そのスライドが第三人間サイド バイ サイドと 2 番目の顕微鏡比較として使われたサブリナ ノーランと同様、スライドの 2 番目の人間サイド ・ バイ ・ サイド比較として使われていたアンソニー ・ ボーエンを認識したいと思います。

1. インドのインク スライドの準備
<ol><li>スライドにクリプトコッカス サンプルの 10 μ L をピペットします。すべての円形の酵母が動作しますが、この実験のため H99 は使用される唯一のひずみ。 注: 文化メディアから直接サンプルの場合は、1:2 PBS または水で希釈すること防ぐことができますインドのインク群生します。</li>
	<li>2 μ L のサンプル上にインドのインク汚れをピペットし、ミックスを物理的にピペット チップをサンプルにプッシュおよびインドのインクが均等に配置された表示されるまで円を描くように移動します。</li>
	<li>サンプルに、やさしく均等にサンプル上、coverslip の反対側を下げる、スライドの表面に対して coverslip の左端を押しながら観察を置きます。</li>
	<li>5 分間乾燥空気にスライドを許可します。</li>
	<li>軽くシールを形成およびインドのインク汚れを保持する coverslip 罫線にマニキュアの発光層を適用します。</li>
</ol>2. 画像スライド
<ol><li>カメラの付属品および知られているピクセル-ミクロン変換明視野顕微鏡でスライドを配置します。細胞カプセルが明確と細胞体は焦点を当て、暗いバンド フィルター、目標、およびコントラストを調整します。 注: さまざまなフィルターがあり、目的、およびコントラストの設定は、動作しますが、目的、Ph1 のフィルター、および 2 × 2 ビン × 20 が推奨されます。</li>
	<li>ビューのフィールドは密がクリプトコッカス細胞、細胞カプセルと背景のコントラストがはっきりとない過密、暗いバンドとして視覚化細胞体で正しく焦点を確認します。 注: サンプルや使用目的に応じて最適な画像のための細胞の正確な数が異なります。セルがないクラスター化または重複を確認する重要な側面が、細胞の焦点面が大幅に変化しない、重要なインドのインクがあることを染色 (フィールドの少なくとも 25%) の背景にはっきりと見える。</li>
	<li>単一ディレクトリ内の画像の計測アルゴリズムが実行され、出力データをイメージ ファイルの名前によると整理すると明確なタイトルを持つ単一のディレクトリに画像を保存します。</li>
</ol>3. アルゴリズム設定
<ol><li>Python のバージョン 2.7 をインストールします。</li>
	<li>「Pip インストール枕」コマンドを実行して追加 python ライブラリをインストールし、"pip は、openpyxl をインストール"します。</li>
	<li>次の手順に従って、MATLAB をインストールします。</li>
	<li>ビルド https://www.mathworks.com/help/matlab/matlab_external/install-the-matlab-engine-for-python.html で提供される指示に従い、MATLAB の python ライブラリ。</li>
	<li>この原稿の補足資料 ("QCA.py"、"Analysis2.m"、"TestRun.m") に含まれている 3 つの必要なファイルをダウンロードします。 メモ: これらのファイルは任意の場所に解凍することができますが、すべての 3 つは、同じディレクトリにある必要があります。</li>
</ol>4. アルゴリズムの使用
<ol><li>QCA.py をダブルクリックして、アプリケーションを実行します。 注: アプリケーションを起動するのに数分をかかる場合があります。"QCA.py"ファイルには、実際のアルゴリズムを実行する".m"ファイルを呼び出すプログラムの構造が含まれています。</li>
	<li>プログラムに記載されている手順に従います。<ol>
<li>入力画像ファイルの拡張子の前にピリオドをセミコロンで区切る (ex.」。TIF;。"jpeg) し、 Enterボタンをクリック。</li>
		<li>画像ファイルがあるディレクトリの選択]ボタンをクリックすると画像が含まれているフォルダーを選択するディレクトリを選択します。</li>
		<li>イメージ リストの生成ボタンをクリックしてディレクトリ内の画像ファイルのリストを生成します。画像は、右側のテキスト ボックスに表示されます。確認し、リストが正確で完全なことを確認します。</li>
		<li>ランダム イメージの選択] ボタンをクリックしてプレビューとして使用するリストからランダムな画像を選択します。 注: イメージは「誤ったイメージ モード エラー」のために開くことができる、アルゴリズムがまだ正しく動作にもかかわらず画像が表示されません。4.2.7 のステップの後、テスト画像が表示されます。</li>
		<li>対物レンズとビニング設定を入力します。既定の設定で使用される顕微鏡が一致しない場合「カスタム ピクセル変換」を選択し、画像ファイルのピクセル-に-um 変換を入力します。一度選択すると、変換の計算ボタンをクリックし、変換が右側のテキスト ボックスによると正しいを確認します。 注: x 倍率と 2 × 2 ビン選択 40 と図 1に示すように代表的な画像を求めた。</li>
		<li>円検出のアルゴリズム パラメーターを入力します。<ol>
<li>Min と Max カプセル半径エントリとして外側のカプセル検出の検出可能な最小値と最大半径を入力します。小さい範囲はより正確な結果になります。</li>
			<li>Min と Max の細胞体半径のエントリとして細胞体検出の検出可能な最小値と最大半径を入力します。 注: これらのエントリのすべての 4 つは、ソース画像によるとそれぞれの値 (ピクセル単位) を表す番号をする必要があります。</li>
			<li>アルゴリズムの感度閾値を調整するカプセルと細胞体感度のスライダーを移動します。低感度に厳格される偽の肯定的な円検出の削減、少ない真円の検出可能性がありますも。逆に、感度の高い検出率は増えますが、偽肯定的なサークルもあります。 注: 代表的な結果は、7 の最小カプセル半径、最大 45 カプセル半径、最小体半径 4、30 の本文の最大半径、87、カプセルの感度と 87 の体感度が得られました。</li>
		</ol>
</li>
		<li>テストの実行ボタンをクリックして、ランダムに選択したイメージのパラメーターをテストします。結果は、元のイメージの交換プログラムの上部中央に表示されます。正確な検索の結果場合は、同様に選択したパラメーターはすべて選択した画像に収まることを確認しようとする追加のランダムなイメージを選択することをお勧めします。<ol>
<li>ボディの数を最大化し、カプセルが検出され、正しく収まるように円が表示されるかどうかを目視で確認します。検出されたカプセル内に遺体を数は、右側にテキスト ボックスに表示されます。それ以外の場合、結果が正確になるまでは、アルゴリズム パラメーターを操作します。 注: 濃い色のついた丸は、可視化を支援するだけです。測定用に生成された実際のサークルは、HCT アルゴリズムによって計算される数学的な曲線です。</li>
		</ol>
</li>
		<li>画像ファイルのディレクトリ全体に検出アルゴリズムを実行するには、 [分析の開始] ボタンをクリックします。各イメージ分析を行い、プログラムが表示されます「終了」、右側のテキスト ボックスにすべての画像の分析が完了したとき。</li>
		<li>一致およびクリーンアップ] ボタンをクリックします。彼らは内に存在する検出されたカプセルに検出された細胞体に一致、カプセルから身を引いて真のカプセルの半径を計算します。 注: 蛍光を検出するアルゴリズムが使用されている場合のみ 1 つの円がある別の状況はこの手順を検出必要はありません。代わりに引いて体のみまたはプル カプセルのみボタンそれぞれのみ、青または緑の円のみのデータを収集するをクリックします。カプセルのデータが取得される場合にのみ、半径が参照するセルの合計半径細胞体の半径を引かれませんよう注意することが重要です。</li>
		<li>画像ディレクトリの"CleanedOuput.csv"ファイルに完成品のデータを検索できます。1 つのデータを選択した場合にのみ、ファイルは"CleanedBodies.csv"または"CleanedCapsules.csv"ラベルがされます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Park, B. J., Wannemuehler, K. A., Marston, B. J., Govender, N., Pappas, P. G., Chiller, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+the+current+global+burden+of+cryptococcal+meningitis+among+persons+living+with+HIV/AIDS.">Estimation of the current global burden of cryptococcal meningitis among persons living with HIV/AIDS.</a> AIDS. 23 (4), 525-530 (2009).</li><li>Kwon-Chung, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptococcus+neoformans+and+Cryptococcus+gattii,+the+etiologic+agents+of+cryptococcosis.">Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii, the etiologic agents of cryptococcosis.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 4 (7), 019760 (2014).</li><li>Granger, D. L., Perfect, J. R., Durack, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virulence+of+Cryptococcus+neoformans.+Regulation+of+capsule+synthesis+by+carbon+dioxide.">Virulence of Cryptococcus neoformans. Regulation of capsule synthesis by carbon dioxide.</a> J Clin Invest. 76 (2), 508 (1985).</li><li>Rumbaugh, J., Pool, A., Gainey, L., Forrester, K., Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Cryptococcal+Capsule+in+Pathogenesis+of+Cryptococcal+Meningitis.">The Role of Cryptococcal Capsule in Pathogenesis of Cryptococcal Meningitis.</a> Neurology. 80 (7), 007 (2013).</li><li>Bojarczuk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptococcus+neoformans+Intracellular+Proliferation+and+Capsule+Size+Determines+Early+Macrophage+Control+of+Infection.">Cryptococcus neoformans Intracellular Proliferation and Capsule Size Determines Early Macrophage Control of Infection.</a> Sci Rep. 6, (2016).</li><li>Robertson, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptococcus+neoformans+Ex+Vivo+Capsule+Size+Is+Associated+With+Intracranial+Pressure+and+Host+Immune+Response+in+HIV-associated+Cryptococcal+Meningitis.">Cryptococcus neoformans Ex Vivo Capsule Size Is Associated With Intracranial Pressure and Host Immune Response in HIV-associated Cryptococcal Meningitis.</a> J Infect Dis. 209 (1), 74-82 (2014).</li><li>Araujo, G. d. e. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capsules+from+Pathogenic+and+Non-Pathogenic+Cryptococcus+spp.+Manifest+Significant+Differences+in+Structure+and+Ability+to+Protect+against+Phagocytic+Cells.">Capsules from Pathogenic and Non-Pathogenic Cryptococcus spp. Manifest Significant Differences in Structure and Ability to Protect against Phagocytic Cells.</a> PLoS One. 7 (1), 29561 (2012).</li><li>Garc&#237;a-Rivera, J., Chang, Y. C., Kwon-Chung, K. J., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptococcus+neoformans+CAP59+(or+Cap59p)+Is+Involved+in+the+Extracellular+Trafficking+of+Capsular+Glucuronoxylomannan.">Cryptococcus neoformans CAP59 (or Cap59p) Is Involved in the Extracellular Trafficking of Capsular Glucuronoxylomannan.</a> Eukaryot Cell. 3 (2), 385-392 (2004).</li><li>Guimar&#227;es, A. J., Frases, S., Cordero, R. J. B., Nimrichter, L., Casadevall, A., Nosanchuk, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptococcus+neoformans+responds+to+mannitol+by+increasing+capsule+size+in+vitro+and+in+vivo:+Mannitol+impacts+the+structure+of+C.+neoformans+capsule.">Cryptococcus neoformans responds to mannitol by increasing capsule size in vitro and in vivo: Mannitol impacts the structure of C. neoformans capsule.</a> Cell Microbiol. 12 (6), 740-753 (2010).</li><li>Zaragoza, O., Fries, B. C., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Capsule+Growth+in+Cryptococcus+neoformans+by+Mammalian+Serum+and+CO2.">Induction of Capsule Growth in Cryptococcus neoformans by Mammalian Serum and CO2.</a> Infect and Immun. 71 (11), 6155-6164 (2003).</li><li>Rossi, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Resistance+to+Fluconazole+on+Virulence+and+Morphological+Aspects+of+Cryptococcus+neoformans+and+Cryptococcus+gattii+Isolates.">Impact of Resistance to Fluconazole on Virulence and Morphological Aspects of Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii Isolates.</a> Front Microbiol. 7, (2016).</li></ol>

著者はある利益相反を開示します。

この手法の重要なステップはインドのインク スライドを準備、顕微鏡画像を取得します。さまざまなスライドと画像技術が正常にテストされてアルゴリズム間の推奨プロトコルはこの原稿で説明されます。これらの粒子が大きすぎて多糖類の線維ネットワークに侵入すると、カプセルのドメインからインドのインク粒子の排除に基づく多糖類カプセルが検出されました。インドのインク除外...

クリプトコッカス ・ ネオフォルマンス免疫抑制の人口に主にひと疾患に関連付けられている世界中で普遍的見つける病原性酵母です。クリプトコッカスは、特に感染症1のためのサハラ以南アフリカで合計年間死亡の重要な原因を占めています。クリプトコッカス感染症の主な臨床症状は髄膜脳炎は、感染させた大食細胞 (トロイの木馬方法) の輸送によって中枢神経系の侵略に続くまたは血液-脳関門の直接交差。クリプトコッカスは、人間の体温、ウレアーゼ活性、メラニン化、多糖類カプセル2の形成で複製する機能を含むいくつかの病原因子を表しています。多糖類のカプセルは、環境ストレス、ホスト免疫反応2等に対する防護壁として glucuronoxylomannan と glucoronoxylomannangalactan ポリマーおよび関数を繰り返しので構成されます。
クリプトコッカス多糖類カプセルのサイズが一貫して関連付けられていない病原性、病態2,3,4、5の要因であることの証拠があります。 6,7。カプセル サイズ髄膜炎病理学6に関連付けられて、クリプトコッカス感染症5を制御するマクロファージの機能に影響を与えることができます、8不在の場合の病原性の低下を招きます。したがって、クリプトコッカスの研究では、一般的なカプセルのサイズ測定がカプセル測定方法の標準的な fieldwide はありません。
現在、クリプトコッカス多糖類のカプセル測定、顕微鏡画像の手動測定に基づいており、画像と計測の両方の買収の正確なメソッドは、研究所9,10、間で異なります 11。このメソッドの当面の関心事は、いくつかの研究では、精度と信頼性の維持を困難にする個々 の測定の何千もの取得を必要とします。さらに、結果を公開するときにもしばしばある測定法の不十分な説明。多くの出版物は彼らの測定値が得られた方法を説明しないかどうか、彼らは 1 つの測定を使用またはいくつか、または他の平均、半径または直径が使用されるかどうか、彼らはカプセルの識別のためのしきい値を決定する方法は、どのような焦点平面が使用されました。詳細。いくつかの出版物だけの状態プログラムとしての法を用い, 例えば、「Adobe Photoshop CS3 使用されたセルを測定する「11。標準化およびレポートの詳細のこの欠乏、再現困難不可能ではない場合。人間の視力、コンピューターの明るさ、顕微鏡設定の違いは、照明、スライドおよび他の要因は、ピクセルの明度の値の比率に基づいて計算は一定になりますが、個人間だけでなく、サンプル、間変わることができるとサンプルとの間に適用されます。この手法は、カプセルの前にどれもなかったフィールドのサイズを測定する標準化された、正確、迅速、簡単な手法を提供することのコンテキストで生成されました。
前述したように、CHT アルゴリズムは, 老舗し、サークルを自動的に検出するスクリプトは、前に書かれています。このメソッドは、他のスクリプトの短い秋、2 つの分野で向上します。まず、円を検出するだけ十分ではない、クリプトコッカス細胞 2 つの明瞭な円は互いに関連して検出する必要がありますので。このメソッドは具体的にカプセル内の細胞体を検出し、両者の差別、関連体カプセル ペアでのみ計算を実行します。第二に、でもときに続いて同じプロトコル、別の捜査官で終る異なる画像を取得しました。捜査官すべてアルゴリズム パラメーター制御を許可すると、このツールは、取得方法の広い範囲を一致するように調整できます。標準化されたスコープ、目的、フィルターの必要はありません。
この手法は、調査官がその背景とは対照的イメージ内の円の検出する必要がありますどのような状況に容易に適用できます。両方円軽量化とその背景を検出できるより暗くカウント、およびこの手法を用いて測定します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:875px;" width="875">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:213px;">India Ink</td>
			<td style="width:99px;">Becton, Dickinson and Co.</td>
			<td style="width:119px;">261194</td>
			<td style="width:444px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:213px;">Fisherbrand Superfrost Microscope Slides</td>
			<td style="width:99px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-550-143</td>
			<td>25x75x1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:213px;">Fisherfinest Premium Cover Glass</td>
			<td style="width:99px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-548-B</td>
			<td>22x22-1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:213px;">Sally Hansen HardasNails Xtreme Wear Nail Polish</td>
			<td style="width:99px;">Sally Hansen</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>109 invisible</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">SAB Media</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S3306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Cryptotoccus neoformans</td>
			<td style="width:99px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">208821</td>
			<td>H99 strain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Olympus AX70 Microscope</td>
			<td style="width:99px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">AX70TRF</td>
			<td>Discontinued ; Bright Field Microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Qimaging Retiga 1300</td>
			<td style="width:99px;">Qimaging</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Discontinued ; Camera Microscope Attachment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">MATLAB</td>
			<td style="width:99px;">MathWorks</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Most recent version recommended</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Python Programming Language</td>
			<td style="width:99px;">Python</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Version 2 necessary ; 2.7 recommended</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Microsoft Excel</td>
			<td style="width:99px;">Microsoft</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Most recent version recommended</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:213px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P3813</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated measurement of cryptococcal species polysaccharide capsule and cell body

このテクニックの目的は、多数多糖類カプセル測定の一貫性のある、正確、かつ管理可能なプロセスを提供することです。
まず、一意に各イメージの計算された強度値に基づくしきい値のイメージが生成されます。その後、円は、オブジェクトと老舗サークル Hough 変換 (CHT) アルゴリズムを使用して背景のコントラストに基づいて検出されます。最後に、検出された細胞カプセルとボディ中心座標と半径のサイズと一致し、データが管理可能なスプレッドシートのユーザーにエクスポートします。
この手法の利点は、シンプルだが重要なです。最初に、これらの計算は人間ではなく、アルゴリズムによって実行されるので精度と信頼性を向上します。 正確性や信頼性に関係なく、どのように多くのサンプルは、分析の減少はありません。第 2 に、このアプローチは、クリプトコッカスフィールド カプセル測定がラボによって現在の状況ではなく潜在的な標準操作手順を確立します。第三に、手動カプセル測定されますがゆっくりと単調なため、オートメーションは高スループット データ解析およびますます強力な統計を円滑に多数の酵母細胞の迅速な測定ができます。
この技術の主要な制限方法から来るアルゴリズム関数。まず、アルゴリズムだけ円が生成されます。クリプトコッカス細胞と彼らのカプセルで円形の形態にかかる、非円形オブジェクトを検出するこの手法を適用することは困難でしょう。第二に、円を検出する方法のため、CHT アルゴリズムはクラスター化されたいくつかの円の外側のエッジに基づく巨大な擬似円を検出できます。ただし、擬似サークル内でキャッチすべての誤って細胞体簡単に検出できその結果のデータ セットから削除されます。
この手法は、インドのインク明視野顕微鏡に基づくクリプトコッカス属円形多糖類のカプセルを測定用適用される可能性が他のコントラストは円形オブジェクトの測定を用いた。

画像は、カメラ (図 1A) と相まって明るいフィールド顕微鏡を使用してインドのインク スライドの顕微鏡観察によって得られる最初。細胞分離とセルと背景のコントラストを作成する十分な汚れを使用して、ビューのフィールドを同様負荷をかけないように十分に低密度を持つことが重要です。プロトコルで述べたように、最適な画...

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Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body

クリプトコッカスの種多糖類カプセルと細胞体の自動測定

この手法では、多糖類のカプセルと体の半径を測定するために設計された自動バッチ イメージ プロセッサについて説明します。クリプトコッカス ・ ネオフォルマンスカプセル測定用にデザインしながらの自動画像処理プロセッサは円形オブジェクトの他の基づいて、コントラスト検出にも適用できます。

The purpose of this technique is to provide a consistent, accurate, and manageable process for large numbers of polysaccharide capsule measurements.
...

automated-measurement-cryptococcal-species-polysaccharide-capsule

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body

7.2K ビュー.  Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health. この手法では、多糖類のカプセルと体の半径を測定するために設計された自動バッチ イメージ プロセッサについて説明します。クリプトコッカス ・ ネオフォルマンスカプセル測定用にデザインしながらの自動画像処理プロセッサは円形オブジェクトの他の基づいて、コントラスト検出にも適用できます。

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Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not representative of the behavior, status or phenotype of single cells. Due to this new insight the number of single cell studies rises continuously (for recent reviews see 1,2,3). However, many of the single cell techniques applied do not allow monitoring the development and behavior of one specific single cell in time (e.g. flow cytometry or standard microscopy).
Here, we provide a detailed description of a microscopy method used in several recent studies 4, 5, 6, 7, which allows following and recording (fluorescence of) individual bacterial cells of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae through growth and division for many generations. The resulting movies can be used to construct phylogenetic lineage trees by tracing back the history of a single cell within a population that originated from one common ancestor. This time-lapse fluorescence microscopy method cannot only be used to investigate growth, division and differentiation of individual cells, but also to analyze the effect of cell history and ancestry on specific cellular behavior. Furthermore, time-lapse microscopy is ideally suited to examine gene expression dynamics and protein localization during the bacterial cell cycle. The method explains how to prepare the bacterial cells and construct the microscope slide to enable the outgrowth of single cells into a microcolony. In short, single cells are spotted on a semi-solid surface consisting of growth medium supplemented with agarose on which they grow and divide under a fluorescence microscope within a temperature controlled environmental chamber. Images are captured at specific intervals and are later analyzed using the open source software ImageJ.

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

This protocol provides a step-by-step procedure to monitor single cell behavior of different bacteria in time using automated fluorescence time-lapse microscopy. Furthermore, we provide guidelines how to analyze the microscopy images.

の生細胞イメージング枯草菌と肺炎球菌自動タイムラプス顕微鏡を使用して

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

免疫・感染学

Measurement of &#947;HV68 Infection in Mice

&gamma;-Herpesviruses (&gamma;-HVs) are notable for their ability to establish latent infections of lymphoid cells1. The narrow host range of human &gamma;-HVs, such as EBV and KSHV, has severely hindered detailed pathogenic studies. Murine &gamma;-herpesvirus 68 (&gamma;HV68) shares extensive genetic and biological similarities with human &gamma;-HVs and is a natural pathogen of murid rodents2. As such, evaluation of &gamma;HV68 infection of mice inbred strains at different stages of viral infection provides an important model for understanding viral lifecycle and pathogenesis during &gamma;-HVs infection.
Upon intranasal inoculation, &gamma;HV68 infection results in acute viremia in the lung that is later resolved into a latent infection of splenocytes and other cells, which may be reactivated throughout the life of the host3,4. In this protocol, we will describe how to use the plaque assay to assess infectious virus titer in the lung homogenates on Vero cell monolayers at the early stage (5 - 7 days) of post-intranasal infection (dpi). While acute infection is largely cleared 2 - 3 weeks postinfection, a latent infection of &gamma;HV68 is established around 14 dpi and maintained later on in the spleen of the mice. Latent infection usually affects a very small population of cells in the infected tissues, whereby the virus stays dormant and shuts off most of its gene expression. Latently-infected splenocytes spontaneously reactivate virus upon explanting into tissue culture, which can be recapitulated by an infectious center (IC) assay to determine the viral latent load. To further estimate the amount of viral genome copies in the acutely and/or latently infected tissues, quantitative real-time PCR (qPCR) is used for its maximal sensitivity and accuracy. The combined analyses of the results of qPCR and plaque assay, and/or IC assay will reveal the spatiotemporal profiles of viral replication and infectivity in vivo.

&#947;-Herpesviruses (&#947;-HVs) establish life-long persistency in their host. Infection of mice with &#947;-HV68 provides a genetically tractable in vivo model for the characterization of the lifecycle/pathogenesis of &#947;HVs. This protocol describes the detection and quantitation of &#947;HV68 infection at acute and latent stages following infection by plaque-forming, infectious center, and qPCR assays.

マウスにおけるγHV68感染の測定

&gamma;-Herpesviruses (&gamma;-HVs) are notable for their ability to establish latent infections of lymphoid cells1. The narrow host range of human ...

Automated Cell Enrichment of Cytomegalovirus-specific T cells for Clinical Applications using the Cytokine-capture System

The adoptive transfer of pathogen-specific T cells can be used to prevent and treat opportunistic infections such as cytomegalovirus (CMV) infection occurring after allogeneic hematopoietic stem-cell transplantation. Viral-specific T cells from allogeneic donors, including third party donors, can be propagated ex vivo in compliance with current good manufacturing practice (cGMP), employing repeated rounds of antigen-driven stimulation to selectively propagate desired T cells. The identification and isolation of antigen-specific T cells can also be undertaken based upon the cytokine capture system of T cells that have been activated to secrete gamma-interferon (IFN-&#947;). However, widespread human application of the cytokine capture system (CCS) to help restore immunity has been limited as the production process is time-consuming and requires a skilled operator. The development of a second-generation cell enrichment device such as CliniMACS Prodigy now enables investigators to generate viral-specific T cells using an automated, less labor-intensive system. This device separates magnetically labeled cells from unlabeled cells using magnetic activated cell sorting technology to generate clinical-grade products, is engineered as a closed system and can be accessed and operated on the benchtop. We demonstrate the operation of this new automated cell enrichment device to manufacture CMV pp65-specific T cells obtained from a steady-state apheresis product obtained from a CMV seropositive donor. These isolated T cells can then be directly infused into a patient under institutional and federal regulatory supervision. All the bio-processing steps including removal of red blood cells, stimulation of T cells, separation of antigen-specific T cells, purification, and washing are fully automated. Devices such as this raise the possibility that T cells for human application can be manufactured outside of dedicated good manufacturing practice (GMP) facilities and instead be produced in blood banking facilities where staff can supervise automated protocols to produce multiple products.

The goal of this protocol is to manufacture pathogen-specific clinical-grade T cells using a bench-top, automated, second generation cell enrichment device that incorporates a closed cytokine capture system and does not require dedicated staff or use of a GMP facility. The cytomegalovirus pp65-specific-T cells generated can be directly administered to patients.

サイトカインキャプチャシステムを用いた臨床応用のためのサイトメガロウイルス特異的T細胞の自動化された細胞濃縮

The adoptive transfer of pathogen-specific T cells can be used to prevent and treat opportunistic infections such as cytomegalovirus (CMV) infection ...

Highly Sensitive Assay for Measurement of Arenavirus-cell Attachment

Arenaviruses are a family of enveloped RNA viruses that cause severe human disease. The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral particles to host cells. While virus-cell attachment can be measured through the use of virions labeled with biotin, radioactive isotopes, or fluorescent dyes, these approaches typically require high multiplicities of infection (MOI) to enable detection of bound virus. We describe a quantitative (q)RT-PCR-based assay that measures Junin virus strain Candid 1 attachment via quantitation of virion-packaged viral genomic RNA. This assay has several advantages including its extreme sensitivity and ability to measure attachment over a large dynamic range of MOIs without the need to purify or label input virus. Importantly, this approach can be easily tailored for use with other viruses through the use of virus-specific qRT-PCR reagents. Further, this assay can be modified to permit measurement of particle endocytosis and genome uncoating. In conclusion, we describe a simple, yet robust assay for highly sensitive measurement of arenavirus-cell attachment.

The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral particles to host cells. We report a quantitative (q)RT-PCR-based assay for ultrasensitive detection and quantitation of arenavirus attachment events.

アレナウイルス - 細胞付着の測定のための高感度アッセイ

Arenaviruses are a family of enveloped RNA viruses that cause severe human disease. The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral ...

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal of immunosuppression. The mixed leukocyte reaction (MLR), limiting dilution assays, and trans-vivo delayed-type hypersensitivity (DTH) assay have all been applied to this question, but these methods have limited predictive ability and/or significant practical limitations that reduce their usefulness. Imaging flow cytometry is a technique that combines the multiparametric quantitative powers of flow cytometry with the imaging capabilities of fluorescent microscopy. We recently made use of an imaging flow cytometry approach to define the proportion of recipient T cells capable of forming mature immune synapses with donor antigen-presenting cells (APCs). Using a well-characterized mouse heart transplant model, we have shown that the frequency of in vitro immune synapses among T-APC membrane contact events strongly predicted allograft outcome in rejection, tolerance, and a situation where transplant survival depends on induced regulatory T cells. The frequency of T-APC contacts increased with T cells from mice during acute rejection and decreased with T cells from mice rendered unresponsive to alloantigen. The addition of regulatory T cells to the in vitro system reduced prolonged T-APC contacts. Critically, this effect was also seen with human polyclonally expanded, naturally occurring regulatory T cells, which are known to control the rejection of human tissues in humanized mouse models. Further development of this approach may allow for a deeper characterization of the alloreactive T-cell compartment in transplant recipients. In the future, further development and evaluation of this method using human cells may form the basis for assays used to select patients for immunosuppression minimization, and it can be used to measure the impact of tolerogenic therapies in the clinic.

This paper describes a method for measuring alloreactivity in a mixed population of T cells using imaging flow cytometry.

イメージングフローサイトメトリーを使用したT細胞同種反応性の測定

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...

Cell-free Biochemical Fluorometric Enzymatic Assay for High-throughput Measurement of Lipid Peroxidation in High Density Lipoprotein

Low high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) levels are one of the most powerful independent negative predictors of atherosclerotic cardiovascular disease (CVD). The structure and function of HDL rather than HDL-C may more accurately predict atherosclerosis. Several HDL protein and lipid compositional changes that impair HDL function occur in inflammatory states such as atherosclerosis. HDL function is usually determined by cell based assays such as cholesterol efflux assay but these assays have numerous drawbacks lack of standardization. Cell-free assays may give more robust measures of HDL function compared to cell-based assays. HDL oxidation impairs HDL function. HDL has a major role in lipid peroxide transport and high amount of lipid peroxides is related to abnormal HDL function. Lipid-probe interactions should be considered when interpreting the results of non-enzymatic fluorescence assays for measuring the lipid oxidative state. This motivated us to develop a cell-free biochemical enzymatic method to assess HDL lipid peroxide content (HDLox) that contributes to HDL dysfunction. This method is based on the enzyme horseradish peroxidase (HRP) and the fluorochrome Amplex Red that can quantify (without cholesterol oxidase) the lipid peroxide content per mg of HDL-C. Here a protocol is describedfor determination of HDL-lipid peroxidation using the fluorochrome reagent. Assay variability can be reduced by strict standardization of experimental conditions. Higher HDLox values are associated with reduced HDL antioxidant function. The readout of this assay is associated with readouts of validated cell-based assays, surrogate measures of cardiovascular disease, systemic inflammation, immune dysfunction, and associated cardiovascular and metabolic risk phenotypes. This technical approach is a robust method to assess HDL function in human disease where systemic inflammation, oxidative stress and oxidized lipids have a key role (such as atherosclerosis).

We describe here a fluorometric cell-free biochemical assay for determination of HDL-lipid peroxidation. This rapid and reproducible assay can be used to determine HDL function in large scale studies and can contribute to our understanding of HDL function in human disease.

高密度リポタンパク質の脂質過酸化反応の高スループット測定用無細胞生化学的蛍光酵素試金

Low high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) levels are one of the most powerful independent negative predictors of atherosclerotic cardiovascular ...

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. albicans is its ability to form biofilms, structured communities of cells attached to biotic and abiotic surfaces. C. albicans biofilms can form on host tissues, such as mucosal layers, and on medical devices, such as catheters, pacemakers, dentures, and joint prostheses. Biofilms pose significant clinical challenges because they are highly resistant to physical and chemical perturbations, and can act as reservoirs to seed disseminated infections. Various in vitro assays have been utilized to study C. albicans biofilm formation, such as microtiter plate assays, dry weight measurements, cell viability assays, and confocal scanning laser microscopy. All of these assays are single end-point assays, where biofilm formation is assessed at a specific time point. Here, we describe a protocol to study biofilm formation in real-time using an automated microfluidic device under laminar flow conditions. This method allows for the observation of biofilm formation as the biofilm develops over time, using customizable conditions that mimic those of the host, such as those encountered in vascular catheters. This protocol can be used to assess the biofilm defects of genetic mutants as well as the inhibitory effects of antimicrobial agents on biofilm development in real-time.

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

This protocol describes the use of a customizable automated microfluidic device to visualize biofilm formation in Candida albicans under host physiological conditions.

自動マイクロ流体デバイスを使用してカンジダ菌バイオ フィルム形成の可視化

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...

Size Matters: Measurement of Capsule Diameter in Cryptococcus neoformans

The polysaccharide capsule of Cryptococcus neoformans is the primary virulence factor and one of the most commonly studied aspects of this pathogenic yeast. Capsule size can vary widely between strains, has the ability to grow rapidly when introduced to stressful or low nutrient conditions, and has been positively correlated with strain virulence. For these reasons, the size of the capsule is of great interest to C. neoformans researchers. The growth of the C. neoformans capsule is induced during phenotypic testing to help understand the effects of different treatments on the yeast or size differences between strains. Here we describe one of the standard methods of capsule induction and compare two accepted methods of staining and measuring capsule diameter: (i) India ink, a negative stain, used in conjunction with conventional light microscopy and (ii) co-staining with fluorescent dyes of both the cell wall and capsule followed by confocal microscopy. Finally, we show how measurement of capsule diameter from India ink-stained samples can be automated using computational image analysis.

Size Matters: Measurement of Capsule Diameter in Cryptococcus neoformans

The polysaccharide capsule is the primary virulence factor in Cryptococcus neoformans, and its size correlates with strain virulence. Capsule diameter measurements are used in phenotypic testing and to gauge therapeutic efficacy. Here a standard method of capsule induction is presented, and two methods of staining and measuring diameter are compared.

クリプトコッカス ・ ネオフォルマンスでカプセルの直径のサイズの問題: 測定

The polysaccharide capsule of Cryptococcus neoformans is the primary virulence factor and one of the most commonly studied aspects of this pathogenic ...

Mouse Body Temperature Measurement Using Infrared Thermometer During Passive Systemic Anaphylaxis and Food Allergy Evaluation

Mouse body temperature measurement is of paramount importance for investigating allergies and anaphylactic symptoms. Rectal probes for temperature readings is common, and they have been proven to be accurate and invaluable in this regard. However, this method of temperature measurement requires the mice to be anesthetized in order to insert the probe without injury to the animal. This limits the ability to observe other phenotypes of the mouse simultaneously. In order to investigate other phenotypes while measuring temperatures, rectal probes are not ideal, and another method is desired. Here, we introduce a noninvasive method of temperature measurement that foregoes the requirement for mouse anesthesia while maintaining equal reliability to rectal probes in measuring body temperature. We use an infrared thermometer that detects body surface temperatures at ranges between 2 and 150 mm. This method of body temperature measurement is successful in reliably replicating temperature change trends during passive system anaphylaxis experiments in mice. We show that body surface temperatures are about 2.0 &#176;C lower than rectal probe measurements, but the degree of temperature drop follows the same trend. Furthermore, we use the same technique to observe mice in a food allergy model to evaluate temperature and activity levels simultaneously.

Here we present a new method to accurately measure body temperature differences in passive systemic anaphylaxis (PSA) and food allergy mouse models using an infrared thermometer. This procedure has been accurately duplicated in previous PSA results.

パッシブ全身性アナフィラキシーと食品アレルギーの評価中に赤外線放射温度計を使用してマウスの体温測定

Mouse body temperature measurement is of paramount importance for investigating allergies and anaphylactic symptoms. Rectal probes for temperature ...

In Vivo Imaging of Reactive Oxygen Species in a Murine Wound Model

The generation of reactive oxygen species (ROS) is a hallmark of inflammatory processes, but in excess, oxidative stress is widely implicated in various pathologies such as cancer, atherosclerosis and diabetes. We have previously shown that dysfunction of the Nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2 (Nrf2)/ Kelch-like erythroid cell-derived protein 1 (Keap1) signaling pathway leads to extreme ROS imbalance during cutaneous wound healing in diabetes. Since ROS levels are an important indicator of progression of wound healing, specific and accurate quantification techniques are valuable. Several in vitro assays to measure ROS in cells and tissues have been described; however, they only provide a single cumulative measurement per sample. More recently, the development of protein-based indicators and imaging modalities have allowed for unique spatiotemporal analyses. L-012 (C13H8ClN4NaO2) is a luminol derivative that can be used for both in vivo and in vitro chemiluminescent detection of ROS generated by NAPDH oxidase. L-012 emits a stronger signal than other fluorescent probes and has been shown to be both sensitive and reliable for detecting ROS. The time lapse applicability of L-012-facilitated imaging provides valuable information about inflammatory processes while reducing the need for sacrifice and overall reducing the number of study animals. Here, we describe a protocol utilizing L-012-facilitated in vivo imaging to quantify oxidative stress in a model of excisional wound healing using diabetic mice with locally dysfunctional Nrf2/Keap1.

In Vivo Imaging of Reactive Oxygen Species in a Murine Wound Model

We describe a non-invasive in vivo imaging protocol that is streamlined and cost-effective, utilizing L-012, a chemiluminescent luminol-analog, to visualize and quantify reactive oxygen species (ROS) generated in a mouse excisional wound model.

生体内でマウスにおける活性酸素種のイメージング創モデル

The generation of reactive oxygen species (ROS) is a hallmark of inflammatory processes, but in excess, oxidative stress is widely implicated in various ...