この手順の全体的な目標は、多変量データ分析を用いたATR-FTIR分光法を用いたマラリア原虫血症予測の回帰モデルを構築することである。この方法は、将来の患者の転帰を改善するのに役立つポイントオブケア診断を促進するのに役立ちます。この手法の主な利点は、モデルの構築に時間がかかる場合がありますが、ポータブルで、ユーザーフレンドリーで、高感度で低コストである点です。
この方法はマラリア原虫の定量を可能にするが、抗菌剤による寄生虫組成の変化などの環境変化に対する表現性応答を観察するためにも使用できる。このアイデアは、マラリアに感染した細胞に関するオーストラリアのシンクロトロンで行った作業から開発されました。これは単一細胞レベルでした。
そこから、ATR-FTIR分光法を用いて、実際に診断テストを開発することにしました。同期手順を開始する前に、テキストプロトコルに記載されているように3D7株熱帯熱マラリア原虫の30ミリリットルの培養。自動化されたピペットを使用して、培養を再中断し、50ミリリットルの円錐管に移します。
標準的な実験室条件下で300〜400倍gの培養物を5分間遠心する。ペレットを邪魔することなく、自動ピペットで上澄みして上清を取り除く。廃棄物培地を10%漂白剤溶液に廃棄します。
4%ソルビトール溶液の12〜15ミリリットルをペレットにゆっくりと加え、培養物が均一になるまでチューブをキャッピングして反転させて培養を混合する。37°Cで15分間培養します。15分後、培養物を5分間遠心分離します。
ペレットを邪魔することなく上清を除去するために、自動化されたピペットを使用してください。ペレットに0.9%の生理食塩水の10〜15ミリリットルを加え、培養物が均一になるまでチューブをキャッピングして反転させて溶液を混合します。遠心分離と生理液を2回洗浄してソルビトールの残骸をすべて除去します。
この手順を開始するには、ストック赤血球、またはRBCsを遠心分離します。ストックRBCと培養物を300~400倍gで5分間遠心し、各チューブから上清を捨てます。
示されているとおりに8本のマイクロ遠心管にラベルを付けます。その後、0.2~20マイクロリットルのピペットを使用して、各チューブに適切な量の培養液を加えます。次に、各チューブに適量のストックRBCを加え、所望の寄生虫希釈液を得る。
遠心分離剤は、1,200グラムの抗凝固管で採取された新鮮なドナー血液を10分間標準の検査条件で行う。ピペットでプラズマを引き上げ、10%漂白剤溶液に捨ててプラズマを取り除きます。各マイクロ遠心分離管に900マイクロリットルの単離ドナーRBCを加え、10回反転して十分に混ぜます。
シンプルなベンチトップの減衰総反射フーリエ変換赤外線、またはATR-FTIR分光計は、スペクトルを取得するために使用されます。超純水で湿らせた糸くず拭き物を使用してクリスタルを準備し、きれいにして、クリスタルを円の動きにそっとこすります。その後、別の糸くずのないワイプを使用して、クリスタルを完全に乾燥させます。
[バックグラウンド測定]をクリックして、空気の背景測定を行います。20分ごとに、結晶をきれいにし、この測定を繰り返します。[プレビュー] をクリックしてライブ ビューを開きます。
結晶がきれいであることを示す平らな水平ベースラインを観察します。ピペット10マイクロリットルの脱イオン水を結晶の真ん中に直接入れ、[サンプルを測定]をクリックします。糸くず拭きと穏やかな円運動を使用して結晶を乾燥させます。
結晶の中央に10マイクロリットルのサンプルをピペットし、サンプルを測定をクリックします。サンプル間の結晶をきれいにします。このデモでは、MATLABを使用して多変量データ解析を行います。
データ処理を開始するには、コマンド ウィンドウに解析を入力して、グラフィック ユーザー インターフェイスを開きます。[X] ボックスを右クリックして、[データのインポート] を見つけます。解析するファイルのタイプを選択します。
サンプル、水、ベースラインスペクトルをデータセットとして作業環境にインポートするには、各セットのすべてのスペクトルを個別に選択し、[開く]をクリックして、各セットに短い名前を付けます。コマンド ウィンドウで [新規変数] をクリックし、ベクターに [パラシテミア] という名前を付けます。各サンプルの寄生虫症を入力します。
[X]ボックスを右クリックして[印刷データ]を見つけます。[データのプロット]アイコンをクリックして、データをプロットします。ズームをクリックし、1、800〜1、400センチメートルでズームインして水蒸気効果のスペクトルを検査し、最も明確にアミドIとアミドIIバンドの斜面に沿って短く、鋭く、狭いピークとして観察されます。
極端な水蒸気の場合は、[前処理データを編集]タブを開き、[スムージング]を選択します。サンプルと水スペクトルを平滑化することで、ノイズや強い水蒸気の寄与を低減します。テキスト プロトコルで説明したデータ処理の後、[データの編集] タブを開き、列変数で、ボックスにのみチェックを入れて 2980 ~ 2800 センチメートル、1750 ~ 850 センチメートルを選択します。
これで、データは分析の準備が整いました。主成分分析(PCA)を実行するには、「分析分解」をクリックして「PCA」を選択します。[モデルの構築] をクリックします。
PC 1 と PC 2 の間のスコア プロット上の 95% 信頼限界、破線リングを観察します。[スペクトル選択]ツールを使用して、制限外れ値として範囲外に出現するスコアでサンプルスペクトルをマークします。部分最小二乗回帰(PLSR)を実行するには、[分析回帰]をクリックして[PLSR]を選択します。
Y ブロックを右クリックし、ベクトル[パラシテミア構築モデル]を選択します。回帰モデルと回帰ベクトルを分析し、生物学的バンドを特定します。0から1%の間でスパイクされたRBCの部分的な最小二乗回帰プロットは、R-2乗値0.87と0.13%パラシデミアの二乗交差検証誤差を生成した。
これは、x軸上の既知の寄生虫症とy軸上の予測寄生虫血症を有する各サンプルのパラシテミアを予測するモデルの能力を示す。関連する回帰係数は、モデルの予測能力に対する各バンドの寄与を表します。バンドが強ければ強いほど、より多くのバンドがモデルに寄与し、したがって、寄生虫が血液の化学組成をどのように変化させるか。
結果は、寄生虫からのシグナルがRBCと十分に区別され、将来のデータセットにおける寄生虫の予測のための線形回帰モデルを形成するために使用できることを示している。この方法は、一度マスター化すると、適切に実行すれば、サンプルあたり3分未満で済みます。この手順を試みている間、すべての残渣のATR結晶をきれいにすることを忘れないでください。
この手順に従って、P vivaxやPマラリアなどの他のマラリア種は、このような質問に答えるためにモデル化することができ、ATR-FTIR分光法は種を区別するのに十分に敏感ですか?その開発後、この技術は、バイオスペクトロスコピーの分野の研究者が他の血液媒介病原体の検出と定量を探求し、さらにはグルコースや尿素などの血液中で分析する道を開いた。このビデオを見た後、回帰モデルを構築するためにATR-FTIR分光法とNVDA分析をよく理解する必要があります。
患者の血液やマラリアサンプルを使用することは危険であり、この手順を試みるときには常に適切なバイオセーフティレベルのトレーニングと封じ込めが行われるべきであることを忘れないでください。
