プリスカ教会 Leferink 私たちの手順を示すための生成と 2 つの制御 iPSC 線の特性とリサ Gasparotto の貢献のために、彼らの専門家技術支援のため Gerbren ジェイコブスと Jurjen Broeke に感謝しております。

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著者が明らかに何もありません。

複雑さとコストは、幹細胞研究者を選択または微分のプロトコルを開発するときの関連する要因です。これは特に目的のセル型を生成するために必要どのくらいの外部制御未解決の問題であるまたは -ポーズを異なる-有能な hPSCs が自分の発達環境を作り出す十分なと自分自身に残っている場合どのように栄養素。体外性あるいは外因性要因の導入が目的のセル製品を生成して非常によくが彼らも妨げる可能性がある生体内で本質的な発達能力細胞が出展したが。そのような考察が重要な特に場合は、目標は、患者由来の Ips の疾患モデル作製用です。パターン形成および成長因子の広範な使用は、疾患表現型をマスクでした。本報告では詳細なプロトコルの複雑さ、コスト、および/または外因性パターン形成要因8,9の使用を減らすために先行研究の傾向に従います。
六車らと私たち自身の最近の研究によって報告された結果に基づいて、ようで以前の研究を行っている生体内での条件を再現する努力せず小脳運命に向かって差別を実現することが可能です。1,2,3,4,8,10. 魅力的な部分が 2 つの研究が FGF2 の両方を使用、どちらのセットが必要だったことを示唆している成長因子の異なるセットを使用します。Fgf が選択的にプロトコルから除外され、セルがなく外因性 Fgf10同じ製品を生成する能力があったことを示したその他のテストをしました。私たちの研究の違いは、我々 異なる hPSC 線と文化方法を使用、ra、神経分化を誘導、顆粒細胞の生存と成熟 (BDNF、GDNF、サグ、KCL) をサポートするコンポーネントに含まれているという事実によって修飾された11 -14。さらに、六車らと比較して、少なく複雑な起動の方法が採用されました。そのプロトコルで 96WPs は、お互いから物理的に、化学的にそれらを分離した均一 EBs を生成することによって始めた。ここでのプロトコルは、比較的自由に対話することができる理事会の形成中に 6WPs に一緒に混雑のすべての Psc を持っていた。どのようにこの可能性がありますが影響を受ける EBs と後 organoids (シグナル化合物の本質的な生産を含む) の物理・化学的環境は不明と検討することができます。また、表示されますが発現遺伝子に関連付けられている- との挑発的な-我々 を除外することはできません六車ら、によって報告されたそれらに類似した形態の構造内にある、小脳の起源世代のような神経の構造。・小脳のアイデンティティであります。今後の研究のそれらのような抗体の大きいパネルを使用して六車らによって報告されました。(すなわちATOH1、CALBなど) このような割り当て、および両方のプロトコルより決定的な製品との比較になります。
3 D のプロトコル内で開始することが重要ですして最終製品分析のための十分な数を確保するため培養細胞の十分な数を維持します。重要な死ぬオフを指定すると、プロトコルの早い段階で、EBs/井戸文化 (図 1) の最初の 3 日間以上 500 から始まることをお勧めします。これは与えられたコロニーでフィーダー フリー培養、hPSCs のサイズを達成するために困難であるが、まだフィーダーに依存した方法を使用してそれらのために簡単なできない可能性があります。多数のセルを指定すると、色変化 (pH の変化を示す)、媒体や死んだ細胞の蓄積を監視することが重要です。両方は、文化の崩壊を防ぐために修正する必要があります。細胞凝集体の凝集があります大規模な構造に。集計分析することができますまだありますが製品数量が大幅に削減、穏やかな製粉に小さい凝集体に分割することができますので。しかし、不穏な普通骨材を避ける自身が大きなサイズ (図 4) を育てることができます。集計があまりにもまばらになる場合は、集計が完全に分離されているので、井戸を結合することをお勧めします。(数、サイズ、および形態) の製品ばらつきは 3 D 細胞培養、分離、制服 EB 形成の手順、示唆 (ここで説明したプロトコルなどのより複雑なスタートアップ プロシージャから始まるこれらのプロトコルなどでよく知られている問題) より実用的な8,15可能性があります。この不均一性研究者は分析中に特に注意してくださいする必要があるものですが報告されたプロトコルは他 3 D プロトコル8,9,15で見つかったものと一貫性のある製品を生成されます。サイズや形態に基づき、彼らニューラル ロゼットの範囲内に落ちる脳における Kelava、ランカスターの15回転楕円体の分類をフィッティングほとんど最近のレビューで記述されます。特に注目すべきは、3 D 構造の存在がルーメン、(サブ) 心室ゾーン、および機能のような菱形リップと神経はロゼットを示唆している (図 5 図 6) によって識別される他のグループ8,15,16,17. すべての実験は、少なくとも 1 つを作り出すので集計推定 VZ/SVZs と小脳関連マーカー (ZIC1、KIRREL2)、あれらは RL のように私たちのプロトコルを使用して 3 D の分化の成功を決定するための有用な基準その他のサポートを提供する機能。文化過去 35 日間に延長テストは行いませんでしたが、成長、複雑さ、および成熟のこの技術によって許可される最大範囲の特定に追求できます。
2D のプロトコルは、3 D プロトコルに同じ非付着性 EB 形成と神経誘導プロセスを使用し、だから上記のコメントにも適用。メッキ、一度別の考慮事項のセットを考慮されなければなりません。EBs は、外側プレートの上に増殖する細胞にすぐに従う必要があります。付着、ri (使用されていない) 場合は、追加の問題が媒体の容積を減少または PLO/ラムの濃度で実験的な変更が適用される場合。(20-80% の confluency 間の成長できれば) をも密またはスパース成長から細胞を保つことが重要です; の井戸日常の監視とタイムリーな継以上 confluency または浮遊細胞を避けるために、重要です。3 D のプロトコルとは異なりべきであるあります重要なダイオフ、培養中の貧しい人々 の成長分野や増殖率の減速があるかもしれませんが。継 (たとえば、細胞プロセスおよびセル間開発ネットワークの取り外し) 細胞の成熟状態に影響し、細胞が収集または何らかの方法で分析したポイントに近づいているときに留めておかれるべきであります。たとえば、カルシウム イメージすることは非常に重要な分析の前に 2-6 日間の通路のセルです。継に近すぎる分析を意味するかもしれない細胞に接続する時間がなかったおよび/または細胞過密、イメージングを困難に成熟したのとあまりにも遠い可能性があります。実験間のばらつきが存在する可能性があります、結果が初期 2 D 小脳プロトコル1,2で報告されたものと一致。ICC 染色及び遺伝子発現解析は、また他の神経と小脳 id (図 7および図 8) に関連付けられたマーカーを特定し、顆粒細胞のマーカー、ZIC1 陽性細胞の存在を裏付けます。Fluor5 染付培養細胞の電気刺激を含む、カルシウム イメージングに機能神経 (図 9図 1 の補足、および補足図 2) が示されている場合それは確認されていませんが、これら顆粒細胞をだった。過去 35 日間文化の長さを拡張することによって成熟する細胞のより多くの時間を与えること、によって機能的な神経活動量が増やす必要があります議論の余地です。この潜在的な可能性が、将来的に検討します。
上記の提案研究の行に加えてそれは 2 D と 3 D のプロトコル間 (量と質) のプロダクト id の違いを決定するのに興味のでしょう。外因性 Fgf の重要性 2 D プロトコルでテストされなかった、それは知っている場合に役立ちますめっき後, 3次元構造の欠如し、関連するシグナル伝達経路になるので 2 D 文化早期化合物をパターンの人に多かれ少なかれ依存。多くの簡易プロトコル (例えばRA、BDNF、SAG) は、同様にさらに捜査のため説得力のある線です。今後の研究がより良いを特徴付ける (との生成効率を評価する) 新しい研究ツールの恩恵を最後に、人間固有の小脳神経細胞サブタイプ。
心の特定の警告の両方のプロトコルは、さまざまな目的に適した製品と小脳分化の使用する可能性があります報告。彼らは、このような分化または他の種類対象となる神経分化のための基本的なモデルとして細胞の生存率をテスト パイロット研究を行っている研究の実用的な開始ポイントとして役立つかもしれない。

生体内で小脳の発生1,2,3、4を模倣するという原理に最初小脳系統へ hPSCs を区別するための in vitroプロトコルが運営しています。など、彼らはプロ小脳パターニングと成熟を駆動する特定時に導入した因子の継承が必要です。これらの中で最高、wnt シグナルをした骨形成タンパク質 (Bmp) と辷りオーガナイザー5,6、7の中間後脳発達と形成に知られている役割を持つ線維芽細胞成長因子 (Fgf)。もちろん、各追加の手順と因子研究員、労働集約的な操作および大きい費用の増加を意味し、関心のあるのでより簡単なプロトコルと同じ結果を達成するための能力を開発します。細胞がこのようなタイトな外部制御の開発で体外を必要とするかどうか、この実用的な問題は仮定の質問とうまく合致します。
小脳分化の 2015 年に公開されたプロトコルによるパターンの目的8FGF2、FGF19、間質細胞由来因子 1 (SDF1) を使用して、成長因子の豊富な数を使用しての必要性に対処。本研究はまた浮遊三次元培養システムを用いた前小脳プロトコルから異なっていた。細胞陽性小脳マーカーに加え、彼らの技術によって生成される"脳"オルガノイドは関連する形態、菱形の唇のような構造などの伝統的な 2次元単層培養で使用できないを展示する示されていた。複雑な成長因子、96 ウェル プレート (96WPs) で統一された胚様体 (EBs) 文化の形成などその他の機能に関して高価は低くなりますがそれ複雑な手続き中に行われた最初のステップ。3 D の他のプロトコルは、同じ年に発行された、一般的で安価な細胞培養技術9を使用して神経系統への正常な分化を報告しました。このグループは、皮質小脳分化ではなく調査していたが小脳分化の彼らの概念の適用は割引されませんでした。
我々 は最近パターン化要因の数が減少を使用して 3 D 小脳分化プロトコルを報告した (すなわち、FGF2、4、および 8)、中規模要件10を最小限に抑える全体 6 ウェル プレート (6WPs) の細胞を保つことによってセットアップの簡略化だけでなく。顆粒細胞の生産を支援するために滑らかアゴニスト (SAG) は、最終的な成熟のステップ中に使用されました。サグは顆粒細胞前駆体調査生体内で1,2,の育成の推進におけるその役割のために、以前小脳プロトコルで使用されていたソニック ・ ヘッジホッグ (SHH) により安価な化学の代替11,12,13。差別化製品は、形態学的に関連する構造8,9の小脳関連マーカーの存在を含め、他の 3 D プロトコルからと一致しました。このような結果は、擬態の詳細以前のメッセージを強化[生体内の環境必要はないかもしれませんの複雑な 3 Dの in vitro分化プロトコル。
3 D プロトコルに加えてこのレポートは同じのクイック セットアップでは、基本的な材料は、設計された 2D プロトコルをについて説明します、成長因子の数を削減します。早期に関連付けられたマーカーの陽性、ヒト胚性幹細胞 (hESCs) からの細胞を作り出すことができる、誘導多能性幹細胞 (hiPSCs) 神経、小脳、および顆粒細胞の id。また、カルシウム イメージングは、機能的な人間ニューロンの存在を示します。プロトコルの間を選択する能力はいずれかに興味のある方、研究者のレベルの柔軟性を追加します: (1) 生成する特定のセル型、(2) モデルの人間の脳の開発と関連する構造、単分子膜の最適化解析 (3)設定 (例えば、ホールセル記録)、または混合神経文化 (4) 細胞間の相互作用。そのシンプルで低コストの性質はそれら hPSC フィールドに新しい、または分化オプションを更に探検するから基本 hPSC プロシージャを必要者のアクセスになります。

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12+Glutamax</td><td>Gibco</td><td>31331-028</td><td>glutamine fortified DMEM/F12</td></tr><tr><td>Neurobasal medium</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td>neural basic medium</td></tr><tr><td>N2 supplement</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplement</td><td>Gibco</td><td>17504001</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Imgen</td><td>PT468-B</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Non-essential Amino Acids (NEAA)</td><td>Gibco</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>beta-mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Ornithine</td><td>Sigma</td><td>P3655</td><td></td></tr><tr><td>Poly (2-hydroxyethyl methacrylate)</td><td>Sigma</td><td>P3932</td><td>aka Poly-Hema</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>E8 medium and supplement</td><td>Gibco</td><td>A1517001</td><td>hPSC medium and supplement</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Sigma</td><td>S-5886</td><td></td></tr><tr><td>y-27632 (ROCK inhibitor)</td><td>SelleckChem</td><td>S1049-10mg</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D-2650</td><td></td></tr><tr><td>Geltrex</td><td>Gibco</td><td>A1413302</td><td>hPSC-appropriate adherent coating (PAAC)</td></tr><tr><td>0,5M EDTA</td><td>Gibco</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>0.2 um filter</td><td>VWR</td><td>28145-77</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL Eppendorf tube</td><td>VWR</td><td>525-0130</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>21331-020</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>VWR</td><td>83804360</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma</td><td>PM996</td><td>wrap for culture plates</td></tr><tr><td>cryotubes</td><td>ThermoFisher</td><td>368632</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Gibco</td><td>12563-029</td><td>trypsin-based dissociation agent</td></tr><tr><td>Defined Trypsin Inhibitor (DTI)</td><td>Gibco</td><td>R-007-100</td><td></td></tr><tr><td>FGF-2</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>FGF-4</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>100-31</td><td></td></tr><tr><td>FGF-8B</td><td>Peprotech</td><td>100-25</td><td></td></tr><tr><td>Retinoic Acid</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>Brain Derived Neurotrophic Factor</td><td>Peprotech</td><td>450-02</td><td></td></tr><tr><td>Glial Derived Neurotrophic Factor</td><td>Peprotech</td><td>450-10</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>Neurotrophic Factor 3</td><td>Peprotech</td><td>450-03</td><td></td></tr><tr><td>Smoothened Agonist (SAG)</td><td>Cayman</td><td>11914</td><td>CAS 912545-86-9</td></tr><tr><td>Axiovert 40C microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Brightfield imaging microscope</td></tr><tr><td>Axiocam</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Brightfield imaging - image aquisition</td></tr><tr><td>Eppendorf Centrifuge 5810</td><td>Eppendorf</td><td>521-0996</td><td>centrifuge for cell culture</td></tr><tr><td>PBS (gebufferde natrium oplossing)</td><td>Braun Medical</td><td>3623140</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Serological pipets</td><td>VWR</td><td>612-4950</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Serological pipets</td><td>VWR</td><td>612-4951</td><td></td></tr><tr><td>6-wells culture plates</td><td>VWR</td><td>734-2323</td><td></td></tr><tr><td>12-wells culture plates</td><td>VWR</td><td>734-2324</td><td></td></tr><tr><td>hESCs</td><td>WiCELL</td><td></td><td>line H01</td></tr></tbody></table>

streamlined 3d cerebellar differentiation protocol with optional 2d modification

複雑性と微分のプロトコルのコスト低減は、研究者にとって重要です。この関心は、外因性パターン形成要因がひと多能性幹細胞 (hPSC) に脳の発達や病気の表現型をマスキングなどの病態モデルに導入する可能性があります可能性のある意図しない影響についての懸念に適合します。ここでは、hPSCs、設計の簡単な起動方法、パターン形成因子の減少と以前プロトコルよりも材料の要件以下の 2 つの小脳分化プロトコルを提案する.最近では、我々 開発培養プロシージャは、sub/心室ゾーンなど脳の発達のモデル化に関連して菱形の形態を含む他の脳「における」プロトコルと一貫性のあるフローティング 3 次元 (3 D) 製品を生成唇状の構造物。2 番目は、製品小脳関連マーカー陽性ニューロンのようなカルシウムの流入を展示と機能的な小脳ニューロンを生成することが示されている完全な分化に付着、2次元単層プロシージャを使用します。一緒に、これらのプロトコルは科学者合理化された神経分化の他の種類のテストの基本的なモデルと同様、別の研究目的に適したのオプションの選択肢を提供しています。

2 D と 3 D の小脳分化プロトコルを考慮し低成長の視覚的な概要 外因とめっきの時刻を識別する 2 D と 3 D 小脳分化のプロトコルでは、全体的なタイムラインを図 1に示します。図 2に 3 D 小脳分化を受けている hPSCs の典型的な進行状況を示す: フィーダー フリー培養日 0 (左図); で始まる植民地として悪名高く行 H01 と日 2 (中上); による EB 形成を受ける次の日 14 (右上); RA と FGF8 神経誘導明らかルーメンと大きい細胞凝集塊に成長さまざまなサイズと形状で 28 日 (左下); の総計を形作る28 (中下); の日に示される単一集合体の構造の異なる複雑さの開発35 日で同じ構造 (右下) に形態学的変化を続けた。図 3に描かれている 2 D 小脳分化を受けている hPSCs の典型的な進行状況: hESC にフィーダー フリー培養日 0 (hESC の植民地の間で区別されたセルの領域を示す円と、図の左上) の植民地として H01 を行;日 2 (中上); による EB 形成を受ける次の日 13 (右上); RA と FGF8 神経誘導明らかルーメンと大きい細胞凝集塊に成長(左下); 14 日でめっき付着細胞として増殖そしてより多くの複合体/成熟した形態と細胞の単層として [低 (中下) と高倍率 (右下) 35 日。
3 D 製品展示マーカーと初期の神経上皮の構造 図 2(下の左画像)図 4確率のマージし同様に、成長や成熟率の変化や、骨材の分割による養殖全体に見られる 3 D 集計形態の不均一性を示し。不均一性にもかかわらず各分化は免疫細胞化学 (ICC)図5 染色によって示される小脳顆粒マーカー ZIC1 を含む初期の神経は、神経細胞マーカーを示す集計を生成します。もっと重要なは、図 5と図 6は、減らされた成長因子で、単純な 3次元培養が初期神経上皮や菱形リップなど脳の発達に関連する複雑な構造を持つ集合体を生成することが示唆されました。
2 D 製品展示小脳マーカーと機能の神経活動 複雑な 3次元構造を再現できないのは、2 D の文化、ICC 染色図 7で示されるように、小脳顆粒細胞のマーカー ZIC1 を含む初期の神経は、神経細胞マーカーを示す細胞を生成することができるが。RT-PCR による遺伝子発現解析図 8に見られるように初期顆粒細胞のマーカー ATOH1の存在は実験と線の間の変数が ICC 染色結果をサポートします。カルシウム イメージングは、2 D の文化でより簡単に処理されます。補足のビデオ 2補足のビデオ 1図 9からわかるように、電気刺激細胞は機能的なニューロンの生成を示唆している神経細胞の発火パターンの代表的なカルシウムの流入を示します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig1.jpg"> 図 1: 分化プロトコル (分化の日 0 から始まる) のタイムライン。実線ボックスを示す点線のボックスがオプションの 2 D 加工のプレート コーティングを示すし、特定の要因は、培養液に追加されます。FGF2、下向きの矢印は、低濃度 (4 ng/mL)、上向きの矢印は高濃度 (20 ng/mL) を指します。この図は、ホームズとハイネの10から変更されています。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig2.jpg"> 図 2: 3 D プロトコルの代表明視野イメージ。d0 d2 で EBs の hESC 植民地誘導 d14 で違うサイズの形態 (番号 1-5) d28、d28 で、(手紙、-のcで示される) ユニークな個人レベルの機能を備えた単一の集計で集計集計とd35 で同じ機能で目に見える変化は。スケールバー = 100 μ m。この図は、ホームズとハイネの10から変更されています。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig3.jpg"> 図 3: 2次元プロトコルの代表明視野イメージ。hESC コロニー d0、d2 で EBs を d35 で成熟後、d14 で集計をメッキでは 5 倍の倍率と 20 倍の倍率で見られる後で d13 の誘導後集計します。上の左側のパネルに白い円は、hESC の植民地の間で区別されたセルの領域を示しています。スケールバー = 50 μ m.<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig4.jpg"> 図 4: 明視野イメージ 3 D の文化のさまざまなサイズと複雑さを示すします。集計は (A) 8 日目 (hESCs)、および (B) d35 (hiPSCs)。後者の画像は、全体の集計を表示する 3 つの別々 の画像で構成されます。両方の集計は、小さい骨材の損失 (中断) 構造の結合によって影響されている可能性があります。スケール バー 200 μ m を =。この図は、ホームズとハイネの10から再発行されます。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig5.jpg"> 図 5: 3 D 製品の ICC 画像表示関連マーカーおよび構造体。文化 d35、3 D 製品展示: PAX6 (緑)、TBR2 (赤) 神経のロゼットのような形成の内腔で (最初の行)。DCX (緑) と外側の端心室ゾーン (VZ) から広がる NeuN (赤)-(2 列目) のような構造;KIRREL2、小脳の神経上皮に関連付けられたマーカー (3 列目、左)。そして ZIC1 マーカーに関連付け小脳顆粒細胞 (3 番目の行、右)。4 つの異なる hPSC ラインを使用して複数回実験を行った: hESC ライン H01 (n = 5) と iPSC 線 hvs88 (n = 4)、hvs60 (n = 3)、および hvs51 (n = 1)。矢印の指す菱形リップ (RL) の構造のような。スケールバー = 100 μ m。この図は、ホームズとハイネの10から再発行されます。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig6.jpg"> 図 6: 3 D 製品で大規模な心室のゾーンのような構造です。文化 d35 で悪名高く派生集約は PAX6 (緑) と TBR2 (赤) 心室ゾーン (VZs) と脳室下帯ゾーン (SVZs)、 in vivo内で見つかった初期のニューロンに関連する一般的です。(Top)アスタリスク (*) マーク VZ 専攻/深さを示す角かっこで、骨材のエッジに沿って実行している VZ のような地方の根尖側 SVZs (中央) 結合される信号は、PAX6 の散乱セクションを表示/+/TBR2 セル上部の右側の終わりの方のサイズが大きく。新築マンション。(下)中央のパネルの四角形で示されるセクションの高倍率画像。スケールバー = 100 μ m。この図は、ホームズとハイネの10から変更されています。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig7.jpg"> 図 7: 2 D 製品の ICC イメージが関連するマーカーを表示します。2 D 製品展示、hESCs (上の行) と hiPSCs (下の行)、細胞の肯定的な文化 d35 で: 顆粒細胞のマーカー ZIC1 と渡り鳥の小脳神経細胞マーカー TAG1 (左の列)。神経マーカー ニューロ フィラメント (NF)、TAG1 (右の列)。スケールバー = 50 μ m.<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig7large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig8.jpg"> 図 8: 2 D 製品の RT-PCR 。hESC ライン H01 の mRNA 発現解析 (上の行) とによるライン hvs60 (下段) 2 D の終わりにプロトコルを示しますゲル電気泳動と製品: 顆粒細胞のマーカー ZIC1、顆粒細胞のマーカー ATOH1、渡り鳥の小脳神経細胞マーカーに、TAG1、プルキンエセル マーカー カルビンジン (CALB)、電位依存性カルシウム チャネル CACNA1A (C 1 a)、CACNA1E (C 1 e)、γ-アミノ酪酸 (GABA) B 受容体 1 (G Br1)、およびハウスキーピング遺伝子 EIF4G2)。
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig9.jpg"> 図 9: 2 D 製品のカルシウム イメージング分析します。文化 d35 で hPSC 分化製品は fluor5 色素の孵化後、顕微鏡下で 2 分間に記録されました。30 s、10 セル電気刺激 s で 10 Hz。 (A) が 0 でショー hESCs を静止画像 (左) と 30 分の電気刺激開始後 s (右)。矢印は、カルシウム流入の解析 (ROI) 関心領域を示しています。投資収益率の時間に対する相対的な蛍光の変更を (B) のグラフィカルな分析を示す (蛍光の変化 = (F F0)/F0、どこ F0 = (∑F1 n)/n) 前に中、後に発生するニューロンのような穂状花序を持つ刺激。黒いバーは、電気刺激の長さを示します。スケール バーの (白) = 50 μ m フル録画 hESC (ここに見られる) と、(表示されていません) による回線利用補助のビデオ 1で補助ビデオ 2、それぞれ。レコーディングは、4 倍のスピードでの avi ファイル形式です。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig9large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
補足ビデオ 1: カルシウム hESC ライン H01 から 2 D 製品のビデオ イメージングします。文化 d35 で H01 は fluor5 の孵化後、顕微鏡下で 2 分間記録された悪名高くラインから差別化製品を染めます。30 s、10 セル電気刺激 10 Hz の. 録音で s が 2 フレーム/秒で行われ 〜 7 フレーム/秒 〜 30 を永続的なビデオの制作で AVI ビデオに加工 s 〜 4 倍速で。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/figS1_hESC_stim@10Hz.avi">このファイルをダウンロードするここをクリックしてください</a>。
補足ビデオ 2: カルシウム イメージングによるライン hvs51 から 2 D 製品のビデオします。文化 d35 で差別化製品によるライン hvs51 からは fluor5 色素の孵化後、顕微鏡下で 2 分間に記録されました。30 s、10 セル電気刺激 10 Hz の. 録音で s が 2 フレーム/秒で行われ 〜 7 フレーム/秒 〜 30 を永続的なビデオの制作で AVI ビデオに加工 s 〜 4 倍速で。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/figS2_hiPSC_stim@10Hz.avi">このファイルをダウンロードするここをクリックしてください</a>。

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Streamlined 3D Cerebellar Differentiation Protocol with Optional 2D Modification

簡易 3 D 識別定義されているプロトコルを使用して hPSCs の媒体と初期の上皮細胞内構造を有する細胞集塊を生成できると関連付けられている小脳のマーカーだけでなく、オプションの肯定的な成長因子を減少機能的なニューロンを生成する単分子膜として分化細胞の 2 D 変更。

オプションの 2 D 加工で合理化された 3 D 小脳分化プロトコル

Reducing the complexity and cost of differentiation protocols is important for researchers. This interest fits with concerns about possible unintended ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

7.5K ビュー.  VU University Medical Center. 簡易 3 D 識別定義されているプロトコルを使用して hPSCs の媒体と初期の上皮細胞内構造を有する細胞集塊を生成できると関連付けられている小脳のマーカーだけでなく、オプションの肯定的な成長因子を減少機能的なニューロンを生成する単分子膜として分化細胞の 2 D 変更。

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Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

小脳顆粒ニューロンの遺伝子操作<em&gt;体外</em&gt;と<em&gt;インビボ</em&gt;ニューロンの形態と移行を研究するために、

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

神経科学

Isolation of Distinct Cell Populations from the Developing Cerebellum by Microdissection

Microdissection is a novel technique that can isolate specific regions of a tissue and eliminate contamination from cellular sources in adjacent areas. This method was first utilized in the study of Nestin-expressing progenitors (NEPs), a newly identified population of cells in the cerebellar external germinal layer (EGL). Using microdissection in combination with fluorescent-activated cell sorting (FACS), a pure population of NEPs was collected separately from conventional granule neuron precursors in the EGL and from other contaminating Nestin-expressing cells in the cerebellum. Without microdissection, functional analyses of NEPs would not have been possible with the current methods available, such as Percoll gradient centrifugation and laser capture microdissection. This technique can also be applied for use with various tissues that contain either recognizable regions or fluorescently-labeled cells. Most importantly, a major advantage of this microdissection technique is that isolated cells are living and can be cultured for further experimentation, which is currently not possible with other described methods.

Nestin-expressing&#160;progenitors are a newly identified population of neuronal progenitors in the developing cerebellum. Using the microdissection technique presented here in combination with fluorescent-activated cell sorting, this cell population can be purified with no contamination from other cerebellar regions and can be cultured for further studies.

マイクロダイセクションによる開発小脳とは異なる細胞集団の単離

Microdissection is a novel technique that can isolate specific regions of a tissue and eliminate contamination from cellular sources in adjacent areas. ...

2D and 3D Human Induced Pluripotent Stem Cell-Based Models to Dissect Primary Cilium Involvement during Neocortical Development

Primary cilia (PC) are non-motile dynamic microtubule-based organelles that protrude from the surface of most mammalian cells. They emerge from the older centriole during the G1/G0 phase of the cell cycle, while they disassemble as the cells re-enter the cell cycle at the G2/M phase boundary. They function as signal hubs, by detecting and transducing extracellular signals crucial for many cell processes. Similar to most cell types, all neocortical neural stem and progenitor cells (NSPCs) have been shown harboring a PC allowing them to sense and transduce specific signals required for the normal cerebral cortical development. Here, we provide detailed protocols to generate and characterize two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) cell-based models from human induced pluripotent stem cells (hIPSCs) to further dissect the involvement of PC during neocortical development. In particular, we present protocols to study the PC biogenesis and function in 2D neural rosette-derived NSPCs including the transduction of the Sonic Hedgehog (SHH) pathway. To take advantage of the three-dimensional (3D) organization of cerebral organoids, we describe a simple method for 3D imaging of in toto immunostained cerebral organoids. After optical clearing, rapid acquisition of entire organoids allows detection of both centrosomes and PC on neocortical progenitors and neurons of the whole organoid. Finally, we detail the procedure for immunostaining and clearing of thick free-floating organoid sections preserving a significant degree of 3D spatial information and allowing for the high-resolution acquisition required for the detailed qualitative and quantitative analysis of PC biogenesis and function.

We present detailed protocols for the generation and characterization of 2D and 3D human induced pluripotent stem cell (hIPSC)-based models of neocortical development as well as complementary methodologies enabling qualitative and quantitative analysis of primary cilium (PC) biogenesis and function.

2Dおよび3Dヒト人工多能性幹細胞ベースのモデルにより、新皮質発生中の原発性繊毛の関与を解剖

Primary cilia (PC) are non-motile dynamic microtubule-based organelles that protrude from the surface of most mammalian cells. They emerge from the older ...

発生生物学

Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can trigger cerebellar dysfunction. Most of the current knowledge about disease-related neuronal phenotypes is based on postmortem tissues, which makes understanding of disease progression and development difficult. Animal models and immortalized cell lines have also been used as models for neurodegenerative disorders. However, they do not fully recapitulate human disease. Human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have great potential for disease modeling and provide a valuable source for regenerative approaches. In recent years, the generation of cerebral organoids from patient-derived iPSCs improved the prospects for neurodegenerative disease modeling. However, protocols that produce large numbers of organoids and a high yield of mature neurons in 3D culture systems are lacking. The protocol presented is a new approach for reproducible and scalable generation of human iPSC-derived organoids under chemically-defined conditions using scalable single-use bioreactors, in which organoids acquire cerebellar identity. The generated organoids are characterized by the expression of specific markers at both mRNA and protein level. The analysis of specific groups of proteins allows the detection of different cerebellar cell populations, whose localization is important for the evaluation of organoid structure. Organoid cryosectioning and further immunostaining of organoid slices are used to evaluate the presence of specific cerebellar cell populations and their spatial organization.

This protocol describes a dynamic culture system to produce controlled size aggregates of human pluripotent stem cells and further stimulate differentiation in cerebellar organoids under chemically-defined and feeder-free conditions using a single-use bioreactor.

ヒト多能性幹細胞からの成熟小脳オルガノイドのスケーラブルな生成と免疫染色による特徴付け

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can ...

生物工学

Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures

In the nervous system, myelin is a complex membrane structure generated by myelinating glial cells, which ensheathes axons and facilitates fast electrical conduction. Myelin alteration has been shown to occur in various neurological diseases, where it is associated with functional deficits. Here, we provide a detailed description of an ex vivo model consisting of mouse organotypic cerebellar slices, which can be maintained in culture for several weeks and further be labeled to visualize myelin.

Here we present a method to prepare organotypic slice cultures from mouse cerebellum and myelin sheath staining by immunohistochemistry suitable for investigating mechanisms of myelination and remyelination in the central nervous system.

準備や髄脊髄小脳スライス培養の免疫染色

In the nervous system, myelin is a complex membrane structure generated by myelinating glial cells, which ensheathes axons and facilitates fast electrical ...

Ex Vivo Myelination and Remyelination in Cerebellar Slice Cultures as a Quantitative Model for Developmental and Disease-Relevant Manipulations

Studying myelination&#160;in vitro&#160;and&#160;in vivo poses numerous challenges. The differentiation of oligodendrocyte precursor cells (OPCs)&#160;in vitro, although scalable,&#160;does not recapitulate axonal myelination. OPC-neuron cocultures and OPC-fiber cultures allow for the examination of in vitro myelination, but they lack additional cell types that are present in vivo, such as astrocytes and microglia. In vivo&#160;mouse models, however, are less amenable to chemical, environmental, and genetic manipulation and are much more labor intensive. Here, we describe&#160;an&#160;ex vivo mouse cerebellar slice culture (CSC) quantitative system that is useful for: 1) studying developmental myelination, 2) modeling demyelination and remyelination, and 3) conducting translational research. Sagittal sections of the cerebellum and hindbrain are isolated from postnatal day (P) 0&#8211;2 mice, after which they myelinate&#160;ex vivo&#160;for 12 days. During this period, slices can be manipulated in various ways, including the addition of compounds to test for an effect on developmental myelination. In addition, tissue can be fixed for electron microscopy to assess myelin ultrastructure and compaction. To model disease, CSC can be subjected to acute hypoxia to induce hypomyelination. Demyelination in these explants can also be induced by lysolecithin, which allows for the identification of factors that promote remyelination. Aside from chemical and environmental modifications, CSC can be isolated from transgenic mice and are responsive to genetic manipulation induced with Ad-Cre adenoviruses and tamoxifen. Thus, cerebellar slice cultures are a fast, reproducible, and quantifiable model for recapitulating myelination.

Presented is a protocol for an ex vivo quantitative model of demyelination and remyelination using mouse cerebellar slice cultures. This method closely recapitulates an in vivo model with its full complement of CNS cell types in intact tissue, while maintaining the chemical, genetic, and environmental amenability of an in vitro system.

Studying myelination&#160;in vitro&#160;and&#160;in vivo poses numerous challenges. The differentiation of oligodendrocyte precursor cells (OPCs)&#160;in ...

Modeling Human Cerebellar Development In Vitro in 2D Structure

The precise and timely development of the cerebellum is crucial not only for accurate motor coordination and balance but also for cognition. In addition, disruption in cerebellar development has been implicated in many neurodevelopmental disorders, including autism, attention deficit-hyperactivity disorder (ADHD), and schizophrenia. Investigations of cerebellar development in humans have previously only been possible through post-mortem studies or neuroimaging, yet these methods are not sufficient for understanding the molecular and cellular changes occurring in vivo during early development, which is when many neurodevelopmental disorders originate. The emergence of techniques to generate human-induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells and the ability to further re-differentiate iPSCs into neurons have paved the way for in vitro modeling of early brain development. The present study provides simplified steps toward generating cerebellar cells for applications that require a 2-dimensional (2D) monolayer structure. Cerebellar cells representing early developmental stages are derived from human iPSCs via the following steps: first, embryoid bodies are made in 3-dimensional (3D) culture, then they are treated with FGF2 and insulin to promote cerebellar fate specification, and finally, they are terminally differentiated as a monolayer on poly-l-ornithine (PLO)/laminin-coated substrates. At 35 days of differentiation, iPSC-derived cerebellar cell cultures express cerebellar markers including ATOH1, PTF1&#945;, PAX6, and KIRREL2, suggesting that this protocol generates glutamatergic and GABAergic cerebellar neuronal precursors, as well as Purkinje cell progenitors. Moreover, the differentiated cells show distinct neuronal morphology and are positive for immunofluorescence markers of neuronal identity such as TUBB3. These cells express axonal guidance molecules, including semaphorin-4C, plexin-B2, and neuropilin-1, and could serve as a model for investigating the molecular mechanisms of neurite outgrowth and synaptic connectivity. This method generates human cerebellar neurons useful for downstream applications, including gene expression, physiological, and morphological studies requiring 2D monolayer formats.

Modeling Human Cerebellar Development In Vitro in 2D Structure

The present protocol explains the generation of a 2D monolayer of cerebellar cells from induced pluripotent stem cells for investigating the early stages of cerebellar development.

ヒト小脳発生 のin vitro での2次元構造モデリング

The precise and timely development of the cerebellum is crucial not only for accurate motor coordination and balance but also for cognition. In addition, ...

Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the Nucleoskeleton and Cytoskeleton (LINC complexes). These protein scaffolds span the nuclear envelope and connect the interior of the nucleus to components of the surrounding cytoplasmic cytoskeleton. LINC complexes consist of two evolutionary-conserved protein families, Sun proteins and Nesprins that harbor C-terminal molecular signature motifs called the SUN and KASH domains, respectively. Sun proteins are transmembrane proteins of the inner nuclear membrane whose N-terminal nucleoplasmic domain interacts with the nuclear lamina while their C-terminal SUN domains protrudes into the perinuclear space and interacts with the KASH domain of Nesprins. Canonical Nesprin isoforms have a variable sized N-terminus that projects into the cytoplasm and interacts with components of the cytoskeleton. This protocol describes the validation of a dominant-negative transgenic mouse strategy that disrupts endogenous SUN/KASH interactions in a cell-type specific manner. Our approach is based on the Cre/Lox system that bypasses many drawbacks such as perinatal lethality and cell nonautonomous phenotypes that are associated with germline models of LINC complex inactivation. For this reason, this model provides a useful tool to understand the role of LINC complexes during development and homeostasis in a wide array of tissues.

Nuclear envelope proteins play a central role in many basic biological processes and have been implicated in a variety of human diseases. This protocol describes a new Cre/Lox-based mouse model that allows for the spatiotemporal control of LINC complexes disruption.

細胞特異的にLINC複合体を破壊するマウスモデルの検証

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the ...

生物学

Cranial Neural Crest Cells Three-Dimensional In Vitro Differentiation Protocol for Multiplexed Assay

With their remarkable capacity to generate both ectodermal and mesenchymal derivatives, cranial neural crest cells (CNCC) have attracted a lot of interest in studying the mechanisms regulating cell fate decisions and plasticity. Originating in the dorsal neuroepithelium, this cell population is transient and relatively rare in the developing embryo - making functional tests, genomic screens, and biochemistry assays challenging to perform in vivo. To overcome these limitations, several methods have been developed to model CNCC development in vitro. Neurosphere (NS) based culturing methods provide a complex microenvironment that recapitulates the developing anterior neuroepithelium in 3D. These systems allow the growth of many NS in the same plate to generate a large amount of CNCC, but the produced NS present a high variability in shape, size, and number of CNCC formed - making quantitative assays difficult to perform. This protocol outlines a reproducible method for generating NS from mouse embryonic stem cells (mESC) in a 96-well format. NS generated in 96-well plates produce cranial neural crest cells (CNCC), which can be further cultured. By controlling the number of starting cells, this approach reduces variability in the size and shape between NS and increases reproducibility across experiments. Finally, this culture system is adaptable to several applications and offers a higher degree of flexibility, making it highly customizable and suitable for multiplexing experimental conditions.

We present a three-dimensional (3D) in vitro differentiation protocol generating neurospheres of reproducible size to produce cranial neural crest cells from mouse embryonic stem cells. We show that this methodology reduces variability compared to previous protocols and how it can be used for multiplexed assay to study cranial neural crest cell development.

多重化の試みのための頭蓋神経堤の細胞の三次元 の試験管 外分化のプロトコル

With their remarkable capacity to generate both ectodermal and mesenchymal derivatives, cranial neural crest cells (CNCC) have attracted a lot of interest ...

Cerebellum Dissection and Slice Preparation: A Method to Generate Tissue Slices from Mouse Cerebellum

Source: Thetiot, M. et al. <a href="https://www.jove.com/video/59163" target="_blank">Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures.</a> J. Vis. Exp. (2019)
This video describes a method to generate tissue slices from the mouse cerebellum. The cerebellar slices can be used for organotypic culturing that provides insights into neurodevelopmental mechanisms, including myelination dynamics.

小脳解剖とスライス調製:マウス小脳から組織スライスを生成する方法

Source: Thetiot, M. et al. Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures. J. Vis. Exp. (2019)
This video describes a ...

オプションの 2 D 加工で合理化された 3 D 小脳分化プロトコル

要約

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小脳顆粒ニューロンの遺伝子操作

マイクロダイセクションによる開発小脳とは異なる細胞集団の単離

2Dおよび3Dヒト人工多能性幹細胞ベースのモデルにより、新皮質発生中の原発性繊毛の関与を解剖

ヒト多能性幹細胞からの成熟小脳オルガノイドのスケーラブルな生成と免疫染色による特徴付け

準備や髄脊髄小脳スライス培養の免疫染色

Ex Vivo Myelination and Remyelination in Cerebellar Slice Cultures as a Quantitative Model for Developmental and Disease-Relevant Manipulations

ヒト小脳発生のin vitro での2次元構造モデリング

細胞特異的にLINC複合体を破壊するマウスモデルの検証

多重化の試みのための頭蓋神経堤の細胞の三次元の試験管外分化のプロトコル

小脳解剖とスライス調製:マウス小脳から組織スライスを生成する方法

オプションの 2 D 加工で合理化された 3 D 小脳分化プロトコル

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ヒト多能性幹細胞からの成熟小脳オルガノイドのスケーラブルな生成と免疫染色による特徴付け

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多重化の試みのための頭蓋神経堤の細胞の三次元 の試験管 外分化のプロトコル

小脳解剖とスライス調製:マウス小脳から組織スライスを生成する方法

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多重化の試みのための頭蓋神経堤の細胞の三次元の試験管外分化のプロトコル