ありがとう分子生命科学 (MOBI) 博士後期課程・生物学部ミドル テネシー州立大学 (MTSU) でこの研究のための資金を提供します。プロジェクトはだった MTSU 財団 D.E.N. に与えられた特別なプロジェクトの補助金によって一部で賄われても。

注: は、クリプトコッカスがバイオ セーフティ レベル 2 (BSL-2) 病原体とそれを扱う研究者は適切な予防措置を取る必要があります。手続きの詳細な方法に安全に BSL 2 病原体で仕事見つけることができますセンター疾病管理 (CDC) のウェブサイトでは、それは処理のクリプトコッカスと接触しているすべての人はきちんと訓練されることに注意してくださいすることが重要病原体、適切な個人用保護具 (PPE) は、一般的にラテックスやニトリル手袋を常に着用する必要があります。さらに、遠心分離機のロータは、サンプルとすぐに 10% の漂白剤の解決策28を使用してクリーンアップこぼれのエアロゾル化を防ぐために密封する必要があります。
1. カプセル誘導
注: すべての手順は特に断らない限り、室温で実行必要があります。
<ol><li>酵母ペプトン ブドウ糖 (YPD) 液 (pH 6.5 ± 0.2) におけるクリプトコッカスを文化し、ログ段階 (約 18-36 時間) になるまでの揺れで 37 ° C で孵化させなさい。</li>
	<li>870 x g 21 ° C で 5 分間で細胞を遠心し、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) にて 3 回洗浄します。</li>
	<li>セルをカウントし、ダルベッコ最小限不可欠なメディア (DMEM) 2 x 105セル/2 mL で再懸濁します診断 (または自動化された細胞カウンター) を使用します。</li>
	<li>カプセルを誘導して、18 h の CO2を 37 ° C、5% で孵化させなさい。 注: メディアの栄養素の欠如と CO2の存在の組み合わせは、クリプトコッカスカプセルの成長を刺激します。</li>
	<li>後の培養 (上記参照) 遠心、上清のすべてが 5-10 μ L を削除してセルを収穫します。同時に測定される各緊張に対応する非誘導細胞サンプルを収穫します。これらネガティブ コントロールとして使用します。 注: 細胞ペレットが非常に小さくなるし、見づらい場合があります。上清を吸引するときは注意してください。</li>
	<li>インドのインク (セクション 2.1) または蛍光染料 (セクション 2.2) を汚します。</li>
</ol>2. 染色
<ol><li>
インドのインクのみ染色
	<ol>
<li>インドのインクと酵母を染色する残りの上清でペレットを再懸濁し、4μL を追加 (約半分) の細胞懸濁液およびインドのインクをガラス顕微鏡スライドの 4μL。ゆっくり混ぜるし、泡を避けるため。</li>
		<li>13 mm ガラス基板 (#1.5 厚) を適用し、サンプルが乾くを防ぐために非毒性シーラント (明確なマニキュア) 端を密封します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
蛍光染料のみで染色
	<ol>
<li>蛍光色素と酵母を染色するには、1% ウシ血清アルブミン (BSA) で 50 μ L の PBS で細胞ペレットを再懸濁します。</li>
		<li>カルコフ ホワイト (CFW) の等量と文化を孵化させなさい (1 μ g/mL) カプセル モノクローナル抗体 18B7 は AlexaFluor488 に共役 (材料の表を参照)、(AF488) (10 μ G/ml) 37 ° C で 30 分間</li>
		<li>870 x g後の培養を 21 ° C で 5 分間で細胞を遠心し、上清を吸引します。</li>
		<li>1% ウシ血清アルブミン (BSA) を 10 μ L の PBS で細胞ペレットを再懸濁します。</li>
		<li>ガラス顕微鏡スライド上に細胞を懸濁液 8 μ L をピペットします。</li>
		<li>13 mm ガラス基板 (#1.5 厚) を適用し、サンプルが乾くを防ぐために非毒性シーラント (明確なマニキュア) 端を密封します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
インドのインクと蛍光染料染色
	<ol>
<li>直接インドのインク蛍光染料の染色の有効性を比較するため汚れの両方の種類で同じセル人口を共同染色します。これを行うには、まず蛍光カプセルと 2.2.1 - 2.2.3 の手順に従って、細胞壁の汚れの両方で細胞を孵化させなさい。</li>
		<li>次に、蛍光染色細胞懸濁液およびインドのインクをガラス スライドの平等なボリューム (4 μ L) のピペットします。優しく混ぜます。</li>
		<li>13 mm ガラス基板 (#1.5 厚) を適用し、サンプルが乾くを防ぐために非毒性シーラント (明確なマニキュア) エッジをシールします。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 画像集録/顕微鏡
<ol><li>
インドのインクで染まってイメージ投射セル。
	<ol>
<li>標準的な光学顕微鏡 (100 倍) を使用してイメージを取得します。</li>
		<li>条件ごとの 50 のセルの最小値をイメージします。 注: フィールドあたりのセル数は異なります、これは許容されます。重要です、しかし、その重複細胞 (手動で、および自動化されたソフトウェア両方) を測定する困難なので最低限、保持します。これらの実験の画像は露出時間のセルの小さな動きによって引き起こされるぼかしを最小限に抑えながら画像のコントラストを最大にする最適化と 16 ビットの深さでに買収されました。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
蛍光色素で染色細胞イメージング
	<ol>
<li>蛍光顕微鏡による細胞をイメージする顕微鏡イメージング ソフトウェアを開き、使用 fluorophores の適切な励起と発光波長を選択 (CFW と AF488 興奮しているそれぞれ、405 nm と 488 nm ライトを使用して)。蛍光顕微鏡を用いて画像を取得します。</li>
		<li>条件ごとの 50 のセルの最小値をイメージします。 注: フィールドあたりのセル数は異なります、これは許容されます。重要です、しかし、その重複細胞 (手動で、および自動化されたソフトウェア両方) を測定する困難なので最小に保たれます。</li>
		<li>特定のフィールド内の各セルの最大のカプセル径が得られることを確認するために細胞の z スタックのイメージのシリーズを取得します。<ol>
<li>顕微鏡制御ソフトウエア"z"コントロール パネルを開き、パネルの左上隅で「姓」オプションを選択する"z"バーをクリックします。</li>
			<li>単一酵母細胞とビューの現在のフィールド内のすべてのカプセルの最も広いポイントの下は、「最初に設定」をクリックしてレベルで集中する顕微鏡の罰金フォーカス コントロールを使用します。</li>
			<li>現在の表示領域内のセルのすべてのカプセルの同じ細胞の細胞体の最も広いポイントの上の集中する微小焦点コントロールを使用し、「過去の設定」をクリックします。</li>
			<li>「実験を開始」をクリック現在位置の z スタックを取得するを取得する」タブ。複数の位置でプロセスを繰り返して 50 セルの最小の z スタック画像が取得されています。 注: これらの実験では、1.0 に設定された共焦点ピンホール AU と 10-20 スライス各 0.7 μ M をカバーの重複する z シリーズは、選択された位置に買収されました。AU = 風通しの良いユニット。</li>
		</ol>
</li>
		<li>次に、それぞれの z シリーズを最大強度投影法 (MIP) 適切なイメージ解析ソフトウェアを使用してに変換します。 注: MIPs プロジェクト積み上げ画像29のすべての面で最大の強度です。MIPs の作成セルの最大とキャプチャされた 3-D スタック内でカプセルの直径に対応するイメージの 2 D 表現を生成することができます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
インドのインクと蛍光染色細胞イメージング
	<ol>
<li>広視野 (40 倍) または共焦点の顕微鏡を使用して画像を取得 (63 倍または 100 倍)。インドのインクと蛍光染色細胞のコンピューター制御ステージと油浸対物レンズを搭載した広視野顕微鏡を使用してイメージをキャプチャします。 注記: 使用の顕微鏡は、イメージング ソフトウェアの CFW を使用して制御する必要があります。340-380 nm の励起フィルターを介して励起と光を放って蛍光 400 nm ダイクロイック ミラーから反映 435-485 nm バリア フィルターを介して検出されます。AF488 蛍光を 465 495 nm の励起フィルターを励起できることし、505 nm のダイクロイック ミラーで反射バリア フィルターの 515-555 nm から放出される光を検出できます。</li>
		<li>イメージごとの染色法の条件ごとの 50 のセルの最小値。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4 カプセルの手動測定
<ol><li>インドのインクまたは蛍光汚れに染まったセル、カプセルとセル径を手動で測定するセル測定ソフトウェアを使用 (材料の表を参照してください)。これを行うには、"File"へ行く >「画像を開く」>「測定」とカーソルの使用全体のセル (径) の最も広いポイントを通る直線を描画します。</li>
	<li>次に、「測定」をもう一度クリックし、細胞体 (細胞体径) を通る直線を描画します。 注: 測定、セルに自動的に保存されます。</li>
	<li>(最低 50/グループ) のすべてのセルについてこのプロセスを繰り返します。</li>
	<li>彼らを測定したら、画像を保存するクリックして「ファイル」>「名前を付けて保存」、画像を適切な名前します。</li>
	<li>新しく測定ファイルを選択し、表計算ソフトへデータをエクスポートします。</li>
	<li>式を使用してカプセルの直径の平均を計算する: ([合計直径] - [細胞体直径])。</li>
</ol>5 カプセルの自動測定
注: 自動測定に成功のコントラストの高い 16 ビット画像を使用し、するは正しく適切なイメージ解析ソフトウェアと一緒に焦点を当てた (材料の表を参照してください)。クリプトコッカスは、カプセル測定用イメージング、細胞壁とカプセルの間の境界で暗いリングに焦点を当てることが重要です。これによりセルとカプセルを正しく記述するソフトウェアです。
<ol><li>反転し、染色細胞像が適切なイメージ編集ソフトウェアを使用してすべてのインドのインクのコピーを作成 (材料の表を参照してください)。これを行うには、「ファイル」をクリックして > 墨染色画像を開き、「コントロール」では、「オープン」+"I"イメージを反転しますします。クリックして「ファイル」>「名前を付けて保存」反転イメージを保存します。</li>
	<li>オリジナルと逆の両方をインポートするソフトウェアに画像クリックして「ファイル」>「インポート シーケンス」>「読み込み画像」>「を定義するシーケンス (手動)」>「寸法 (チャネル)」>「インポート」>「適用」。 注:クリプトコッカス細胞体とカプセル識別でき、ソフトウェアに含まれている - 'レシピ' と呼ばれる - 特定のアルゴリズムを使用してマスクします。</li>
	<li>倒立像に ' 植民地アナライザー (蛍光)' のレシピを使用して検出し、細胞体をマスクし、「適用」をクリックします。反転イメージクリプトコッカスセルの境界を定義する暗いリングは周囲のカプセルよりも明るくなります。</li>
	<li>彼らのカプセルからクリプトコッカス細胞体のセグメントをクリックして「適用」を反転した画像を ' 植民地アナライザー (蛍光)' レシピを使用します。これは、カウントのマスクを作成します。このカウント マスク「体細胞」の名前を変更するには、"カウント マスク"というラベルの付いたタブを右クリックして。 メモ: レシピは、複数の画像処理手順ので構成されます: 背景除去、オブジェクトの検出、オブジェクトの分離とサブセット フィルタ リングします。</li>
	<li>次に、元の画像の '細胞増殖' レシピを使用して検出し、カプセルをマスクし、「適用」をクリックします。これは、カウントのマスクを作成します。このカウント マスク「カプセル」の名前を変更するには、「カウント マスク」というラベルの付いたタブを右クリックします。</li>
	<li>互いに隣接するカプセルを分割する元のイメージの上に新しいマスクを作成レシピ、' カプセル パーティション ' を使用しています。これを行うには、レシピのドロップ ダウン メニューから「パーティションのカプセル」をクリックします。カプセル パーティション ボックスでカプセル領域の今名前を変更したカウント マスク「カプセル」(5.5) を選択します。暗号のセル (5.4) 今名前を変更したカウント マスク「体細胞」を選択します。「オリジナル」を選択入力チャネル、および"パーティションに分割されたカプセルの作成マスク。"適用をクリックします。 注: セルと検出マスクからセル ・ カプセル、エリア測定の中心を通る最長と最短の軸の平均値として定義されているカプセルの直径にレシピが生成されます。このソフトウェアのスプレッドシート タブの下にある出力を見つけます。すべての画像 (最低 50 セル/グループ) には、このプロセスを繰り返します。レシピのパラメーターは、個々 の画像の検出を最適化するためにチューニングまたは複数画像のバッチ検出用に最適化できませんでした。セルとカプセルの形態の包括的な評価のためのレシピでは、追加の計測を計算できます。</li>
	<li>さらに分析に最適な表計算ソフトへデータをエクスポートします。</li>
</ol>

<ol>
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T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virulence+of+Cryptococcus+neoformans.+Regulation+of+capsule+synthesis+by+carbon+dioxide.">Virulence of Cryptococcus neoformans. Regulation of capsule synthesis by carbon dioxide.</a> J Clin Invest. 76 (2), 508-516 (1985).</li></ol>

著者は、Hoyin ライ、自動画像解析ソフトウェア、Aivia を発行して DRVision で製品マネージャーです。

何十年も、カプセルは mycologists および臨床医クリプトコッカスとクリプトコッカス症病原体の主要な病原因子としての役割のために興味があるための研究の主要な焦点をされています。カプセル サイズの系統間の違いを測定する顕微鏡を用いたと異なる成長の下で条件は、病原体と様々 な刺激 (すなわち、異なった環境条件に対する応答に関する重要な情報を提供できます。?...

毎年 25万人に影響を与えると年間 180,000 以上の死の結果、クリプトコッカスは、細胞内病原性酵母やクリプトコッカス症1,2,の病原3。 直撃鋭く病気4,5,6に受けやすく抗レトロ ウイルス療法に準備ができてアクセスを持っていない貧しい国の HIV 陽性患者であります。CDC からのデータは、サハラ以南のアフリカで、クリプトコッカスを殺すこと結核より多くの人々 毎年、レコード1に任意のエボラ出血熱流行より以上の毎月を示します。露出の最も一般的なルートは、7環境で一般的とされている乾燥の胞子を吸い込むから発生します。肺に入ると、クリプトコッカスの感染した個人内の成功に寄与するいくつかの病原因子があります。多糖類のカプセルは、acapsular 系統ではない病原性8と微生物の主な病原性因子と見なされます。
クリプトコッカスのカプセルは、3 つの主要なコンポーネントの成っている: glucuronoxylomannan (GXM)、galactoxylomannan (GalXM) とマンノタンパク質の利用 (MPs)9。MPs はカプセルの比較的マイナーな細胞壁関連コンポーネント、それらは免疫原性、ほとんどプロ炎症性応答9,10を促進することができます。対照的に、GXM と GalXM カプセルの大部分を構成する (> 重量 90%)11免疫抑制作用を持っていると。その免疫調節効果に加えて体内のカプセルの急速な拡大はホスト貪食細胞 (すなわち、好中球、マクロファージ)12で摂取する機械的な障壁を作成します。クリプトコッカスカプセルとその合成は、複雑ですが、全体的に、高められたカプセル直径増加病原性6,13,14と相関しています。これを考えると、迅速かつ正確に定量化カプセル測定できなければクリプトコッカス研究者にとって重要です。
クリプトコッカスセルとその多糖類カプセル動的構造し、時間15間の変更を表示します。カプセルは、密度、サイズ、およびホスト環境16,17,18の変化に対応したアセンブリに変更できます。低鉄または栄養レベル、血清、人間の生理学的 pH および増加の CO2の露出は、カプセルの成長16,18,19,20を開始する知られています。さらに、研究者は、21,22クリプトコッカスにそのホスト上の優位性を融資感染中陽性で有意差で生じる構造変化を示しています。これは、クリプトコッカスカプセルのアーキテクチャは、さまざまな方法で分析されているために知られています。電子顕微鏡は、たとえば、外部より透過性層23下内側の電子密度の高い層を持つ異種行列をカプセルには明らかにしました。光散乱と光ピンセットの使用は、その高分子プロパティ24をさらに解明する研究者を許可しています。我々 は、多糖類のカプセルは、複雑な分岐構造23知っている両方の静的および動的光散乱測定から結果を分析した。光ピンセットは、構造体の剛性をテストだけでなく、その抗体の反応性の24の評価に使用されています。ただし、クリプトコッカスカプセルのこれまでで最もよく使われる分析のサイズの測定であります。
カプセル サイズを定量化する研究者は、単純な測定をする必要がありますどのようなを使用: カプセルの線径。デジタル マイクロ スコープは、インドのインクまたは蛍光染料で染色複数のクリプトコッカスセル (通常数百) の画像をキャプチャする使用されます。それぞれの細胞体と周囲のカプセルのサイズが測定されます。データがコンパイルされ、カプセルの平均粒径は、セル全体の直径 (セル本体 + カプセル) から細胞体直径を差し引いて計算されます。この時点まで、これらの測定は手動で行われています。一般的に正確にしながら、研究者の欠点があるこの方法。数日かかるまたは手で分析する数週間を大きなデータ セット。主観とヒューマン エラーが結果に影響を与えるこれらの測定は手動で行われるため。
自動計算画像解析生体画像25,26,27のより速くより信頼性の高い分析を有効にする分子細胞生物学の多くの分野の研究者の必要不可欠なツールとなっています。精密な画像解析手法は、私のものは、複雑で膨大なデータ セットから定量的情報に必要です。しかし、いくつかの測定、特にクリプトコッカスカプセルの測定は、自動化が困難されています。正確に細胞壁とカプセルは、一般的に暗いリングの時に位相差顕微鏡を用いたイメージングとして表示されます、インターフェイスを識別することができますシンプルなしきい値を使用して解決するは面倒。さらに、クリプトコッカス培養細胞は一緒に群生する傾向があるし、細胞の正確な分割が正確な測定に必要です。
このプロジェクトの目的は、(i) カプセル誘導クリプトコッカス、 (ii) 比較とコントラスト墨標準プロトコルの 1 つを説明するためにだったし、蛍光染色直径計測をカプセルに関連する (iii) シンプルでインドのインク、画像解析ソフトウェア、(iv) を使用してセルをステンド グラスのイメージを使用してカプセルの直径を測定するための計算方法は、利点と手動でカプセルの直径を計測の自動化ソフトウェアを使用して制限を評価します。2 つの染色法、蛍光細胞壁とカプセルの標識のそれを見つけるより時間がかかる中、実験間の最も一貫した結果を提供します。ただし、両方のメソッドは、正常に区別するために私たちを有効に研究室と臨床クリプトコッカスの系統別展示カプセル サイズ。さらに、インドのインク染色画像からカプセルの直径の測定を自動化し、これはカプセルの手動計測を実行可能な代替であることがわかったことができました。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="983">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Capsule Induction</td>
			<td style="width:204px;"></td>
			<td style="width:117px;"></td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">C. neoformans cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>The clinical lab strain, H99S, was a kind gift from Dr. John Perfect (Duke University).&#160; The clinical strains, B18 and B52, were kind gifts from Dr. Greg Bisson (University of Pennsylania).&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast Peptone Dextrose Broth (YPD)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0428-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>This is made in the lab using standard recipe (137mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mM Na2HPO4O, 2 mM Kh2PO4O)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/high-glucose with L-glutamine, without sodium pyruvate</td>
			<td>GE Life Sciences</td>
			<td>SH30022.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6-well plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>CL5335-5EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Shaking incubator</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td></td>
			<td>MaxQ6000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CO2 incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Isotemp</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Legend XTR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Staining</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Legend Micro 21R</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">India ink</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-910-56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcofluor white</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>18909-100ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">18B7 mouse anti-GXM antibody conjugated to Alexafluor 488</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>A kind gift from Dr. Arturo Casadevall (Johns Hopkins University)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS with 1% Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>PBS is the same recipe listed above (line 4) with 1% BSA added and filter sterilized.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Superfrost microscope slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass coverslips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2855-18</td>
			<td>#1.5 thickness</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Clear nail polish or other non-toxic sealant</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image Acquisition&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immersion oil</td>
			<td>Cargille&#160;</td>
			<td>16484</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Light microscope with immersion oil objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Zeiss Axio A1 with a Plan - NEOFLUAR 100x oil immersion NA 1.30 objective</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Light microscope camera</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Zeiss Axiocam ErCD camera</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal microscope with oil immersion objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>LSM 700 laser scanning confocal equipped with a Plan-Apochromat 63X NA 1.4 oil immersion DIC M27 objective.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal microscope software</td>
			<td>Zen 2009</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal microscope camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Nikon Ti-Eclipse with a Intensilight epifluorescence illuminator (Nikon), CoolSNAP MYO microscope camera (Photometrics), Plan Apo 60x NA 1.40 oil immersion objective (Nikon) and 1.5x magnification changer.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Widefield imaging software</td>
			<td>Nikon Elements (Nikon)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Capsule Measurement</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image editing software</td>
			<td>Photoshop (Adobe)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope software for manual measurement</td>
			<td>Axiovision (Carl Zeiss)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image analysis software for automated meesurement</td>
			<td>Aivia (DRVision Technologies)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spreadsheet software</td>
			<td>Excel (Microsoft)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

size matters: measurement of capsule diameter in cryptococcus neoformans

クリプトコッカス ・ ネオフォルマンスの多糖類のカプセルが主な病原性因子と最もよくこの病原性酵母の側面を検討しました。カプセル サイズ系統によって大きく異なります、ストレスや低栄養状態に導入されたとき、急速に成長する能力を持って、積極的に株の病原性と相関しています。これらの理由から、カプセルのサイズは、クリプトコッカスの研究者の関心です。クリプトコッカスカプセルの成長が表現型のテスト中に系統の酵母やサイズ違いのさまざまな治療法の効果を理解するために誘導されます。ここで述べるカプセル誘導と比較 2 つの受け入れられた方法の染色とカプセルの直径を測定の標準的な方法の 1 つ: (i) インドのインクと、従来の光学顕微鏡と組み合わせて・ (ii) 共同で染色、ネガティブ染色細胞壁と共焦点顕微鏡によるカプセルの両方の蛍光染料。最後に、どのようにインドのインク染色サンプルからカプセルの直径の測定をすることができますを示す計算イメージ分析を使用して自動化します。

3 系統を用いてカプセル誘導、細胞染色、イメージング、および計測技術を示すためには、クリプトコッカス:共通、よ特徴付けられた実験室株、H99S30、および 2 つの臨床分離株の以前不明なカプセルの直径、B18 と B5231。
カプセル誘導、染色、およびインドのインクを使用して画?...

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Size Matters: Measurement of Capsule Diameter in Cryptococcus neoformans

クリプトコッカス ・ ネオフォルマンスでカプセルの直径のサイズの問題: 測定

多糖類のカプセルはクリプトコッカス ・ ネオフォルマンスの主な病原性因子とそのサイズが株の病原性と相関します。カプセル径測定は、表現型のテストと治療効果を測定するために使用されます。カプセル誘導の標準的な方法の紹介、染色し、直径を測定の 2 つの方法が比較されます。

The polysaccharide capsule of Cryptococcus neoformans is the primary virulence factor and one of the most commonly studied aspects of this pathogenic ...

size-matters-measurement-capsule-diameter-cryptococcus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Size Matters: Measurement of Capsule Diameter in Cryptococcus neoformans

13.4K ビュー.  Middle Tennessee State University. 多糖類のカプセルはクリプトコッカス ・ ネオフォルマンスの主な病原性因子とそのサイズが株の病原性と相関します。カプセル径測定は、表現型のテストと治療効果を測定するために使用されます。カプセル誘導の標準的な方法の紹介、染色し、直径を測定の 2 つの方法が比較されます。

ビデオ: Size Matters: Measurement of Capsule Diameter in Cryptococcus neoformans

Measurement of Cytosolic Ca2+ in Isolated Contractile Lymphatics

Lymphatic vessels comprise a multifunctional transport system that maintains fluid homeostasis, delivers lipids to the central circulation, and acts as a surveillance system for potentially harmful antigens, optimizing mucosal immunity and adaptive immune responses1. Lymph is formed from interstitial fluid that enters blind-ended initial lymphatics, and then is transported against a pressure gradient in larger collecting lymphatics. Each collecting lymphatic is made up of a series of segments called lymphangions, separated by bicuspid valves that prevent backflow. Each lymphangion possesses a contractile cycle that propels lymph against a pressure gradient toward the central circulation2. This phasic contractile pattern is analogous to the cardiac cycle, with systolic and diastolic phases, and with a lower contraction frequency4. In addition, lymphatic smooth muscle generates tone and displays myogenic constriction and dilation in response to increases and decreases in luminal pressure, respectively5. A hybrid of molecular mechanisms that support both the phasic and tonic contractility of lymphatics are thus proposed.
Contraction of smooth muscle is generally regulated by the cytosolic Ca2+ concentration ([Ca2+]i) plus sensitivity to Ca2+, of the contractile elements in response to changes in the environment surrounding the cell6. [Ca2+]i is determined by the combination of the movement of Ca2+ through plasma membrane ligand or voltage gated Ca2+ channels and the release and uptake of Ca2+ from internal stores. Cytosolic Ca2+ binds to calmodulin and activates enzymes such as myosin light chain (MLC) kinase (MLCK), which in turn phosphorylates MLC leading to actin-myosin-mediated contraction8. However, the sensitivity of this pathway to Ca2+ can be regulated by the MLC phosphatase (MLCP)9. MLCP activity is regulated by Rho kinase (ROCK) and the myosin phosphatase inhibitor protein CPI-17.
Here, we present a method to evaluate changes in [Ca2+]i over time in isolated, perfused lymphatics in order to study Ca2+-dependent and Ca2+-sensitizing mechanisms of lymphatic smooth muscle contraction. Using isolated rat mesenteric collecting lymphatics we studied stretch-induced changes in [Ca2+]i and contractile activity. The isolated lymphatic model offers the advantage that pressure, flow, and the chemical composition of the bath solution can be tightly controlled. [Ca2+]i was determined by loading lymphatics with the ratiometric, Ca2+-binding dye Fura-2. These studies will provide a new approach to the broader problem of studying the different molecular mechanisms that regulate phasic contractions versus tonic constriction in lymphatic smooth muscle.

Measurement of Cytosolic Ca2+ in Isolated Contractile Lymphatics

We introduce an approach to evaluate the cytosolic Ca2+ concentration in isolated lymphatics to study Ca2+-dependent and Ca2+-sensitizing mechanisms of lymphatic smooth muscle contraction.

細胞質のCaの測定 2 +絶縁収縮リンパ管における

Lymphatic vessels comprise a multifunctional transport system that maintains fluid homeostasis, delivers lipids to the central circulation, and acts as a ...

免疫・感染学

Measurement of &#947;HV68 Infection in Mice

&gamma;-Herpesviruses (&gamma;-HVs) are notable for their ability to establish latent infections of lymphoid cells1. The narrow host range of human &gamma;-HVs, such as EBV and KSHV, has severely hindered detailed pathogenic studies. Murine &gamma;-herpesvirus 68 (&gamma;HV68) shares extensive genetic and biological similarities with human &gamma;-HVs and is a natural pathogen of murid rodents2. As such, evaluation of &gamma;HV68 infection of mice inbred strains at different stages of viral infection provides an important model for understanding viral lifecycle and pathogenesis during &gamma;-HVs infection.
Upon intranasal inoculation, &gamma;HV68 infection results in acute viremia in the lung that is later resolved into a latent infection of splenocytes and other cells, which may be reactivated throughout the life of the host3,4. In this protocol, we will describe how to use the plaque assay to assess infectious virus titer in the lung homogenates on Vero cell monolayers at the early stage (5 - 7 days) of post-intranasal infection (dpi). While acute infection is largely cleared 2 - 3 weeks postinfection, a latent infection of &gamma;HV68 is established around 14 dpi and maintained later on in the spleen of the mice. Latent infection usually affects a very small population of cells in the infected tissues, whereby the virus stays dormant and shuts off most of its gene expression. Latently-infected splenocytes spontaneously reactivate virus upon explanting into tissue culture, which can be recapitulated by an infectious center (IC) assay to determine the viral latent load. To further estimate the amount of viral genome copies in the acutely and/or latently infected tissues, quantitative real-time PCR (qPCR) is used for its maximal sensitivity and accuracy. The combined analyses of the results of qPCR and plaque assay, and/or IC assay will reveal the spatiotemporal profiles of viral replication and infectivity in vivo.

&#947;-Herpesviruses (&#947;-HVs) establish life-long persistency in their host. Infection of mice with &#947;-HV68 provides a genetically tractable in vivo model for the characterization of the lifecycle/pathogenesis of &#947;HVs. This protocol describes the detection and quantitation of &#947;HV68 infection at acute and latent stages following infection by plaque-forming, infectious center, and qPCR assays.

マウスにおけるγHV68感染の測定

&gamma;-Herpesviruses (&gamma;-HVs) are notable for their ability to establish latent infections of lymphoid cells1. The narrow host range of human ...

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

A complex interaction between the immune response and host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in particular, is known to occur as a response to infection in mammals 1 and has also recently been described in Drosophila melanogaster2. It is generally accepted that sleep is beneficial to the host during an infection and that it is important for the maintenance of a robust immune system3,4. However, experimental evidence that supports this hypothesis is limited4, and the function of excess sleep during an immune response remains unclear. We have used a multidisciplinary approach to address this complex problem, and have conducted studies in the simple genetic model system, the fruitfly Drosophila melanogaster. We use a standard assay for measuring locomotor behavior and sleep in flies, and demonstrate how this assay is used to measure behavior in flies infected with a pathogenic strain of bacteria. This assay is also useful for monitoring the duration of survival in individual flies during an infection. Additional measures of immune function include the ability of flies to clear an infection and the activation of NF&kappa;B, a key transcription factor that is central to the innate immune response in Drosophila. Both survival outcome and bacterial clearance during infection together are indicators of resistance and tolerance to infection. Resistance refers to the ability of flies to clear an infection, while tolerance is defined as the ability of the host to limit damage from an infection and thereby survive despite high levels of pathogen within the system5. Real-time monitoring of NF&kappa;B activity during infection provides insight into a molecular mechanism of survival during infection. The use of Drosophila in these straightforward assays facilitates the genetic and molecular analyses of sleep and the immune response and how these two complex systems are reciprocally influenced.

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

To understand a link between the immune response and behavior, we describe a method to measure locomotor behavior in Drosophila during bacterial infection as well as the ability of flies to mount an immune response by monitoring survival, bacterial load, and real-time activity of a key regulator of innate immunity, NF&kappa;B.

免疫応答やスリープ中の定量的測定<em&gt;ショウジョウバエ</em

A complex interaction between the immune response and  host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in  particular, is known ...

Measurement of Tactile Allodynia in a Murine Model of Bacterial Prostatitis

Uropathogenic Escherichia coli (UPEC) are pathogens that play an important role in urinary tract infections and bacterial prostatitis1. We have recently shown that UPEC have an important role in the initiation of chronic pelvic pain2, a feature of Chronic prostatitis/Chronic pelvic pain syndrome (CP/CPPS)3,4. Infection of the prostate by clinically relevant UPEC can initiate and establish chronic pain through mechanisms that may involve tissue damage and the initiation of mechanisms of autoimmunity5.
A challenge to understanding the pathogenesis of UPEC in the prostate is the relative inaccessibility of the prostate gland to manipulation. We utilized a previously described intraurethral infection method6 to deliver a clinical strain of UPEC into male mice thereby establishing an ascending infection of the prostate. Here, we describe our protocols for standardizing the bacterial inoculum7 as well as the procedure for catheterizing anesthetized male mice for instillation of bacteria.
CP/CPPS is primarily characterized by the presence of tactile allodynia4. Behavior testing was based on the concept of cutaneous hyperalgesia resulting from referred visceral pain8-10. An irritable focus in visceral tissues reduces cutaneous pain thresholds allowing for an exaggerated response to normally non-painful stimuli (allodynia). Application of normal force to the skin result in abnormal responses that tend to increase with the intensity of the underlying visceral pain. We describe methodology in NOD/ShiLtJ mice that utilize von Frey fibers to quantify tactile allodynia over time in response to a single infection with UPEC bacteria.

Infection of the prostate may be a contributing factor in mediating pelvic pain in chronic prostatitis. We describe the procedure for preparation of standardized bacterial inoculum, instillation of bacteria into the urethra of male mice and methodology for measuring tactile allodynia in mice over time.

細菌性前立腺炎のマウスモデルにおける接触性アロディニアの測定

Uropathogenic Escherichia coli (UPEC) are pathogens that play an important role in urinary tract infections and bacterial prostatitis1. We have recently ...

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

Many aspects of the infection of macrophages by Cryptococcus neoformans have been extensively studied and well defined. However, one particular interaction that is not clearly understood is non-lytic exocytosis. In this process, yeast cells are released into the extracellular space by a poorly understood mechanism that leaves both the macrophage and Cn viable. Here, we describe how to follow a large number of individually infected macrophages for a 24 hr infection period by time-lapsed microscopy. Infected macrophages are housed in a heating chamber with a CO2 atmosphere attached to a microscope that provides the same conditions as a cell-culture incubator. Live digital microscopy can provide information about the dynamic interactions between a host and pathogen that is not available from static images. Being able to visualize each infected cell can provide clues as to how macrophages handle fungal infections, and vice versa. This technique is a powerful tool in studying the dynamics that are behind a complex phenomenon.

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

We describe how to visualize macrophage-C. neoformans (Cn) interactions in real time, with specific emphasis on the process of non-lytic exocytosis using digital light microscopy. Using this technique individually infected macrophages can be studied to ascertain various aspects of this phenomenon.

の非溶解性エキソサイトーシスの可視化<em&gt;クリプトコッカス·ネオフォルマンス</em&gt;デジタル光学顕微鏡を使用したマクロファージから

Many aspects of the infection of macrophages by Cryptococcus neoformans have been extensively studied and well defined. However, one particular ...

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are able to replicate in the deep lung. Phagocytosis of Cryptococcus by macrophages is one of the ways that the disease is able to spread into the central nervous system to cause lethal meningoencephalitis. Therefore, study of the association between Cryptococcus and macrophages is important to understanding the progression of the infection. The present study describes a step-by-step protocol to study macrophage infectivity by C. neoformansin vitro. Using this protocol, the role of host sterols on host-pathogen interactions is studied. Different concentrations of methyl--cyclodextrin (MCD) were used to deplete cholesterol from murine reticulum sarcoma macrophage-like cell line J774A.1. Cholesterol depletion was confirmed and quantified using both a commercially available cholesterol quantification kit and thin layer chromatography. Cholesterol depleted cells were activated using Lipopolysacharide (LPS) and Interferon gamma (IFN&#947;) and infected with antibody-opsonized Cryptococcus neoformans wild-type H99 cells at an effector-to-target ratio of 1:1. Infected cells were monitored after 2 hr of incubation with C. neoformans and their phagocytic index was calculated. Cholesterol depletion resulted in a significant reduction in the phagocytic index. The presented protocols offer a convenient method to mimic the initiation of the infection process in a laboratory environment and study the role of host lipid composition on infectivity.

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

In this article, a protocol for infection of macrophages with Cryptococcus neoformans is described. Also, a method for sterol depletion from the macrophages is explained. These protocols provide a guide to study fungal infections in vitro and examine the role of sterols in such infections.

マクロファージコレステロール枯渇との食作用への影響<em&gt;クリプトコックス·ネオフォルマンス</em

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans

The basidiomycete Cryptococcus neoformans, an invasive opportunistic pathogen of the central nervous system, is the most frequent cause of fungal meningitis worldwide resulting in more than 625,000 deaths per year worldwide.&#160;Although electroporation has been developed for the transformation of plasmids in Cryptococcus, only&#160;biolistic&#160;delivery provides&#160;an effective means to transform&#160;linear&#160;DNA&#160;that can be integrated into the genome by homologous recombination.&#160;
Acetate has been shown to be a major fermentation product during cryptococcal infection, but the significance of this is not yet known.&#160;A bacterial pathway composed of the enzymes xylulose-5-phosphate/fructose-6-phosphate phosphoketolase (Xfp) and acetate kinase (Ack) is one of three potential pathways for acetate production in C. neoformans. Here, we demonstrate the biolistic transformation of a construct, which has the gene encoding Ack fused to the fluorescent tag mCherry, into&#160;C. neoformans. We then confirm integration of the ACK-mCherry fusion into the&#160;ACK&#160;locus.

Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans

Biolistic transformation is a method used to generate stable integration of DNA into the genome of the opportunistic pathogen Cryptococcus neoformans through homologous recombination. We will demonstrate biolistic transformation of a construct, which has the gene encoding acetate kinase fused to the fluorescent tag mCherry into&#160;C. neoformans.

日和見菌病原体への蛍光タグ付き遺伝子のバイオリスティック変容<em&gt;クリプトコックス·ネオフォルマンス</em

The basidiomycete Cryptococcus neoformans, an invasive opportunistic pathogen of the central nervous system, is the most frequent cause of fungal ...

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the viral capsid (CA) core into the cytoplasm. Subsequently, the viral Reverse Transcriptase (RT), as part of a namesake nucleoprotein complex termed the Reverse Transcription Complex (RTC), converts the viral single-stranded RNA genome into a double-stranded DNA copy (vDNA). This leads to the biogenesis of another nucleoprotein complex, termed the pre-integration complex (PIC), composed of the vDNA and associated virus proteins and host factors. The PIC-associated viral integrase (IN) orchestrates the integration of the vDNA into the host chromosomal DNA in a temporally and spatially regulated two-step process. First, the IN processes the 3&#39; ends of the vDNA in the cytoplasm and, second, after the PIC traffics to the nucleus, it mediates integration of the processed vDNA into the chromosomal DNA. The PICs isolated from target cells acutely infected with HIV-1 are functional in vitro, as they are competent to integrate the associated vDNA into an exogenously added heterologous target DNA. Such PIC-based in vitro integration assays have significantly contributed to delineating the mechanistic details of retroviral integration and to discovering IN inhibitors. In this report, we elaborate upon an updated HIV-1 PIC assay that employs a nested real-time quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR)-based strategy for measuring the in vitro integration activity of isolated native PICs.

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

This report describes an in vitro assay for measuring the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) preintegration complex (PIC)-associated integration activity in the cytoplasmic extracts of acutely infected cells. The integration of PIC-associated HIV-1 DNA into heterologous target DNA is quantified by using a nested real-time polymerase chain reaction strategy.

の測定<em&gt;インビトロ</em&gt; HIV-1プレインテグレーション複合体の統合活動

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...

Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body

The purpose of this technique is to provide a consistent, accurate, and manageable process for large numbers of polysaccharide capsule measurements.
First, a threshold image is generated based on intensity values uniquely calculated for each image. Then, circles are detected based on contrast between the object and background using the well-established Circle Hough Transformation (CHT) algorithm. Finally, the detected cell capsules and bodies are matched according to center coordinates and radius size, and data is exported to the user in a manageable spreadsheet.
The advantages of this technique are simple but significant. First, because these calculations are performed by an algorithm rather than a human both accuracy and reliability are increased. There is no decline in accuracy or reliability regardless of how many samples are analyzed. Second, this approach establishes a potential standard operating procedure for the Cryptococcus field instead of the current situation where capsule measurement varies by lab. Third, given that manual capsule measurements are slow and monotonous, automation allows rapid measurements on large numbers of yeast cells that in turn facilitates high throughput data analysis and increasingly powerful statistics.
The major limitations of this technique come from how the algorithm functions. First, the algorithm will only generate circles. While Cryptococcus cells and their capsules take on a circular morphology, it would be difficult to apply this technique to non-circular object detection. Second, due to how circles are detected the CHT algorithm can detect enormous pseudo-circles based on the outer edges of several clustered circles. However, any misrepresented cell bodies caught within the pseudo-circle can be easily detected and removed from the resulting data sets.
This technique is meant for measuring the circular polysaccharide capsules of Cryptococcus species based on India Ink bright field microscopy; though it could be applied to other contrast based circular object measurements.

Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body

This technique describes an automated batch image processor designed to measure polysaccharide capsule and body radii. While initially designed for Cryptococcus neoformans capsule measurements the automated image processor can also be applied to other contrast based detection of circular objects.

クリプトコッカスの種多糖類カプセルと細胞体の自動測定

The purpose of this technique is to provide a consistent, accurate, and manageable process for large numbers of polysaccharide capsule measurements.
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A Method for the Measurement of Salivary Gland Function in Mice

Patients with Sj&#246;gren&#39;s syndrome, an autoimmune disease affecting the exocrine glands, develop salivary gland inflammation and have reduced saliva production. Similarly, saliva production is severely compromised in patients receiving radiation treatment for head and neck cancers. Rodent models, developed to mimic these clinical conditions, facilitate an understanding of the disease pathogenesis and allow for the development of new therapeutic strategies. Therefore, the ability to accurately, reproducibly, and repeatedly measure salivary gland function in animal models is critical. Building on procedures previously described in the literature, a method was developed that meets these criteria and was used to evaluate salivary gland function in mice. An additional advantage of this new method is that it is easily mastered, and has little inter-operator variation. Salivary gland function is evaluated as the amount (weight or volume) or rate (mL/min) of saliva produced in response to pilocarpine stimulation. The collected saliva is a good source for the analyses of protein content, immunoglobulin concentrations, and other biomolecules.

Salivary gland hypofunction is a frequent consequence of autoimmune disease and radiation therapy. Reproducible evaluation of salivary gland function in mouse models of these diseases is a technical challenge. Here, a simple method for accurate and reproducible measurement of saliva production in mice is described.

マウスの唾液腺機能の測定法

Patients with Sj&#246;gren&#39;s syndrome, an autoimmune disease affecting the exocrine glands, develop salivary gland inflammation and have reduced ...

クリプトコッカス ・ ネオフォルマンスでカプセルの直径のサイズの問題: 測定

クリプトコッカス・ネオフォルマンスでカプセルの直径のサイズの問題: 測定