이 절차의 전반적인 목표는 다변량 데이터 분석을 가진 ATR-FTIR 분광법을 사용하여 말라리아 기생충증의 예측을 위한 회귀 모형을 구축하는 것입니다. 이 방법은 미래에 환자 결과를 개선하는 데 도움이 될 수있는 치료 시점 진단을 신속하게 하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 모델이 구축하는 데 시간이 걸릴 수 있지만 휴대성이 뛰어나고 사용자 친화적이며 매우 민감하며 비용이 낮다는 것입니다.
이 방법은 말라리아 기생충의 정량화를 가능하게 하지만, 항균제로 인한 기생충 조성의 변화와 같은 환경 변화에 대한 현상적 반응을 관찰하는 데도 사용될 수 있다. 아이디어는 우리가 말라리아 감염한 세포에 호주 싱크로트론에서 한 일에서 개발했습니다. 이것은 단세포 수준에 있었습니다.
거기에서, 우리는 실제로 진단 시험을 개발하기 위하여 ATR-FTIR 분광기를 사용하기로 결정했습니다. 동기화 절차를 시작하기 전에, 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 3D7 균주 플라스모듐 팔시파룸 기생충의 문화 30 밀리리터. 자동 파이펫을 사용하여 문화를 다시 중단하고 50밀리리터 원유형 튜브로 전송합니다.
원심 분리는 5 분 동안 표준 실험실 조건하에서 300 ~ 400 배 g에서 배양합니다. 펠릿을 방해하지 않고 자동화된 파이펫으로 그려서 상체를 제거합니다. 폐기물 미디어를 10% 표백액으로 폐기합니다.
펠릿에 4%의 소르돌 용액의 12~15밀리리터를 천천히 추가하고 문화가 균일해질 때까지 튜브를 캡핑하고 반전시켜 배양을 혼합합니다. 15분 동안 섭씨 37도에서 문화를 배양합니다. 15분 후, 원심분리기를 5분간 양해합니다.
자동 파이펫을 사용하여 펠릿을 방해하지 않고 상체를 제거합니다. 펠릿에 0.9%의 식염수 10~15밀리리터를 넣고 배양이 균일해질 때까지 튜브를 캡핑하고 반전시켜 용액을 혼합합니다. 원심분리및식염액을 두 번 더 씻어 서 소르비톨의 모든 잔해를 제거한다.
이 절차를 시작하려면, 재고 적혈구 또는 RbC. 상체를 제거하고 총 3 번 0.9 %의 식염수로 씻어. 주식 RBC와 문화를 5분 동안 300~400회 g로 원심분리하고 각 튜브에서 상퍼를 폐기합니다.
표시된 대로 8개의 미세원심분리기 튜브에 라벨을 붙입니다. 그런 다음 0.2 ~ 20 마이크로 리터 파이펫을 사용하여 각 튜브에 적절한 양의 배양을 추가하십시오. 다음으로, 원하는 기생충 희석을 얻기 위해 각 튜브에 적절한 양의 스톡 RBC를 추가한다.
10 분 동안 1, 200 배 g 및 표준 실험실 조건에서 항응고관에서 수집 된 신선한 기증자 혈액 원심 분리. 파이펫으로 플라즈마를 제거하고 10 % 표백제 용액으로 폐기하십시오. 각 마이크로센심분리기 튜브에 900마이크로리터의 마이크로리터를 추가하고 10번 반전하여 철저히 섞습니다.
간단한 벤치탑 감쇠 총 반사 푸아로 변환 적외선, 또는 ATR-FTIR 분광계스펙트럼을 획득하는 데 사용됩니다. 초순수물로 감쇠된 보풀이 없는 물티슈를 사용하여 크리스탈을 원형 으로 부드럽게 닦아 크리스탈을 준비하고 청소합니다. 그런 다음 다른 보풀이없는 닦기를 사용하여 크리스탈을 완전히 건조시하십시오.
배경 측정을 클릭하여 공기의 배경 측정을 수행합니다. 20분마다 크리스탈을 청소하고 이 측정을 반복합니다. 미리 보기를 클릭하여 라이브 뷰를 엽니다.
결정이 깨끗하다는 것을 나타내는 평평한 수평 기준선을 관찰합니다. 파이펫 10 마이크로리터의 탈이온화된 물은 크리스탈 의 중앙에 직접 정수및 측정 샘플을 클릭합니다. 보풀이 없는 와이프와 부드러운 원형 동작으로 크리스탈을 건조시다.
파이프 10 마이크로리터의 샘플은 결정의 중간에 측정 샘플을 클릭합니다. 샘플 사이에 결정을 청소합니다. 이 데모에서는 MATLAB을 사용하여 다변량 데이터 분석을 수행합니다.
데이터 처리를 시작하려면 명령 창에 입력 분석을 입력하여 그래픽 사용자 인터페이스를 엽니다. X 상자를 마우스 오른쪽 단추로 클릭하여 가져오기 데이터를 찾습니다. 분석을 위해 파일 유형을 선택합니다.
샘플, 물 및 기준 스펙트럼을 각 집합의 모든 스펙트럼을 별도로 선택하고 열기를 클릭하고 각 집합에 짧은 이름을 지정하여 데이터 집합으로 데이터 집합으로 가져옵니다. 명령 창에서 새 변수를 클릭하고 벡터에게 파라사이트미아라는 이름을 지정합니다. 각 샘플의 기생충증을 입력합니다.
X 상자를 마우스 오른쪽 단추로 클릭하여 플롯 데이터를 찾습니다. 데이터 플롯 아이콘을 클릭하여 데이터를 플롯합니다. 확대/축소를 클릭하고 1, 800에서 1, 400센티미터를 확대하여 수증기 효과에 대한 스펙트럼을 검사하며, 가장 명확하게 아미드 I 와 Amide II 대역의 경사면을 따라 짧고 날카롭고 좁은 봉우리로 관찰됩니다.
극단적인 수증기의 경우 사전 처리 편집 데이터 탭을 열고 스무딩을 선택합니다. 시료 및 수분 스펙트럼을 부드럽게 하여 소음 및/또는 강력한 수증기 기여도를 줄입니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 추가 데이터 처리 후 데이터 편집 탭을 열고 열 변수에서 상자만 체크하여 2980~2800cm 및 1750~850cm를 선택합니다.
이제 데이터가 분석을 위해 준비되었습니다. 주 성분 분석 또는 PCA를 수행하려면 분석 분해를 클릭하고 PCA를 선택합니다. 모델 빌드를 클릭합니다.
PC 1과 PC 2 사이의 점수 플롯에 95 %의 신뢰 도면, 파선 링을 관찰합니다. 스펙트럼 선택 도구를 사용하여 한도 외부에서 발생하는 점수와 샘플 스펙트럼을 잠재적 이상값으로 표시합니다. 부분 최소 제곱 회귀 또는 PLSR을 수행하려면 분석 회귀를 클릭하고 PLSR을 선택합니다.
Y 블록을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 벡터 Parasitemia 빌드 모델을 선택합니다. 회귀 모델 및 회귀 벡터를 분석하고 생물학적 대역을 식별한다. RBC의 부분 최소 사각형 회귀 플롯은 0에서 1% 사이로 급증하여 R-제곱 값0.87및 루트 평균 제곱 교차 유효성 검사 오류 0.13%의 파라사이트미아를 생성했습니다.
이는 x축에 알려진 기생충증과 y축의 예측된 기생충증을 가진 각 샘플에서 기생충증을 예측하는 모델의 능력을 보여줍니다. 관련 회귀 계수는 모델의 예측 능력에 대한 각 밴드의 기여도를 설명합니다. 밴드가 더 강렬할수록 모델에 더 많이 기여하며, 따라서 기생충이 혈액의 화학 적 조성을 어떻게 변화시키는지.
결과는 기생충의 신호가 향후 데이터 집합에서 기생충의 예측을 위한 선형 회귀 모델을 형성하는 데 사용할 수 있는 RBC와 충분히 구별된다는 것을 보여줍니다. 일단 마스터되면, 이 기술은 제대로 수행하면 샘플 당 3 분 미만 걸릴 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 모든 잔류물의 ATR 결정을 청소하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.
이 절차에 따라, P vivax와 P 말라리아 와 같은 그밖 말라리아 종은 종을 구별하기에 충분히 민감한 ATR-FTIR 분광기같이 대답하기 위하여 모델링될 수 있습니다? 개발 후, 이 기술은 생체 분화 분야의 연구원들이 다른 혈액 매개 병원체의 검출 및 정량화를 탐구하고 포도당및 우레아와 같은 혈액에서 분석할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 회귀 모델을 구축하기 위해 ATR-FTIR 분광및 NVDA 분석을 잘 이해해야 합니다.
환자 혈액 및 말라리아 샘플로 작업하는 것은 위험할 수 있으며 적절한 생체 안전 수준 훈련 및 봉쇄는 이 절차를 시도할 때 항상 수행해야 한다는 것을 잊지 마십시오.
