イタリア語研究所核物理 (INFN) の部分的マニアック子午線プロジェクトを通じてこの仕事の資金。著者がマニアック子午線プロジェクト調整; 教授エドアルド ・ Milotti (イタリア、トリエステ大学物理学部) を認める博士ロベルト Chignola (バイオ テクノロジー学科、ヴェローナ大学、イタリア)、オーム、caco-2 細胞を提供するため、彼の貴重なヘルプとトレーニング。我々 はまたテクニカル サポート Agnese ソラリを認めます。

次のプロトコルは、健常人血中撤退を含まれます。ドナーには、入学前に書面によるインフォームド コンセントが用意されています。この手順はヘルシンキ宣言に従って、血引き出し専門の医療アシスタントによって実行されていました。
1. 細胞培養と培養セットアップ
<ol><li>1 週間、照射前に、mL の 10% 牛胎児血清 (FBS)、2 ミリメートル L グルタミン、100 U/mL ペニシリンと 100 μ g/mL ストレプトマイシンと新鮮な RPMI1640 培/2.5 × 105細胞を含む細胞懸濁液カコ 2 を準備します。</li>
	<li>種子滅菌 1 μ m 孔径細胞培養の細胞懸濁液 2 mL 6 ウェル プレートの挿入、挿入 6 ウェル プレートに。 注: セル文化挿入は、培養細胞の播種前に完全培地滅菌でアクティブにする必要があります。この場合、文化メディアを破棄され、細胞懸濁液媒体を交換する必要があります。</li>
	<li>10 %fbs、2 mM L グルタミン、100 IU/mL ペニシリン各下部コンパートメントの 100 μ g/mL ストレプトマイシンと新鮮な RPMI1640 培の 3 mL を加えるし、5% CO2を含む加湿雰囲気のインキュベーターで 37 ° C で培養します。</li>
	<li>カコ 2 細胞照射の同じ日、市販リチウム ヘパリン コーティング 6 mL チューブでひと全血を収集 (チューブのサイズ: 13 × 100 mm)。</li>
	<li>その後、Ficoll のグラデーションを用いた末梢血単核球 (PBMC) を分離します。50 mL の円錐形遠心管と層全血の等量で Ficoll の 25 mL を入れ、PBMC を分離 Ficoll サーフェイス RPMI1640 と 1:1 希釈。 注: 通常健康なドナーは通常約 4-10 × 10 6/mL の PBMC を持っています。</li>
	<li>室温で 30 分間 400 x g で 50 mL のチューブを遠心します。</li>
	<li>優しく Ficoll とプラズマのパスツール ピペット吸引により界面 PBMC を収集し、15 mL の円錐管に入れてください。</li>
	<li>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 10 mL を追加し、PBMC を 10 分間 250 × g で遠心分離によって 2 回、PBMC を洗います。</li>
	<li>文化 PBMC T25 で 3-5 h の最大の cm2フラスコで完了 RPMI1640 媒体、37 ° c 5% CO2を含む加湿雰囲気で、前に説明したよう。 注: は、実験の日に PBMC を収集し、シード 2 × 106細胞/ウェル、3 mL の共培養の底部のコンパートメントで、完全の RPMI1640 培で中断します。Caco-2 細胞を挿入は、その照射後 PBMC 含む井戸 30 分で転送されます。全血から収集した PBMC できない以上約 72 時間、文化で維持されない例えば刺激。な (PHA) は、細胞の生存率が失われました。 注意: すべての血液や血液製剤の安全性と品質は、プロセス全体を通して保証されなければなりません。</li>
</ol>2. 照射設定
注: caco2 細胞の照射は、異なったタイプの癌を治療するために定期的に使用される線形加速器の Istituto ・ ディ ・ Ricovero 電子クーラ Carattere Scientifico (IRCCS) s ・ モージュ (パヴィア、イタリア) の放射線治療部門で行われました。
<ol><li>6 MV ピークに光子 x 線エネルギーを設定します。線形加速器パルス政権で動作 (4 ms の約 2 つの連続したパルス間の時間; 線量で 5 μ s の単一パルスの期間率は最大 1 × 10-3 Gy/p)。</li>
	<li>カコ 2 1.4 cm 厚プレキシ グラス (使用される放射線の蓄積よりも少し大きな距離に対応する) でシート 100 cm 放射の源からの x 線の軌道上の挿入を含む 6 ウェル プレートを配置します。</li>
	<li>照射の前に後方散乱放射成分と荷電粒子平衡を保証する各サンプルに 0.5 cm の厚さの塊を配置します。</li>
	<li>セルに照射 (2-10 Gy の範囲で用量) フラットと対称 (± 2%)20 × 20 cm2放射フィールド、3 Gy/分の線量率。 注: 制御「シャム」-照射細胞照射室に入ることがなく、照射物の同じ手続き型条件を施行した (受け取られた線量: 0 Gy)。 注意: 電離放射線を生み出す装置は専門スタッフによってのみ使用する必要があります。</li>
</ol>3. セル実行可能性の試金 (MTT の試金)
注: カコ 2 細胞代謝活性は 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium ブロマイド (MTT) アッセイ14によって評価しました。
<ol><li>シード 2 × 105カコ 2 24 ウェル プレート 24 h で 1.25 mL の完全培地の照射前に。</li>
	<li>2.1 2.4 の手順で説明するよう細胞に照射し、37 ° c 5% CO2を含む加湿雰囲気で細胞をインキュベートします。</li>
	<li>照射後 21 h を 5 mg/mL の MTT 溶液を 100 μ l 添加し、37 ° c 3 時間 5% CO2を含む加湿雰囲気で細胞を維持します。</li>
	<li>上澄みを廃棄し、1 ml の PBS のセルを洗浄してください。</li>
	<li>各ウェル内のジメチルスルホキシド (DMSO) 500 μ L を追加することで塩の結晶を溶解し、λ のウェル プレート リーダーで吸光度を評価 = 570 nm。</li>
	<li>照射後ステップ - 3.3 3.4 3.5-3.6 45 h を繰り返します。 注: 結果は、100% に正規化された対応する偽状態から摂動として表示されます。 注意: DMSO は引火しやすいおよび刺激剤皮膚、目、呼吸器系 (GHS07、GHS08 です)。目に接触した場合豊富な水で十分に洗い流して、医師の診察。MTT は、皮膚、目、呼吸器系 (GHS07、GHS08) の刺激剤です。目に接触した場合直ちに多量の水で洗浄し、医師の診察。</li>
</ol>4. 生菌測定 (トリパン ブルー色素排除試験) の割合
注: 実行可能な細胞の割合は、トリパン ブルー色素排除法によって評価されました。
<ol><li>シード 2 × 105カコ 2 24 ウェル プレート 24 h で 1.25 mL の完全培地の照射前に。</li>
	<li>0 の範囲内の用量で細胞を照射 - 10 Gy (手順 2.1 2.4 参照)、37 ° c 24-48 h の 5% CO2を含む加湿雰囲気でセルを孵化させなさい。</li>
	<li>2 つの選ばれた時ポイント、PBS のセルを洗浄して、それを破棄し、トリプシン エチレンジアミン edta 溶液を 100 μ l 添加します。37 ° C でセルを入れて 2 分間 5% CO2を含む加湿雰囲気し、酵素反応を阻止する完全培地を追加します。</li>
	<li>1.5 mL チューブに細胞を収集し上澄み 500 x g で 5 分間破棄でチューブを遠心し、50 μ L の PBS のセルを再停止します。</li>
	<li>細胞懸濁液を混ぜてトリパン ブルー色素溶液を 50 μ l 添加し、室温で 3 分間混合物を孵化させなさい。</li>
	<li>ステンド_グラス カウント (現実的な) Bürker 室 (実行可能な) セルを無染色。</li>
</ol>5. トランス上皮電気抵抗 (TEER)
<ol><li>シード 5 × 105カコ 2 セル 6 ウェル プレートに照射する前に 1 週間共培養 (ポリエチレンテレフタラート (PET) 2 x 106毛穴/cm2) の挿入。</li>
	<li>照射直前に 1 h を測定電圧計/オームと TEER。</li>
	<li>手順 2.1 2.4 では、細胞を照射します。</li>
	<li>37 ° c 5% CO2を含む加湿雰囲気で PBMC 共培養の有無で caco-2 細胞を孵化させなさい。</li>
	<li>最初数時間後照射測定 TEER 毎の時間とその後 48 時間まですべての 3 h。</li>
</ol>6. 西部のしみのクローディン 1、オクルディン、Afadin、ZO 1、ZO-2 の解析、Nf-kb など XIAP
<ol><li>シード 5 × 105セル 6 ウェル プレート共培養における x 線暴露の前に 1 週 (ペット、2 × 106毛穴/cm2) を挿入し、手順 2.1 2.4 で説明されているように細胞を照射します。</li>
	<li>37 ° c 5% CO2を含む加湿雰囲気で PBMC 共培養の有無で caco-2 細胞を孵化させなさい。</li>
	<li>照射後 48 h 準備カコ 2 と PBMC セル lysates セル換散とセルを扱うことによってバッファーに格納し、-20 ° C で試料を保存 注: プロトコルはここで一時停止することができます。</li>
	<li>ビシンコニン酸 (BCA) 法による総蛋白量を定量化します。 注: プロトコルはここで一時停止することができます。</li>
	<li>総蛋白の同量を混ぜて β-メルカプトエタノールを追加 Laemli サンプル バッファー (β-メルカプトエタノールの最終濃度は 5%)、95 ° C、5 分でサンプルを加熱し、10,000 x g でそれらをスピンします。</li>
	<li>ロード 4-20% のサンプルはゲルをプレキャストし、polyvinildiene ビニリデン (PVDF) 膜の 1 h. 転送蛋白質の 120 V で電気泳動を行います。</li>
	<li>5% 脱脂乾燥したミルク (NFDM) PBS の 0.2% に追加で室温で PVDF 膜の孵化によって非特異的結合部位をブロック トゥイーン 20 (PBT)。0.2 %10 mL で 3 回膜を洗って 5 分 PBT です。</li>
	<li>次の一次抗体の 4 ° C で一晩に配置されている前に室温で 1 時間穏やかな攪拌と膜を孵化させなさい: 反クローディン 1、アンチ ZO 1、アンチ ZO 2、反 afadin、アンチ オクルディン、抗 NF kB、アンチ XIAP、および抗アクチン。0.2 %10 mL で 3 回膜を洗って 5 分 PBT です。</li>
	<li>穏やかな攪拌と室温で 1 h の西洋わさびペルオキシダーゼ HRP 標識二次抗体と膜を孵化させなさい。0.2 %10 mL で 3 回膜を洗って 5 分 PBT です。</li>
	<li>常温で強化された化学発光キットと膜の孵化によって写真フィルムを開発します。</li>
	<li>写真フィルム スキャン システムを取得して適切な画像解析ソフトで得られたバンドを定量化します。 注: ZO 2、ZO-1 Afadin Occludin クローディン 1 の評価は、caco-2 細胞で実行されます。PBMC で Nf-kb など XIAP の評価を行います。 注意: β-メルカプトエタノールは有毒である (GHS05、GHS06、GHS08、GHS09)。蒸気を呼吸に、環境への放出を避けることし、個々 の保護デバイスと呼吸用保護具を着用しません。飲み込んだ場合は、すぐに医学的なアドバイスを求めます。</li>
</ol>7. 統計解析
<ol><li>放射線被ばくと共培養が統計的に有意な摂動を誘発するかどうかを確認するのに繰り返し測定のため (ボンフェローニ事後テストを比較するとの双方向の分散分析 (ANOVA) 多重比較テストを実行する.複製を意味)。</li>
	<li>記載のない場合は、2-スチューデントの両側 t 検定で有意 (p) を計算します。各値は、3 の独立実験 ± 標準誤差の意味 (SEM) の平均値です。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Cunningham, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorectal+cancer.">Colorectal cancer.</a> Lancet. 375 (9719), 1030-1047 (2010).</li><li>Mancuso, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+bystander+radiation+effects+in+Patched+heterozygous+mouse+cerebellum.">Oncogenic bystander radiation effects in Patched heterozygous mouse cerebellum.</a> PNAS. 105 (34), 12445-12450 (2008).</li><li>Demaria, S., Formenti, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+abscopal+effects+of+local+radiotherapy+be+predicted+by+modeling+T+cell+trafficking.">Can abscopal effects of local radiotherapy be predicted by modeling T cell trafficking.</a> J Immunother Cancer. 4 (1), 29 (2016).</li><li>Trott, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+mechanisms+of+normal+tissue+damage:+Importance+for+the+design+of+NTCP+models.">Biological mechanisms of normal tissue damage: Importance for the design of NTCP models.</a> Radiother Oncol. 105 (1), 79-85 (2012).</li><li>Derer, A., Deloch, L., Rubner, Y., Fietkau, R., Frey, B., Gaipl, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radio-immunotherapy-induced+immunogenic+cancer+cells+as+basis+for+induction+of+systemic+anti-tumor+immune+responses+-+pre-clinical+evidence+and+ongoing+clinical+applications.">Radio-immunotherapy-induced immunogenic cancer cells as basis for induction of systemic anti-tumor immune responses - pre-clinical evidence and ongoing clinical applications.</a> Front Immunol. 6, 505 (2015).</li><li>Frey, B., Gaipl, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radio-immunotherapy:+The+focused+beam+expands.">Radio-immunotherapy: The focused beam expands.</a> Lancet Oncol. 16 (7), 742-743 (2015).</li><li>Prise, K. M., O'Sullivan, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation-induced+bystander+signalling+in+cancer+therapy.">Radiation-induced bystander signalling in cancer therapy.</a> Nat Rev Cancer. 9 (5), 351-360 (2009).</li><li>Sambuy, Y., De Angelis, I., Ranaldi, G., Scarino, M. L., Stammati, A., Zucco, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caco-2+cell+line+as+a+model+of+the+intestinal+barrier:+Influence+of+cell+and+culture-related+factors+on+Caco-2+cell+functional+characteristics.">The Caco-2 cell line as a model of the intestinal barrier: Influence of cell and culture-related factors on Caco-2 cell functional characteristics.</a> Cell Biol Toxicol. 21 (1), 1-26 (2005).</li><li>Babini, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+the+induction+of+apoptosis+mediated+by+radiation-induced+cytokine+release.">Mechanisms of the induction of apoptosis mediated by radiation-induced cytokine release.</a> Radiat Prot Dosim. 166 (1-4), 165-169 (2015).</li><li>Pellegrina, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+wheat+germ+agglutinin+on+human+gastrointestinal+epithelium:+Insights+from+an+experimental+model+of+immune/epithelial+cell+interaction.">Effects of wheat germ agglutinin on human gastrointestinal epithelium: Insights from an experimental model of immune/epithelial cell interaction.</a> Toxicol Appl Pharm. 237 (2), 146-153 (2009).</li><li>Pozo-Rubio, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunostimulatory+effect+of+faecal+Bifidobacterium+species+of+breast-fed+and+formula-fed+infants+in+a+peripheral+blood+mononuclear+cell/Caco-2+co-culture+system.">Immunostimulatory effect of faecal Bifidobacterium species of breast-fed and formula-fed infants in a peripheral blood mononuclear cell/Caco-2 co-culture system.</a> Brit J Nutr. 106 (8), 1216-1223 (2011).</li><li>Parlesak, A., Haller, D., Brinz, S., Baeuerlein, A., Bode, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+cytokine+release+by+differentiated+CACO-2+cells+in+a+compartmentalized+coculture+model+with+mononuclear+leucocytes+and+nonpathogenic+bacteria.">Modulation of cytokine release by differentiated CACO-2 cells in a compartmentalized coculture model with mononuclear leucocytes and nonpathogenic bacteria.</a> Scand J Immunol. 60 (5), 477-485 (2004).</li><li>Haller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-pathogenic+bacteria+elicit+a+differential+cytokine+response+by+intestinal+epithelial+cell/leucocyte+co-cultures.">Non-pathogenic bacteria elicit a differential cytokine response by intestinal epithelial cell/leucocyte co-cultures.</a> Gut. 47 (1), 79-87 (2000).</li><li>Mosmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+colorimetric+assay+for+cellular+growth+and+survival:+application+to+proliferation+and+cytotoxicity+assay.">Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assay.</a> J Immunol Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).</li><li>Morini, J., Babini, G., Barbieri, S., Baiocco, G., Ottolenghi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Interplay+between+Radioresistant+Caco-2+Cells+and+the+Immune+System+Increases+Epithelial+Layer+Permeability+and+Alters+Signaling+Protein+Spectrum.">The Interplay between Radioresistant Caco-2 Cells and the Immune System Increases Epithelial Layer Permeability and Alters Signaling Protein Spectrum.</a> Front Immunol. 8, 1-12 (2017).</li><li>Dittmar, S., Harms, H., Runkler, N., Maisner, A., Kim, K. S., Schneider-Schaulies, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measles+virus-induced+block+of+transendothelial+migration+of+T+lymphocytes+and+infection-mediated+virus+spread+across+endothelial+cell+barriers.">Measles virus-induced block of transendothelial migration of T lymphocytes and infection-mediated virus spread across endothelial cell barriers.</a> J Virol. 82 (22), 11273-11282 (2008).</li><li>Srinivasan, B., Kolli, A. R., Esch, M. B., Abaci, H. E., Shuler, M. L., Hickman, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TEER+Measurement+Techniques+for+In+Vitro+Barrier+Model+Systems.">TEER Measurement Techniques for In Vitro Barrier Model Systems.</a> J Lab Autom. 20 (2), 107-126 (2015).</li><li>Moyes, S. M., Killick, E. M., Morris, J. F., Kadhim, M. A., Hill, M. A., Carr, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+produced+by+external+radiation+in+parameters+influencing+intestinal+permeability+and+microparticle+uptake+in+vitro.">Changes produced by external radiation in parameters influencing intestinal permeability and microparticle uptake in vitro.</a> Int J Radiat Biol. 84 (6), 467-486 (2008).</li></ol>

著者は利益相反を宣言しません。

先進国での発生が高いの大腸がんは、罹患率と死亡率、人口の最も頻繁な原因の一つです。それは通常、手術、化学療法、および放射線治療1によって管理されます。放射線治療の枠組みでの注目は、健康な組織の露出4の効果に与えられなければなりません。また、放射線被曝と免疫システムの関係に関する分類学的研究、ラジオ免疫療法3のアプローチを開発のための基礎。
この作品で採用する方法論は、caco-2 細胞と PBMC クロストークの調査に調整されています。我々 は腫瘍細胞の x 線暴露の影響に焦点を当てたが、同じプロトコルが薬理学的エージェントを用いた研究に適応することができます。標準的な細胞培養に関する生理学的な条件に近いが、このメソッドの強力な利点は複雑なシステムでは、異なる種類の細胞とのリリースの両方を分析の可能性を与えられたの完全切除の可能性シグナル分子自体共培養の 2 つのコンパートメントに。このように、日常的に応用生物学的方法は携帯関連のメカニズムを相互作用の理解を助けることができます。
Caco-2 細胞に対する X 線照射効果の初期特性が 2 つの相補的な測定に基づいていた、すなわちMTT 比色定量法とトリパン ブルー色素排除試験。これらの 2 つの試金の別の焦点によって、外見上矛盾した結果を説明できます。MTT は、トリパン ブルーの染料は、生きている細胞の排除色素メカニズムに基づいている間、酸化還元酵素の酵素活性を評価します。
カコ 2 PBMC の相互作用の調査には、上皮性単分子膜共培養の 2 つのコンパートメント間の完全な分離につながることができるの作成が必要です。共培養挿入 caco-2 細胞を播種の可能性によりこの細胞集団のみの照射ができます。照射後共培養を開始、以来、PBMC の任意の偶発的な暴露のためのバイアスはありません。6 ウェル プレート他挿入の動きの時に、細胞膜に必要して損傷 (または汚染) を避けるために慎重に処理するこのセットアップ。慎重に実行されると、TEER 測定、単分子膜の透過性を調べるシンプルかつ非侵襲的な方法です。この試金は厳密に共培養セットアップに関連し、単分子膜の透磁率の調査のための唯一の選択肢ではないです。それは新鮮な完全培地によく校正されて一度対策の良い再現性をことができます。一般的な試金 1 つ下「基底」に上部「頂」コンパートメントから化学染料の普及に焦点を当てる (例:かに (FITC)-デキストラン アッセイ)16。ただし、PBMC が本研究の基底外側コンパートメントに存在するので、実験化学試薬の導入を避けるためにしました。
この作品で採用した別のテクニック、TEER 測定のみである共培養セットアップ17,18を必要とします。ただし、他の一般的な実験技術は細胞の培養に適用するセットアップ生理に近い条件の調査をようにデータより強い生物学的意義があるとより有益な結果を提供します。その一方で、多孔質支持体上に成長した細胞の使用は西部にしみが付くことによって分析される細胞抽出物の調製のためのセル換散などのサンプルを準備するために必要な操作のいくつかの困難につながることを注意しなければなりません。
本研究で採用システム改良、例えば物質の細胞外マトリックスの環境を再作成することができるアプリケーションとさらにする可能性があります。これはまた、システムの複雑さの増加になり、セットアップの完全な郭清は達成するが難しくなります。
細胞培養のためのセットアップは確かに生体外で研究の進歩のため、複雑なシステムを理解するための強力なツールを表しています。このテクニックは基礎研究への新しい入力を提供する分子シグナルと免疫システムの枠組みの中の活動の変調可能なアプリケーションの基本的なメカニズムに知識を増やす可能性を秘めてください。腫瘍臨床患者管理。

今回採用した方法論は、大腸癌細胞と通常の 2次元細胞培養と比較して生理的状態に近いセットアップを利用する免疫システムの間の相互作用を調査するため設計されました。
大腸癌 (CRC) は、第三に最も頻繁なタイプの癌、以上 100 万世界中のケースのと (グローバルがん天文台、癌、世界保健機関、http://gco.iarc.fr の研究のための国際機関) と見なされます。CRC の管理は、手術、化学療法や放射線療法の1によって日常的に行われます。手術や化学療法のような侵襲的な技術と比較して、放射線治療は、主に、放射線のローカライズされた配信のおかげで、これらの臨床的アプローチから派生する典型的な有害な全身反応を回避します。しかし、周囲の健康な組織に健康な細胞への直接作用と非ターゲット効果2,3、4を介した損傷炎症をトリガーに副作用が生じる。大腸癌治療中の照射による副作用を中心に、2 つの側面は調査する必要があります。まず、腸の不浸透性の原因である機構は、ターンでは、細菌の人口の変更された原子格納容器および分子と溶質の傍細胞通過による副作用の可能性を引き起こす放射の配達によって変更できます。第二に、腸管関連リンパ組織 (GALT) の存在は、細菌の増殖を制御して、全般的な免疫応答5,6,7を仲介することの機能を免疫システムの前哨基地として機能します。これらの機能を果たすためには、細胞の膜の複合体の作用により腸の不浸透性が保たれます。これらの理由から、x 線の異なる投与量により誘導される有害な結果で調べた caco-2 細胞単独でそして PBMC と共培養。
細胞培養の研究は生物医学研究における調査の最初 setline が、異なる種類の細胞の細胞生物学および相互相互作用を駆動メカニズムの詳細な知識の欠如が重大になるとき臓器、システム、および実験室で簡単に再作成できない器具の生理学の研究に近づいています。したがって、我々 は一緒に 2 つの細胞集団の研究と細胞間および細胞のメカニズムに関連する側面の郭清可能共培養セットアップを採用すること。
培養は、上皮の機能と異なる種類の細胞間の相互作用を学ぶとき悪用手法です。特に、上皮の極性によって特徴付けられる細胞から成っているので、このような技術の使用は我々 の場合に必須になります。腸管バリアの場合腸を示す根尖との明確に定義された分極と基底のポールは通常タイトな接合を作成する接着分子の存在のために区切られました。この区画は、人身売買と断固とした分子のみ通行許可は傍細胞を避け、組織生理学に必要です。この機能は、もちろん正常なセットアップを培養細胞で再現することが可能。さらに、共培養セットアップの採用は、頂端表面 (腸管に対応) はありませんが他の細胞と接触して直接基底面でのみ免疫細胞の存在を再現します。
最近、カコ 2 細胞は腸粘膜バリアーの生体外モデルとしてより重要性を得た。ひと大腸癌由来、caco-2 細胞分化機能を維持、作成機能偏光膜8、共培養挿入で育てられたとき細胞膜特性の調査を可能にします。
カコ 2 養殖多孔質膜上腸管膜の老舗の in vitroモデルですが、以来、改善はカコ 2 と他の細胞との共培養をされています。この設定は、頻繁に採用されているメジャー間クロストーク タイプ9セルし、カコ 2 を解明するため摂動カコ 2 単独で培養に関しての共培養の外因性の刺激への応答。
多くの研究は、カコ 2 を対処している動作と両方の非病原性細菌の共培養と末梢血単核細胞、特に免疫システム10のクロストークを明らかにします。ポソ ルビオら11は、ビフィズス菌 caco-2 細胞を刺激することで炭酸カルシウム-2/PBMC 培養でいくつかのサイトカインの発現を検討しました。自分の仕事には、PBMC の有無で細菌の刺激によってサイトカイン発現プロファイルに実質的な変更が強調表示されます。その結果は、ビフィズス菌に PBMC の存在がカコ 2 の感受性を高めるという結論に導きます。
Caco-2 細胞の非病原性と病原性細菌に対する異なるは、異なる研究チームによって評価されています。Parlesakら。12は、大腸菌に対する caco-2 細胞の免疫抑制効果を実証-PBMC を刺激します。また、ハラーら。13腸管病原大腸菌属または非腸管病原細菌に関する大腸菌属、caco-2 細胞両方のリポ多糖 (LPS) の刺激の応答を検討した乳酸桿菌属、強化、caco-2 細胞の応答厳密に共培養セットアップ中の白血球の存在に依存するいると推測します。
別の相補的な研究所の試金の実行によって (例えば西部のしみ、トランス上皮電気抵抗、MTT、等)、共同文化で育つ異なったセルタイプの分析に加えて全体の方法論の約束結果より、何が本当に起こるかin vivoの代表ともいえる。さらに、この設定により、関連するセル型の研究だけでなく、細胞間シグナル分子の上対下のコンパートメントにまたはの存在下でリリースを許可する別の共培養区画の分離対共培養の不在。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1007px;" width="1007">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:535px;">ThinCert 
			6 Well Cell Culture Inserts for Multiwell Plates</td>
			<td style="width:187px;">Greiner Bio-one</td>
			<td style="width:119px;">657610</td>
			<td style="width:167px;">Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell Culture Multiwell Plate, 6 Well&#160;</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>657160</td>
			<td>Plastic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell Culture Multiwell Plate, 24 Well&#160;</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>662160</td>
			<td>Plastic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI 1640 without L-Glutamine</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-167F</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Foetal Bovine Serum</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>DE14-801</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Glutamine 200 mM</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-605C</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/Streptomycin&#160; 10K/10K</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-602E</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CO2 Incubator</td>
			<td>Heal Force</td>
			<td>HF240</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ficoll Histopaque-1077</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10771</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:535px;">Tube, 50 mL, PP, Conical Bottom</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>227261</td>
			<td>Plastic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:535px;">Tube, 15 mL, PP, Conical Bottom</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>188261</td>
			<td>Plastic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>CL31R</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3813</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Cell Culture Flask, 25 cm2, PS</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>690175</td>
			<td>Plastic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Clinac 2100 Linear Accelerator</td>
			<td>Varian</td>
			<td>CLINAC 2100C/D</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5655</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Multiwell Plate Reader</td>
			<td>GDV</td>
			<td>DV990BV6</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypan Blue Solution 0,4 %&#160;</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>K940</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4049</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.5 mL tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030125150</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Millicell-ERS voltmeter/ohmeter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MERS 00001</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell Lysis Buffer (10x)</td>
			<td>Cell Signalling Technology</td>
			<td>#9803</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B&#252;rker Hemocytometer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>BR719520</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BCA Protein Quantification Kit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab102536</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2x Laemmli Sample Buffer&#160;</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>#1610737</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-Mercaptoethanol&#160;</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>#1610710</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Accublock Digital Dry Bath</td>
			<td>Labnet International Inc.</td>
			<td>D1100</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4&#8211;20% Mini-PROTEAN TGX Stain-Free Protein Gels, 10 well, 30 &#181;L</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>#4568093&#160;</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mini-PROTEAN&#160;Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, 4-gel</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>#1658004</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PowerPac HC High-Current Power Supply</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>#1645052&#160;</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Precision Plus Protein WesternC Blotting Standards</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>#1610385&#160;</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10x Tris/Glycine/SDS Running Buffer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>#1610732&#160;</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trans-Blot&#160;Turbo Mini PVDF Transfer Packs</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>#1704156</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trans-Blot&#160;Turbo Transfer System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>#1704150</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blotting-Grade Blocker&#160;</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>#1706404</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93773</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Claudin-1 (D5H1D) XP&#160;Rabbit mAb&#160;</td>
			<td>Cell Signalling Technology</td>
			<td>#13255</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine Serum Albumine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ZO-1 (D7D12) Rabbit mAb&#160;</td>
			<td>Cell Signalling Technology</td>
			<td>#8193</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ZO-2 Antibody&#160;</td>
			<td>Cell Signalling Technology</td>
			<td>#2847</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Afadin (D1Y3Z) Rabbit mAb</td>
			<td>Cell Signalling Technology</td>
			<td>&#160;#13531</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-Occludin Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ABT146</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-NF-kB p65 antibody [E379]</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab32536</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-XIAP antibody&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab21278</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amersham ECL Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (from sheep)</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>NA931V</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amersham ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (from donkey)</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>NA934V</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Clarity Western ECL Substrate, 200 mL</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>#1705060&#160;</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Carestream&#160;Kodak&#160;autoradiography GBX developer/replenisher</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7042</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Carestream&#160;Kodak&#160;autoradiography GBX fixer/replenisher</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7167</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Carestream&#160;Kodak&#160;BioMax&#160;light film</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z370401</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gel Doc EZ System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>#1708270&#160;</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a co-culture method to investigate the crosstalk between x-ray irradiated caco-2 cells and pbmc

プロトコル採用でこの作品がどのように x 線摂動の腸粘膜バリアー機能大腸腫瘍細胞と免疫系との相互作用に焦点を当てて解明目指します。大腸癌は、癌が手術、化学療法、放射線治療によって通常の最も一般的な種類の一つです。腫瘍を対象に放射線治療の利点は、よく知られています。ただし、健康な組織の限られた露出は特に腸のバリアと免疫システムに及ぼす影響について、大きな懸念のです。採用のセットアップは通常細胞培養と比較して生理学的に同じような条件で 2 つの細胞集団間の相互作用を研究することができます。このため、我々 はさまざまなテクニックに頼るし、体外培養モデル、単分子膜と同じ培養培地を共有 PBMC 分化 caco-2 細胞に基づきます。このプロトコルは、フォーカス マクロ的効果、すなわち細胞生存率とトランス上皮電気抵抗 (TEER) と、西部のしみ、分子の変化、すなわち炎症経路の活性化に開発されています。免疫細胞、caco-2 細胞のタイト結合蛋白質の表現。TEER がオーム計で一定の時間間隔で測定した中、3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium ブロマイド (MTT) とトリパン ブルーの試金、評価されたのカコ 2 セル実行可能性の放射線照射効果の初期評価共培養系に特化しました。このように、放射線、プレゼンスの末梢血単核細胞 (PBMC)、および最終的に彼らの相乗効果による効果を示すことができます。これらの相補的な技術によって PBMCs を追加したとき、ラジオ - の抵抗が高いカコ 2 2 10 Gy の x 線およびカコ 2 単分子膜の透過性が亢進の範囲内を観察しました。特に、PBMC の存在はタイト結合足場蛋白質発現の変化に関連する発見されました。

1 週間、実験前にセルを挿入の多孔質膜に播種して次の日の間に育つことができます。倒立顕微鏡を使用するか合流点のレベルをチェックすることができますまたは TEER 値の測定。確かに、成長段階では、TEER をすべての多孔質膜は、細胞によって覆われているし、彼らは分化細胞単層を形成するまで増加し続けます。細胞増殖速い/遅い場合実験は、シードされている後以前/以降の時点で開始でした。Confluence (コンフルエンス) 時はセルは、有無/下部コンパートメント (図 1A) でシード PBMC 培養を開始する前に与えられる環境ストレス (温度、pH) を最小限に抑え、照射設備に持って来られるか、caco-2 細胞増殖を評価しています。初期播種密度を考える日目 0 セルする必要があります 100% の合流点に達するし、図 1Bに示す TEER の高原で観察することができます上皮細胞の分化した単分子膜を作成します。細胞がこのような状態に達すれば、TEER 値に次の週では、比較的一定保持され限り古い培養液は新鮮な媒体に置き換えられます、少なくとも週に一度 (図 1B)。図 1Cに示すようは、24 h でも (最大 10 Gy) を受けた線量とは関係なく、48 h で MTT の試金は caco-2 細胞の増殖状態の任意の統計的に有意な変化を表示されません。
異なる結果は caco-2 細胞の短期死亡率に関する観察されました。両方の時点でセル死亡率の用量依存性の増加を示すトリパン ブルー染色します。死んだ細胞の割合が最高線量 (10 Gy) が大まかにしかも細胞死 (図 1D) の 20% を生成することを考慮すると非常に低いように見えますが、これらの結果は放射線被曝の明確な効果を示します。
試料共培養下のコンパートメントの PBMC の有無。PBMC が増殖する任意の外部刺激を受信しなかったこと事実を考えると、48 h 実験は死ぬことを始めて PBMC によって導入されたバイアスを避けるために最適と考えられました。したがってから、照射直前 TEER 定期的に測定した 48 時間照射プロトコルによって引き起こされる可能な一時的な効果を追跡します。(1200-1500 Ω·cm2の順序が) 前処理条件に関して相対的な変化は x 線照射による摂動をハイライトとして TEER の値が表示されます図 1 E Fのようと共培養の PBMC の有無によってまたは。両方のケースで初期の一時的なピークがはっきりわかります最初の時点で、照射プロシージャに帰することができる放射線暴露後。
セルが TEER の長期減少を示していない PBMC (図 1E) との共培養で TEER 値場合は、48 h をほぼ一定 10 Gy x 線の後、3 時間後照射で始まります。PBMCs の存在は完全に TEER ダイナミクス (図 1F) を変更します。すべての用量 TEER が一定値 (図 1F) で解決されたら、TEER の減少は約 30 時間照射後、最大 3 h からの観測では明らかに。
西部のしみの分析を通じてカコ 2 セル lysates のタイト結合複合体の発現量を調べた。Caco-2 細胞 (0、2、および 10 Gy の線量) の電離放射線にさらされる、(図 2A ~ Fで示すように)、その後単独で、または 48 h の下部コンパートメントの PBMCs との共培養を栽培します。クローディン 1 と Occludin (図 2A、2 b) は、x 線および/または PBMC との共培養により大きく変化がないと見つけられました。変動幅が大きい代わりに、足場蛋白質 ZO 1、ZO 2、Afadin (図 2C、2 D、2 e) で観察されました。特に、カコ 2 は単独で育っていたとき既に 10 Gy でのみ PBMC 培養時に 2 Gy 後 ZO 2 発現レベルの低下が観察されます。Afadin 式レベル代わりにカコ 2、PBMCs との共培養時の追加削減 10 Gy x 線の後にのみ影響は。
炎症性の状態に関する PBMCs カコ 2 共培養を行った、特に、核トランスクリプション要因 kB (NF kB) とアポトーシス蛋白 (XIAP) X 連鎖阻害剤を検討した (図 2 G-私)。NF kB 合計金額カコ 2 異なる放射線量 (図 2G) にさらされると共培養によって影響されなかった。どころか、XIAP レベルは大きな変動需要高くそのような変動を削減しより良い統計的検出力を得るために分析したサンプル数が 4 倍アップ規制 2 Gy で 10 Gy 共培養をだった。
図 2Fと2 iのように、いくつかの非特異的バンドが興味の蛋白質の予想される分子量の横に表示されます。真と非特異的バンドがわかりやすい、場合を除き、異なる抗体および BSA または NFDM 濃度を考慮されなければなりません。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56908/56908fig1.jpg"> 図 1.全体的な実験装置と放射線被曝や PBMC 培養のマクロ的効果です。A) 共培養モデルの模式。B) TEER 値は caco-2 細胞単一層の適切な成長および分化状態を評価するための初期シードから毎日測定。C) 細胞生存率及び D) カコ 2 (0、2、5、および 10 Gy) x 線にさらされて死亡。E) TEER caco-2 細胞単位照射 0、2、および 10 Gy の x 線をせず培養または F) PBMCs の。各値は、3 の独立実験 ± SEM. の平均 * p ヴァル < 0.05;* * p va l < 0.01;p ヴァル < 0.001。グラフ モリーニらから適応。15.<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56908/56908fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56908/56908fig2.jpg"> 図 2。カコ 2、PBMC の lysates の西部のしみの結果。PBMC 培養の有無、0、2、および 10 Gy の x 線後カコ 2 タイト結合蛋白質 (クローディン 1 (A)、オクルディン (B)、ZO-1 (C)、ZO 2 (D)、および Afadin (E)) の発現レベル。値は、アクチン レベルで正規化されます。各タイト結合蛋白質および条件の例示の上映をパネル (F)。NF-κ B (G) と XIAP (H) caco-2 細胞と共培養 PBMCs の発現レベル。NF kB、XIAP、アクチンに代表作は、パネルに表示されます。各値は、3 の独立実験 ± モリーニらから適応 SEM. グラフの平均です。15.<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56908/56908fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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A Co-culture Method to Investigate the Crosstalk Between X-ray Irradiated Caco-2 Cells and PBMC

X 線照射したカコ 2 および末梢血単核球 (PBMC) 間のクロストークを調査するためのプロトコルを提案します。プロトコルはカコ 2 照射と PBMC; と共培養のセットアップから始まります。その後、上皮細胞の電気抵抗は、カコ 2 と PBMC の両方で実行 48 h および西部のしみを定期的に測定されます。

X 線間のクロストークを解析のための共培養法照射 caco-2 細胞と PBMC

The protocol adopted in this work aims at unraveling how X-rays perturb the functioning of the intestinal barrier, focusing on the interplay between ...

a-co-culture-method-to-investigate-crosstalk-between-x-ray-irradiated

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

12.9K ビュー.  Università degli Studi di Pavia. X 線照射したカコ 2 および末梢血単核球 (PBMC) 間のクロストークを調査するためのプロトコルを提案します。プロトコルはカコ 2 照射と PBMC; と共培養のセットアップから始まります。その後、上皮細胞の電気抵抗は、カコ 2 と PBMC の両方で実行 48 h および西部のしみを定期的に測定されます。

ビデオ: A Co-culture Method to Investigate the Crosstalk Between X-ray Irradiated Caco-2 Cells and PBMC

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living surfaces. In this paper, we describe protocols for forming Pseudomonas aeruginosa biofilms on human airway epithelial cells (CFBE cells) grown in culture. In the first method (termed the Static Co-culture Biofilm Model), P. aeruginosa is incubated with CFBE cells grown as confluent monolayers on standard tissue culture plates. Although the bacterium is quite toxic to epithelial cells, the addition of arginine delays the destruction of the monolayer long enough for biofilms to form on the CFBE cells. The second method (termed the Flow Cell Co-culture Biofilm Model), involves adaptation of a biofilm flow cell apparatus, which is often used in biofilm research, to accommodate a glass coverslip supporting a confluent monolayer of CFBE cells. This monolayer is inoculated with P. aeruginosa and a peristaltic pump then flows fresh medium across the cells. In both systems, bacterial biofilms form within 6-8 hours after inoculation. Visualization of the biofilm is enhanced by the use of P. aeruginosa strains constitutively expressing green fluorescent protein (GFP). The Static and Flow Cell Co-culture Biofilm assays are model systems for early P. aeruginosa infection of the Cystic Fibrosis (CF) lung, and these techniques allow different aspects of P. aeruginosa biofilm formation and virulence to be studied, including biofilm cytotoxicity, measurement of biofilm CFU, and staining and visualizing the biofilm.

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

This paper describes different methods of growing Pseudomonas aeruginosa biofilms on cultured human airway epithelial cells. These protocols can be adapted to study different aspects of biofilm formation, including visualization of the biofilm, staining of the biofilm, measuring the colony forming units (CFU) of the biofilm, and studying biofilm cytotoxicity.

共培養モデルの緑膿菌</emライブヒト気道細胞上に成長した>バイオフィルム

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

免疫・感染学

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of infection with influenza virus alone. Instead, most individuals are thought to have succumbed to a secondary bacterial infection, predominately caused by the bacterium Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). The synergistic relationship between infections caused by influenza virus and the pneumococcus has subsequently been observed during the 1957 Asian influenza virus pandemic, as well as during seasonal outbreaks of the virus (reviewed in 1, 2). Here, we describe a protocol used to investigate the mechanism(s) that may be involved in increased morbidity as a result of concurrent influenza A virus and S. pneumoniae infection. We have developed an infant murine model to reliably and reproducibly demonstrate the effects of influenza virus infection of mice colonised with S. pneumoniae. Using this protocol, we have provided the first insight into the kinetics of pneumococcal transmission between co-housed, neonatal mice using in vivo imaging 3.

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

A concurrent infection with influenza A virus is one of the factors implicated in the induction of invasive pneumococcal disease during asymptomatic Streptococcus pneumoniae carriage. Here we describe a mixed infection method using infant mice to investigate the synergism between these two respiratory pathogens.

の間に相乗効果を調査するために生物発光イメージングを使用して肺炎球菌幼児マウスで>とインフルエンザウイルス

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

The Insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis

The study of bacterial virulence often requires a suitable animal model. Mammalian models of infection are costly and may raise ethical issues. The use of insects as infection models provides a valuable alternative. Compared to other non-vertebrate model hosts such as nematodes, insects have a relatively advanced system of antimicrobial defenses and are thus more likely to produce information relevant to the mammalian infection process. Like mammals, insects possess a complex innate immune system1. Cells in the hemolymph are capable of phagocytosing or encapsulating microbial invaders, and humoral responses include the inducible production of lysozyme and small antibacterial peptides2,3. In addition, analogies are found between the epithelial cells of insect larval midguts and intestinal cells of mammalian digestive systems. Finally, several basic components essential for the bacterial infection process such as cell adhesion, resistance to antimicrobial peptides, tissue degradation and adaptation to oxidative stress are likely to be important in both insects and mammals1. Thus, insects are polyvalent tools for the identification and characterization of microbial virulence factors involved in mammalian infections.
Larvae of the greater wax moth Galleria mellonella have been shown to provide a useful insight into the pathogenesis of a wide range of microbial infections including mammalian fungal (Fusarium oxysporum, Aspergillus fumigatus, Candida albicans) and bacterial pathogens, such as Staphylococcus aureus, Proteus vulgaris, Serratia marcescens Pseudomonas aeruginosa, Listeria monocytogenes or Enterococcus faecalis4-7. Regardless of the bacterial species, results obtained with Galleria larvae infected by direct injection through the cuticle consistently correlate with those of similar mammalian studies: bacterial strains that are attenuated in mammalian models demonstrate lower virulence in Galleria, and strains causing severe human infections are also highly virulent in the Galleria model8-11. Oral infection of Galleria is much less used and additional compounds, like specific toxins, are needed to reach mortality.
G. mellonella larvae present several technical advantages: they are relatively large (last instar larvae before pupation are about 2 cm long and weight 250 mg), thus enabling the injection of defined doses of bacteria; they can be reared at various temperatures (20 &deg;C to 30 &deg;C) and infection studies can be conducted between 15 &deg;C to above 37 &deg;C12,13, allowing experiments that mimic a mammalian environment. In addition, insect rearing is easy and relatively cheap. Infection of the larvae allows monitoring bacterial virulence by several means, including calculation of LD5014, measurement of bacterial survival15,16 and examination of the infection process17. Here, we describe the rearing of the insects, covering all life stages of G. mellonella. We provide a detailed protocol of infection by two routes of inoculation: oral and intra haemocoelic. The bacterial model used in this protocol is Bacillus cereus, a Gram positive pathogen implicated in gastrointestinal as well as in other severe local or systemic opportunistic infections18,19.

The Insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis

Oral and intra haemocolic infection of larvae of the greater wax moth Galleria mellonella is described. This insect can be used to study virulence factors of entomopathogenic as well as mammalian opportunistic bacteria. Rearing of the insects, methods of infection and examples of in vivo analysis are described.

昆虫<em&gt;ハチノスツヅリガ</em&gt;細菌性病因を調査するための強力な感染モデルとして

The study of bacterial virulence often requires a suitable animal model. Mammalian models of infection are costly and may raise ethical issues. The use of ...

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Continuous advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance imaging (MRI) have greatly improved our ability to study physiological or pathological processes in living organisms. MRI is also proving to be a valuable tool for capturing transplanted cells in vivo. Initial cell labeling strategies for MRI made use of contrast agents that influence the MR relaxation times (T1, T2, T2*) and lead to an enhancement (T1) or depletion (T2*) of signal where labeled cells are present. T2* enhancement agents such as ultrasmall iron oxide agents (USPIO) have been employed to study cell migration and some have also been approved by the FDA for clinical application. A drawback of T2* agents is the difficulty to distinguish the signal extinction created by the labeled cells from other artifacts such as blood clots, micro bleeds or air bubbles. In this article, we describe an emerging technique for tracking cells in vivo that is based on labeling the cells with fluorine (19F)-rich particles. These particles are prepared by emulsifying perfluorocarbon (PFC) compounds and then used to label cells, which subsequently can be imaged by 19F MRI. Important advantages of PFCs for cell tracking in vivo include (i) the absence of carbon-bound 19F in vivo, which then yields background-free images and complete cell selectivityand(ii) the possibility to quantify the cell signal by 19F MR spectroscopy.

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Tracking of cells using MRI has gained remarkable attention in the past years. This protocol describes the labeling of dendritic cells with fluorine (19F)-rich particles, the in vivo application of these cells, and monitoring the extent of their migration to the draining lymph node with 19F/1H MRI and 19F MRS.

使用して樹状細胞の移行の監視<sup&gt; 19</sup&gt; F /<sup&gt; 1</sup&gt; H磁気共鳴イメージング

Continuous  advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance  imaging (MRI) have greatly improved our ability to study ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the protocols described here use freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or plasmacytoid dendritic cells (pDCs) to sense infections in either T cell line (MT4) or heterologous primary CD4+ T cells. In order to ensure proper sensing, it is essential that PBMC are isolated immediately after blood collection and that optimal percentage of infected T cells are used. Furthermore, multi-parametric flow cytometric staining can be used to confirm that PBMC samples contain the different cell lineages at physiological ratios. A number of controls can also be included to evaluate viability and functionality of pDCs. These include, the presence of specific surface markers, assessing cellular responses to known agonist of Toll-Like Receptors (TLR) pathways, and confirming a lack of spontaneous type-I interferon (IFN) production. In this system, freshly isolated PBMCs or pDCs are co-cultured with HIV-1 infected cells in 96 well plates for 18-22 hr. Supernatants from these co-cultures are then used to determine the levels of bioactive type-I IFNs by monitoring the activation of the ISGF3 pathway in HEK-Blue IFN-&#945;/&#946; cells. Prior and during co-culture conditions, target cells can be subjected to flow cytometric analysis to determine a number of parameters, including the percentage of infected cells, levels of specific surface markers, and differential killing of infected cells. Although, these protocols were initially developed to follow type-I IFN production, they could potentially be used to study other imuno-modulatory molecules released from pDCs and to gain further insight into the molecular mechanisms governing HIV-1 innate sensing.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Unlike cell-free HIV-1 particles, infected CD4+ T cells are effectively sensed by plasmacytoid dendritic cells (pDCs). This manuscript describes a method where peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or isolated pDCs are co-cultured with HIV-1 infected T cells to evaluate innate sensing by pDCs as assessed by release of type-I IFN.

HIV-1感染CD4の生得センシングを評価<sup&gt; +</sup&gt;使用して形質細胞様樹状細胞によるT細胞<em&gt;エクスビボ</em&gt;共培養系。

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The molecular basis of this resistance, which is known to be multifactorial, remains incompletely understood. Recent studies found that the differential expression of erythrocyte microRNAs, once translocated into malaria parasites, affect both gene regulation and parasite growth. These miRNAs were later shown to inhibit mRNA translation by forming a chimeric RNA transcript via 5&#39; RNA fusion with discreet subsets of parasite mRNAs. Here, the techniques that were used to study the functional role and putative mechanism underlying erythrocyte microRNAs on the gene regulation and translational potential of P. falciparum, including the transfection of modified synthetic microRNAs into host erythrocytes, will be detailed.&#160; Finally, a polysome gradient method is used to determine the extent of translation of these transcripts. Together, these techniques allowed us to demonstrate that the dysregulated levels of erythrocyte microRNAs contribute to cell-intrinsic malaria resistance of sickle erythrocytes.

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

Human microRNAs translocate from host erythrocytes to Plasmodium falciparum parasites. Here, the techniques used to transfect synthetic microRNAs into host erythrocytes and isolate all RNAs from P. falciparum are described. In addition, this paper will detail a method of polysome isolation in P. falciparum to determine the ribosomal occupancy and translational potential of parasite transcripts.

小さなRNAおよびリボソームの占有の調節の役割を調査する方法<em&gt;熱帯熱マラリア原虫</em

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The ...

Using X-ray Crystallography, Biophysics, and Functional Assays to Determine the Mechanisms Governing T-cell Receptor Recognition of Cancer Antigens

Human CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) are known to play an important role in tumor control. In order to carry out this function, the cell surface-expressed T-cell receptor (TCR) must functionally recognize human leukocyte antigen (HLA)-restricted tumor-derived peptides (pHLA). However, we and others have shown that most TCRs bind sub-optimally to tumor antigens. Uncovering the molecular mechanisms that define this poor recognition could aid in the development of new targeted therapies that circumnavigate these shortcomings. Indeed, present therapies that lack this molecular understanding have not been universally effective. Here, we describe methods that we commonly employ in the laboratory to determine how the nature of the interaction between TCRs and pHLA governs T-cell functionality. These methods include the generation of soluble TCRs and pHLA and the use of these reagents for X-ray crystallography, biophysical analysis, and antigen-specific T-cell staining with pHLA multimers. Using these approaches and guided by structural analysis, it is possible to modify the interaction between TCRs and pHLA and to then test how these modifications impact T-cell antigen recognition. These findings have already helped to clarify the mechanism of T-cell recognition of a number of cancer antigens and could direct the development of altered peptides and modified TCRs for new cancer therapies.

Here, we describe methods that we commonly employ in the laboratory to determine how the nature of the interaction between the T-cell receptor and tumor antigens, presented by human leukocyte antigens, governs T-cell functionality; these methods include protein production, X-ray crystallography, biophysics, and functional T-cell experiments.

がん抗原の機構理事T細胞受容体の認識を決定するためにX線結晶学、生物物理学、および機能アッセイを使用して、

Human CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) are known to play an important role in tumor control. In order to carry out this function, the cell ...

Using Phylogenetic Analysis to Investigate Eukaryotic Gene Origin

Phylogenetic analysis uses nucleotide or amino acid sequences or other parameters, such as domain sequences and three-dimensional structure, to construct a tree to show the evolutionary relationship among different taxa (classification units) at the molecular level. Phylogenetic analysis can also be used to investigate domain relationships within an individual taxon, particularly for organisms that have undergone substantial change in morphology and physiology, but for which researchers lack fossil evidence due to the organisms&#39; long evolutionary history or scarcity of fossilization.
In this text, a detailed protocol is described for using the phylogenetic method, including amino acid sequence alignment using Clustal Omega, and subsequent phylogenetic tree construction using both Maximum Likelihood (ML) of Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) and Bayesian Inference via MrBayes. To investigate the origin of eukaryotic Sugars Will Eventually be Exported Transporters (SWEET) genes, 228 SWEETs including 35 SWEET proteins from unicellular eukaryotes and 57 SemiSWEET proteins from prokaryotes were analyzed. Interestingly, SemiSWEETs were found in prokaryotes, but SWEETs were found in eukaryotes. Two phylogenetic trees constructed using theoretically distinct methods have consistently&#160;suggested that the first eukaryotic SWEET gene might stem from the fusion of a bacterial SemiSWEET gene and an archaeal SemiSWEET gene.&#160;It is worth noting that one should be cautious to draw a conclusion based only on phylogenetic analysis, although it is useful to explain the underlying relationship between different taxa, which is difficult or even impossible to discern through experimental means.

A method of constructing a phylogenetic tree based on sequence homology of SWEETs from eukaryotes and SemiSWEETs from prokaryotes is described. Phylogenetic analysis is a useful tool for explaining the evolutionary relatedness between homologous proteins or genes from different organism groups.

系統解析を使用して真核生物遺伝子の起源を調査するには

Phylogenetic analysis uses nucleotide or amino acid sequences or other parameters, such as domain sequences and three-dimensional structure, to construct ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor microenvironment and the underlying mechanism is still largely unknown. The lack of a consistent and reliable source of NK cells limits the research progress of NK cell immunity. Here, we report an in vitro system that can provide high quality and quantity of bone marrow-derived murine NK cells under a feeder-free condition. More importantly, we also demonstrate that siRNA-mediated gene silencing successfully inhibits the E4bp4-dependent NK cell maturation by using this system. Thus, this novel in vitro NK cell differentiating system is a biomaterial solution for immunity research.

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Here, we present a protocol to mass-produce gene-silencing murine NK cells by using a feeder-free differentiation system for mechanistic study in vitro and in vivo.

生体外でマウスのナチュラル キラー細胞の大量生産のため新規無料の送り装置システム

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Bone Marrow Transplantation Platform to Investigate the Role of Dendritic Cells in Graft-versus-Host Disease

Allogeneic bone marrow transplantation (BMT) is an effective therapy for hematological malignancies due to the graft-versus-leukemia (GVL) effect to eradicate tumors. However, its application is limited by the development of graft-versus-host disease (GVHD), a major complication of BMT. GVHD is evoked when T-cells in the donor grafts recognizealloantigen expressed by recipient cells and mount unwanted immunological attacks against recipient healthy tissues. Thus, traditional therapies are designed to suppress donor T-cell alloreactivity. However, these approaches substantially impair the GVL effect so that the recipient&#39;s survival is not improved. Understanding the effects of therapeutic approaches on BMT, GVL, and GVHD, is thus essential. Due to the antigen-presenting and cytokine-secreting capacities to stimulate donor T-cells, recipient dendritic cells (DCs) play a significant role in the induction of GVHD. Therefore, targeting recipient DCs becomes a potential approach for controlling GVHD. This work provides a description of a novel BMT platform to investigate how host DCs regulate GVH and GVL responses after transplantation. Also presented is an effective BMT model to study the biology of GVHD and GVL after transplantation.

Graft-versus-host disease is a major complication after allogeneic bone marrow transplantation. Dendritic cells play a critical role in the pathogenesis of graft-versus-host disease. The current article describes a novel bone marrow transplantation platform to investigate the role of dendritic cells in the development of graft-versus-host disease and the graft-versus-leukemia effect.

移植片対宿主病における樹状細胞の役割を調べる骨髄移植プラットフォーム

Allogeneic bone marrow transplantation (BMT) is an effective therapy for hematological malignancies due to the graft-versus-leukemia (GVL) effect to ...