우리는 Gerbren 제이콥스와 Jurjen Broeke Prisca 리사 Gasparotto 생성 및 두 개의 제어 iPSC 라인의 특성을 보여주는 우리의 절차에 대 한 기여에 대 한 Leferink를 그들의 전문 기술 지원에 대 한 감사.

<ol>
	<li>Erceg, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+functional+cerebellar-like+cells.">Efficient differentiation of human embryonic stem cells into functional cerebellar-like cells.</a> Stem Cells Dev. 19, 1745-1756 (2010).</li><li>Erceg, S., Lukovic, D., Moreno-Manzano, V., Stojkovic, M., Bhattacharya, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+cerebellar+neurons+from+human+pluripotent+stem+cells.">Derivation of cerebellar neurons from human pluripotent stem cells.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. , (2012).</li><li>Su, H. L., Muguruma, K., Matsuo-Takasaki, M., Kengaku, M., Watanabe, K., Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+cerebellar+neuron+precursors+from+embryonic+stem+cells.">Generation of cerebellar neuron precursors from embryonic stem cells.</a> Dev Biol. 290, 287-296 (2006).</li><li>Salero, E., Hatten, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+ES+cells+into+cerebellar+neurons.">Differentiation of ES cells into cerebellar neurons.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 2997-3002 (2007).</li><li>Joyner, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engrailed,+Wnt+and+Pax+genes+regulate+midbrain--hindbrain+development.">Engrailed, Wnt and Pax genes regulate midbrain--hindbrain development.</a> Trends Genet. 12, 15-20 (1996).</li><li>Joyner, A. L., Liu, A., Millet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Otx2,+Gbx2+and+Fgf8+interact+to+position+and+maintain+a+mid-hindbrain+organizer.">Otx2, Gbx2 and Fgf8 interact to position and maintain a mid-hindbrain organizer.</a> Curr Opin Cell Biol. 12, 736-741 (2000).</li><li>Tam, E. W. Y., Benders, M. J. N. L., Heine, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+Development-The+Impact+of+Preterm+Birth+and+Comorbidities.">Cerebellar Development-The Impact of Preterm Birth and Comorbidities.</a> Fetal and Neonatal Physiology. , (2017).</li><li>Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+polarized+cerebellar+tissue+in+3D+culture+of+human+pluripotent+stem+cells.">Self-organization of polarized cerebellar tissue in 3D culture of human pluripotent stem cells.</a> Cell Rep. 10, 537-550 (2015).</li><li>Pasca, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+cortical+neurons+and+astrocytes+from+human+pluripotent+stem+cells+in+3D+culture.">Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture.</a> Nat Methods. 12, 671-678 (2015).</li><li>Holmes, D. B., Heine, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+3D+protocol+capable+of+generating+early+cortical+neuroepithelium.">Simplified 3D protocol capable of generating early cortical neuroepithelium.</a> Biology Open. 6, 402-406 (2017).</li><li>Chen, J. K., Taipale, J., Cooper, M. K., Beachy, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Hedgehog+signaling+by+direct+binding+of+cyclopamine+to+Smoothened.">Inhibition of Hedgehog signaling by direct binding of cyclopamine to Smoothened.</a> Genes Dev. 16, 2743-2748 (2002).</li><li>Chen, J. K., Taipale, J., Young, K. E., Maiti, T., Beachy, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+modulation+of+Smoothened+activity.">Small molecule modulation of Smoothened activity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14071-14076 (2002).</li><li>Dahmane, N., Ruiz-i-Altaba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog+regulates+the+growth+and+patterning+of+the+cerebellum.">Sonic hedgehog regulates the growth and patterning of the cerebellum.</a> Development. 126, 3089-3100 (1999).</li><li>Borghesani, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BDNF+stimulates+migration+of+cerebellar+granule+cells.">BDNF stimulates migration of cerebellar granule cells.</a> Development. 129, 1435-1442 (2002).</li><li>Kelava, I., Lancaster, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+Cell+Models+of+Human+Brain+Development.">Stem Cell Models of Human Brain Development.</a> Cell Stem Cell. 18, 736-748 (2016).</li><li>Kadoshima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+axial+polarity,+inside-out+layer+pattern,+and+species-specific+progenitor+dynamics+in+human+ES+cell-derived+neocortex.">Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 20284-20289 (2013).</li><li>Englund, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pax6,+Tbr2,+and+Tbr1+are+expressed+sequentially+by+radial+glia,+intermediate+progenitor+cells,+and+postmitotic+neurons+in+developing+neocortex.">Pax6, Tbr2, and Tbr1 are expressed sequentially by radial glia, intermediate progenitor cells, and postmitotic neurons in developing neocortex.</a> J Neurosci. 25, 247-251 (2005).</li><li>Warlich, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vector+design+and+imaging+approaches+to+visualize+the+early+stages+of+cellular+reprogramming.">Lentiviral vector design and imaging approaches to visualize the early stages of cellular reprogramming.</a> Mol Ther. 19, 782-789 (2011).</li></ol>

저자는 공개 없다.

복잡성 및 비용 요인이 관련 줄기 세포 연구자 선택 또는 분화 프로토콜을 개발 하는 경우입니다. 그것은 얼마나 많은 외부 컨트롤 원하는 세포 유형, 생성 하는 데 필요한의 미결 문제 이것은 특히 사실 이다 또는-다르게 포즈-얼마나 유능한 hPSCs 생산 하는 그들의 자신의 개발 환경에 두고 자신에 게 충분 한 경우 영양소입니다. 체 외에 외적 요인의 소개 아주 잘 원하는 셀 제품을 생산할 수 있습니다 하지만 그들은 또한 방해 수 내장 발달 용량 세포 vivo에서전시는 것 이다. 그런 고려는 목표는 질병 모델링 환자 파생 Ipsc의 사용 하는 경우에 특히 중요 하다. 패턴화 성장 요인의 광범위 한 사용 질병 고기 마스크 수 있습니다. 이 보고서에 대 한 자세한 프로토콜 복잡성, 비용, 또는 모방 하는 외부 요인8,9의 사용을 줄이기 위해 이전 연구의 추세에 따라.
그것은 이전 연구 다 vivo에서 조건 재현 공동된 노력 없이 소 뇌 운명 향해 차별화를 달성 하는 것은 나타납니다 보고 Muguruma 그 외 여러분, 그리고 우리 자신의 최근 연구 결과 바탕으로, 1 , 2 , 3 , 4 , 8 , 10. 흥미로운 점은 두 연구 모두 사용 FGF2 어느 설정 필요, 했다 제안 성장 요인의 다른 세트를 사용. 우리 도망 추가 테스트, 어디 FGFs 선택적으로 프로토콜을에서 제외 되었고 셀 외부 FGFs10없이 동일한 제품을 생성할 수 있는 것으로 나타났다. 우리의 연구 간의 차이 사실 우리가 다른 hPSC 라인과 문화 방법을 사용, RA, 신경 감 별 법을 유도 하 고과 립 세포 생존과 성숙 (BDNF GDNF, SAG, KCL)을 지 원하는 구성 요소를 포함 하 여 한정 했다11 -14. 또한, Muguruma 그 외 여러분에 비해 덜 복잡 한 시작 방법 채택 되었다. 그들의 프로토콜 96WPs, 그들에 게 서로 다른 물리적 및 화학적 절연에 균일 한 EBs를 생성 하 여 시작 했다. 여기에 프로토콜 모든 PSCs 상대적으로 EB 형성, 자유롭게 상호 작용 하도록 허용 하는 동안 6WPs에서 함께 혼잡 했다. 어떻게이 수 있습니다. 차동 영향을 EBs와 나중에 organoids (를 포함 하 여 신호 화합물의 본질적인 생산)의 물리적, 화학적 환경 알, 그리고 탐험 될 수 있습니다. 또한, 우리의 식을 표시 하는 동안 유전자 연관-그래서의 암시-형태학 상으로 비슷한 구조 내에 있는 소 뇌 근원 보고 Muguruma 그 외 여러분, 우리 제외할 수 없습니다 같은 신경의 구조는 소 뇌 비 정체성의 있습니다. 미래 연구, Muguruma 그 외 여러분 보고 그 같은 항 체의 대형 패널을 사용 하 여 (즉, ATOH1, CALB, 등) 같은 할당 및 비교 더 결정적인 두 프로토콜의 제품을 만들 것입니다.
3D 프로토콜 내에서 중요 한 시작 이며 셀 문화 분석에 대 한 최종 제품의 충분 한 숫자를 보장 하기에 충분 한 수를 유지 합니다. EBs/잘 문화 (그림 1)에서 첫 3 일 동안 500 이상 부터는 감안할 때 상당한 죽는 일찍 프로토콜, 좋습니다. 이 hPSCs 지류 무료 문화에 대 한 주어진된 식민지 크기를 달성 하기 어려울 수 없습니다 하지만 여전히 급지대 종속 방법을 사용 하 여 그에 대 한 쉽지 않을 수도 있습니다. 셀의 많은 수를 감안할 때, 매체 (pH 변화를 나타내는), 그리고 죽은 세포의 축적에서 색상 변경에 대 한 감시에 중요 하다. 두 문화권의 붕괴를 방지 하기 위해 수정 해야 합니다. 도 있을 수 있습니다 셀 및 집계의 응집으로 대규모 구조. 비록 아직도 분석 될 수 있다 집계 될 수도, 제품 수량 줄어들 것입니다 크게, 그래서 부드러운 분쇄와 작은 집계에 그들을 깨는 유용할 수 있습니다. 그러나, 방해 일반 집계를 피하기는 스스로 성장할 수 있는 큰 크기 (그림 4). 집계 될 경우 너무 스파스, 집계는 완전히 격리 된 있도록 웰 스를 결합 하는 것이 좋습니다. 제품 다양성 (숫자, 크기 및 형태)은 3 차원 세포 배양, 덜 복잡 한 시작 프로시저 (예: 여기에 설명 된 프로토콜 절연, 균일 한 EB 형성 단계, 제안 하는 시작 하는 이러한 프로토콜에 대 한 포함 한 잘 알려진 문제 ) 더 실용적인8,15수. 이 연구자 명심, 특히 분석, 중 필요가 뭔가 보고 프로토콜 제품 다른 3D 프로토콜8,,915에서 발견 된 일치를 생성. 크기와 형태에 따라, 그들은을 신경 근 엽의 범위 안에 대뇌 organoid Kelava 및 랭 커스터15, 회전 타원 체의 분류를 피팅 하는 가장 최근의 리뷰에 설명 된 대로. 특히 주목할 만한 3D 구조의 존재를 루멘, (하위) 심 실 영역와 마름모꼴-입술 기능 같은 신경 근 엽의 암시는 (그림 5 와 그림 6) 구분으로 다른 그룹8 , 15 , 16 , 17. 모든 실험에서 이상 생산 이후 putative VZ/SVZs와 소 뇌 관련 마커 (ZIC1, KIRREL2), 집계 그는 RL 같은 우리의 프로토콜을 사용 하 여 3D 차별화의 성공 결정을 위한 유용한 기준 추가 지원을 제공 하는 기능. 과거 35 일 문화의 길이 연장 하지 테스트, 하지만, 복잡성, 성장과 성숙이이 기술에 의해 허용의 최대 범위를 결정 하 추진 수 있습니다.
2D 프로토콜 3D 프로토콜로 같은 비 부착 EB 형성 및 신경 유도 과정을 사용 하 고 그래서 위의 코멘트에도 적용. 도금, 일단 고려의 다른 세트는 고려 되어야 한다. EBs는 접시에 바깥쪽에 셀에 대 한 신속 하 게 준수 해야 합니다. 준수, RI (해당 되는 경우 이미 사용)의 추가 문제가 매체의 볼륨 감소 또는 PLO/램 농도 실험 변경 적용 될 수 있습니다 경우. 세포 성장에서 너무 조밀한 또는 스파스 (20-80 %confluency 사이 성장 선호)로 유지 하는 것이 중요 하다 우물; 일일 모니터링 및 적시 뿌리고 오버-confluency 또는 부동 셀을 피하기 위해 중요 하다. 3D 프로토콜 달리 거기 해서는 안됩니다 상당한 죽는 문화 중의 가난한 성장, 지역 또는 확산 속도 둔화 될 수 있습니다. 뿌리고 (예: 셀 프로세스와 셀 사이의 개발된 네트워크 제거) 세포의 성숙 상태에 영향을 하 고 포인트 셀을 수집 것 이다 또는 어떤 방식으로 분석 접근 하는 때 염두에 보관 해야 합니다. 예를 들어 칼슘에 대 한 그것을 이미징 분석 2-6 일전 사이 통로 세포에 매우 중요 하다. 너무 가까이 뿌리고 분석 셀에 연결 하는 시간이 없 또는 성숙, 그리고 너무 멀리 셀과 밀, 이미징 어렵게 될 수 있습니다 의미할 수 있습니다. 실험 사이 변이 있을 수 있지만 결과 그 초기 2D 소 뇌 프로토콜1,2보고와 일치. ICC 얼룩 및 유전자 표정 분석 또한 식별 하는 표식 (그림 7 , 그림 8) 다른 신경 및 소 뇌 id와 관련 된과 립 세포 마커 ZIC1에 대 한 긍정적인 세포의 존재를 확증. 칼슘 이미징, 세포 fluor5 염료와 incubated의 전기 자극을 포함, 기능 신경 활동 (그림 9, 보충 그림 1, 그림 2 보충), 표시는 확인 되지 않고 있지만 이러한 과 립 세포를 했다. 그것은 arguable 함으로써 세포 더 많은 시간 과거 35 일 문화의 길이 확장 하 여 성숙, 기능 신경 활동의 양을 증가 한다. 이 잠재적인 나중에 탐험 수 있습니다.
위에 제안 하는 연구의 라인 이외 것 제품 id (수량 및 품질) 차이 결정 하는 관심의 2D 및 3D 프로토콜 사이. 외부 FGFs의 중요성은 2D 프로토콜에서 테스트 하지 및 알고 도움이 될 것 이라고 후 도금, 3 차원 구조의 부족 그리고 그래서 관련된 신호 경로 만들 것 이다 2D 문화 다소 일찍 화합물을 패턴화에 의존. 축소 된 기본 프로토콜 (예, RA, BDNF SAG)은 동등 하 게 그럴듯한 추가 조사에 대 한 됩니다. 마지막으로, 미래의 연구는 새로운 연구 및 도구를 더 나은 특성 (발전 효율의 평가)에서 유익할 수 있습니다 특정 인간 소 뇌 신경 하위.
마음에 주어진된 주의 둘 다 보고 프로토콜 소 뇌 차별점, 다른 목적에 적합 한 제품으로 사용 될 수 있습니다. 그들은 셀 라인 같은 차별점 또는 타겟된 신경 감 별 법의 다른 유형에 대 한 기본 모델의 생존 능력을 테스트, 파일럿 연구를 수행 연구원에 대 한 실질적인 출발점으로 봉사 할지도 모른다.

처음 소 뇌 혈통으로 hPSCs를 차별화 하는 데 체 외에서 프로토콜 vivo에서 소 뇌 개발1,2,,34를 흉내 낸의 원리에 운영 한다. 이와 같이, 그들은 프로-소 뇌 패턴 및 성숙에 특정 시간에 도입 요인의 승계 요구. 이러한 가운데 최고 morphogenetic 단백질 (BMPs), 그리고 섬유 아 세포 성장 인자 (FGFs) 중간 hindbrain 개발 및 isthmic 주최자5,,67의 형성에서 알려진된 역할 뼈 WNT, 했다. 물론, 각 추가 단계 및 요소는 연구원에 대 한 노동 집약적인 조작 및 큰 비용의 증가 의미 하 고 그래서 동등한 결과 달성 가능한 간단한 프로토콜 개발 관심입니다. 그들의 개발 시험관같은, 외부 제어를 필요로 하는 셀 든이 실제적인 문제 가상 질문으로 멋지게 dovetails.
소 뇌 차별화, 2015 년에 출판 하는 프로토콜 목적8패턴화 FGF2, FGF19, 및 stromal 세포 파생 요소 1 (SDF1)만 사용 하 여 성장 요인의 광범위 한 번호를 사용 하 여의 필요성을 해결. 이 연구는 또한 자유 롭 뜨 3D 문화 시스템을 사용 하 여 이전 소 뇌 프로토콜에서 달랐다. 소 뇌 표식에 대 한 긍정적인 세포를 생산, 이외에 두뇌 "organoids" 그들의 기술에 의해 생성 된 관련 형태학, 마름모꼴 입술 모양의 구조와 같은 전통적인 2D 단층 문화에서 사용할 수 없는 전시를 표시 했다. 비록 덜 복잡 하 고 비용이 많이 드는 성장 요인, 유니폼 embryoid 몸 (EBs)와 96 잘 접시 (96WPs), 문화 형성 등의 기능에 관하여 했다 절차 복잡 한 초기 단계. 또 다른 3D 프로토콜 같은 해 출판, 일반적이 고 저렴 한 셀 문화 기술9를 사용 하 여 신경 계보에 성공적인 차별화를 보고. 비록이 그룹 소 뇌 차별화 보다 대뇌 피 질의 조사, 소 뇌 차별화에 대 한 그들의 개념의 응용 프로그램 할인 하지 수 없습니다.
우리는 최근 보고 패턴화 요인의 감소 된 수를 사용 하 여 3D 소 뇌 분화 프로토콜 (즉, FGF2, 4, 및 8), 중간 요구 사항10을 최소화 하기 위해 전체 6 잘 플레이트 (6WPs)에서 세포를 유지 하 여 간소화 된 설치 뿐만 아니라. 과 립 세포의 생산을 돕기 위해, 흐려져 주 작동 근 (SAG) 최종 성숙 단계 동안 사용 되었다. SAG 소닉 고슴도치 (쉬), 이전 소 뇌 프로토콜과 립 세포 선구자 (GCPs) vivo에서1,2, 의 성장을 촉진 하는 역할 때문에 사용 했다 보다 적게 비싼 화학 대안입니다 11,,1213. 차별화 제품 형태학 상으로 관련 구조8,9소 뇌 관련 마커의 존재를 포함 하 여 다른 3D 프로토콜에서 그와 일치 했다. 이러한 결과 강화 흉내 상세한 이전 메시지는 vivo에서 의 환경 복잡 한 3 차원 체 외에서 분화 프로토콜에 필요한 않을 수 있습니다.
3D 프로토콜 외에도이 보고서에 설명 합니다 같은 빠른 설치, 기본 재료, 설계 2D 프로토콜 및 성장 요인의 수를 감소. 표식에 대 한 긍정적인 조기와 관련 된, 그것은 인간 배아 줄기 세포 (hESCs)에서 셀 수 또는 유도 만능 줄기 세포 (hiPSCs), 소 뇌, 신경 및과 립 세포 id. 또한, 칼슘 이미징 기능 인간의 뉴런의 존재를 나타냅니다. 프로토콜 중에서 선택할 수 중 하나에 관심이 연구원에 대 한 유연성의 수준을 추가: (1) 생성 특정 세포 유형, 모델링 (2) 인간의 두뇌 개발 및 구조, (3) 분석 단층에서 최적화 된 관련 설정 (예를 들어, 패치 클램프 기록), 또는 혼합 신경 문화에서 (4) 세포 세포 상호 작용. 그들의 간단 하 고 저가 자연 적합 그들 액세스할 수 연구자의 hPSC 필드에 새로 또는 기본 hPSC 절차에서 더 차별화 옵션 필요 합니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM/F12+Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31331-028</td>
			<td>glutamine fortified DMEM/F12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td>neural basic medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Imgen</td>
			<td>PT468-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential Amino Acids (NEAA)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beta-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Ornithine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly (2-hydroxyethyl methacrylate)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3932</td>
			<td>aka Poly-Hema</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E8 medium and supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1517001</td>
			<td>hPSC medium and supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y-27632 (ROCK inhibitor)</td>
			<td>SelleckChem</td>
			<td>S1049-10mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D-2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1413302</td>
			<td>hPSC-appropriate adherent coating (PAAC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0,5M EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15575-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 um filter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28145-77</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Eppendorf tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-0130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21331-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83804360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PM996</td>
			<td>wrap for culture plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cryotubes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>368632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12563-029</td>
			<td>trypsin-based dissociation agent&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Defined Trypsin Inhibitor (DTI)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>R-007-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-2</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-4</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>100-31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-8B</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain Derived Neurotrophic Factor</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glial Derived Neurotrophic Factor</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurotrophic Factor 3</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smoothened Agonist (SAG)</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>11914</td>
			<td>CAS 912545-86-9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovert 40C microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Brightfield imaging microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiocam</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Brightfield imaging - image aquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Centrifuge 5810</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>521-0996</td>
			<td>centrifuge for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (gebufferde natrium oplossing)</td>
			<td>Braun Medical</td>
			<td>3623140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml Serological pipets</td>
			<td>VWR</td>
			<td>612-4950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml Serological pipets</td>
			<td>VWR</td>
			<td>612-4951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-wells culture plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-2323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-wells culture plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-2324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hESCs</td>
			<td>WiCELL</td>
			<td></td>
			<td>line H01</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

streamlined 3d cerebellar differentiation protocol with optional 2d modification

복잡성과 분화 프로토콜의 비용을 감소 하는 것이 연구자에 대 한 중요 합니다. 이 관심이 모방 하는 외부 요인 인간 만능 줄기 세포 (hPSC)로 두뇌 개발 또는 이상, 질병 표현 형을 마스킹 등의 모델 소개 수 있습니다 가능한 의도 하지 않은 효과 대 한 우려와 맞는. 여기, 우리 hPSCs, 소재 요구 사항 이전 프로토콜 보다 덜 간단한 시작 방법, 적은 패턴 요소와 설계에 대 한 두 개의 소 뇌 분화 프로토콜을 제시. 최근, 우리 문화 절차, 형태학 등 하위/심 실 영역-두뇌 개발 모델링 관련 및 마름모꼴을 포함 한 다른 뇌 "organoid" 프로토콜 일치 부동성 3 차원 (3D) 제품을 생성 하는 개발 입술 모양의 구조입니다. 두 번째 제품 소 뇌 관련 된 표식에 대 한 긍정적인 고 신경 같은 칼슘 유입 전시 기능 소 뇌 신경 세포를 생성할 수 표시 되는 완전 한 차별화를 부착, 2 차원 단층 프로시저를 사용 합니다. 함께, 이러한 프로토콜 테스트 유선형된 신경 차별점의 기본 모델 뿐 아니라 다른 연구 목적에 적합 한 옵션 선택 과학자를 제공 합니다.

감소 된 성장에 대 한 시각적 개요는 2D 및 3D 소 뇌 분화 프로토콜 요소 그림 1 에서는 2D 및 3D 소 뇌 분화 프로토콜에 대 한 전체 일정 외적 요소와 도금의 시간. HPSCs 3D 소 뇌 차별화 진행에 대 한 일반적인 진행 그림 2에 표시: hESC 라인 h01-식민지로 시작 하는 피더 무료 문화에 0에서 (그림의 왼쪽 위); 하루 2 (위 가운데); EB 형성을 겪고 다음 주 14 (오른쪽 위);에서 RA와 FGF8 신경 유도 명백한 루멘과 더 큰 셀 집계로 성장 다양 한 크기와 모양 하루 28 (왼쪽 아래);의 집계를 형성 하루 28 (아래 가운데);에 표시 단일 집계의 다른 구조와 복잡성에 개발 고와 (오른쪽 아래) 하루 35에서 동일한 구조를 형태학 상 변화를 계속 했다. 2D 소 뇌 차별화를 진행 하는 hPSCs에 대 한 일반적인 진행은 그림 3에서 묘사: hESC와 피더 무료 문화 날 0 (hESC 식민지 가운데 차별화 된 셀의 영역을 나타내는 동그라미 그림의 왼쪽 위)에 식민지로 h01-라인 ; 하루 2 (위 가운데); EB 형성을 겪고 다음 날 13 (오른쪽 위);에서 RA와 FGF8 신경 유도 명백한 루멘과 더 큰 셀 집계로 성장 (왼쪽 아래); 주 14에서 도금 후 부착 세포로 확산 그리고 하루 35 낮은 (더 낮은 중간) 및 고배율 (오른쪽 아래)에 더 많은 복잡 한/성숙한 형태를 가진 세포의 단층으로 다음.
3D 제품 전시 마커 및 초기 Neuroepithelium의 구조 그림 2 (아래 왼쪽된 이미지) 그림 4 확률적 병합 뿐 아니라 성장 및 성숙 속도, 변화 또는 집계의 떨어져 깨고 경작을 통해 본 3D 집계 형태가 고. 이에 불구 하 고 각 차별화 immunocytochemistry (ICC) 그림 5에 얼룩으로 소 뇌과 립 마커 ZIC1을 포함 한 초기 신경 및 신경 마커를 전시 하는 집계를 생성 합니다. 더 중요 한 것은, 그림 5 와 그림 6 간단한 3D 문화, 감소 성장 요인, 초기 neuroepithelium 마름모꼴 입술 등 두뇌 개발에 관련 된 복잡 한 구조와 집계를 생성할 수는 건의 한다.
2D 제품 전시 소 뇌 마커 및 기능 신경 활동 2D 문화는 복잡 한 3 차원 구조를 재현할 수 없는, 그들은 ICC 얼룩 그림7에서에 표시 된 대로 소 뇌과 립 세포 마커 ZIC1을 포함 한 초기 신경 및 신경 마커를 전시 하는 세포를 생성할 수 있습니다. RT-PCR을 통해 유전자 표정 분석 그림 8에서 보듯이 비록 초기과 립 세포 마커 ATOH1 의 존재는 변수를 실험과 라인 사이의 ICC 얼룩 결과 지원 합니다. 칼슘 이미징 2D 문화에 더 쉽게 처리 됩니다. 그림 9, 보충 비디오 1및 추가 비디오 2에서 보듯이 전기적 자극된을 세포 신경 발사 패턴, 기능적 뉴런의 생성 제안의 전형적인 칼슘 유입 보여줍니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig1.jpg"> 그림 1: 차별화 프로토콜 (차별화의 하루 0에서 시작)의 타임 라인. 실선 상자는 특정 요소 문화 매체에 추가 하 고 점선 상자 표시 판-코팅 옵션 2D 수정에 대 한 나타냅니다. FGF2, 아래쪽 화살표는 낮은 농도 (4 ng/mL), 참조 및 위쪽 화살표는 높은 농도 (20 ng/mL)를 말합니다. 이 그림은 홈즈와 하이 네10에서 수정 되었습니다. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig2.jpg"> 그림 2: 3D 프로토콜의 대표 명시 이미지. d0, d2에서 EBs에서 hESC 식민지 유도 d14, 다양 한 크기와 형태 (번호 1-5) d28, d28에 독특한, 식별 기능 (문자는 는-c로 표시)와 단일 집계의 집계에 따라 집계 및 d35에 동일한 기능에서 볼 수 변경 됩니다. 눈금 막대 = 100 µ m. 이 그림은 홈즈와 하이 네10에서 수정 되었습니다. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig3.jpg"> 그림 3: 2D 프로토콜의 대표 명시 이미지. hESC 식민지 d0, d2에서 EBs 20 x 확대 및 확대, x 5에서 보듯이 d35에서 성숙 후 d14에서 집계를 도금 후 d13에서 유도 후 집계 합니다. 상단 왼쪽된 패널에서 백색 원형 hESC 식민지 가운데 차별화 된 셀의 영역을 표시합니다. 눈금 막대 = 50 µ m. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig4.jpg"> 그림 4: 3 차원 문화에 다양 한 크기와 복잡성을 보여주는 명시 이미지. (A) 주 8에서 집계 (hESCs), 및 (B) d35 (hiPSCs). 후자의 이미지 전체 집계 표시 하려면 세 가지 별도 이미지 구성 됩니다. 두 집계 작은 집계 또는 (속보) 구조의 손실의 병합에 의해 영향을 받은 수 있습니다. 눈금 막대 = 200 µ m. 이 그림은 홈즈와 하이 네10에서 재 공포. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig5.jpg"> 그림 5: 3D 제품의 ICC 이미지 표시 관련 마커 및 구조. 문화 d35에 3D 제품 전시: PAX6 (녹색) 및 신경 장미 같은 대형의 루멘으로 (빨강) TBR2 (첫 번째 행); DCX (녹색) 및 외부 가장자리 심 실 영역 (VZ)에서 확산 NeuN (레드)-같은 구조 (두 번째 행); KIRREL2, neuroepithelium 소 뇌와 관련 된 마커 (3 행, 왼쪽); 그리고 ZIC1는 마커 관련 된 소 뇌과 립 세포 (오른쪽 세 번째 행). 여러 번 사용 하 여 4 개의 다른 hPSC 라인 실험 실시: hESC 라인 h01-(n = 5), 및 iPSC 라인 hvs88 (n = 4), hvs60 (n = 3), 및 hvs51 (n = 1). 화살표 마름모꼴 입술 (RL)을 가리킨-구조와 같은. 눈금 막대 = 100 µ m. 이 그림은 홈즈와 하이 네10에서 재 공포. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig6.jpg"> 그림 6: 3D 제품에서 대규모 심 실 영역 같은 구조. 문화 d35에서 hESC 파생 집계 PAX6 (녹색) 및 TBR2 (적색) 일반적으로 관련 된 심 실 영역 (VZs) 및 subventricular 영역 (SVZs) 에서 vivo에서 발견 하는 초기 뉴런에 대 한 긍정적 이다. (맨 위) 별표 (*) 표시 VZ 같은 지역 괄호 VZ의 깊이/부서를 나타내는 집계의 가장자리를 따라 실행의 꼭대기 쪽 / SVZs. (중간) 결합 된 신호 표시 PAX6 흩어져 섹션 + TBR2-셀 상단 오른쪽 끝으로 크기에서 증가 하 고 VZ. (아래) 중간 패널에 사각형으로 표시 된 섹션의 높은 확대 이미지. 눈금 막대 = 100 µ m. 이 그림은 홈즈와 하이 네10에서 수정 되었습니다. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig7.jpg"> 그림 7: 2D 제품의 ICC 이미지 표시 관련 마커. 문화 d35에서 2D 제품 전시, hESCs (위쪽 행)와 hiPSCs (아래쪽 행), 셀에 대 한 긍정적인:과 립 세포 마커 ZIC1 및 철새 소 뇌 신경 마커 TAG1 (왼쪽 열); 그리고 신경 마커 neurofilament (NF)와 TAG1 (오른쪽 열). 눈금 막대 = 50 µ m. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig8.jpg"> 그림 8: 2D 제품의 RT-PCR. h01-hESC 선의 mRNA 표정 분석 (위쪽 행)와 hiPSC 라인 hvs60 (아래쪽 행)는 2D의 끝에 프로토콜 제품에 젤 전기 이동 법을 보여줍니다:과 립 세포 마커 ZIC1과 립 세포 마커 ATOH1, 철새 소 뇌 신경 마커 TAG1, Purkinje 셀 표식 Calbindin (CALB), 전압 종속 칼슘 채널 CACNA1A (C-1A), CACNA1E (C-1E), 감마-aminobutyric 산 (GABA) B 수용 체 1 (G-Br1), 및 내부 관리 유전자 EIF4G2).
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig9.jpg"> 그림 9: 칼슘 이미징/2D 제품의 분석. 문화 d35에 hPSC 차별화 제품 fluor5 염료를 가진 외피 후 현미경, 2 분 동안 기록 되었다. 30 s, 셀 10 전기 자극 했다 s에서 10 Hz. (A) 스틸 이미지 보기 hESCs 0에서 s (왼쪽)와 30에서 전기 자극의 시작 후 s (오른쪽). 화살표 (ROI) 칼슘 유입의 분석에 대 한 관심의 영역을 나타냅니다. 투자 수익에 대 한 시간 대 상대 형광에 (B) 그래픽 분석 표시 변경 (형광 변화 = (F F0) /F0, 어디 F0 = (∑F1-n) / n), 신경 같은 급격 한 발생 하기 전에, 도중, 그리고 후 자극입니다. 검정색 막대는 전기 자극의 길이 나타냅니다. (화이트) 바 규모 50 µ m. 전체 기록에 대 한 hESC (로 여기에 본) 하 고 (표시 되지 않음)는 hiPSC 라인 보충 비디오 1 , 비디오 2 보충, 각각 =. 녹음 4 배속에서 AVI 형식으로 되어있습니다. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig9large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 비디오 1: 칼슘 hESC 선에서 h01-2D 제품의 비디오 이미징. 문화 d35에 h01-현미경, 아래 2 분 fluor5 가진 외피 후 기록 하는 hESC 선에서 차별화 제품 염료. 30 s, 셀 10 전기 자극 했다 10 Hz. 녹음에 s 2 프레임/s에서 되었고 ~ 7 프레임/s, ~ 30 지속 비디오에서 AVI 비디오로 처리 ~ 4 배속에서 s. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/figS1_hESC_stim@10Hz.avi">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 비디오 2: 칼슘 hiPSC 라인 hvs51에서 2D 제품의 비디오 이미징. 문화 d35에 hiPSC 라인 hvs51에서 차별화 제품 fluor5 염료를 가진 외피 후 현미경, 2 분 동안 기록 되었다. 30 s, 셀 10 전기 자극 했다 10 Hz. 녹음에 s 2 프레임/s에서 되었고 ~ 7 프레임/s, ~ 30 지속 비디오에서 AVI 비디오로 처리 ~ 4 배속에서 s. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/figS2_hiPSC_stim@10Hz.avi">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Streamlined 3D Cerebellar Differentiation Protocol with Optional 2D Modification

우리 간단한 3D 차별화를 사용 하 여 hPSCs에 대 한 프로토콜 정의 매체를 설명 하 고 초기 neuroepithelial 구조와 셀 집계를 생성할 수와 소 뇌 관련 표식으로 옵션에 대 한 긍정적인 성장 요인 감소 기능적 뉴런을 생성 하는 단층으로 셀을 차별화 하는 데 2D 수정.

효율적인된 3D 소 뇌 분화 프로토콜 옵션 2D 수정

Reducing the complexity and cost of differentiation protocols is important for researchers. This interest fits with concerns about possible unintended ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

7.5K 조회수.  VU University Medical Center. 우리 간단한 3D 차별화를 사용 하 여 hPSCs에 대 한 프로토콜 정의 매체를 설명 하 고 초기 neuroepithelial 구조와 셀 집계를 생성할 수와 소 뇌 관련 표식으로 옵션에 대 한 긍정적인 성장 요인 감소 기능적 뉴런을 생성 하는 단층으로 셀을 차별화 하는 데 2D 수정.

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3D Organotypic Co-culture Model Supporting Medullary Thymic Epithelial Cell Proliferation, Differentiation and Promiscuous Gene Expression

Intra-thymic T cell development requires an intricate three-dimensional meshwork composed of various stromal cells, i.e., non-T cells. Thymocytes traverse this scaffold in a highly coordinated temporal and spatial order while sequentially passing obligatory check points, i.e., T cell lineage commitment, followed by T cell receptor repertoire generation and selection prior to their export into the periphery. The two major resident cell types forming this scaffold are cortical (cTECs) and medullary thymic epithelial cells (mTECs). A key feature of mTECs is the so-called promiscuous expression of numerous tissue-restricted antigens. These tissue-restricted antigens are presented to immature thymocytes directly or indirectly by mTECs or thymic dendritic cells, respectively resulting in self-tolerance.
Suitable in vitro models emulating the developmental pathways and functions of cTECs and mTECs are currently lacking. This lack of adequate experimental models has for instance hampered the analysis of promiscuous gene expression, which is still poorly understood at the cellular and molecular level. We adapted a 3D organotypic co-culture model to culture ex vivo isolated mTECs. This model was originally devised to cultivate keratinocytes in such a way as to generate a skin equivalent in vitro. The 3D model preserved key functional features of mTEC biology: (i) proliferation and terminal differentiation of CD80lo, Aire-negative into CD80hi, Aire-positive mTECs, (ii) responsiveness to RANKL, and (iii) sustained expression of FoxN1, Aire and tissue-restricted genes in CD80hi mTECs.

Studying medullary thymic epithelial cells in vitro has been largely unsuccessful, as current 2D culture systems do not mimic the in vivo scenario. The 3D culture system described herein - a modified skin organotypic culture model - has proven superior in recapitulating mTEC proliferation, differentiation and maintenance of promiscuous gene expression.

수질 흉선 상피 세포의 증식, 분화 및 무차별 유전자 발현을 지원하는 3D의 Organotypic 공동 문화 모델

Intra-thymic T cell development requires an intricate three-dimensional meshwork composed of various stromal cells, i.e., non-T cells. Thymocytes traverse ...

연구

발생학

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

에반스 블루 염료와 Zebrafish의 애벌레 골격 근육 무결성 분석

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Differentiation of the SH-SY5Y Human Neuroblastoma Cell Line

Having appropriate in vivo and in vitro systems that provide translational models for human disease is an integral aspect of research in neurobiology and the neurosciences. Traditional in vitro experimental models used in neurobiology include primary neuronal cultures from rats and mice, neuroblastoma cell lines including rat B35 and mouse Neuro-2A cells, rat PC12 cells, and short-term slice cultures. While many researchers rely on these models, they lack a human component and observed experimental effects could be exclusive to the respective species and may not occur identically in humans. Additionally, although these cells are neurons, they may have unstable karyotypes, making their use problematic for studies of gene expression and reproducible studies of cell signaling. It is therefore important to develop more consistent models of human neurological disease. 
The following procedure describes an easy-to-follow, reproducible method to obtain homogenous and viable human neuronal cultures, by differentiating the chromosomally stable human neuroblastoma cell line, SH-SY5Y. This method integrates several previously described methods1-4 and is based on sequential removal of serum from media. The timeline includes gradual serum-starvation, with introduction of extracellular matrix proteins and neurotrophic factors. This allows neurons to differentiate, while epithelial cells are selected against, resulting in a homogeneous neuronal culture. Representative results demonstrate the successful differentiation of SH-SY5Y neuroblastoma cells from an initial epithelial-like cell phenotype into a more expansive and branched neuronal phenotype. This protocol offers a reliable way to generate homogeneous populations of neuronal cultures that can be used for subsequent biochemical and molecular analyses, which provides researchers with a more accurate translational model of human infection and disease.

It is critical in neurobiology and neurovirology to have a reliable, replicable in vitro system that serves as a translational model for what occurs in vivo in human neurons. This protocol describes how to culture and differentiate SH-SY5Y human neuroblastoma cells into viable neurons for use in in vitro applications.

SH-SY5Y 인간 신경 모세포종 세포 라인의 차별화

Having appropriate in vivo and in vitro systems that provide translational models for human disease is an integral aspect of research in neurobiology and ...

Initiating Differentiation in Immortalized Multipotent Otic Progenitor Cells

Use of human induced pluripotent stem cells (iPSC) or embryonic stem cells (ESC) for cell replacement therapies holds great promise. Several limitations including low yields and heterogeneous populations of differentiated cells hinder the progress of stem cell therapies. A fate restricted immortalized multipotent otic progenitor (iMOP) cell line was generated to facilitate efficient differentiation of large numbers of functional hair cells and spiral ganglion neurons (SGN) for inner ear cell replacement therapies. Starting from dissociated cultures of single iMOP cells, protocols that promote cell cycle exit and differentiation by basic fibroblast growth factor (bFGF) withdrawal were described. A significant decrease in proliferating cells after bFGF withdrawal was confirmed using an EdU cell proliferation assay. Concomitant with a decrease in proliferation, successful differentiation resulted in expression of molecular markers and morphological changes. Immunostaining of Cdkn1b (p27KIP) and Cdh1 (E-cadherin) in iMOP-derived otospheres was used as an indicator for differentiation into inner ear sensory epithelia while immunostaining of Cdkn1b and Tubb3 (neuronal &#946;-tubulin) was used to identify iMOP-derived neurons. Use of iMOP cells provides an important tool for understanding cell fate decisions made by inner ear neurosensory progenitors and will help develop protocols for generating large numbers of iPSC or ESC-derived hair cells and SGNs. These methods will accelerate efforts for generating otic cells for replacement therapies.

The current protocols to maintain immortalized multipotent otic progenitor (iMOP) cells and otic differentiation are described. Culture conditions and molecular markers that indicate differentiation into sensory epithelia and spiral ganglion neurons (SGN) are highlighted.

불멸화 된 다 능성 귀의 전구 세포의 분화를 초기화

Use of human induced pluripotent stem cells (iPSC) or embryonic stem cells (ESC) for cell replacement therapies holds great promise. Several limitations ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust methods for the large-scale production of functional cell types, including cardiomyocytes. Here we demonstrate that the temporal manipulation of WNT, TGF-&#946;, and SHH signaling pathways leads to highly efficient cardiomyocyte differentiation of single-cell passaged hPSC lines in both static suspension and stirred suspension bioreactor systems. Employing this strategy resulted in ~ 100% beating spheroids, consistently containing &#62; 80% cardiac troponin T-positive cells after 15 days of culture, validated in multiple hPSC lines. We also report on a variation of this protocol for use with cell lines not currently adapted to single-cell passaging, the success of which has been verified in 42 hPSC lines. Cardiomyocytes generated using these protocols express lineage-specific markers and show expected electrophysiological functionalities. Our protocol presents a simple, efficient and robust platform for the large-scale production of human cardiomyocytes.

Here, we present a robust, fast and scalable cardiomyocyte differentiation protocol for human pluripotent stem cells (hPSCs). Cardiomyocytes derived using this large-scale method can provide sufficient cell numbers for their effective use in human cardiovascular disease modeling, high-throughput drug screening, and potentially clinical applications.

고도의 재현 작은 분자 기반의 차별화 프로토콜을 사용하여 인간 다 능성 줄기 세포로부터 심근 세포의 대규모 생산

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Protocol for the Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells into Mixed Cultures of Neurons and Glia for Neurotoxicity Testing

Human pluripotent stem cells can differentiate into various cell types that can be applied to human-based in vitro toxicity assays. One major advantage is that the reprogramming of somatic cells to produce human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) avoids the ethical and legislative issues related to the use of human embryonic stem cells (hESCs). HiPSCs can be expanded and efficiently differentiated into different types of neuronal and glial cells, serving as test systems for toxicity testing and, in particular, for the assessment of different pathways involved in neurotoxicity. This work describes a protocol for the differentiation of hiPSCs into mixed cultures of neuronal and glial cells. The signaling pathways that are regulated and/or activated by neuronal differentiation are defined. This information is critical to the application of the cell model to the new toxicity testing paradigm, in which chemicals are assessed based on their ability to perturb biological pathways. As a proof of concept, rotenone, an inhibitor of mitochondrial respiratory complex I, was used to assess the activation of the Nrf2 signaling pathway, a key regulator of the antioxidant-response-element-(ARE)-driven cellular defense mechanism against oxidative stress.

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) are considered a powerful tool for drug and chemical screening and for the development of new in vitro models for toxicity testing, including neurotoxicity. Here, a detailed protocol for the differentiation of hiPSCs into neurons and glia is described.

인간 독성 Pluripotent 줄기 세포의 신경 독성 테스트를위한 뉴런과 Glia의 혼합 문화로의 분화를위한 프로토콜

Human pluripotent stem cells can differentiate into various cell types that can be applied to human-based in vitro toxicity assays. One major advantage is ...

Three-dimensional Rendering and Analysis of Immunolabeled, Clarified Human Placental Villous Vascular Networks

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that makes up much of the parenchyma of the human placenta. The distal villous capillary network is the terminus of the fetal blood supply after several generations of branching of vessels extending out from the umbilical cord. This network has a contiguous cellular sheath, the syncytial trophoblast barrier layer, which prevents mixing of fetal blood and the maternal blood in which it is continuously bathed. Insults to the integrity of the placental capillary network, occurring in disorders such as maternal diabetes, hypertension and obesity, have consequences that present serious health risks for the fetus, infant, and adult. To better define the structural effects of these insults, a protocol was developed for this study that captures capillary network structure on the order of 1 - 2 mm3 wherein one can investigate its topological features in its full complexity. To accomplish this, clusters of terminal villi from placenta are dissected, and the trophoblast layer and the capillary endothelia are immunolabeled. These samples are then clarified with a new tissue clearing process which makes it possible to acquire confocal image stacks to z- depths of ~1 mm. The three-dimensional renderings of these stacks are then processed and analyzed to generate basic capillary network measures such as volume, number of capillary branches, and capillary branch end points, as validation of the suitability of this approach for capillary network characterization.

This study presents a protocol for the reversible tissue clearing, immunostaining, 3D-rendering and analysis of vascular networks in human placenta villi samples on the order of 1 - 2 mm3.

3 차원 렌더링 및 Immunolabeled, 분석 인간 Placental Villous 혈관 네트워크를 명확히

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that ...

Chemical Reversion of Conventional Human Pluripotent Stem Cells to a Na&#239;ve-like State with Improved Multilineage Differentiation Potency

Na&#239;ve human pluripotent stem cells (N-hPSC) with improved functionality may have a wide impact in regenerative medicine. The goal of this protocol is to efficiently revert lineage-primed, conventional human pluripotent stem cells (hPSC) maintained on either feeder-free or feeder-dependent conditions to a na&#239;ve-like pluripotency with improved functionality. This chemical na&#239;ve reversion method employs the classical leukemia inhibitory factor (LIF), GSK3&#946;, and MEK/ERK inhibition cocktail (LIF-2i), supplemented with only a tankyrase inhibitor XAV939 (LIF-3i). LIF-3i reverts conventional hPSC to a stable pluripotent state adopting biochemical, transcriptional, and epigenetic features of the human pre-implantation epiblast. This LIF-3i method requires minimal cell culture manipulation and is highly reproducible in a broad repertoire of human embryonic stem cell (hESC) and transgene-free human induced pluripotent stem cell (hiPSC) lines. The LIF-3i method does not require a re-priming step prior to the differentiation; N-hPSC can be differentiated directly with extremely high efficiencies and maintain karyotypic and epigenomic stabilities (including at imprinted loci). To increase the universality of the method, conventional hPSC are first cultured in the LIF-3i cocktail supplemented with two additional small molecules that potentiate protein kinase A (forskolin) and sonic hedgehog (sHH) (purmorphamine) signaling (LIF-5i). This brief LIF-5i adaptation step significantly enhances the initial clonal expansion of conventional hPSC and permits them to be subsequently na&#239;ve-reverted with LIF-3i alone in bulk quantities, thus obviating the need for picking/subcloning rare N-hPSC colonies later. LIF-5i-stabilized hPSCs are subsequently maintained in LIF-3i alone without the need of anti-apoptotic molecules. Most importantly, LIF-3i reversion markedly improves the functional pluripotency of a broad repertoire of conventional hPSC by decreasing their lineage-primed gene expression and erasing the interline variability of directed differentiation commonly observed amongst independent hPSC lines. Representative characterizations of LIF-3i-reverted N-hPSC are provided, and experimental strategies for functional comparisons of isogenic hPSC in lineage-primed vs. na&#239;ve-like states are outlined.

We present a protocol for efficient, bulk, and rapid chemical reversion of conventional lineage-primed human pluripotent stem cells (hPSC) into an epigenomically-stable na&#239;ve preimplantation epiblast-like pluripotent state. This method results in decreased lineage-primed gene expression and marked improvement in directed multilineage differentiation across a broad repertoire of conventional hPSC lines.

향상 된 Multilineage 차별화 힘으로 순진한 같은 상태로 기존의 인간의 Pluripotent 줄기 세포의 화학 귀선

Na&#239;ve human pluripotent stem cells (N-hPSC) with improved functionality may have a wide impact in regenerative medicine. The goal of this protocol is ...

Synaptic Microcircuit Modeling with 3D Cocultures of Astrocytes and Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

A barrier to our understanding of how various cell types and signals contribute to synaptic circuit function is the lack of relevant models for studying the human brain. One emerging technology to address this issue is the use of three dimensional (3D) neural cell cultures, termed &#39;organoids&#39; or &#39;spheroids&#39;, for long term preservation of intercellular interactions including extracellular adhesion molecules. However, these culture systems are time consuming and not systematically generated. Here, we detail a method to rapidly and consistently produce 3D cocultures of neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells. First, pre-differentiated astrocytes and neuronal progenitors are dissociated and counted. Next, cells are combined in sphere-forming dishes with a Rho-Kinase inhibitor and at specific ratios to produce spheres of reproducible size. After several weeks of culture as floating spheres, cocultures (&#39;asteroids&#39;) are finally sectioned for immunostaining or plated upon multielectrode arrays to measure synaptic density and strength. In general, it is expected that this protocol will yield 3D neural spheres that display mature cell-type restricted markers, form functional synapses, and exhibit spontaneous synaptic network burst activity. Together, this system permits drug screening and investigations into mechanisms of disease in a more suitable model compared to monolayer cultures.

In this protocol, we aim to describe a reproducible method for combining dissociated human pluripotent stem cell derived neurons and astrocytes together into 3D sphere cocultures, maintaining these spheres in free floating conditions, and subsequently measuring synaptic circuit activity of the spheres with immunoanalysis and multielectrode array recordings.

3D Cocultures 이다 인간 만능 줄기 세포에서 신경 세포의 시 냅 스 마이크로 회로 모델링

A barrier to our understanding of how various cell types and signals contribute to synaptic circuit function is the lack of relevant models for studying ...

Derivation and Differentiation of Canine Ovarian Mesenchymal Stem Cells

Interest in mesenchymal stem cells (MSCs) has increased over the past decade due to their ease of isolation, expansion, and culture. Recently, studies have demonstrated the wide differentiation capacity that these cells possess. The ovary represents a promising candidate for cell-based therapies due to the fact that it is rich in MSCs and that it is frequently discarded after ovariectomy surgeries as biological waste. This article describes procedures for the isolation, expansion, and differentiation of MSCs derived from the canine ovary, without the necessity of cell-sorting techniques. This protocol represents an important tool for regenerative medicine because of the broad applicability of these highly differentiable cells in clinical trials and therapeutic uses.

Herein, we describe a method for the isolation, expansion, and differentiation of mesenchymal stem cells from canine ovarian tissue.

파생 및 개 난소 중간 엽 줄기 세포의 분화

Interest in mesenchymal stem cells (MSCs) has increased over the past decade due to their ease of isolation, expansion, and culture. Recently, studies ...