このトランスウェル共培養法は、免疫応答を抑制するために腫瘍細胞が使用するパラクリンシグナル伝達を研究するために用いられる。この方法は、新しい分泌リガンド、ならびに免疫抑制効果の機械主義的基盤を発見するために使用することができる。我々は以前、この方法を使用して、腫瘍分泌因子がマクロファージ炎症促進遺伝子転写を減衰させる方法を示した。
このツールは、腫瘍由来免疫抑制の研究に広範な意味を持つと考えています。この技術の主な利点の1つは、細胞間接触の潜在的に交和変数を伴わずに腫瘍細胞と免疫細胞の間のパラクリンシグナル伝達を研究するために使用できることである。このプラットフォームは、下流分析のための様々な分子生物学的手法にも適しています。
腹膜マクロファージを収穫した後、0.4マイクロメートルのポリエステル膜挿入の上の部屋に直接それらをプレートする6ウェルプレートを含む。その後、上部のチャンバーが1ミリリットルを含み、底のチャンバーが1.5ミリリットルを含むようなウェルに添加されたDMEMを加えた。5%の二酸化炭素で摂氏37度で3日間インキュベートします。
まず、それぞれの培地で市販の腫瘍細胞を培養し、ATCC推奨組織培養方法に従う。次に、接着性腫瘍細胞をPBSで1回洗浄する。EDTAに0.05%トリプシンを加え、細胞が切り離されるまで摂氏37度でインキュベートします。
次に、FBS を含むメディアのセルを再中断します。ヘモサイトメーターまたはセルカウンターを使用して、細胞と遠心分離機の総数をGの220倍のペレットに5分間定量します。遠心分離の間、透過性膜支持プレートを含むマクロファージの上下のチャンバーから培地を吸引し、新鮮な培地に交換する。
腫瘍細胞がメッキされる下部のチャンバーの場合、細胞の添加に十分な体積を残すために1.5ミリリットルではなく1ミリリットルの培地で満たします。遠心分離が完了したら、ペレット化された腫瘍細胞から培地を吸引し、1ミリリットル当たり300,000個の濃度で補充されたDMEM中の細胞を再懸濁する。所望のウェルの下の部屋にこの細胞懸濁液の0.5ミリリットルを加える。
マクロファージの炎症促進遺伝子発現を誘導するには、1ミリリットル当たり100ナノグラムのインターフェロンガンマを加え、LPSを1ミリリットル当たり50ナノグラムの濃度で添加して、1回または共同培養マクロファージを治療する。必要に応じて、培養での治療時間を変更します。マクロファージの活性化は2時間以内に起こり、腫瘍媒介抑制は8時間までに起こる。
24時間の共培養は、堅牢で一貫した腫瘍由来抑制をもたらす。ネガティブコントロールとして、文化マクロファージは1人で放置します。陽性対照として、インターフェロンガンマとLPSを用いて、サンプルに使用されるのと同じ濃度で、1回培養したマクロファージを治療する。
所望のインキュベーション時間が経過した後、試験の必要性に応じて必要に応じて細胞のライセートまたは条件培地を分離する。定量的ポリメラーゼ連鎖反応分析のために細胞ライセートを分離するために、ウェルの両チャンバーから培地を吸引し、PBSの2ミリリットルで1回洗浄する。マクロファージを含む上部チャンバーにRNAライシスバッファーを適用します。
この後、膜を静かに掻き取って細胞のライセートを放出し、それを回収管に移して、RNA分離キットメーカーのプロトコルに従ってさらに処理します。ここで説明する共培養法は、物理的接触を伴わないマクロファージおよび腫瘍細胞の培養を含む。腫瘍細胞の不在時に培養した腹膜マクロファージは、陰性および陽性対照として使用される。
B16F10腫瘍細胞の存在下で共培養された腹膜マクロファージは、刺激を活性化しないが、炎症促進関連遺伝子の発現を増加させない。これは、腫瘍分泌リガンドが単独で炎症促進遺伝子発現を誘導するのに十分でないか、または腫瘍分泌による免疫活性化がある場合、パラクリンリガンドがその天然レベルまでそれを抑制するのに十分であることを意味する。この共培養法は、インターフェロンガンマとLPSによって分極したマクロファージが腫瘍細胞の存在下で培養される場合、マウスマクロファージ細胞株J774が腹膜マクロファージに代用されると、炎症関連遺伝子発現の抑制が60%も減少したマクロファージプロ炎症遺伝子抑制が観察されることを示す。
これまでの研究では、マクロファージ活性化を阻害できる腫瘍分泌因子としてプロテインSを同定しており、透過性膜支持共培養モデルは、24時間後に調整された培地中のプロテインSの濃度をアッセイするためにライサと組み合わせて使用されている。インターフェロンガンマおよびLPS処理B16F10黒色腫細胞からのコンディションされた培地では、プロテインSは、1ミリリットル当たり約475ナノグラムの濃度で発現される。腹膜マクロファージは、同じ条件で処理されたプロテインSを、1ミリリットル当たり約61ナノグラムで発現した。
興味深いことに、共培養した場合、インターフェロンガンマとLPS処理ウェルにおけるプロテインSの濃度は、1ミリリットル当たり約86ナノグラムであった。これは、マクロファージが腫瘍分泌タンパク質Sを摂取するか、またはマクロファージの存在下でB16F10細胞によって分泌されるタンパク質Sの量が実質的に減少することを示唆している。これらの結果は、マクロファージが腫瘍細胞と共培養される場合のマクロファージ活性化およびパラクリンシグナル伝達の深い変化を強調する。
トランスウェルの共培養法は、パラクリンシグナル伝達に関する様々な質問に答えることができます。ウェスタンブロット分析を行い、腫瘍分泌タンパク質がマクロファージの様々なシグナル伝達経路をどのように変化させるかを調べることができます。
