L.K. は、ブリティッシュ ・ コロンビアの大学 4 年間奨学金 (4YF) 大学院学生の身分賞の受信者です。L.M.S. は消化器のカナダの協会の受信者/クローン病、大腸炎カナダされて新しい調査官給与賞/健康研究、生物医学学者マイケル ・ スミス財団。この作品は、(# CIHR2016 LS を付与) 健康研究のカナダの協会と共同でカナダの血サービスからプロジェクトの助成金によって支えられました。

ここで説明するすべての方法は、制度的動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) ブリティッシュ ・ コロンビアの大学のによって承認されています。
1. 骨髄マクロファージ導出と抗体で活性化
<ol>
	<li>CO2窒息を使用して安楽死を実行します。<ol>
		<li>誘導チャンバー内にマウスを置く。不動と呼吸はゆっくりと深くまで、60-90 s のための 5% イソフルレン麻酔とマウスを安楽死させます。</li>
		<li>イソフルラン麻酔を切りマウスが呼吸を停止するまで 6 ~ 8 リットル/分の CO2を管理します。マウスを残す CO2に、少なくともあと 5 分確認心拍か呼吸が不要になったこと。死を確保するための頚部転位を実行します。 注: 8-12 週古いマウスのマクロファージの最高収量を提供します。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>70% エタノール スプレー マウス足と腕と発泡ボードの上に仰臥位で伸ばして脚を固定します。はさみと皮膚を保持するための鉗子で、後脚のそれぞれの面から皮膚や毛を削除する浅いカット (0.2 cm) を作る。 注: は、無菌フードでこのプロシージャとすべての培養操作を実行します。</li>
	<li>脛骨と大腿骨を表示する筋肉をトリムします。脛骨と大腿骨を骨と足首から股関節のすぐ下の筋肉を切断することによって削除します。可能な限りとして多くの筋肉を切り落とします。</li>
	<li>70% エタノールで骨をスプレーし、蒸発、その後骨フラッシュ媒体 (Iscove の変更ダルベッコ媒体 (IMDM) 10% 牛胎児血清 (FBS)) の 6 ウェル プレートに配置するために 1 分を待ちます。</li>
	<li>骨空洞を露出するように 0.1 cm 足首や大腿骨の一番上の骨を切断することによって骨の両端をトリミングします。骨髄が表示されて 26 ゲージの針は骨の空洞に配置できることを確認します。</li>
	<li>骨と脛骨と大腿骨、膝関節から分離する筋肉をカットします。空洞に 10 mL の注射器に接続されている 26 ゲージの針を挿入します。フラッシュ中骨の 5 mL と 50 mL の円錐管に骨髄をフラッシュします。各 50 mL チューブに 2 つの脛骨と 1 つのマウスからの 2 つの大腿骨をフラッシュします。</li>
	<li>上下にいくつかの時間または渦塊を優しく分散する低速で骨髄をピペットします。骨髄の文字列は、骨髄の小型 (0.5 mm 以下) の斑点に分割する必要があります。フラッシュ中の骨付きを 50 mL の円錐管を埋めます。75 cm2組織培養に円錐形の管のピペット内容はフラスコを扱われ、37 ° c、5% CO2 1 時間孵化させなさい。 注: 成熟マクロファージ、間葉系細胞になるフラスコに付着し必要な造血前駆細胞の懸濁液のまま破棄します。</li>
	<li>造血前駆細胞と培地の 50 mL の円錐管にピペットします。常温 5 分破棄 300 x g でチューブに上清を遠心し、マクロファージコロニー刺激因子 (MCSF) 培養液 5 mL にペレットを再懸濁します (IMDM、10 %fbs、5 ng/mL MCSF、100 U/mL ペニシリン/ストレプトマイシン、および 150 μ Mmonothioglycerol (MTG))。</li>
	<li>検定18を使用してセルをカウントします。中長期 0.5 106セル/mL、30 ml 中の 10 の7セル/フラスコ × 1.5 倍の濃度に細胞を再懸濁し、優しく上下にピペットを追加します。新 75 cm2処理培養フラスコに懸濁液 30 mL のピペットします。</li>
	<li>1.9 のステップで初期培養後 7 日目の 4 日目、細胞が付着し少し分岐逆相明視野顕微鏡を使用することを確認します。非付着性細胞を含む培地を破棄します。IMDM とセルを洗浄して 1 回、MCSF 培養液 30 mL を追加します。</li>
	<li>セルが 10 日で成熟した (&#62; F4/80 の Mac 1 肯定的な 95%)、再度セルがあることを確認付着とわずかに。</li>
	<li>刺激のための細胞をプレート、フラスコから培養液を削除し 8 mL の酵素無料、EDTA を用いた細胞解離バッファー (資材表) を追加します。セル 5% CO2、37 ° C で 5 分間インキュベートします。</li>
	<li>無菌細胞スクレーパーを使用して、圧力の量が少ない細胞を優しくこすり。細胞がフラスコ表面から切断した顕微鏡で確認します。50 mL の円錐管にピペットの解離細胞。3 回 IMDM の 5 mL のフラスコを洗い、収穫された細胞と洗浄液をプールします。5 分間室温で 300 x g で細胞を遠心します。</li>
	<li>MCSF 培地 50 mL の円錐管あたりの 3 mL の細胞ペレットを再懸濁します。検定18を使用して実行可能なセルを数える。96 ウェル組織文化、底が平らなプレートのウェルあたり 1 x 10 の6セル/mL とプレート 100 μ 細胞懸濁液 (1 x 105細胞/ウェル) の濃度で細胞を再懸濁します。 注: 1 つのマウスの骨 100 基の井戸に十分なセルが生成されます。必要な場合は、6 ウェル プレート (組織培養処理、フラット下) でセルの 1 mL をめっきすることが。セル (1 x 10 の6セル) の大きい数は西部のしみの分析の役に立つかもしれません。</li>
	<li>一度付着、帳票の写し井戸各 10 ng/ml の IMDM、IVIg、または IVIg + 組合の 30 mg/mL LP を刺激します。LPS や IVIg の投与量は、応答を最適化する滴定することができます。些細コントロールとして帳票の写しの井戸を残します。24 時間 (37 ° C、5% CO2) それらを孵化させなさい。 注: 再めっきされたセルは、1 時間以内の組織培養井戸に従う必要があります。</li>
	<li>個々 の 1.7 mL 遠心チューブに各ウェルから細胞培養上清を収集し、5 分 10,000 x g で回して任意の粒子状物質を削除します。</li>
	<li>細胞培養上清を取り外して、ペレットを妨害しません。滅菌遠心チューブに上清明らかにセルを配置します。 注: 細胞培養上清がサイトカイン、IL-10、およびサイトカイン サブユニット、IL-12/23 p 40 の酵素免疫測定法 (ELISA)、すぐにによって試金または長期的に-80 ° C で保存します。市販のキット (材料表) から ELISA のプロトコルに従ってください。その他の炎症性サイトカインが試金する、il-6, TNF など IVIg 共同処理による低減 + LPS 刺激と比較すると、単独で LPS 刺激。刺激後、西部にしみが付くことや量的なポリメラーゼの連鎖反応 (PCR-Q) 19,20技術の付着性のセルを用意できます。</li>
</ol>
2. マウスIn Vivo IVIg と腹腔マクロファージを収穫に挑戦
<ol>
	<li>各マウスの重量を量る。</li></ol>IVIg (100 mg/mL のストック濃度) 各マウスの体重 2.5 g/kg の最終的な投与量を提供するために必要な量を計算します。 注: たとえば、20 g のマウスでは、IVIg の 500 μ L 必要です。
	<li>IVIg の必要量を 1 mL の滅菌注射器に滅菌 26 装備描画ゲージの針。IVIg を受け取らないコントロール マウス、滅菌リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)、IVIg ではなく pH 7.4 の等価線量ボリュームを管理します。</li>
	<li>親指と人差し指で首の後ろの皮をつかむと、尾と後ろ足を残りの指で片方の手でマウスの首筋。地面に向かって体を傾けてください。</li>
	<li>右下の象限に、マウスの腹部を基準にして 30-40 ° の角度で針を配置、ベベル、1.5 cm の針を挿入します。IVIg または PBS を腹腔内に挿入します。1 時間を待ちます。</li>
	<li>6-8 L/分 CO2窒息に続いて 5% イソフルレン麻酔とマウスを安楽死させる (1.1.1 - 1.1.2 の手順を参照)、または機関の倫理的なガイドラインによると。</li>
	<li>四肢が広げ、発泡ボードにマウスを固定します。70% のエタノールの部分をスプレーします。 注: は、無菌フードの手順を実行します。</li>
	<li>腹腔内の切断を避けるために、マウスの正中線に沿ってはさみで皮膚 0.2 cm の浅いカットを作る。そのまま腹腔壁のライニングが表示されるので、鉗子を使用してマウスの腹の腹部皮を引き出します。</li>
	<li>滅菌 PBS (pH 7.4) の 5 mL と 5 mL のシリンジを入力します。25 または 27 ゲージの針のベベルとマウスの中心に向かって右側または左側のいずれかからのキャビティの上部に針をします。 注: 置き針慎重にマウスで、臓器が腹膜腔にではなく、PBS を挿入しません。</li>
	<li>液を腹腔内に押し込みます。針を抜く空洞と 10 の腹膜をマッサージいずれかのセルを除去する s。空洞の上部に針を挿入し、臓器を避けてください。収集し、氷の上の 15 mL の円錐管に復元された洗浄液を配置します。 注: 流体注入毎の 5 Ml、約 3.75 mL がリカバリされます。</li>
	<li>注入および回復 (2.8 2.9 の手順) を繰り返して合計で洗浄液 15 mL を回復する (20 mL の総注入量)、回以上 3。それぞれのマウスから別の 15 mL の円錐管に洗浄を収集します。 メモ: 最終的な投与後があります簡単液が蓄積してきたマウスのところ左と右の側面から流体を抽出すること。臓器はこの位置に針が少なくをなります。</li>
	<li>4 ° C で 5 分間 300 x g でセルをスピンダウンします。500 μ L のめっき中で細胞を再懸濁します (IMDM、10 %fbs と 100 U/mL ペニシリン/ストレプトマイシン) フラッシュ マウスあたり。検定18を使用して実行可能なマクロファージをカウントします。 注: マクロファージは他の腹膜の細胞よりも少し大きめになります。典型的な収量は 5 x 105 - 1 × 106マクロファージ/マウス野生型 c57bl/6 マウスを使用です。 オプション: 細胞ペレットに赤血球の数が多いがある場合は、製造元の指示に従って 1 x 赤血球細胞の換散バッファーを使用して、それらを削除する溶解手順を実行します。</li>
	<li>播種で 1 × 106マクロファージ/mL の培地で細胞を再懸濁します、96 ウェル平底処理組織培養プレートのウェルあたり 100 μ L をプレートします。 注: プールが必要になる場合がありますトリプリケート井戸や覚醒剤の滴定の実験を使用して場合の 1 つ以上のマウスから細胞。たとえば、1 つのマウスは、5 x 105マクロファージを持っていた、めっき中の 500 μ L は必要になります。5 井戸または 1 実験 1 LPS 投与で、重複での十分なセルがあります。</li>
	<li>細胞大食細胞になることを許可するように 5% CO2 37 ° C で 1 時間インキュベート付着。付着性のセルは、腹腔マクロファージです。細胞培養上清、非付着性のセルを削除します。200 μ L IMDM (37 ° C に加温) で 2 回井戸を洗い流し、10 を待つ s プレートをゆっくりと傾ける。メッキ媒体を交換してください。37 ° C、5% CO2刺激前に 30 分で細胞を孵化させなさい。</li>
	<li>10 ng/ml の IMDM、LP のマクロファージを刺激するかコントロールとして、安静のまま。24 時間インキュベートを収集し、明確に elisa 法による IL 10 サイトカイン解析のためのセル清 (1.16 1.17 の手順を参照してください)。市販のキット (材料表) から ELISA のプロトコルに従ってください。 注: 刺激後付着性のセルは西部のしみや PCR などの手法を用意できます。</li>

3. マウスin Vivo IVIg + LPS および腹腔マクロファージを収穫に挑戦
<ol>
	<li>各マウスの重量を量る。IVIg (100 mg/mL のストック濃度) 体重 2.5 g/kg の最終的な投与量を提供するために必要な量を計算します。0.2 μ g/g の体重の最終的な投与量を提供するために必要な LP (IMDM ストック濃度 100 μ g/mL) の量を計算します。 注: たとえば、20 g のマウスでは、IVIg 原液を 500 μ l 添加し、LPS の 100 μ g/mL 溶液 40 μ L 必要です。</li>
	<li>IVIg の必要量を描画し、1 mL の滅菌注射器滅菌 26 装備に LPS ゲージの針。IVIg を受け取らないコントロール マウス、滅菌 PBS pH 7.4 の IVIg の相当量を交換してください。</li>
	<li>親指と人差し指で首の後ろの皮をつかむと、尾と後ろ足を残りの指で片方の手でマウスの首筋。地面に向かって体を傾けてください。</li>
	<li>針マウスの腹部、右下の象限を基準にして 30-40 ° の角度で、ベベルし 1.5 cm。 挿入、IVIg + LP、または PBS + LP を挿入、腹腔と手順で 2.4 の場所。</li>
	<li>1 時間後 2.5 2.10 の手順を実行することによって腹腔マクロファージを収穫します。</li>
	<li>4 ° C で 5 分間 300 x g でセルをスピンダウンします。回復された洗浄液の 1 mL を削除製造元の指示に従って IL-10 と IL-12/23 p 40 elisa 法による解析に使用したり、将来分析-80 ° C で凍結します。 注意: 洗浄液サイトカイン解析する試験治療間の比較を正確にするにはに、腹腔内の 5 mL flushs が 15 mL の最終巻の 4 回実行します。すべての流体は、各フラッシュから回復されます。</li>
	<li>2.11 の手順を再懸濁しますそして実行可能なマクロファージをカウントします。 注: マクロファージは他の腹膜の細胞よりも少し大きめになります。</li></ol>典型的な収量は 5 x 105 - 1 × 106マクロファージ/マウス野生型 c57bl/6 マウスを使用です。 オプション: 細胞ペレットに赤血球の数が多いがある場合ステップ 2.11 のように、それらを削除するための製造元の指示に従って溶解手順を実行します。
	<li>2.12 の手順、再播種培地で細胞を中断します。 注: 実験の 1 つ以上のマウスからプールのセルに必要になる可能性があります。たとえば、1 つのマウスは、5 x 105マクロファージを持っていた、めっき中の 500 μ L は必要になります。</li>
	<li>2.13 のように細胞にマクロファージを許可する 37 ° C 5% CO2で 1 時間インキュベート付着。</li>
	<li>収集し、すべての腹腔細胞から 1.14 1.15、手順に従って、馴化培地を明らかにします。 注: サンプルすぐに使用または凍結し、elisa 法によるサイトカイン解析-80 ° C で保存します。</li>
	<li>2.11、手順を実行が、24 h 物質の細胞を孵化させなさい。収集し、ELISA によるサイトカイン解析のための手順、1.16 1.17 に従って細胞の培養上清を明らかにします。 注: 手順 1.16 1.17 と 2.14 のように西部のしみや PCR など技術のセルを用意できます。</li>

<ol>
	<li>Murray, P. J., Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+and+pathogenic+functions+of+macrophage+subsets.">Protective and pathogenic functions of macrophage subsets.</a> Nat Rev Immunol. 11 (11), 723-737 (2011).</li><li>Martinez, F. O., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+M1+and+M2+paradigm+of+macrophage+activation:+time+for+reassessment.">The M1 and M2 paradigm of macrophage activation: time for reassessment.</a> F1000Prime Rep. 6, 13 (2014).</li><li>Mosser, D. M., Edwards, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+full+spectrum+of+macrophage+activation.">Exploring the full spectrum of macrophage activation.</a> Nat Rev Immunol. 8 (12), 958-969 (2008).</li><li>Edwards, J. P., Zhang, X., Frauwirth, K. A., Mosser, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+functional+characterization+of+three+activated+macrophage+populations.">Biochemical and functional characterization of three activated macrophage populations.</a> J Leukoc Biol. 80 (6), 1298-1307 (2006).</li><li>Mosser, D. M., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+murine+macrophages.">Activation of murine macrophages.</a> Curr Protoc Immunol. , (2008).</li><li>Gallo, P., Gon&#231;alves, R., Mosser, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+IgG+density+and+macrophage+Fc+(gamma)+receptor+cross-linking+on+phagocytosis+and+IL-10+production.">The influence of IgG density and macrophage Fc (gamma) receptor cross-linking on phagocytosis and IL-10 production.</a> Immunol Lett. 133 (2), 70-77 (2010).</li><li>Vos, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-tumor+necrosis+factor-&#945;+antibodies+induce+regulatory+macrophages+in+an+Fc+region-dependent+manner.">Anti-tumor necrosis factor-&#945; antibodies induce regulatory macrophages in an Fc region-dependent manner.</a> Gastroenterology. 140 (1), 221-230 (2011).</li><li>Kozicky, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravenous+immunoglobulin+skews+macrophages+to+an+anti-inflammatory,+IL-10-producing+activation+state.">Intravenous immunoglobulin skews macrophages to an anti-inflammatory, IL-10-producing activation state.</a> J Leukoc Biol. 98 (6), 983-994 (2015).</li><li>Sutterwala, F. S., Noel, G. J., Salgame, P., Mosser, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversal+of+proinflammatory+responses+by+ligating+the+macrophage+Fcgamma+receptor+type+I.">Reversal of proinflammatory responses by ligating the macrophage Fcgamma receptor type I.</a> J Exp Med. 188 (1), 217-222 (1998).</li><li>Nimmerjahn, F., Ravetch, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antiinflammatory+activity+of+IgG:+the+intravenous+IgG+paradox.">The antiinflammatory activity of IgG: the intravenous IgG paradox.</a> J Exp Med. 204 (1), 11-15 (2007).</li><li>Gelfand, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravenous+immune+globulin+in+autoimmune+and+inflammatory+diseases.">Intravenous immune globulin in autoimmune and inflammatory diseases.</a> N Engl J Med. 368 (8), 777 (2013).</li><li>Andersson, J., Skans&#233;n-Saphir, U., Sparrelid, E., Andersson, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravenous+immune+globulin+affects+cytokine+production+in+T+lymphocytes+and+monocytes/macrophages.">Intravenous immune globulin affects cytokine production in T lymphocytes and monocytes/macrophages.</a> Clin Exp Immunol. 104, 10-20 (1996).</li><li>Saito, S., Matsuura, M., Hirai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+lipopolysaccharide-induced+interleukin-12+production+by+activation+of+repressor+element+GA-12+through+hyperactivation+of+the+ERK+pathway.">Regulation of lipopolysaccharide-induced interleukin-12 production by activation of repressor element GA-12 through hyperactivation of the ERK pathway.</a> Clin Vaccine Immunol. 13 (8), 876-883 (2006).</li><li>Cao, S., Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-kappaB1+(p50)+homodimers+differentially+regulate+pro-+and+anti-inflammatory+cytokines+in+macrophages.">NF-kappaB1 (p50) homodimers differentially regulate pro- and anti-inflammatory cytokines in macrophages.</a> J Biol Chem. 281 (36), 26041-26050 (2006).</li><li>Neurath, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+targets+for+mucosal+healing+and+therapy+in+inflammatory+bowel+diseases.">New targets for mucosal healing and therapy in inflammatory bowel diseases.</a> Mucosal Immunol. 7 (1), 6-19 (2014).</li><li>Bryant, A., Moore, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rituximab+and+its+potential+for+the+treatment+of+rheumatoid+arthritis.">Rituximab and its potential for the treatment of rheumatoid arthritis.</a> Ther Clin Risk Manag. 2 (2), 207-212 (2006).</li><li>Weiner, L. M., Surana, R., Wang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies:+versatile+platforms+for+cancer+immunotherapy.">Monoclonal antibodies: versatile platforms for cancer immunotherapy.</a> Nat Rev Immunol. 10 (5), 317-327 (2010).</li><li>Louis, K. S., Siegel, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+viability+analysis+using+trypan+blue:+manual+and+automated+methods.">Cell viability analysis using trypan blue: manual and automated methods.</a> Methods Mol Biol. 740, 7-12 (2011).</li><li>Liu, Z. Q., Mahmood, T., Yang, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blot:+technique,+theory+and+trouble+shooting.">Western blot: technique, theory and trouble shooting.</a> N Am J Med Sci. 6 (3), 160 (2014).</li><li>Nolan, T., Hands, R. E., Bustin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+mRNA+using+real-time+RT-PCR.">Quantification of mRNA using real-time RT-PCR.</a> Nat Protoc. 1 (3), 1559-1582 (2006).</li><li>Lucas, M., Zhang, X., Prasanna, V., Mosser, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ERK+activation+following+macrophage+FcgammaR+ligation+leads+to+chromatin+modifications+at+the+IL-10+locus.">ERK activation following macrophage FcgammaR ligation leads to chromatin modifications at the IL-10 locus.</a> J Immunol. 175 (1), 469-477 (2005).</li><li>Murray, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+activation+and+polarization:+nomenclature+and+experimental+guidelines.">Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines.</a> Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).</li><li>Anderson, C. F., Gerber, J. S., Mosser, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+macrophage+function+with+IgG+immune+complexes.">Modulating macrophage function with IgG immune complexes.</a> J Endotoxin Res. 8 (6), 477-481 (2002).</li><li>Sutterwala, F. S., Noel, G. J., Clynes, R., Mosser, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+suppression+of+interleukin-12+induction+after+macrophage+receptor+ligation.">Selective suppression of interleukin-12 induction after macrophage receptor ligation.</a> J Exp Med. 185 (11), 1977-1985 (1997).</li><li>Riquelme, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFN-&#947;-induced+iNOS+expression+in+mouse+regulatory+macrophages+prolongs+allograft+survival+in+fully+immunocompetent+recipients.">IFN-&#947;-induced iNOS expression in mouse regulatory macrophages prolongs allograft survival in fully immunocompetent recipients.</a> Mol Ther. 21 (2), 409-422 (2013).</li><li>Vos, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+macrophages+induced+by+infliximab+are+involved+in+healing+in+vivo+and+in+vitro.">Regulatory macrophages induced by infliximab are involved in healing in vivo and in vitro.</a> Inflamm Bowel Dis. 18 (3), 401-408 (2012).</li><li>Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolation+and+characterization+of+murine+macrophages.">The isolation and characterization of murine macrophages.</a> Curr Protoc Immunol. , (2008).</li><li>Gerber, J. S., Mosser, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversing+lipopolysaccharide+toxicity+by+ligating+the+macrophage+Fc+gamma+receptors.">Reversing lipopolysaccharide toxicity by ligating the macrophage Fc gamma receptors.</a> J Immunol. 166 (11), 6861-6868 (2001).</li><li>Durandy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravenous+immunoglobulins--understanding+properties+and+mechanisms.">Intravenous immunoglobulins--understanding properties and mechanisms.</a> Clin Exp Immunol. 158, 2-13 (2009).</li><li>Jolles, S., Sewell, W. A., Misbah, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+uses+of+intravenous+immunoglobulin.">Clinical uses of intravenous immunoglobulin.</a> Clin Exp Immunol. 142 (1), 1-11 (2005).</li><li>Murakami, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravenous+immunoglobulin+preparation+prevents+the+production+of+pro-inflammatory+cytokines+by+modulating+NF&#954;B+and+MAPKs+pathways+in+the+human+monocytic+THP-1+cells+stimulated+with+procalcitonin.">Intravenous immunoglobulin preparation prevents the production of pro-inflammatory cytokines by modulating NF&#954;B and MAPKs pathways in the human monocytic THP-1 cells stimulated with procalcitonin.</a> Inflamm Res. 63 (9), 711-718 (2014).</li></ol>

著者はある利益相反を開示します。

マクロファージ活性化状態は、恒常性と疾患22を組織と両方で重要な役割を果たします。マクロファージはその微小環境3の手掛かりによって、アクティブ化の状態の重複だけでなく、個別に持つことができます。炎症性応答のすべての段階に個別の役割がある: 病原体に対する防衛、創傷治癒と組織の反発、また炎症性応答2 をオフにすることが重要です明確な抗炎症活性化状態にあります。.抗炎症マクロファージ活性化には、抗炎症サイトカイン、IL-10、およびプロ炎症性サイトカイン IL 1223などの少量の大量に生産する大食細胞の 2 つの外部刺激が必要です。抗体 Fc のガンマの受容体を介して作用から来る 1 つの信号と 2 つ目の信号、LPS や肝腎などのプロ炎症性刺激24,25。マクロファージ8,23,25,26で高 IL-10-水田抗炎症活性化状態を誘導するためには、抗 tnf α 抗体、免疫複合体血清のすべてを発見されています。私たちのグループは、マウス骨髄由来マクロファージとマクロファージの IVIg 刺激も IL-10 と少しにないプロ炎症性 IL-12/23 p 40 組合8に応えて大量を生成することに以前公開しています。また、他のプロ炎症性サイトカイン TNF, il-6 が骨髄由来マクロファージ8も IVIg による減少が発見しました。マウス BMDMs と腹腔マクロファージin vitroとin vivoで他の抗体による薬物応答をテストするのには、ここで説明する方法を適用できます。
マウス骨髄のマクロファージ抗体を用いた治療法のテストで多くの重要な手順があります。無菌性の維持は、各プロトコルにとって重要です。マクロファージの文化は空気、毛皮、またはマウスの糞便からの微生物で汚染されている場合、マクロファージは炎症性サイトカインを生産することによってそれらの刺激に対応します。バイオ セーフティ キャビネットのすべての実験を実行する、エタノール、マウスを自由にスプレーと腹膜フラッシュ中に腸の整合性の確保が欠かせません。抗体は、製造元の指示に従って格納され、滅菌にも保たれなければなりません。それは、それは汚染された、有効期限切れ、または濁った場合に使用できません。濁度は、薬剤の有効性を減らすし、薬適切な温度で保存されていないまたは余りに長くのために格納されている場合に発生することができます。IVIg は 4 ° C で保存し、IL 10 生産のレベルが影響を受けるので、期限に達する前にのみ使用できます。また、私たちは応答に影響しない、-20 ° C で凍結されることができることを見てきました。一方、図 1のように、IVIg ブランド製剤の種類はマクロファージの異なる応答を引き起こす可能性が、IVIg の異なった多くは同様の実験結果に します。エッセンシャル コントロールなど些細細胞、そして細胞刺激抗体だけで、各実験ではマクロファージまたは薬物汚染を排除するために含める必要があります。
実験をカスタマイズするこれらの議定書にいくつかの変更を行うことが。非炎症性の状態に十分な大規模な実験のためマクロファージを分離することは困難ことです。腹腔マクロファージは、thioglycollate (TG) の腹腔内投与によって誘発することができます。免疫反応が発生すると、および誘発マクロファージ 4 日後収穫27をすることができます。募集のマクロファージは成熟度も低く、私たちここでは、重要な考慮事項であるを使用している、常駐の細胞を表さない。TG 誘発マクロファージがまた TG スープは、貪食27に関する実験を行う場合は特に合併症がありますから寒天を内面化しています。さまざまな遺伝的背景、C57BL/6 または BALB/c マウス実験も使用できます、特定の遺伝的背景を必要とする疾患モデルで評価される大食細胞の応答に抗体の影響を調べるため選択可能性があります。さらに、我々 は私たち自身の仕事8に行っているIl10-/-マウスなどの遺伝子改変マウスを薬の作用メカニズムの特定の蛋白質の機能を評価するために使用可能性があります。さまざまな炎症性刺激は、マクロファージ活性化における抗体の影響を評価するためにも使用できます。肝腎、および受容体 (TLR) アゴニスト (ヒアルロン酸など) のような派生ホスト フリー ダイヤルは、IL 10 生産マクロファージ25,28をアクティブに使用されています。重要な考慮事項は、抗体の投与量です。抗体とサプライヤー間異なる線量必要があります文化と動物実験で最適な線量を求める滴定。選ばれた線量は人間に与えられる線量を反映する必要がありますもと薬間で異なります。IVIg はこれらプロトコル29,30で使用される滴定された用量を反映した高用量 (25-35 mg/mL または 2 g/kg 体重)、抗炎症療法として与えられます。
骨髄および腹腔マクロファージの使用制限があります。マクロファージ細胞株以上の改善、マウス BMDMs、造血前駆細胞からまだ人工的に派生セルです。大食細胞の in vitroの免疫応答をテスト理解の抗体応答に重要なステップですが、生体内で実験も実行する必要があります。刺激体内細胞の体外培養続いて注入抗体創薬も病気の状態で抗炎症マクロファージをアクティブにできるかどうかを調査するための将来の研究のための詳細を提供できます。これらの実験から何に抗体を用いた生物学的製剤を受けている人は、結論を出せない。いくつかの研究は、IVIg のひと単球由来マクロファージの培養に及ぼす影響を評価するために公開されています。IVIg が共同組合だけで12の刺激と比較して lps 刺激されるとき、IL-6 ひと単球の in vitroの生産数の減少を報告されています。IVIg が減り tnf α、il-6 産生 THP 1 ひと単球性プロカルシトニン (PCT) で刺激したとき細胞31。
本稿内プロトコルには、既存のメソッド上の利点があります。骨髄由来マクロファージとマクロファージは主細胞、マウスから直接ではなく細胞を不死化されています。マウス マクロファージ様細胞株 RAW264.7 細胞などは、賛成して炎症性サイトカインを生成しない IL-12 LP への応答では、IVIg8,13レスポンス内で生成される IL-10 で規制されている重要なサイトカインです。薬物体内lps テスト分析を通してローカル腹膜の環境洗浄液、腹膜の細胞と具体的には、マクロファージの薬の効果の検討を許可します。短期的には、病気のより長くより高価な動物モデルにおけるマクロファージ活性化の抗体の非特異的作用の検討を正当化するための重要な情報を提供することができます単純なモデルです。エンドトキシン血症モデルの実験的測定はしばしばだけマウスの生存率やサイトカイン血清14の上利点があります。生存率と血清サイトカインは、免疫応答の貴重な対策が、彼らを表示しない貢献マクロファージを具体的に持つことができます。分離及び培養マクロファージ挑戦実験から、抗体医薬がマクロファージに直接測定可能な影響を示しています。
これらのメソッドには、アプリケーションのテストおよび生物学的製剤の設計があります。抗体の治療薬としての使用は近年劇的に増加しています。ただし、これらの治療法には、マクロファージは抗体の Fc 部分を認識しサイトカイン生産を変えることができます、追加の不明な効果があります。IL-10 を誘導し、その Fc 部分を介して T 細胞の増殖を抑制する抗 tnf α 抗体インフリキシマブが示されているし、それがアクション7,15,26のメカニズムの一つとして提案されています。遺伝的モデルを使用すると、特定の蛋白質がこれらの薬は、マクロファージ活性化に影響を与えるメカニズムに関与することができます。抗体の調製及び IgG 抗体のクラスは、生物学的製剤でのマクロファージの影響を変更する変更できます。準備のことや、同じ抗体医薬 (IVIg) のストレージことができますマクロファージ活性化に及ぼす影響に影響を与えます。このペーパー内のメソッドは、がん治療中に食餌を維持するために重要な抗炎症マクロファージが腫瘍の進行を促進するかもしれない可能性がありますこれらの効果がない治療を設計する使用できます。これらの技術は、設計および必要であればこれらの効果を持っている薬の評価にも使えます。たとえば、マクロファージ炎症性応答を減らす、抗炎症の IL 10 生産マクロファージ炎症性腸疾患やリウマチ性関節炎の治療を強化するを作成して有益なことがあります。

大食細胞は自然免疫系細胞、感染症やけがに免疫応答における複数の役割を果たすです。マクロファージは、感染、組織の損傷に免疫応答を開始する、炎症性応答を停止、治癒反応1を推進します。3 つの最適勉強マクロファージ活性化状態の例としては、: 1) マクロファージがインターフェロン γ (肝腎) と細菌リポポリサッカライド (LPS)、炎症性応答に貢献する M (肝腎 + LP) を指定2) マクロファージ インターロイキン 4 (IL-4)、M(IL-4)、刺激治療の応答に関連付けられています。3) マクロファージ免疫複合体 (IC) で刺激や LP、M (IC + LP)、炎症性応答の2,3を無効にする能力を持っています。M (IC + LP) M(IL-4) 治癒マクロファージ、異なっているし、酵素アルギナーゼ (Arg-1) または FIZZ14を表現しないでください。これらの抗炎症マクロファージの最高のマーカーは、そのサイトカイン生産5です。マクロファージは、健康を維持するために複数のロールを持つが、炎症性疾患やがん3にも貢献。このため、マクロファージが様々 な疾患の治療のためキーの治療上のターゲットです。抗体マクロファージによる疾患治療法の開発に、活性化状態を検討することが重要です。
本稿の焦点はマウス骨髄由来マクロファージ (BMDMs) とマクロファージ炎症性応答体外と体内に抗体医薬の効果をテストするための使用です。最近、マクロファージ活性化6,7,8抗体の効果を示す複数の調査がずっとあります。共同のマクロファージ免疫複合体、抗体抗原および LP、通常炎症性刺激との複合体であると抗炎症サイトカイン、IL-10、およびプロ炎症性サイトカインの非常に低レベルの非常に高いレベルを生成します。インターロイキン 12 (IL-12)9。また、インフリキシマブ、tnf α、抗体、一部、そのフラグメント結晶 (Fc) 地域7を介して抗炎症大食細胞を誘導することによって動作するように発見されています。我々 は IVIg + LP が m (IC + LP)、共同誘導マクロファージが大量の IL-10 およびプロ炎症性サイトカイン サブユニット インターロイキン 12 の 23 p40 (少量を生成する前記のような抗炎症マクロファージの活性化を誘導することを報告しています。IL-12/23p40)、インターロイキン-6 (IL-6)、および TNF8。IVIg は、1,000 以上のドナー10の血からプールされて主に IgG ポリクローナル抗体から成る薬です。さまざまな慢性的な脱髄性多発性神経障害、特発性血小板減少性紫斑病などの免疫疾患の治療に使用されますが、その作用メカニズムは完全に理解11ではないです。マクロファージ活性化に基づく抗体医薬の効果は、ここに説明する方法を使用して評価できます。
BMDMs と腹腔マクロファージ マクロファージ活性化の特定の生物学的製剤の効果をテストできます。これらのマクロファージのソースを使用すると、一次電池の評価ができます。培養細胞における抗体の予備的なテストより少ない時間と他の時間がかかり、高価な疾患モデルよりも金銭的投資が必要です。健康なマウス生体内で薬を注入すると細胞を分離する前のヴィヴォそれらを分析、研究、生物学的製剤による治療疾患モデルにおけるマクロファージ活性化に影響を与えるかどうかを評価するために保証されているを決定できます。
マクロファージ活性化in vitroとin vivoでの生物学的製剤の効果を直接テストいくつかの研究は、当社の技術は代替技術上の優位性を提供します。現在の技術を含む混合細胞集団の in vitro、ひと末梢血単核細胞、マクロファージにリンパ球混合培養反応 (MLR) や IVIg におけるインフリキシマブの効果などに対するテストの生物学的薬剤の効果、効果特定のセル型7,12に起因することはできません。炎症性サイトカインを生成しない、RAW264.7 細胞など細胞株を使用してで有利である BMDMs および腹腔マクロファージを用いた IL-12 組合8,13に対応。血清サイトカイン レベル14 を測定することによって大食細胞の応答を推定のではなく、サイトカインは、マクロファージに直接帰することができるので利点がありますマクロファージ反応前のヴィヴォにおよぼす抗体創をテスト.BMDMs と腹腔マクロファージを派生し、抗炎症のマクロファージ活性化におけるタンパク質の特定の役割を決定する遺伝子組み換えマウスから分離できます。たとえば、 Il10欠乏を使いました(-/-) BMDMs IVIg がプロ炎症性サイトカイン産生の還元反応は IL-108に部分的に依存します。薬の作用機序は、ウェスタンブロット、特定の蛋白質のシグナル伝達における役割を決定ことができますを使用して調べることができます。BMDMs または腹腔マクロファージ活性化抗体に起因する遺伝子発現のパターンを表示するには、量的なポリメラーゼの連鎖反応 (qPCR) を実行できます。マウスの病態モデルは炎症性腸疾患、関節リウマチ、癌15,16,のような病気のモデルで抗体を用いた生物学的治療の潜在的な有効性に関する情報を提供できます。17します。 ただし、ここで説明する方法に関する情報を提供これらのバイオ医薬品の作用機序彼らは抗炎症マクロファージ活性を誘導するかどうかを決定することによって。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1312px;" width="1311">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Iscove&#8217;s modified Dulbecco&#8217;s medium (IMDM)</td>
			<td style="width:209px;">Life technologies</td>
			<td style="width:408px;">12440053</td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:209px;">Life technologies</td>
			<td style="width:408px;">12483-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Recombinant murine macrophage colony stimulating factor (MCSF)</td>
			<td style="width:209px;">Stemcell technologies</td>
			<td>78059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Penicillin-streptomycin</td>
			<td style="width:209px;">Life technologies</td>
			<td style="width:408px;">15140148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Monothioglycerol (MTG)</td>
			<td style="width:209px;">Sigma</td>
			<td>88640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">1X red blood cell lysis buffer</td>
			<td style="width:209px;">eBioscience</td>
			<td style="width:408px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Cell dissociation buffer</td>
			<td style="width:209px;">Life technologies</td>
			<td style="width:408px;">13150016</td>
			<td>Enzyme-Free, Hanks&#39;s-based, EDTA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Lipopolysaccharide (LPS)</td>
			<td style="width:209px;">Sigma aldrich</td>
			<td style="width:408px;">L 4516</td>
			<td>From E. coli 0127:B8</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">IVIg (Gammunex)</td>
			<td style="width:209px;">Grifols</td>
			<td>Received from BC Children&#39;s Hospital, Transfusion Medicine</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">IVIg (Gammagard liquid)</td>
			<td style="width:209px;">Baxter Healthcare Corporation</td>
			<td>Received from BC Children&#39;s Hospital, Transfusion Medicine</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">IVIg (Octagam)</td>
			<td style="width:209px;">Octapharma</td>
			<td>Received from BC Children&#39;s Hospital, Transfusion Medicine</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Phosphate buffered saline (PBS) (sterile), pH 7.4</td>
			<td style="width:209px;">Life technologies</td>
			<td style="width:408px;">10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">mouse IL-10 ELISA</td>
			<td style="width:209px;">BD biosciences</td>
			<td style="width:408px;">555252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">mouse IL-12/23p40 ELISA</td>
			<td style="width:209px;">BD biosciences</td>
			<td style="width:408px;">555165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">anti-Erk1/2 antibody</td>
			<td style="width:209px;">Cell signalling technology</td>
			<td style="width:408px;">9101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">anti-pp38 antibody</td>
			<td style="width:209px;">Cell signalling technology</td>
			<td style="width:408px;">9211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">anti-GAPDH antibody</td>
			<td style="width:209px;">Fitzgerald industries</td>
			<td style="width:408px;">10R-G109A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">26 g needle</td>
			<td style="width:209px;">BD biosciences</td>
			<td style="width:408px;">305110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">1 mL syringe</td>
			<td style="width:209px;">BD biosciences</td>
			<td style="width:408px;">309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">10 mL syringe</td>
			<td style="width:209px;">BD biosciences</td>
			<td style="width:408px;">309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">15 mL conical tube</td>
			<td style="width:209px;">BD biosciences</td>
			<td style="width:408px;">352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">50 mL conical tube</td>
			<td style="width:209px;">BD biosciences</td>
			<td style="width:408px;">352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">microcentrifuge tube (1.7 mL)</td>
			<td style="width:209px;">Diamed</td>
			<td style="width:408px;">SPE155-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:453px;">75 cm2 tissue culture treated flask</td>
			<td style="width:209px;">BD biosciences</td>
			<td style="width:408px;">353136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Cell scraper</td>
			<td style="width:209px;">BD biosciences</td>
			<td style="width:408px;">353085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Forcepts</td>
			<td style="width:209px;">VWR</td>
			<td>82027-386</td>
			<td>fine tip, dissecting&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:453px;">Scissors</td>
			<td style="width:209px;">VWR</td>
			<td>82027-582</td>
			<td>Delicate, 4 1/2&#34;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Brightfield microscope</td>
			<td style="width:209px;">Motic</td>
			<td style="width:408px;">AE31</td>
			<td>Inverted phase contrast</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Scale&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Mettler&#160;</td>
			<td style="width:408px;">PE 3000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of antibody-based drugs effects on murine bone marrow and peritoneal macrophage activation

マクロファージは、食細胞の自然免疫系の細胞、病原体に対する免疫応答を開始し、癒しと組織の反発に貢献。マクロファージは炎症性応答をオフにする均等に重要であります。マクロファージの免疫グロブリン (IVIg) で刺激が (IL-10)、抗炎症サイトカイン、インターロイキン 10 の多量、細菌リポ多糖 (応答のプロ炎症性サイトカインの低レベルを作り出すことができることを示したLPS)。IVIg は多価抗体は、主に免疫グロブリン (Igg)、Gs は以上 1,000 の献血者のプラズマからプールです。免疫不全症患者における抗体を補完する、または自己免疫・炎症性疾患患者の免疫応答を抑制するものです。インフリキシマブ治療抗腫瘍の壊死の要因アルファ (tnf α) 抗体は、マクロファージ炎症性の刺激への応答の IL-10 を生成するアクティブにも示されています。IVIg と他の抗体を用いた生物は、マクロファージ活性化に及ぼす影響を確認するテストできます。本稿では、派生、刺激との in vitro抗体によるマウス骨髄マクロファージと抗体の生体内で活性化マウス腹腔マクロファージの評価法について説明します。最後に、我々 は特定の細胞シグナル伝達に抗炎症マクロファージ活性経路の寄与を決定する西部にしみが付く使用を示します。これらのプロトコルは、特定の蛋白の抗炎症マクロファージ活性化に及ぼす影響を決定する遺伝子改変マウスを使用できます。これらのテクニックは、特定生物製剤は大食細胞を炎症反応で生体を減らす IL 10 生産抗炎症活性化状態に変更することにより行動できるかどうかを評価するためにも使用できます。これはマウスの病態モデルの中に生物学的製剤の有効性のマクロファージ活性化の役割に関する情報を提供し、人々 の行動の潜在的な新しいメカニズムへの洞察力を提供できます。逆に、これに警告するかもしれない特定抗体を用いた生物学的製剤の使用に対して感染症を治療するためにマクロファージがその感染に対する宿主防御において重要な役割を果たす場合に特に。

マウス骨骨髄由来マクロファージは、骨髄の造血細胞前駆体から培養することができます。骨髄吸引から大腿骨および脛骨 1 つ c57bl/6 マウスの通常プールをもたらす 107骨髄由来マクロファージ、それらにマクロファージ実験のための便利なソースを作るします。BMDMs は、ベース抗体薬物反応を炎症性刺激体外挑戦されたときをテストする使用できます。図 1に示す Gammunex (GX) + LP 増加抗炎症サイトカインの生産、IVIg ブランド IL-10, LPS 刺激だけで (図 1A) と比較して、生産の IL-12/23 p 40 (図 1 を減少させます B)。図 1はまた異なる IVIg 製剤、動作が異なることを示します。IVIg の 3 つの異なる製剤が IL-12/23 の p 40 大幅 (図 1B)、Octagam (OG) と Gammagard を減らすことができる液体 (GL) が IL 10 生産組合 (図 1に応答を大幅増加しません。A). OG と GL が LP、GX よりも程度に応じてで IL-12/23 p 40 の生産を大幅に削減することができます。これらの結果は、抗体に影響を与える骨髄由来マクロファージ活性化であることと、応答の変化を引き起こすことができます同じ薬剤の準備の違いがあることを示しています。
BMDMs は西部にしみが付くことによって免疫グロブリンの機械的効果をテストする使用できます。IC + LPS 活性化マクロファージは、p38、Erk1/2 増加 IL 10 生産21に責任があるマイトジェン活性化タンパク質 (地図表示) キナーゼのリン酸化を増加しています。図 2の結果表示が刺激される、または LPS、IVIg、または IVIg + LPS で刺激されているマクロファージによる IL 10 生産に必要な MAP キナーゼ活性を検出する典型的な西部のしみ。IVIg 単独で刺激や IVIg + 組合共刺激 MAP キナーゼ活性の上昇 Erk1/2 LP だけで見ると比較して以前と長期のリン酸化。P38 の活性化は、以前マクロファージ IVIg + lps 単独でこれらの刺激と比較して LPS 刺激で発生しました。これらの結果は、セルシグナ リング BMDMs に対する抗体薬の効果を示すため西部のしみが付くことなどの方法を使用できますを示します。サイトカイン産生に加えて MAP キナーゼ活性は抗炎症マクロファージ活性化が発生したことを示すため使用できます。
成熟した、その組織マクロファージは、IVIg 5.0 x 10 の5つの応答を評価するためにマウスから分離することができます - 1.0 x 106腹腔マクロファージは 1 つの健康的な c57bl/6 マウスから分離できます。図 3、IVIg 投与マウスの腹腔マクロファージはない大幅増産 IL 10 不在で刺激体外、PBS 注入マウスと比較されました。IVIg から腹腔マクロファージを注入する、マウスは前のヴィヴォLPS で刺激、PBS 投与マウスよりの 6 の IL 10 を出します。ただし、検出可能な量の IL-12/23 p 40前のヴィヴォLPS で刺激したときは生成されません、彼ら。これらの結果は、体内薬物を注入して、このメソッドとex vivo細胞、培養によってマクロファージに対する抗体の効果をテストことができることを示しています。
抗体、炎症性刺激に大食細胞の応答は、 in vivo評価をすることができます。サイトカイン産生は洗浄液で評価することができますおよび前のヴィヴォから上清中に腹腔マクロファージを刺激します。図 4に示す抗炎症サイトカイン IL-10 は洗浄液 (図 4A)、腹膜の細胞 (図 4B) とマクロファージ (図 4C) で増加マウスIVIg + PBS + LP と比較して組合に立ち向かっています。洗浄液ではなく培養マクロファージで、IL-12/23 p 40、プロ炎症性サイトカイン サブユニットの生産は大幅に削減します。このメソッドは、生体内の炎症反応と同様にex vivo抗体医薬の影響の検討できます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56689/56689fig1.jpg"> 
図 1: IVIg と LPS の別のブランドの共刺激に応えてマクロファージ IL-10 と IL-12/23 p 40 生産。C57BL/6 MCSF 骨髄由来マクロファージか些細 (C)、または lps 刺激 (10 ng/mL)、IVIg (30 mg/mL)、または IVIg + LP。IVIg の 3 つの異なるブランドをテストした: Gammunex (GX)、Gammagard 液 (GL) と Octagam (OG)。マクロファージ培養上清は、刺激後 24 h を収集され、遠心分離によって明らかに。IL-10 (A) と (B) IL-12/23 p 40 の Elisa を行った。データは、マクロファージ n から = 3 が独立した実験、実験、Elisa あたり 1 個体のマウスから細胞が複製でアッセイします。データは、平均 ± SD. *P &#60; 0.05、* * P &#60; 0.001、* * *P &#60; LPS 刺激し IVIg と比較 0.0001 + 組合共刺激。一方向の分散分析 (ANOVA) 多重比較のためのテューキー事後テストでは、統計分析に使用されました。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56689/56689fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56689/56689fig2.jpg"> 
図 2: IVIg 活性化マクロファージにおける MAP キナーゼ活性の西部のしみの分析。MCSF は骨髄由来マクロファージが些細または LPS 刺激を受けた (10 ng/mL)、GX IVIg (30 mg/mL)、または GX IVIg + LP;0、10、40、または 120 分全セル lysates (1.0 x 106マクロファージ/レーン) が施されたナトリウム dodecyl 硫酸塩ポリアクリルアミドのゲルの電気泳動 (SDS-PAGE) と西洋の p38 リン酸化特異的抗体としみが付くと細胞外ローディング コントロールとしてグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ (GAPDH) と同様、シグナル調節キナーゼ (Erk1/2)。表示結果が n = 3 が独立した実験、実験あたり 1 個体のマウスから細胞。各バンドの下 3 の独立した実験から平均 GAPDH に正規化 pp38 と pErk1/2 タンパク質レベルのデンシトメトリーのとおりです。この図は、Kozickyら8から変更されています。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56689/56689fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56689/56689fig3.jpg"> 
図 3: IVIgの体内に挑戦マウスからマクロファージによる IL 10 生産。8 週齢の c57bl/6 マウスは、腹腔内滅菌 PBS (インジェクション コントロール) または GX IVIg (2.5 g/kg) を与えられました。1 時間後マウスを安楽死させ、腹膜洗浄を行った。マクロファージは、密着性の選択を使用して分離されました。どちらか些細 (C)、または LPS 刺激によるマクロファージ (10 ng/mL)。細胞培養上清は、収穫され、IL-10 Elisa の 24 h 後明らかに。データは、n = 3 の独立した実験は、Elisa 実行グループあたり 5 個々 のマウスが重複でアッセイします。データは、平均 ± SD. * P &#60; 0.01 と NS = 重要ではないです。統計分析は、複数の比較のため Sidak のポストテストで双方向の分散分析を使用して行った。この図は、Kozickyら8から変更されています。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56689/56689fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56689/56689fig4.jpg"> 
図 4: IL-10 と IL-12/23 p 40 マウス IVIg + LP 挑戦産生体内で。8 週齢の c57bl/6 マウス コントロールとして PBS + LP (0.2 μ g/g 体重) を腹腔内に注入しました。または GX IVIg (2.5 g/kg 体重) + LP (0.2 μ g/g 本体重量)。1 時間後マウスを安楽死させ、腹膜洗浄を行った。(A) 明らかに洗浄液、(B) 1 h マクロファージ遵守手順中に腹腔細胞からエアコンの上清を明らかにし、(C) 明らかに 24 h の測定した腹腔マクロファージ (Mφ) 清IL-10 と IL-elisa 法による 12/23 p 40。データは平均 ± SD n = 3 の独立した実験で 5 マウス Elisa と重複でアッセイします。P &#60; 0.05 * *P &#60; 0.01 * * *P &#60; 0.001 と NS = 重要ではないです。PBS + LPS 投与マウスは IVIg + スチューデントのt検定を使用して LPS 投与マウスと比較しました。この図は、Kozickyら8から変更されています。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56689/56689fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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Assessment of Antibody-based Drugs Effects on Murine Bone Marrow and Peritoneal Macrophage Activation

抗体創薬が炎症性疾患の治療に革命をもたらしました。特定のターゲットに対する直接的な効果だけでなく、抗体は抗炎症になる大食細胞をアクティブ化できます。このプロトコルを記述する方法抗炎症マクロファージ活性化は評価in vitroマウス骨髄マクロファージと生体内のマクロファージを使用して使用することができます。

マウス骨髄と腹腔マクロファージ活性化抗体を用いた薬剤効果の評価

Macrophages are phagocytic innate immune cells, which initiate immune responses to pathogens and contribute to healing and tissue restitution. Macrophages ...

assessment-antibody-based-drugs-effects-on-murine-bone-marrow

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

8.1K ビュー.  University of British Columbia. 抗体創薬が炎症性疾患の治療に革命をもたらしました。特定のターゲットに対する直接的な効果だけでなく、抗体は抗炎症になる大食細胞をアクティブ化できます。このプロトコルを記述する方法抗炎症マクロファージ活性化は評価in vitroマウス骨髄マクロファージと生体内のマクロファージを使用して使用することができます。

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Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone marrow, spleen, lymph nodes and Peyer's patches 1-3. DCs present in peripheral tissues sample the organism for the presence of antigens, which they take up, process and present in their surface in the context of major histocompatibility molecules (MHC). Then, antigen-loaded DCs migrate to immunological organs where they present the processed antigen to T lymphocytes triggering specific immune responses. One way to evaluate the migratory capabilities of DCs is to label them with fluorescent dyes 4.
Herewith we demonstrate the use of Qdot fluorescent nanocrystals to label murine bone marrow-derived DC. The advantage of this labeling is that Qdot nanocrystals possess stable and long lasting fluorescence that make them ideal for detecting labeled cells in recovered tissues. To accomplish this, first cells will be recovered from murine bone marrows and cultured for 8 days in the presence of granulocyte macrophage-colony stimulating factor in order to induce DC differentiation. These cells will be then labeled with fluorescent Qdots by short in vitro incubation. Stained cells can be visualized with a fluorescent microscopy. Cells can be injected into experimental animals at this point or can be into mature cells upon in vitro incubation with inflammatory stimuli. In our hands, DC maturation did not determine loss of fluorescent signal nor does Qdot staining affect the biological properties of DCs. Upon injection, these cells can be identified in immune organs by fluorescent microscopy following typical dissection and fixation procedures.

Dendritic cells uptake antigens and migrate towards immune organs to present processed antigens to T cells. Qdot nanocrystal labeling provides a long-lasting and stable fluorescent signal. This allows tracking of dendritic cells to different organs by fluorescent microscopy.

追跡調査のためのQdot ®二ナノとマウス骨髄由来樹状細胞の世代とラベリング

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

免疫・感染学

Investigation of Macrophage Polarization Using Bone Marrow Derived Macrophages

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic stem/progenitor cells from the bone marrow are directed into monocytic differentiation, followed by M1 or M2 stimulation. The activation status can be tracked by changes in cell surface antigens, gene expression and cell signaling pathways.

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic stem/progenitor cells from the bone marrow are directed into monocytic differentiation, followed by M1 or M2 stimulation. The activation status can be tracked by changes in cell surface antigens, gene expression and cell signaling pathways.

骨髄由来マクロファージを用いたマクロファージ分極の調査

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic ...

Bone Marrow-derived Macrophage Production

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because of their powerful microbicidal activities. Macrophages are widely distributed throughout the body and are present in the lymphoid organs, liver, lungs, gastrointestinal tract, central nervous system, bone, and skin. Because of their repartition, they participate in a wide range of physiological and pathological processes. Macrophages are highly versatile cells that are able to recognize microenvironmental alterations and to maintain tissue homeostasis. Numerous pathogens have evolved mechanisms to use macrophages as Trojan horses to survive, replicate in, and infect both humans and animals and to propagate throughout the body. The recent explosion of interest in evolutionary, genetic, and biochemical aspects of host-pathogen interactions has renewed scientific attention regarding macrophages. Here, we describe a procedure to isolate and cultivate macrophages from murine bone marrow that will provide large numbers of macrophages for studying host-pathogen interactions as well as other processes.

Macrophages have long been recognized as a critical component of the innate and adaptive immune responses. The recent explosion of knowledge pertaining to evolutionary, genetic, and biochemical aspects of the interaction between macrophages and microbes has renewed scientific attention to macrophages. This article describes a method to differentiate macrophages from mouse bone marrow.

骨髄由来マクロファージの生産

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of various fields in biomedical science. The method described below is a simple and effective way to isolate murine monocytes from heterogeneous bone marrow.
Bone marrow from the femur and tibia of Balb/c mice is harvested by flushing with phosphate buffered saline (PBS). Cell suspension is supplemented with macrophage-colony stimulating factor (M-CSF) and cultured on ultra-low attachment surfaces to avoid adhesion-triggered differentiation of monocytes. The properties and differentiation of monocytes are characterized at various intervals. Fluorescence activated cell sorting (FACS), with markers like CD11b, CD115, and F4/80, is used for phenotyping. At the end of cultivation, the suspension consists of 45%&#177; 12% monocytes. By removing adhesive macrophages, the purity can be raised up to 86%&#177; 6%. After the isolation, monocytes can be utilized in various ways, and one of the most effective and common methods for in vivo delivery is intravenous tail vein injection. 
This technique of isolation and application is important for mouse model studies, especially in the fields of inflammation or immunology. Monocytes can also be used therapeutically in mouse disease models.

Here we present a protocol that generates large amounts of murine monocytes from heterogeneous bone marrow for translational applications. In comparison to others, this new method helps reduce the number of sacrificed animals and lowers costs by avoiding expensive methods such as high gradient magnetic cell separation (MACS).

単離とマウス骨髄由来の単球の静脈注射

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal environment. Biological activities of immune cells mainly rely on their motility capacities. Blood monocytes have short half-life in the bloodstream; they originate in the bone marrow and are constitutively released from it. In inflammatory condition, this process is enhanced, leading to blood monocytosis and subsequent infiltration of the peripheral inflammatory tissues. Identifying the biomechanical events controlling monocyte trafficking from the bone marrow towards the vascular network is an important step to understand monocyte physiopathological relevance. We performed in vivo time-lapse imaging by two-photon microscopy of the skull bone marrow of the Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP (MacBlue) mouse. The MacBlue mouse expresses the fluorescent reporters enhanced cyan fluorescent protein (ECFP) under the control of a myeloid specific promoter 1, in combination with vascular network labelling. We describe how this approach enables the tracking of individual medullar monocytes in real time to further quantify the migratory behaviour within the bone marrow parenchyma and the vasculature, as well as cell-to-cell interactions. This approach provides novel insights into the biology of the bone marrow monocyte subsets and allows to further address how these cells can be influenced in specific pathological conditions.

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Monocytes are key regulators of innate immunity and play a critical role in the renewal of the peripheral mononuclear phagocytic system and in case of inflammation. This manuscript describes the procedure of real time imaging of the mouse calvaria bone marrow to study the monocyte mobilisation mechanism.

マウス骨髄単球の追跡<em&gt;インビボ</em

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal ...

Murine Hind Limb Long Bone Dissection and Bone Marrow Isolation

Investigation of the bone and the bone marrow is critical in many research fields including basic bone biology, immunology, hematology, cancer metastasis, biomechanics, and stem cell biology. Despite the importance of the bone in healthy and pathologic states, however, it is a largely under-researched organ due to lack of specialized knowledge of bone dissection and bone marrow isolation. Mice are a common model organism to study effects on bone and bone marrow, necessitating a standardized and efficient method for long bone dissection and bone marrow isolation for processing of large experimental cohorts. We describe a straightforward dissection procedure for the removal of the femur and tibia that is suitable for downstream applications, including but not limited to histomorphologic analysis and strength testing. In addition, we outline a rapid procedure for isolation of bone marrow from the long bones via centrifugation with limited handling time, ideal for cell sorting, primary cell culture, or DNA, RNA, and protein extraction. The protocol is streamlined for rapid processing of samples to limit experimental error, and is standardized to minimize user-to-user variability.

Here we present a protocol for the dissection of hind limb long bones (femurs and tibiae) from the laboratory mouse. We further describe a rapid technique for bone marrow isolation from these bones that utilizes centrifugation for removal of bone marrow from the bone marrow space.

マウス後肢長骨解剖や骨髄の単離

Investigation of the bone and the bone marrow is critical in many research fields including basic bone biology, immunology, hematology, cancer metastasis, ...

Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

Bone marrow is a complex organ that contains various hematopoietic and non-hematopoietic cells. These cells are involved in many biological processes, including hematopoiesis, immune regulation and tumor regulation. Commonly used methods for understanding cellular actions in the bone marrow, such as histology and blood counts, provide static information rather than capturing the dynamic action of multiple cellular components in vivo. To complement the standard methods, a window chamber (WC)-based model was developed to enable serial in vivo imaging of cells and structures in the murine bone marrow. This protocol describes a surgical procedure for installing the WC in the femur, in order to facilitate long-term optical access to the femoral bone marrow. In particular, to demonstrate its experimental utility, this WC approach was used to image and track neutrophils within the vascular network of the femur, thereby providing a novel method to visualize and quantify immune cell trafficking and regulation in the bone marrow. This method can be applied to study various biological processes in the murine bone marrow, such as hematopoiesis, stem cell transplantation, and immune responses in pathological conditions, including cancer.

Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

The protocol describes a novel murine femur window chamber model that can be used to track movement of cells in the femoral bone marrow in vivo. Intravital multiphoton fluorescence microscopy is used to image three components of the femoral bone marrow (vasculature, collagen matrix, and neutrophils) over time.

以下のための大腿骨のウィンドウチャンバーモデル<em&gt;インビボ</emマウス骨髄内&gt;細胞トラッキング

Bone marrow is a complex organ that contains various hematopoietic and non-hematopoietic cells. These cells are involved in many biological processes, ...

Isolation and Activation of Murine Lymphocytes

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading pathogen1,2. Understandably, such intricate abilities are controlled by a large number of molecules involved in various cellular processes to ensure timely and spatially regulated immune responses3. Here, we describe experimental procedures that allow rapid isolation of highly purified murine lymphocytes using magnetic cell sorting technology. The resulting purified lymphocytes can then be subjected to various in vitro or in vivo functional assays, such as the determination of lymphocyte signaling capacity upon stimulation by immunoblotting4 and the investigation of proliferative abilities by 3H-thymidine incorporation or carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) labeling5-7. In addition to comparing the functional capacities of control and genetically modified lymphocytes, we can also determine the T cell stimulatory capacity of antigen-presenting cells (APCs) in vivo, as shown in our representative results using transplanted CFSE-labeled OT-I T cells.

Lymphocytes are the major players in adaptive immune responses. Here, we present a lymphocyte purification protocol to determine the physiological functions of the desired molecules in lymphocyte activation in vitro and in vivo. The described experimental procedures are suitable for comparing functional capacities between control and genetically modified lymphocytes.

単離とマウスリンパ球の活性化

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in diameter. In addition to a characterization of forward and sideward scatter properties, it enables the use of fluorescent labeled markers like antibodies to detect respective structures. Using indirect antibody staining, flow cytometry is employed here to quantify birch pollen allergen (precisely Bet v 1)-loaded particles of 0.5 to 10 &#181;m in diameter in inhalable particulate matter (PM10, particle size &#8804;10 &#181;m in diameter). PM10 particles may act as carriers of adsorbed allergens possibly transporting them to the lower respiratory tract, where they could trigger allergic reactions.
So far the allergen content of PM10 has been studied by means of enzyme linked immunosorbent assays (ELISAs) and scanning electron microscopy. ELISA measures the dissolved and not the particle-bound allergen. Compared to scanning electron microscopy, which can visualize allergen-loaded particles, flow cytometry may additionally quantify them. As allergen content of ambient air can deviate from birch pollen count, allergic symptoms might perhaps correlate better with allergen exposure than with pollen count. In conjunction with clinical data, the presented method offers the opportunity to test in future experiments whether allergic reactions to birch pollen antigens are associated with the Bet v 1 allergen content of PM10 particles &#62;0.5 &#181;m.

Here, we present a protocol to quantify allergen-loaded particles by flow cytometry. Ambient particulate matter particles may act as carriers of adsorbed allergens. We show here that flow cytometry, a method widely used to characterize suspended solids &#62;0.5 &#181;m in diameter, can be used to measure these allergen-loaded particles.

PM10における粒子結合のBet V 1アレルゲンのフローサイトメトリー分析

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Generation of Large Numbers of Myeloid Progenitors and Dendritic Cell Precursors from Murine Bone Marrow Using a Novel Cell Sorting Strategy

Cultures of monocyte-derived dendritic cells (moDC) generated from mouse bone marrow using Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) have recently been recognized to be more heterogeneous than previously appreciated. These cultures routinely contain moDC as well monocyte-derived macrophages (moMac), and even some less developed cells such as monocytes. The goal of this protocol is to provide a consistent method for identification and separation of the many cell types present in these cultures as they develop, so that their specific functions may be further investigated. The sorting strategy presented here separates cells first into four populations based on expression of Ly6C and CD115, both of which are expressed transiently by cells as they develop in GM-CSF-driven culture. These four populations include Common myeloid progenitors or CMP (Ly6C-, CD115-), granulocyte/macrophage progenitors or GMP (Ly6C+, CD115-), monocytes (Ly6C+, CD115+), and monocyte-derived macrophages or moMac (Ly6C-, CD115+). CD11c is also added to the sorting strategy to distinguish two populations within the Ly6C-, CD115- population: CMP (CD11c-) and moDC (CD11c+). Finally, two populations may be further distinguished within the Ly6C-, CD115+ population based on the level of MHC class II expression. MoMacs express lower levels of MHC class II, while a monocyte-derived DC precursor (moDP) expresses higher MHC class II. This method allows for the reliable isolation of several developmentally distinct populations in numbers sufficient for a variety of functional and developmental analyses. We highlight one such functional readout, the differential responses of these cell types to stimulation with Pathogen-Associated Molecular Patterns (PAMPs).

Here we provide a method for identifying and isolating large numbers of GM-CSF driven myeloid cells using high speed cell sorting. Five distinct populations (Common myeloid progenitors, granulocyte/macrophage progenitors, monocytes, monocyte-derived macrophages, and monocyte-derived DCs) can be identified based on Ly6C and CD115 expression.

大量の骨髄前駆細胞と新規セルソーティング戦略を使用してマウスの骨髄から樹状細胞前駆体の生成

Cultures of monocyte-derived dendritic cells (moDC) generated from mouse bone marrow using Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) have ...

マウス骨髄と腹腔マクロファージ活性化抗体を用いた薬剤効果の評価

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