赤血球の数が多いがある場合ステップ 2.11 のように、それらを削除するための製造元の指示に従って溶解手順を実行します。
	<li>2.12 の手順、再播種培地で細胞を中断します。 注: 実験の 1 つ以上のマウスからプールのセルに必要になる可能性があります。たとえば、1 つのマウスは、5 x 105マクロファージを持っていた、めっき中の 500 μ L は必要になります。</li>
	<li>2.13 のように細胞にマクロファージを許可する 37 ° C 5% CO2で 1 時間インキュベート付着。</li>
	<li>収集し、すべての腹腔細胞から 1.14 1.15、手順に従って、馴化培地を明らかにします。 注: サンプルすぐに使用または凍結し、elisa 法によるサイトカイン解析-80 ° C で保存します。</li>
	<li>2.11、手順を実行が、24 h 物質の細胞を孵化させなさい。収集し、ELISA によるサイトカイン解析のための手順、1.16 1.17 に従って細胞の培養上清を明らかにします。 注: 手順 1.16 1.17 と 2.14 のように西部のしみや PCR など技術のセルを用意できます。</li>

<ol>
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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+macrophages+induced+by+infliximab+are+involved+in+healing+in+vivo+and+in+vitro.">Regulatory macrophages induced by infliximab are involved in healing in vivo and in vitro.</a> Inflamm Bowel Dis. 18 (3), 401-408 (2012).</li><li>Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolation+and+characterization+of+murine+macrophages.">The isolation and characterization of murine macrophages.</a> Curr Protoc Immunol. , (2008).</li><li>Gerber, J. S., Mosser, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversing+lipopolysaccharide+toxicity+by+ligating+the+macrophage+Fc+gamma+receptors.">Reversing lipopolysaccharide toxicity by ligating the macrophage Fc gamma receptors.</a> J Immunol. 166 (11), 6861-6868 (2001).</li><li>Durandy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravenous+immunoglobulins--understanding+properties+and+mechanisms.">Intravenous immunoglobulins--understanding properties and mechanisms.</a> Clin Exp Immunol. 158, 2-13 (2009).</li><li>Jolles, S., Sewell, W. A., Misbah, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+uses+of+intravenous+immunoglobulin.">Clinical uses of intravenous immunoglobulin.</a> Clin Exp Immunol. 142 (1), 1-11 (2005).</li><li>Murakami, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravenous+immunoglobulin+preparation+prevents+the+production+of+pro-inflammatory+cytokines+by+modulating+NF&#954;B+and+MAPKs+pathways+in+the+human+monocytic+THP-1+cells+stimulated+with+procalcitonin.">Intravenous immunoglobulin preparation prevents the production of pro-inflammatory cytokines by modulating NF&#954;B and MAPKs pathways in the human monocytic THP-1 cells stimulated with procalcitonin.</a> Inflamm Res. 63 (9), 711-718 (2014).</li></ol>

著者はある利益相反を開示します。

マクロファージ活性化状態は、恒常性と疾患22を組織と両方で重要な役割を果たします。マクロファージはその微小環境3の手掛かりによって、アクティブ化の状態の重複だけでなく、個別に持つことができます。炎症性応答のすべての段階に個別の役割がある: 病原体に対する防衛、創傷治癒と組織の反発、また炎症性応答2 をオフにすること...

大食細胞は自然免疫系細胞、感染症やけがに免疫応答における複数の役割を果たすです。マクロファージは、感染、組織の損傷に免疫応答を開始する、炎症性応答を停止、治癒反応1を推進します。3 つの最適勉強マクロファージ活性化状態の例としては、: 1) マクロファージがインターフェロン γ (肝腎) と細菌リポポリサッカライド (LPS)、炎症性応答に貢献する M (肝腎 + LP) を指定2) マクロファージ インターロイキン 4 (IL-4)、M(IL-4)、刺激治療の応答に関連付けられています。3) マクロファージ免疫複合体 (IC) で刺激や LP、M (IC + LP)、炎症性応答の2,3を無効にする能力を持っています。M (IC + LP) M(IL-4) 治癒マクロファージ、異なっているし、酵素アルギナーゼ (Arg-1) または FIZZ14を表現しないでください。これらの抗炎症マクロファージの最高のマーカーは、そのサイトカイン生産5です。マクロファージは、健康を維持するために複数のロールを持つが、炎症性疾患やがん3にも貢献。このため、マクロファージが様々 な疾患の治療のためキーの治療上のターゲットです。抗体マクロファージによる疾患治療法の開発に、活性化状態を検討することが重要です。
本稿の焦点はマウス骨髄由来マクロファージ (BMDMs) とマクロファージ炎症性応答体外と体内に抗体医薬の効果をテストするための使用です。最近、マクロファージ活性化6,7,8抗体の効果を示す複数の調査がずっとあります。共同のマクロファージ免疫複合体、抗体抗原および LP、通常炎症性刺激との複合体であると抗炎症サイトカイン、IL-10、およびプロ炎症性サイトカインの非常に低レベルの非常に高いレベルを生成します。インターロイキン 12 (IL-12)9。また、インフリキシマブ、tnf α、抗体、一部、そのフラグメント結晶 (Fc) 地域7を介して抗炎症大食細胞を誘導することによって動作するように発見されています。我々 は IVIg + LP が m (IC + LP)、共同誘導マクロファージが大量の IL-10 およびプロ炎症性サイトカイン サブユニット インターロイキン 12 の 23 p40 (少量を生成する前記のような抗炎症マクロファージの活性化を誘導することを報告しています。IL-12/23p40)、インターロイキン-6 (IL-6)、および TNF8。IVIg は、1,000 以上のドナー10の血からプールされて主に IgG ポリクローナル抗体から成る薬です。さまざまな慢性的な脱髄性多発性神経障害、特発性血小板減少性紫斑病などの免疫疾患の治療に使用されますが、その作用メカニズムは完全に理解11ではないです。マクロファージ活性化に基づく抗体医薬の効果は、ここに説明する方法を使用して評価できます。
BMDMs と腹腔マクロファージ マクロファージ活性化の特定の生物学的製剤の効果をテストできます。これらのマクロファージのソースを使用すると、一次電池の評価ができます。培養細胞における抗体の予備的なテストより少ない時間と他の時間がかかり、高価な疾患モデルよりも金銭的投資が必要です。健康なマウス生体内で薬を注入すると細胞を分離する前のヴィヴォそれらを分析、研究、生物学的製剤による治療疾患モデルにおけるマクロファージ活性化に影響を与えるかどうかを評価するために保証されているを決定できます。
マクロファージ活性化in vitroとin vivoでの生物学的製剤の効果を直接テストいくつかの研究は、当社の技術は代替技術上の優位性を提供します。現在の技術を含む混合細胞集団の in vitro、ひと末梢血単核細胞、マクロファージにリンパ球混合培養反応 (MLR) や IVIg におけるインフリキシマブの効果などに対するテストの生物学的薬剤の効果、効果特定のセル型7,12に起因することはできません。炎症性サイトカインを生成しない、RAW264.7 細胞など細胞株を使用してで有利である BMDMs および腹腔マクロファージを用いた IL-12 組合8,13に対応。血清サイトカイン レベル14 を測定することによって大食細胞の応答を推定のではなく、サイトカインは、マクロファージに直接帰することができるので利点がありますマクロファージ反応前のヴィヴォにおよぼす抗体創をテスト.BMDMs と腹腔マクロファージを派生し、抗炎症のマクロファージ活性化におけるタンパク質の特定の役割を決定する遺伝子組み換えマウスから分離できます。たとえば、 Il10欠乏を使いました(-/-) BMDMs IVIg がプロ炎症性サイトカイン産生の還元反応は IL-108に部分的に依存します。薬の作用機序は、ウェスタンブロット、特定の蛋白質のシグナル伝達における役割を決定ことができますを使用して調べることができます。BMDMs または腹腔マクロファージ活性化抗体に起因する遺伝子発現のパターンを表示するには、量的なポリメラーゼの連鎖反応 (qPCR) を実行できます。マウスの病態モデルは炎症性腸疾患、関節リウマチ、癌15,16,のような病気のモデルで抗体を用いた生物学的治療の潜在的な有効性に関する情報を提供できます。17します。 ただし、ここで説明する方法に関する情報を提供これらのバイオ医薬品の作用機序彼らは抗炎症マクロファージ活性を誘導するかどうかを決定することによって。

<table><tbody><tr><td>Iscove&amp;rsquo;s modified Dulbecco&amp;rsquo;s medium (IMDM)</td><td>Life technologies</td><td>12440053</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Life technologies</td><td>12483-020</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant murine macrophage colony stimulating factor (MCSF)</td><td>Stemcell technologies</td><td>78059</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin</td><td>Life technologies</td><td>15140148</td><td></td></tr><tr><td>Monothioglycerol (MTG)</td><td>Sigma</td><td>88640</td><td></td></tr><tr><td>1X red blood cell lysis buffer</td><td>eBioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell dissociation buffer</td><td>Life technologies</td><td>13150016</td><td>Enzyme-Free, Hanks&#039;s-based, EDTA</td></tr><tr><td>Lipopolysaccharide (LPS)</td><td>Sigma aldrich</td><td>L 4516</td><td>From E. coli 0127:B8</td></tr><tr><td>IVIg (Gammunex)</td><td>Grifols</td><td>Received from BC Children&#039;s Hospital, Transfusion Medicine</td><td></td></tr><tr><td>IVIg (Gammagard liquid)</td><td>Baxter Healthcare Corporation</td><td>Received from BC Children&#039;s Hospital, Transfusion Medicine</td><td></td></tr><tr><td>IVIg (Octagam)</td><td>Octapharma</td><td>Received from BC Children&#039;s Hospital, Transfusion Medicine</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS) (sterile), pH 7.4</td><td>Life technologies</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>mouse IL-10 ELISA</td><td>BD biosciences</td><td>555252</td><td></td></tr><tr><td>mouse IL-12/23p40 ELISA</td><td>BD biosciences</td><td>555165</td><td></td></tr><tr><td>anti-Erk1/2 antibody</td><td>Cell signalling technology</td><td>9101</td><td></td></tr><tr><td>anti-pp38 antibody</td><td>Cell signalling technology</td><td>9211</td><td></td></tr><tr><td>anti-GAPDH antibody</td><td>Fitzgerald industries</td><td>10R-G109A</td><td></td></tr><tr><td>26 g needle</td><td>BD biosciences</td><td>305110</td><td></td></tr><tr><td>1 mL syringe</td><td>BD biosciences</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>10 mL syringe</td><td>BD biosciences</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>15 mL conical tube</td><td>BD biosciences</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>50 mL conical tube</td><td>BD biosciences</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>microcentrifuge tube (1.7 mL)</td><td>Diamed</td><td>SPE155-N</td><td></td></tr><tr><td>75 cm&lt;sup&gt;2 &lt;/sup&gt;tissue culture treated flask</td><td>BD biosciences</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>Cell scraper</td><td>BD biosciences</td><td>353085</td><td></td></tr><tr><td>Forcepts</td><td>VWR</td><td>82027-386</td><td>fine tip, dissecting&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Scissors</td><td>VWR</td><td>82027-582</td><td>Delicate, 4 &lt;sup&gt;1&lt;/sup&gt;/&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&quot;</td></tr><tr><td>Brightfield microscope</td><td>Motic</td><td>AE31</td><td>Inverted phase contrast</td></tr><tr><td>Scale&amp;nbsp;</td><td>Mettler&amp;nbsp;</td><td>PE 3000</td><td></td></tr></tbody></table>

assessment of antibody-based drugs effects on murine bone marrow and peritoneal macrophage activation

マクロファージは、食細胞の自然免疫系の細胞、病原体に対する免疫応答を開始し、癒しと組織の反発に貢献。マクロファージは炎症性応答をオフにする均等に重要であります。マクロファージの免疫グロブリン (IVIg) で刺激が (IL-10)、抗炎症サイトカイン、インターロイキン 10 の多量、細菌リポ多糖 (応答のプロ炎症性サイトカインの低レベルを作り出すことができることを示したLPS)。IVIg は多価抗体は、主に免疫グロブリン (Igg)、Gs は以上 1,000 の献血者のプラズマからプールです。免疫不全症患者における抗体を補完する、または自己免疫・炎症性疾患患者の免疫応答を抑制するものです。インフリキシマブ治療抗腫瘍の壊死の要因アルファ (tnf α) 抗体は、マクロファージ炎症性の刺激への応答の IL-10 を生成するアクティブにも示されています。IVIg と他の抗体を用いた生物は、マクロファージ活性化に及ぼす影響を確認するテストできます。本稿では、派生、刺激との in vitro抗体によるマウス骨髄マクロファージと抗体の生体内で活性化マウス腹腔マクロファージの評価法について説明します。最後に、我々 は特定の細胞シグナル伝達に抗炎症マクロファージ活性経路の寄与を決定する西部にしみが付く使用を示します。これらのプロトコルは、特定の蛋白の抗炎症マクロファージ活性化に及ぼす影響を決定する遺伝子改変マウスを使用できます。これらのテクニックは、特定生物製剤は大食細胞を炎症反応で生体を減らす IL 10 生産抗炎症活性化状態に変更することにより行動できるかどうかを評価するためにも使用できます。これはマウスの病態モデルの中に生物学的製剤の有効性のマクロファージ活性化の役割に関する情報を提供し、人々 の行動の潜在的な新しいメカニズムへの洞察力を提供できます。逆に、これに警告するかもしれない特定抗体を用いた生物学的製剤の使用に対して感染症を治療するためにマクロファージがその感染に対する宿主防御において重要な役割を果たす場合に特に。

マウス骨骨髄由来マクロファージは、骨髄の造血細胞前駆体から培養することができます。骨髄吸引から大腿骨および脛骨 1 つ c57bl/6 マウスの通常プールをもたらす 107骨髄由来マクロファージ、それらにマクロファージ実験のための便利なソースを作るします。BMDMs は、ベース抗体薬物反応を炎症性刺激体外挑戦されたときをテストする使用できます?...

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Assessment of Antibody-based Drugs Effects on Murine Bone Marrow and Peritoneal Macrophage Activation

抗体創薬が炎症性疾患の治療に革命をもたらしました。特定のターゲットに対する直接的な効果だけでなく、抗体は抗炎症になる大食細胞をアクティブ化できます。このプロトコルを記述する方法抗炎症マクロファージ活性化は評価in vitroマウス骨髄マクロファージと生体内のマクロファージを使用して使用することができます。

マウス骨髄と腹腔マクロファージ活性化抗体を用いた薬剤効果の評価

Macrophages are phagocytic innate immune cells, which initiate immune responses to pathogens and contribute to healing and tissue restitution. Macrophages ...

assessment-antibody-based-drugs-effects-on-murine-bone-marrow

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

8.2K ビュー.  University of British Columbia. 抗体創薬が炎症性疾患の治療に革命をもたらしました。特定のターゲットに対する直接的な効果だけでなく、抗体は抗炎症になる大食細胞をアクティブ化できます。このプロトコルを記述する方法抗炎症マクロファージ活性化は評価in vitroマウス骨髄マクロファージと生体内のマクロファージを使用して使用することができます。

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Depletion and Reconstitution of Macrophages in Mice

Macrophages are critical players in the innate immune response to infectious challenge or injury, initiating the innate immune response and directing the acquired immune response. Macrophage dysfunction can lead to an inability to mount an appropriate immune response and as such, has been implicated in many disease processes, including inflammatory bowel diseases. Macrophages display polarized phenotypes that are broadly divided into two categories. Classically activated macrophages, activated by stimulation with IFN&gamma; or LPS, play an essential role in response to bacterial challenge whereas alternatively activated macrophages, activated by IL-4 or IL-13, participate in debris scavenging and tissue remodeling and have been implicated in the resolution phase of inflammation. During an inflammatory response in vivo, macrophages are found amid a complex mixture of infiltrating immune cells and may participate by exacerbating or resolving inflammation. To define the role of macrophages in situ in a whole animal model, it is necessary to examine the effect of depleting macrophages from the complex environment. To ask questions about the role of macrophage phenotype in situ, phenotypically defined polarized macrophages can be derived ex vivo, from bone marrow aspirates and added back to mice, with or without prior depletion of macrophages. In the protocol presented here clodronate-containing liposomes, versus PBS injected controls, were used to deplete colonic macrophages during dextran sodium sulfate (DSS)-induced colitis in mice. In addition, polarized macrophages were derived ex vivo and transferred to mice by intravenous injection. A caveat to this approach is that clodronate-containing liposomes deplete all professional phagocytes, including both dendritic cells and macrophages so to ensure the effect observed by depletion is macrophage-specific, reconstitution of phenotype by adoptive transfer of macrophages is necessary. Systemic macrophage depletion in mice can also be achieved by backcrossing mice onto a CD11b-DTR background, which is an excellent complementary approach. The advantage of clodronate-containing liposome-mediated depletion is that it does not require the time and expense involved in backcrossing mice and it can be used in mice regardless of the background of the mice (C57BL/6, BALB/c, or mixed background).

Macrophages play a central role in homeostasis and pathology in many tissues. The protocol presented here describes methods for depleting macrophages in vivo, deriving polarized macrophages from bone marrow aspirates, and adoptively transferring macrophages into mice. These techniques allow determination of the role that polarized macrophages play in health and disease.

マウスのマクロファージの枯渇と再構成

Macrophages are critical players in the innate  immune response to infectious challenge or injury, initiating the innate immune  response and directing ...

免疫・感染学

Investigation of Macrophage Polarization Using Bone Marrow Derived Macrophages

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic stem/progenitor cells from the bone marrow are directed into monocytic differentiation, followed by M1 or M2 stimulation. The activation status can be tracked by changes in cell surface antigens, gene expression and cell signaling pathways.

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic stem/progenitor cells from the bone marrow are directed into monocytic differentiation, followed by M1 or M2 stimulation. The activation status can be tracked by changes in cell surface antigens, gene expression and cell signaling pathways.

骨髄由来マクロファージを用いたマクロファージ分極の調査

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic ...

Bone Marrow-derived Macrophage Production

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because of their powerful microbicidal activities. Macrophages are widely distributed throughout the body and are present in the lymphoid organs, liver, lungs, gastrointestinal tract, central nervous system, bone, and skin. Because of their repartition, they participate in a wide range of physiological and pathological processes. Macrophages are highly versatile cells that are able to recognize microenvironmental alterations and to maintain tissue homeostasis. Numerous pathogens have evolved mechanisms to use macrophages as Trojan horses to survive, replicate in, and infect both humans and animals and to propagate throughout the body. The recent explosion of interest in evolutionary, genetic, and biochemical aspects of host-pathogen interactions has renewed scientific attention regarding macrophages. Here, we describe a procedure to isolate and cultivate macrophages from murine bone marrow that will provide large numbers of macrophages for studying host-pathogen interactions as well as other processes.

Macrophages have long been recognized as a critical component of the innate and adaptive immune responses. The recent explosion of knowledge pertaining to evolutionary, genetic, and biochemical aspects of the interaction between macrophages and microbes has renewed scientific attention to macrophages. This article describes a method to differentiate macrophages from mouse bone marrow.

骨髄由来マクロファージの生産

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because ...

Isolation of Murine Peritoneal Macrophages to Carry Out Gene Expression Analysis Upon Toll-like Receptors Stimulation

During infection and inflammation, circulating monocytes leave the bloodstream and migrate into tissues, where they differentiate into macrophages. Macrophages express surface Toll-like receptors (TLRs), which recognize molecular patterns conserved through evolution in a wide range of microorganisms. TLRs play a central role in macrophage activation which is usually associated with gene expression alteration. Macrophages are critical in many diseases and have emerged as attractive targets for therapy. In the following protocol, we describe a procedure to isolate murine peritoneal macrophages using Brewer&#8217;s thioglycollate medium. The latter will boost monocyte migration into the peritoneum, accordingly this will raise macrophage yield by 10-fold. Several studies have been carried out using bone marrow, spleen or peritoneal derived macrophages. However, peritoneal macrophages were shown to be more mature upon isolation and are more stable in their functionality and phenotype. Thus, macrophages isolated from murine peritoneal cavity present an important cell population that can serve in different immunological and metabolic studies. Once isolated, macrophages were stimulated with different TLR ligands and consequently&#160;gene expression was evaluated.

We describe here a simple protocol to isolate murine peritoneal macrophages. This procedure is followed by RNA extraction to carry out gene expression analysis upon Toll-like receptors stimulation.

Toll様受容体刺激時の遺伝子発現解析を行うためにマウス腹腔マクロファージの単離

During infection and inflammation, circulating monocytes leave the bloodstream and migrate into tissues, where they differentiate into macrophages. ...

Detection of Inflammasome Activation and Pyroptotic Cell Death in Murine Bone Marrow-derived Macrophages

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote inflammatory and autoinflammatory diseases. Inflammasomes are activated by cytosolic pattern recognition receptors, including members of the NOD-like receptor (NLR) family. These receptors oligomerize upon the detection of microbial or damage-associated stimuli. Subsequent recruitment of the adaptor protein ASC forms a microscopically visible inflammasome complex, which activates caspase-1 through proximity-induced auto-activation. Following the activation, caspase-1 cleaves pro-IL-1&#946; and pro-IL-18, leading to the activation and secretion of these pro-inflammatory cytokines. Caspase-1 also mediates the inflammatory form of cell death termed pyroptosis, which features the loss of membrane integrity and cell lysis. Caspase-1 cleaves gasdermin D, releasing the N-terminal fragment which forms plasma membrane pores, leading to osmotic lysis.
In vitro, the activation of caspase-1 can be determined by labeling bone marrow-derived macrophages with the caspase-1 activity probe FAM-YVAD-FMK and by labeling the cells with antibodies against the adaptor protein ASC. This technique allows the identification of inflammasome formation and caspase-1 activation in individual cells using fluorescence microscopy. Pyroptotic cell death can be detected by measuring the release of cytosolic lactate dehydrogenase into the medium. This procedure is simple, cost effective and performed in a 96-well plate format, allowing adaptation for screening. In this manuscript, we show that activation of the NLRP3 inflammasome by nigericin leads to the co-localization of the adaptor protein ASC and active caspase-1, leading to pyroptosis.

We describe the detection of NLRP3 inflammasome activation on cellular basis using fluorescence microscopy and staining for active caspase-1 and the adaptor, ASC. A lactate dehydrogenase release assay is presented to detect pyroptotic lysis on a population basis. These techniques can be adapted to study many aspects of inflammasome biology.

インフラマソーム活性化とマウス骨髄由来マクロファージにおける Pyroptotic の細胞死の検出

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote ...

Effect of Anti-c-fms Antibody on Osteoclast Formation and Proliferation of Osteoclast Precursor In Vitro

Bone remodeling is a complex process and it involves periods of deposition and resorption. Bone resorption is a process by which bone is broken down by osteoclasts in response to different stimuli. Osteoclast precursors differentiate into multinuclear osteoclasts in response to macrophage colony stimulating factor (M-CSF) and receptor activator of nuclear factor Kappa-B ligand (RANKL). Under pathologic conditions, the cytokine profile is different and involves a mixture of inflammatory cytokines. Tumor necrosis factor alpha (TNF-&#945;) is one of the most important cytokines as it is found in large amounts in areas involved with inflammatory osteolysis. The purpose of this protocol is to provide a method by which murine bone marrow is isolated to generate osteoclasts through induction with M-CSF and either RANKL or TNF-&#945; which will be subsequently inhibited by increasing doses of anti-c-fms antibody, the receptor for M-CSF. This experiment highlights the therapeutic value of anti-c-fms antibody in diseases of inflammatory bone resorption.

This protocol includes dissection of murine long bones and bone marrow isolation, to generate bone marrow macrophages and produce osteoclasts using macrophage colony stimulating factor (M-CSF) and receptor activator of nuclear factor Kappa-B ligand (RANKL) or tumor necrosis factor alpha (TNF-&#945;) and their arrest by anti-c-fms antibody, M-CSF receptor.

破骨細胞形成と培養破骨細胞前駆体の増殖に及ぼす抗 c-fms 抗体

Bone remodeling is a complex process and it involves periods of deposition and resorption. Bone resorption is a process by which bone is broken down by ...

Isolation and Culture of Bone Marrow-Derived Macrophages from Mice

Macrophages have important effector functions in homeostasis and inflammation. These cells are present in every tissue in the body and have the important ability to change their profile according to the stimuli present in the microenvironment. Cytokines can profoundly affect macrophage physiology, especially IFN-&#947; and interleukin 4, generating M1 and M2 types respectively. Because of the versatility of these cells, the production of a population of bone marrow-derived macrophages can be a basic step in many experimental models of cell biology. The aim of this protocol is to help researchers in the isolation and culture of macrophages derived from bone marrow progenitors. Bone marrow progenitors from pathogen-free C57BL/6 mice are transformed into macrophages upon exposure to macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) that, in this protocol, is obtained from the supernatant of the murine fibroblast lineage L-929. After incubation, mature macrophages are available for use from the 7th to the 10th day. A single animal can be the source of approximately 2 x 107 macrophages. Therefore, it is an ideal protocol for obtaining large amounts of primary macrophages using basic methods of cell culture.

The present protocol describes the isolation and culture of bone marrow-derived macrophages from mice.

マウス由来骨髄由来マクロファージの単離と培養

Macrophages have important effector functions in homeostasis and inflammation. These cells are present in every tissue in the body and have the important ...

Prediction of Red Blood Cell Antibody Significance Using the Monocyte-Macrophage Assay

Derived from monocytes in the bone marrow, macrophages are large, innate immune cells that play a major role in clearing dead cells, debris, tumor cells, and foreign pathogens. The phagocytic capacity of monocytes versus macrophages is a concept that is not well understood. Here, we aim to examine a difference in the phagocytosis of monocytes versus macrophages, specifically M1/M2 macrophages, against various opsonized red cells using a modified and updated version of the established monocyte monolayer assay (MMA). Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were isolated from donor buffy coats. Using purified monocytes, inflammatory M1 and anti-inflammatory M2 macrophages were produced by in vitro culture and polarization. M1/M2 cells were harvested and used in an MMA-like assay, which we refer to as the M-MA, to decipher clinically significant phagocytosis of various red cell antibodies. A phagocytic index (PI) &#62; 5 was deemed clinically significant phagocytosis with the use of monocytes. A phagocytic index (PI) &#62; 12 was deemed clinically significant phagocytosis with the use of M1/M2 macrophages. M2 macrophages demonstrate an increased ability to phagocytose opsonized RBCs compared to monocytes and M1s. The same weak antibody (anti-S) yields significant phagocytosis with only M2 macrophages (PI=43) but not M1s (PI=2) or monocytes (PI=0), and this was demonstrated repeatedly using various antibodies. The use of M2 macrophages instead of monocytes may allow for more accurate results as these cells are more phagocytic, offering further clinical relevance to the assay. Further studies with different antibodies to red blood cells, including validation of the monocyte-macrophage assay (M-MA) with antibodies having known clinical significance, may show the M-MA&#160;more useful to help predict clinically significant red cell alloantibodies and transfusion reactions. This method will advance the field of transfusion medicine and immunology.

We have developed enhancements and updated methods for the existing monocyte-monolayer assay (MMA), in which macrophages are used to help better predict the clinical relevance of red cell alloantibodies in transfusion medicine and immunology. This assay is named the monocyte-macrophage assay (M-MA).

単球マクロファージアッセイを用いた赤血球抗体の意義の予測

Derived from monocytes in the bone marrow, macrophages are large, innate immune cells that play a major role in clearing dead cells, debris, tumor cells, ...

Activation of Mouse Bone Marrow-Derived Macrophages in Response to Antibodies

Source: Kozicky, L. et al., <a href="https://app.jove.com/v/56689">Assessment of Antibody-based Drugs Effects on Murine Bone Marrow and Peritoneal Macrophage Activation.</a> J. Vis. Exp. (2017)
In this video, we demonstrate the activation of bone marrow-derived macrophages in response to bacterial lipopolysaccharide and intravenous immunoglobulin.

抗体に応答したマウス骨髄由来マクロファージの活性化

Source: Kozicky, L. et al., Assessment of Antibody-based Drugs Effects on Murine Bone Marrow and Peritoneal Macrophage Activation. J. Vis. Exp. (2017)
In ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

免疫学

免疫反応

ホスト防御メカニズム

In Vivo Activation of Peritoneal Macrophages in Response to Antibodies in a Murine Model

Source: Kozicky, L., et al., <a href="https://app.jove.com/v/56689">Assessment of Antibody-based Drugs Effects on Murine Bone Marrow and Peritoneal Macrophage Activation.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2017)
This video demonstrates the activation of a mouse&#39;s peritoneal macrophages using intravenous immunoglobulin and bacterial lipopolysaccharide. The co-stimulation activates the peritoneal macrophages into anti-inflammatory macrophages possessing immune regulatory activity.

マウスモデルにおける抗体に応答した腹膜マクロファージのin vivo活性化

Source: Kozicky, L., et al., Assessment of Antibody-based Drugs Effects on Murine Bone Marrow and Peritoneal Macrophage Activation.&#160;J. Vis. Exp. ...