この方法は、初期のヒト小脳発達と、それが神経精神障害でどのように変化するかを研究するのに役立ちます。この方法の主な利点は、複雑なステップを実行することなく、2D層構造で発生的に初期のヒト小脳細胞を生成することです。また、費用対効果も高くなります。
プルピペットを作るのは最初は難しいかもしれませんが、練習と時間があれば、作業しやすい方法でピペットを引くのが簡単になります。実験の準備を開始するには、22.9センチメートルのパスツールピペットを首から約2センチ下、ブンゼンバーナーの上に引っ張って、2つのガラスピペットを作成します。薄い側は、もう一方の側よりも約4センチ短くなります。
引っ張った側の先端を炎の上で曲げて滑らかなRを作り、引っ張ったピペットをオートクレーブスリーブに入れてオートクレーブで滅菌します。0日目に、10マイクロモルのY-27632およびSB-431542を添加した1ミリリットルの小脳分化培地を6ウェル超低アタッチメント(ULA)プレートの各ウェルに加え、持ち上げられたコロニーをウェルに追加する準備ができるまでインキュベーターに入れます。プルドグラスピペットを使用して分化した細胞を洗浄します。
培地を吸引し、35ミリ皿ごとに1ミリのiPS細胞継代液を加えます。摂氏37度で3分間インキュベートした後、培地を吸引し、10マイクロモルのY-27632およびSB-431542を添加した2ミリメートルの小脳分化培地を透過光倒立顕微鏡の4倍の倍率で加え、引っ張られたガラスピペットの屈曲した端を使用してコロニーを持ち上げます。すべてのコロニーが持ち上げられたら、10ミリリットルの血清学的ピペットを使用して、すべてのコロニーを6ウェルULAプレートの1ウェルに静かに移します。
このプロセスを各iPSプレートで繰り返し、5%二酸化炭素で摂氏37度で細胞をインキュベートします。2日目に、FGF2を各ウェルに追加して、ミリリットルあたり50ナノグラムの最終濃度を調整します。7日目に、1ミリリットルの使用済み培地を吸引し、1ミリリットルの新鮮な小脳分化培地と交換することにより、培地の3分の1を交換します。
胚様体を7日間インキュベートします。14日目に、プレートを回転させて、プレートの中央にすべての胚様体を集めます。次に、プレートを傾け、端から1000マイクロリットルのピペッターを使用してすべての使用済み培地を吸引します。
培地の量が減少したら、プレートをゆっくりと平らに置き、吸引を続け、胚様体が引き出されないように十分な培地を残します。次に、10マイクロモルのY-27632を添加した3ミリリットルの新鮮な小脳分化培地を追加します。次に、10ミリリットルの血清学的ピペットを使用して胚様体をポリ-L-オルニチンラミニンコーティングされた皿に移します。
15日目に、培地を吸引し、新鮮な小脳分化培地と交換します。0日目にiPS細胞コロニーを洗浄し、SB-431542およびY-27632を含む小脳分化培地に持ち上げ、胚様体を生成するための超低接着プレートに入れた。2日目にFGF2を添加し、7日目に1/3培地を変化させた結果、14日目に胚様体が肥大した。
細胞は15日目に胚様体からコーティングされた表面に沿って外側に移動し始めました。21日目から小脳成熟培地への培地の完全な変更により、35日目までにニューロン様の形態と複雑さを持つ細胞の単層が得られました。35日目の遺伝子発現解析により、グルタミン酸作動性前駆細胞、ATOH1、GABA作動性前駆細胞、PTF1アルファ、プルキンエ前駆細胞マーカーKIRREL2、SKOR2などの初期小脳前駆細胞マーカーを発現していることが明らかになりました。
また、菱形口唇マーカーOTX2および主に前ニューロン特異的SIX3の発現も認められた。35日目に採取した細胞の免疫蛍光標識では、小脳マーカーEN2およびPTF1α、神経細胞マーカーβチューブリンIII、および増殖マーカーKI67について陽性染色を示した。4'6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)による核染色では、細胞核が示されました。
分化を成功させるためには、健康な未分化のiPS細胞コロニーから始めて、できるだけ新しく再構成された試薬を使用することが重要です。
