Name: size matters: measurement of capsule diameter in cryptococcus neoformans
Uploaded: 2018-02-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
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ありがとう分子生命科学 (MOBI) 博士後期課程・生物学部ミドル テネシー州立大学 (MTSU) でこの研究のための資金を提供します。プロジェクトはだった MTSU 財団 D.E.N. に与えられた特別なプロジェクトの補助金によって一部で賄われても。

注: は、クリプトコッカスがバイオ セーフティ レベル 2 (BSL-2) 病原体とそれを扱う研究者は適切な予防措置を取る必要があります。手続きの詳細な方法に安全に BSL 2 病原体で仕事見つけることができますセンター疾病管理 (CDC) のウェブサイトでは、それは処理のクリプトコッカスと接触しているすべての人はきちんと訓練されることに注意してくださいすることが重要病原体、適切な個人用保護具 (PPE) は、一般的にラテックスやニトリル手袋を常に着用する必要があります。さらに、遠心分離機のロータは、サンプルとすぐに 10% の漂白剤の解決策28を使用してクリーンアップこぼれのエアロゾル化を防ぐために密封する必要があります。
1. カプセル誘導
注: すべての手順は特に断らない限り、室温で実行必要があります。
<ol><li>酵母ペプトン ブドウ糖 (YPD) 液 (pH 6.5 ± 0.2) におけるクリプトコッカスを文化し、ログ段階 (約 18-36 時間) になるまでの揺れで 37 ° C で孵化させなさい。</li>
	<li>870 x g 21 ° C で 5 分間で細胞を遠心し、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) にて 3 回洗浄します。</li>
	<li>セルをカウントし、ダルベッコ最小限不可欠なメディア (DMEM) 2 x 105セル/2 mL で再懸濁します診断 (または自動化された細胞カウンター) を使用します。</li>
	<li>カプセルを誘導して、18 h の CO2を 37 ° C、5% で孵化させなさい。 注: メディアの栄養素の欠如と CO2の存在の組み合わせは、クリプトコッカスカプセルの成長を刺激します。</li>
	<li>後の培養 (上記参照) 遠心、上清のすべてが 5-10 μ L を削除してセルを収穫します。同時に測定される各緊張に対応する非誘導細胞サンプルを収穫します。これらネガティブ コントロールとして使用します。 注: 細胞ペレットが非常に小さくなるし、見づらい場合があります。上清を吸引するときは注意してください。</li>
	<li>インドのインク (セクション 2.1) または蛍光染料 (セクション 2.2) を汚します。</li>
</ol>2. 染色
<ol><li>
インドのインクのみ染色
	<ol>
<li>インドのインクと酵母を染色する残りの上清でペレットを再懸濁し、4μL を追加 (約半分) の細胞懸濁液およびインドのインクをガラス顕微鏡スライドの 4μL。ゆっくり混ぜるし、泡を避けるため。</li>
		<li>13 mm ガラス基板 (#1.5 厚) を適用し、サンプルが乾くを防ぐために非毒性シーラント (明確なマニキュア) 端を密封します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
蛍光染料のみで染色
	<ol>
<li>蛍光色素と酵母を染色するには、1% ウシ血清アルブミン (BSA) で 50 μ L の PBS で細胞ペレットを再懸濁します。</li>
		<li>カルコフ ホワイト (CFW) の等量と文化を孵化させなさい (1 μ g/mL) カプセル モノクローナル抗体 18B7 は AlexaFluor488 に共役 (材料の表を参照)、(AF488) (10 μ G/ml) 37 ° C で 30 分間</li>
		<li>870 x g後の培養を 21 ° C で 5 分間で細胞を遠心し、上清を吸引します。</li>
		<li>1% ウシ血清アルブミン (BSA) を 10 μ L の PBS で細胞ペレットを再懸濁します。</li>
		<li>ガラス顕微鏡スライド上に細胞を懸濁液 8 μ L をピペットします。</li>
		<li>13 mm ガラス基板 (#1.5 厚) を適用し、サンプルが乾くを防ぐために非毒性シーラント (明確なマニキュア) 端を密封します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
インドのインクと蛍光染料染色
	<ol>
<li>直接インドのインク蛍光染料の染色の有効性を比較するため汚れの両方の種類で同じセル人口を共同染色します。これを行うには、まず蛍光カプセルと 2.2.1 - 2.2.3 の手順に従って、細胞壁の汚れの両方で細胞を孵化させなさい。</li>
		<li>次に、蛍光染色細胞懸濁液およびインドのインクをガラス スライドの平等なボリューム (4 μ L) のピペットします。優しく混ぜます。</li>
		<li>13 mm ガラス基板 (#1.5 厚) を適用し、サンプルが乾くを防ぐために非毒性シーラント (明確なマニキュア) エッジをシールします。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 画像集録/顕微鏡
<ol><li>
インドのインクで染まってイメージ投射セル。
	<ol>
<li>標準的な光学顕微鏡 (100 倍) を使用してイメージを取得します。</li>
		<li>条件ごとの 50 のセルの最小値をイメージします。 注: フィールドあたりのセル数は異なります、これは許容されます。重要です、しかし、その重複細胞 (手動で、および自動化されたソフトウェア両方) を測定する困難なので最低限、保持します。これらの実験の画像は露出時間のセルの小さな動きによって引き起こされるぼかしを最小限に抑えながら画像のコントラストを最大にする最適化と 16 ビットの深さでに買収されました。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
蛍光色素で染色細胞イメージング
	<ol>
<li>蛍光顕微鏡による細胞をイメージする顕微鏡イメージング ソフトウェアを開き、使用 fluorophores の適切な励起と発光波長を選択 (CFW と AF488 興奮しているそれぞれ、405 nm と 488 nm ライトを使用して)。蛍光顕微鏡を用いて画像を取得します。</li>
		<li>条件ごとの 50 のセルの最小値をイメージします。 注: フィールドあたりのセル数は異なります、これは許容されます。重要です、しかし、その重複細胞 (手動で、および自動化されたソフトウェア両方) を測定する困難なので最小に保たれます。</li>
		<li>特定のフィールド内の各セルの最大のカプセル径が得られることを確認するために細胞の z スタックのイメージのシリーズを取得します。<ol>
<li>顕微鏡制御ソフトウエア"z"コントロール パネルを開き、パネルの左上隅で「姓」オプションを選択する"z"バーをクリックします。</li>
			<li>単一酵母細胞とビューの現在のフィールド内のすべてのカプセルの最も広いポイントの下は、「最初に設定」をクリックしてレベルで集中する顕微鏡の罰金フォーカス コントロールを使用します。</li>
			<li>現在の表示領域内のセルのすべてのカプセルの同じ細胞の細胞体の最も広いポイントの上の集中する微小焦点コントロールを使用し、「過去の設定」をクリックします。</li>
			<li>「実験を開始」をクリック現在位置の z スタックを取得するを取得する」タブ。複数の位置でプロセスを繰り返して 50 セルの最小の z スタック画像が取得されています。 注: これらの実験では、1.0 に設定された共焦点ピンホール AU と 10-20 スライス各 0.7 μ M をカバーの重複する z シリーズは、選択された位置に買収されました。AU = 風通しの良いユニット。</li>
		</ol>
</li>
		<li>次に、それぞれの z シリーズを最大強度投影法 (MIP) 適切なイメージ解析ソフトウェアを使用してに変換します。 注: MIPs プロジェクト積み上げ画像29のすべての面で最大の強度です。MIPs の作成セルの最大とキャプチャされた 3-D スタック内でカプセルの直径に対応するイメージの 2 D 表現を生成することができます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
インドのインクと蛍光染色細胞イメージング
	<ol>
<li>広視野 (40 倍) または共焦点の顕微鏡を使用して画像を取得 (63 倍または 100 倍)。インドのインクと蛍光染色細胞のコンピューター制御ステージと油浸対物レンズを搭載した広視野顕微鏡を使用してイメージをキャプチャします。 注記: 使用の顕微鏡は、イメージング ソフトウェアの CFW を使用して制御する必要があります。340-380 nm の励起フィルターを介して励起と光を放って蛍光 400 nm ダイクロイック ミラーから反映 435-485 nm バリア フィルターを介して検出されます。AF488 蛍光を 465 495 nm の励起フィルターを励起できることし、505 nm のダイクロイック ミラーで反射バリア フィルターの 515-555 nm から放出される光を検出できます。</li>
		<li>イメージごとの染色法の条件ごとの 50 のセルの最小値。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4 カプセルの手動測定
<ol><li>インドのインクまたは蛍光汚れに染まったセル、カプセルとセル径を手動で測定するセル測定ソフトウェアを使用 (材料の表を参照してください)。これを行うには、"File"へ行く >「画像を開く」>「測定」とカーソルの使用全体のセル (径) の最も広いポイントを通る直線を描画します。</li>
	<li>次に、「測定」をもう一度クリックし、細胞体 (細胞体径) を通る直線を描画します。 注: 測定、セルに自動的に保存されます。</li>
	<li>(最低 50/グループ) のすべてのセルについてこのプロセスを繰り返します。</li>
	<li>彼らを測定したら、画像を保存するクリックして「ファイル」>「名前を付けて保存」、画像を適切な名前します。</li>
	<li>新しく測定ファイルを選択し、表計算ソフトへデータをエクスポートします。</li>
	<li>式を使用してカプセルの直径の平均を計算する: ([合計直径] - [細胞体直径])。</li>
</ol>5 カプセルの自動測定
注: 自動測定に成功のコントラストの高い 16 ビット画像を使用し、するは正しく適切なイメージ解析ソフトウェアと一緒に焦点を当てた (材料の表を参照してください)。クリプトコッカスは、カプセル測定用イメージング、細胞壁とカプセルの間の境界で暗いリングに焦点を当てることが重要です。これによりセルとカプセルを正しく記述するソフトウェアです。
<ol><li>反転し、染色細胞像が適切なイメージ編集ソフトウェアを使用してすべてのインドのインクのコピーを作成 (材料の表を参照してください)。これを行うには、「ファイル」をクリックして > 墨染色画像を開き、「コントロール」では、「オープン」+"I"イメージを反転しますします。クリックして「ファイル」>「名前を付けて保存」反転イメージを保存します。</li>
	<li>オリジナルと逆の両方をインポートするソフトウェアに画像クリックして「ファイル」>「インポート シーケンス」>「読み込み画像」>「を定義するシーケンス (手動)」>「寸法 (チャネル)」>「インポート」>「適用」。 注:クリプトコッカス細胞体とカプセル識別でき、ソフトウェアに含まれている - 'レシピ' と呼ばれる - 特定のアルゴリズムを使用してマスクします。</li>
	<li>倒立像に ' 植民地アナライザー (蛍光)' のレシピを使用して検出し、細胞体をマスクし、「適用」をクリックします。反転イメージクリプトコッカスセルの境界を定義する暗いリングは周囲のカプセルよりも明るくなります。</li>
	<li>彼らのカプセルからクリプトコッカス細胞体のセグメントをクリックして「適用」を反転した画像を ' 植民地アナライザー (蛍光)' レシピを使用します。これは、カウントのマスクを作成します。このカウント マスク「体細胞」の名前を変更するには、"カウント マスク"というラベルの付いたタブを右クリックして。 メモ: レシピは、複数の画像処理手順ので構成されます: 背景除去、オブジェクトの検出、オブジェクトの分離とサブセット フィルタ リングします。</li>
	<li>次に、元の画像の '細胞増殖' レシピを使用して検出し、カプセルをマスクし、「適用」をクリックします。これは、カウントのマスクを作成します。このカウント マスク「カプセル」の名前を変更するには、「カウント マスク」というラベルの付いたタブを右クリックします。</li>
	<li>互いに隣接するカプセルを分割する元のイメージの上に新しいマスクを作成レシピ、' カプセル パーティション ' を使用しています。これを行うには、レシピのドロップ ダウン メニューから「パーティションのカプセル」をクリックします。カプセル パーティション ボックスでカプセル領域の今名前を変更したカウント マスク「カプセル」(5.5) を選択します。暗号のセル (5.4) 今名前を変更したカウント マスク「体細胞」を選択します。「オリジナル」を選択入力チャネル、および"パーティションに分割されたカプセルの作成マスク。"適用をクリックします。 注: セルと検出マスクからセル ・ カプセル、エリア測定の中心を通る最長と最短の軸の平均値として定義されているカプセルの直径にレシピが生成されます。このソフトウェアのスプレッドシート タブの下にある出力を見つけます。すべての画像 (最低 50 セル/グループ) には、このプロセスを繰り返します。レシピのパラメーターは、個々 の画像の検出を最適化するためにチューニングまたは複数画像のバッチ検出用に最適化できませんでした。セルとカプセルの形態の包括的な評価のためのレシピでは、追加の計測を計算できます。</li>
	<li>さらに分析に最適な表計算ソフトへデータをエクスポートします。</li>
</ol>

<ol>
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著者は、Hoyin ライ、自動画像解析ソフトウェア、Aivia を発行して DRVision で製品マネージャーです。

何十年も、カプセルは mycologists および臨床医クリプトコッカスとクリプトコッカス症病原体の主要な病原因子としての役割のために興味があるための研究の主要な焦点をされています。カプセル サイズの系統間の違いを測定する顕微鏡を用いたと異なる成長の下で条件は、病原体と様々 な刺激 (すなわち、異なった環境条件に対する応答に関する重要な情報を提供できます。?...

毎年 25万人に影響を与えると年間 180,000 以上の死の結果、クリプトコッカスは、細胞内病原性酵母やクリプトコッカス症1,2,の病原3。 直撃鋭く病気4,5,6に受けやすく抗レトロ ウイルス療法に準備ができてアクセスを持っていない貧しい国の HIV 陽性患者であります。CDC からのデータは、サハラ以南のアフリカで、クリプトコッカスを殺すこと結核より多くの人々 毎年、レコード1に任意のエボラ出血熱流行より以上の毎月を示します。露出の最も一般的なルートは、7環境で一般的とされている乾燥の胞子を吸い込むから発生します。肺に入ると、クリプトコッカスの感染した個人内の成功に寄与するいくつかの病原因子があります。多糖類のカプセルは、acapsular 系統ではない病原性8と微生物の主な病原性因子と見なされます。
クリプトコッカスのカプセルは、3 つの主要なコンポーネントの成っている: glucuronoxylomannan (GXM)、galactoxylomannan (GalXM) とマンノタンパク質の利用 (MPs)9。MPs はカプセルの比較的マイナーな細胞壁関連コンポーネント、それらは免疫原性、ほとんどプロ炎症性応答9,10を促進することができます。対照的に、GXM と GalXM カプセルの大部分を構成する (> 重量 90%)11免疫抑制作用を持っていると。その免疫調節効果に加えて体内のカプセルの急速な拡大はホスト貪食細胞 (すなわち、好中球、マクロファージ)12で摂取する機械的な障壁を作成します。クリプトコッカスカプセルとその合成は、複雑ですが、全体的に、高められたカプセル直径増加病原性6,13,14と相関しています。これを考えると、迅速かつ正確に定量化カプセル測定できなければクリプトコッカス研究者にとって重要です。
クリプトコッカスセルとその多糖類カプセル動的構造し、時間15間の変更を表示します。カプセルは、密度、サイズ、およびホスト環境16,17,18の変化に対応したアセンブリに変更できます。低鉄または栄養レベル、血清、人間の生理学的 pH および増加の CO2の露出は、カプセルの成長16,18,19,20を開始する知られています。さらに、研究者は、21,22クリプトコッカスにそのホスト上の優位性を融資感染中陽性で有意差で生じる構造変化を示しています。これは、クリプトコッカスカプセルのアーキテクチャは、さまざまな方法で分析されているために知られています。電子顕微鏡は、たとえば、外部より透過性層23下内側の電子密度の高い層を持つ異種行列をカプセルには明らかにしました。光散乱と光ピンセットの使用は、その高分子プロパティ24をさらに解明する研究者を許可しています。我々 は、多糖類のカプセルは、複雑な分岐構造23知っている両方の静的および動的光散乱測定から結果を分析した。光ピンセットは、構造体の剛性をテストだけでなく、その抗体の反応性の24の評価に使用されています。ただし、クリプトコッカスカプセルのこれまでで最もよく使われる分析のサイズの測定であります。
カプセル サイズを定量化する研究者は、単純な測定をする必要がありますどのようなを使用: カプセルの線径。デジタル マイクロ スコープは、インドのインクまたは蛍光染料で染色複数のクリプトコッカスセル (通常数百) の画像をキャプチャする使用されます。それぞれの細胞体と周囲のカプセルのサイズが測定されます。データがコンパイルされ、カプセルの平均粒径は、セル全体の直径 (セル本体 + カプセル) から細胞体直径を差し引いて計算されます。この時点まで、これらの測定は手動で行われています。一般的に正確にしながら、研究者の欠点があるこの方法。数日かかるまたは手で分析する数週間を大きなデータ セット。主観とヒューマン エラーが結果に影響を与えるこれらの測定は手動で行われるため。
自動計算画像解析生体画像25,26,27のより速くより信頼性の高い分析を有効にする分子細胞生物学の多くの分野の研究者の必要不可欠なツールとなっています。精密な画像解析手法は、私のものは、複雑で膨大なデータ セットから定量的情報に必要です。しかし、いくつかの測定、特にクリプトコッカスカプセルの測定は、自動化が困難されています。正確に細胞壁とカプセルは、一般的に暗いリングの時に位相差顕微鏡を用いたイメージングとして表示されます、インターフェイスを識別することができますシンプルなしきい値を使用して解決するは面倒。さらに、クリプトコッカス培養細胞は一緒に群生する傾向があるし、細胞の正確な分割が正確な測定に必要です。
このプロジェクトの目的は、(i) カプセル誘導クリプトコッカス、 (ii) 比較とコントラスト墨標準プロトコルの 1 つを説明するためにだったし、蛍光染色直径計測をカプセルに関連する (iii) シンプルでインドのインク、画像解析ソフトウェア、(iv) を使用してセルをステンド グラスのイメージを使用してカプセルの直径を測定するための計算方法は、利点と手動でカプセルの直径を計測の自動化ソフトウェアを使用して制限を評価します。2 つの染色法、蛍光細胞壁とカプセルの標識のそれを見つけるより時間がかかる中、実験間の最も一貫した結果を提供します。ただし、両方のメソッドは、正常に区別するために私たちを有効に研究室と臨床クリプトコッカスの系統別展示カプセル サイズ。さらに、インドのインク染色画像からカプセルの直径の測定を自動化し、これはカプセルの手動計測を実行可能な代替であることがわかったことができました。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Capsule Induction&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;C. neoformans cells&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td>The clinical lab strain, H99S, was a kind gift from Dr. John Perfect (Duke University).&amp;nbsp; The clinical strains, B18 and B52, were kind gifts from Dr. Greg Bisson (University of Pennsylania).&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Yeast Peptone Dextrose Broth (YPD)</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0428-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td></td><td></td><td>This is made in the lab using standard recipe (137mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mM Na2HPO4O, 2 mM Kh2PO4O)</td></tr><tr><td>DMEM/high-glucose with L-glutamine, without sodium pyruvate</td><td>GE Life Sciences</td><td>SH30022.01</td><td></td></tr><tr><td>6-well plates</td><td>Falcon</td><td>CL5335-5EA</td><td></td></tr><tr><td>Shaking incubator</td><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;</td><td></td><td>MaxQ6000</td></tr><tr><td>CO2 incubator</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Isotemp</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Legend XTR</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Staining&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Legend Micro 21R</td></tr><tr><td>India ink</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-910-56</td><td></td></tr><tr><td>Calcofluor white</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>18909-100ML-F</td><td></td></tr><tr><td>18B7 mouse anti-GXM antibody conjugated to Alexafluor 488</td><td></td><td></td><td>A kind gift from Dr. Arturo Casadevall (Johns Hopkins University)&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PBS with 1% Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td></td><td></td><td>PBS is the same recipe listed above (line 4) with 1% BSA added and filter sterilized.</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost microscope slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-143</td><td></td></tr><tr><td>Glass coverslips</td><td>Corning</td><td>2855-18</td><td>#1.5 thickness</td></tr><tr><td>Clear nail polish or other non-toxic sealant</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Image Acquisition&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Immersion oil</td><td>Cargille&amp;nbsp;</td><td>16484</td><td></td></tr><tr><td>Light microscope with immersion oil objective</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Zeiss Axio A1 with a Plan - NEOFLUAR 100x oil immersion NA 1.30 objective</td></tr><tr><td>Light microscope camera</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Zeiss Axiocam ErCD camera</td></tr><tr><td>Confocal microscope with oil immersion objective</td><td>Zeiss</td><td></td><td>LSM 700 laser scanning confocal equipped with a Plan-Apochromat 63X NA 1.4 oil immersion DIC M27 objective.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Confocal microscope software</td><td>Zen 2009</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope camera</td><td>Nikon</td><td></td><td>Nikon Ti-Eclipse with a Intensilight epifluorescence illuminator (Nikon), CoolSNAP MYO microscope camera (Photometrics), Plan Apo 60x NA 1.40 oil immersion objective (Nikon) and 1.5x magnification changer.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Widefield imaging software</td><td>Nikon Elements (Nikon)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Capsule Measurement&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image editing software</td><td>Photoshop (Adobe)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope software for manual measurement</td><td>Axiovision (Carl Zeiss)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image analysis software for automated meesurement</td><td>Aivia (DRVision Technologies)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spreadsheet software</td><td>Excel (Microsoft)</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

size matters: measurement of capsule diameter in cryptococcus neoformans

クリプトコッカス ・ ネオフォルマンスの多糖類のカプセルが主な病原性因子と最もよくこの病原性酵母の側面を検討しました。カプセル サイズ系統によって大きく異なります、ストレスや低栄養状態に導入されたとき、急速に成長する能力を持って、積極的に株の病原性と相関しています。これらの理由から、カプセルのサイズは、クリプトコッカスの研究者の関心です。クリプトコッカスカプセルの成長が表現型のテスト中に系統の酵母やサイズ違いのさまざまな治療法の効果を理解するために誘導されます。ここで述べるカプセル誘導と比較 2 つの受け入れられた方法の染色とカプセルの直径を測定の標準的な方法の 1 つ: (i) インドのインクと、従来の光学顕微鏡と組み合わせて・ (ii) 共同で染色、ネガティブ染色細胞壁と共焦点顕微鏡によるカプセルの両方の蛍光染料。最後に、どのようにインドのインク染色サンプルからカプセルの直径の測定をすることができますを示す計算イメージ分析を使用して自動化します。

3 系統を用いてカプセル誘導、細胞染色、イメージング、および計測技術を示すためには、クリプトコッカス:共通、よ特徴付けられた実験室株、H99S30、および 2 つの臨床分離株の以前不明なカプセルの直径、B18 と B5231。
カプセル誘導、染色、およびインドのインクを使用して画?...

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Size Matters: Measurement of Capsule Diameter in Cryptococcus neoformans

クリプトコッカス ・ ネオフォルマンスでカプセルの直径のサイズの問題: 測定

多糖類のカプセルはクリプトコッカス ・ ネオフォルマンスの主な病原性因子とそのサイズが株の病原性と相関します。カプセル径測定は、表現型のテストと治療効果を測定するために使用されます。カプセル誘導の標準的な方法の紹介、染色し、直径を測定の 2 つの方法が比較されます。

The polysaccharide capsule of Cryptococcus neoformans is the primary virulence factor and one of the most commonly studied aspects of this pathogenic ...

size-matters-measurement-capsule-diameter-cryptococcus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Size Matters: Measurement of Capsule Diameter in Cryptococcus neoformans

13.5K ビュー.  Middle Tennessee State University. 多糖類のカプセルはクリプトコッカス ・ ネオフォルマンスの主な病原性因子とそのサイズが株の病原性と相関します。カプセル径測定は、表現型のテストと治療効果を測定するために使用されます。カプセル誘導の標準的な方法の紹介、染色し、直径を測定の 2 つの方法が比較されます。

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Separating Bacteria by Capsule Amount Using a Discontinuous Density Gradient

Capsule is a key virulence factor in many bacterial species, mediating immune evasion and resistance to various physical stresses. While many methods are available to quantify and compare capsule production between different strains or mutants, there is no widely used method for sorting bacteria based on how much capsule they produce. We have developed a method to separate bacteria by capsule amount, using a discontinuous density gradient. This method is used to compare capsule amounts semi-quantitatively between cultures, to isolate mutants with altered capsule production, and to purify capsulated bacteria from complex samples. This method can also be coupled with transposon-insertion sequencing to identify genes involved in capsule regulation. Here, the method is demonstrated in detail, including how to optimize the gradient conditions for a new bacterial species or strain, and how to construct and run the density gradient.

We demonstrate the use of discontinuous density gradients to separate bacterial populations based on capsule production. This method is used to compare capsule amount between cultures, isolate mutants with a specific capsule phenotype, or to identify capsule regulators. Described here is the optimization and running of the assay.

不連続密度勾配を使用してカプセルの量による細菌の分離

Capsule is a key virulence factor in many bacterial species, mediating immune evasion and resistance to various physical stresses. While many methods are ...

遺伝学

Use of Image Cytometry for Quantification of Pathogenic Fungi in Association with Host Cells

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans commonly employ infection of mammalian hosts or host cells (i.e. macrophages) followed by yeast quantification using colony forming unit analysis or flow cytometry. While colony forming unit enumeration has been the most commonly used method in the field, this technique has disadvantages and limitations, including slow growth of some fungal species on solid media and low and/or variable plating efficiencies, which is of particular concern when comparing growth of wild-type and mutant strains. Flow cytometry can provide rapid quantitative information regarding yeast viability, however, adoption of flow cytometric detection for pathogenic yeasts has been limited for a number of practical reasons including its high cost and biosafety considerations. Here, we demonstrate an image-based cytometric methodology using the Cellometer Vision (Nexcelom Bioscience, LLC) for the quantification of viable pathogenic yeasts in co-culture with macrophages. Our studies focus on detection of two human fungal pathogens: Histoplasma capsulatum and Candida albicans. H. capsulatum colonizes alveolar macrophages by replicating within the macrophage phagosome, and here, we quantitatively assess the growth of H. capsulatum yeasts in RAW 264.7 macrophages using acridine orange/propidium iodide staining in combination with image cytometry. Our method faithfully recapitulates growth trends as measured by traditional colony forming unit enumeration, but with significantly increased sensitivity. Additionally, we directly assess infection of live macrophages with a GFP-expressing strain of C. albicans. Our methodology offers a rapid, accurate, and economical means for detection and quantification of important human fungal pathogens in association with host cells.

Here, we demonstrate how image cytometry can be used for quantification of pathogenic fungi in association with host cells in culture. This technique can be used as an alternative to CFU enumeration.

宿主細胞に関連して病原性真菌の定量化のための画像サイトメトリーの使用

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans ...

免疫・感染学

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

Many aspects of the infection of macrophages by Cryptococcus neoformans have been extensively studied and well defined. However, one particular interaction that is not clearly understood is non-lytic exocytosis. In this process, yeast cells are released into the extracellular space by a poorly understood mechanism that leaves both the macrophage and Cn viable. Here, we describe how to follow a large number of individually infected macrophages for a 24 hr infection period by time-lapsed microscopy. Infected macrophages are housed in a heating chamber with a CO2 atmosphere attached to a microscope that provides the same conditions as a cell-culture incubator. Live digital microscopy can provide information about the dynamic interactions between a host and pathogen that is not available from static images. Being able to visualize each infected cell can provide clues as to how macrophages handle fungal infections, and vice versa. This technique is a powerful tool in studying the dynamics that are behind a complex phenomenon.

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

We describe how to visualize macrophage-C. neoformans (Cn) interactions in real time, with specific emphasis on the process of non-lytic exocytosis using digital light microscopy. Using this technique individually infected macrophages can be studied to ascertain various aspects of this phenomenon.

の非溶解性エキソサイトーシスの可視化<em&gt;クリプトコッカス·ネオフォルマンス</em&gt;デジタル光学顕微鏡を使用したマクロファージから

Many aspects of the infection of macrophages by Cryptococcus neoformans have been extensively studied and well defined. However, one particular ...

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are able to replicate in the deep lung. Phagocytosis of Cryptococcus by macrophages is one of the ways that the disease is able to spread into the central nervous system to cause lethal meningoencephalitis. Therefore, study of the association between Cryptococcus and macrophages is important to understanding the progression of the infection. The present study describes a step-by-step protocol to study macrophage infectivity by C. neoformansin vitro. Using this protocol, the role of host sterols on host-pathogen interactions is studied. Different concentrations of methyl--cyclodextrin (MCD) were used to deplete cholesterol from murine reticulum sarcoma macrophage-like cell line J774A.1. Cholesterol depletion was confirmed and quantified using both a commercially available cholesterol quantification kit and thin layer chromatography. Cholesterol depleted cells were activated using Lipopolysacharide (LPS) and Interferon gamma (IFN&#947;) and infected with antibody-opsonized Cryptococcus neoformans wild-type H99 cells at an effector-to-target ratio of 1:1. Infected cells were monitored after 2 hr of incubation with C. neoformans and their phagocytic index was calculated. Cholesterol depletion resulted in a significant reduction in the phagocytic index. The presented protocols offer a convenient method to mimic the initiation of the infection process in a laboratory environment and study the role of host lipid composition on infectivity.

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

In this article, a protocol for infection of macrophages with Cryptococcus neoformans is described. Also, a method for sterol depletion from the macrophages is explained. These protocols provide a guide to study fungal infections in vitro and examine the role of sterols in such infections.

マクロファージコレステロール枯渇との食作用への影響<em&gt;クリプトコックス·ネオフォルマンス</em

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body

The purpose of this technique is to provide a consistent, accurate, and manageable process for large numbers of polysaccharide capsule measurements.
First, a threshold image is generated based on intensity values uniquely calculated for each image. Then, circles are detected based on contrast between the object and background using the well-established Circle Hough Transformation (CHT) algorithm. Finally, the detected cell capsules and bodies are matched according to center coordinates and radius size, and data is exported to the user in a manageable spreadsheet.
The advantages of this technique are simple but significant. First, because these calculations are performed by an algorithm rather than a human both accuracy and reliability are increased. There is no decline in accuracy or reliability regardless of how many samples are analyzed. Second, this approach establishes a potential standard operating procedure for the Cryptococcus field instead of the current situation where capsule measurement varies by lab. Third, given that manual capsule measurements are slow and monotonous, automation allows rapid measurements on large numbers of yeast cells that in turn facilitates high throughput data analysis and increasingly powerful statistics.
The major limitations of this technique come from how the algorithm functions. First, the algorithm will only generate circles. While Cryptococcus cells and their capsules take on a circular morphology, it would be difficult to apply this technique to non-circular object detection. Second, due to how circles are detected the CHT algorithm can detect enormous pseudo-circles based on the outer edges of several clustered circles. However, any misrepresented cell bodies caught within the pseudo-circle can be easily detected and removed from the resulting data sets.
This technique is meant for measuring the circular polysaccharide capsules of Cryptococcus species based on India Ink bright field microscopy; though it could be applied to other contrast based circular object measurements.

Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body

This technique describes an automated batch image processor designed to measure polysaccharide capsule and body radii. While initially designed for Cryptococcus neoformans capsule measurements the automated image processor can also be applied to other contrast based detection of circular objects.

クリプトコッカスの種多糖類カプセルと細胞体の自動測定

The purpose of this technique is to provide a consistent, accurate, and manageable process for large numbers of polysaccharide capsule measurements.
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Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

The method presented in this paper aims to automate Bio-AFM experiments and the recording of force curves. Using this method, it is possible to record forces curves on 1000 cells in 4 hours automatically. To maintain a 4 hour analysis time, the number of force curves per cell is reduced to 9 or 16. The method combines a Jython based program and a strategy for assembling cells on defined patterns. The program, implemented on a commercial Bio-AFM, can center the tip on the first cell of the array and then move, automatically, from cell to cell while recording force curves on each cell. Using this methodology, it is possible to access the biophysical parameters of the cells such as their rigidity, their adhesive properties, etc. With the automation and the large number of cells analyzed, one can access the behavior of the cell population. This is a breakthrough in the Bio-AFM field where data have, so far, been recorded on only a few tens of cells.

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

This protocol aims to automate AFM measurements on hundreds of microbial cells. First, microbes are immobilized into PDMS stamp microstructures and then force spectroscopy measurements are performed automatically on hundreds of immobilized cells.

数百個の C.アルビカン 細胞に対するバイオ原子間力顕微鏡測定の自動化

The method presented in this paper aims to automate Bio-AFM experiments and the recording of force curves. Using this method, it is possible to record ...

生物工学

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for macrophages. This predatory organism, similar to macrophages, employs phagocytosis to kill internalized cells. With the aid of a confocal laser-scanning microscope, images depicting interactive moments between cryptococcal cells and amoeba are captured. The resolution power of the electron microscope also helps to reveal the ultrastructural detail of cryptococcal cells when trapped inside the amoeba food vacuole. Since phagocytosis is a continuous process, quantitative data is then integrated in the analysis to explain what happens at the timepoint when an image is captured. To be specific, relative fluorescence units are read in order to quantify the efficiency of amoeba in internalizing cryptococcal cells. For this purpose, cryptococcal cells are stained with a dye that makes them fluoresce once trapped inside the acidic environment of the food vacuole. When used together, information gathered through such techniques can provide critical information to help draw conclusions on the behavior and fate of cells when internalized by amoeba and, possibly, by other phagocytic cells.

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

This paper details a protocol for preparing a co-culture of cryptococcal cells and amoebae that is studied using still, fluorescent images and high-resolution transmission electron microscope images. Illustrated here is how quantitative data can complement such qualitative information.

クリプトコッカスの研究における顕微鏡技術と蛍光読解の補完的利用-アメーバ相互作用

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for ...

Broth Microdilution In Vitro Screening: An Easy and Fast Method to Detect New Antifungal Compounds

Fungal infections have become an important medical condition in the last decades, but the number of available antifungal drugs is limited. In this scenario, the search for new antifungal drugs is necessary. The protocol reported here details a method to screen peptides for their antifungal properties. It is based on the broth microdilution susceptibility test from the Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) M27-A3 guidelines with modifications to suit the research of antimicrobial peptides as potential new antifungals. This protocol describes a functional assay to evaluate the activity of antifungal compounds and may be easily modified to suit any particular class of molecules under investigation. Since the assays are performed in 96-well plates using small volumes, a large-scale screening can be completed in a short amount of time, especially if carried out in an automation setting. This procedure illustrates how a standardized and adjustable clinical protocol can help the bench-work pursuit of new molecules to improve the therapy of fungal diseases.

Broth Microdilution In Vitro Screening: An Easy and Fast Method to Detect New Antifungal Compounds

An easy and adaptable broth microdilution method for screening antifungal compounds and extracts.

スープ希釈の in Vitroスクリーニング: 新しい抗真菌化合物を検出するための簡単かつ高速メソッド

Fungal infections have become an important medical condition in the last decades, but the number of available antifungal drugs is limited. In this ...

生物学

Quantitative Analysis of Aspergillus nidulans Growth Rate using Live Microscopy and Open-Source Software

It is well established that colony growth of filamentous fungi, mostly dependent on changes in hyphae/mycelia apical growth rate, is macroscopically estimated on solidified media by comparing colony size. However, to quantitatively measure the growth rate of genetically different fungal strains or strains under different environmental/growth conditions (pH, temperature, carbon and nitrogen sources, antibiotics, etc.) is challenging. Thus, the pursuit of complementary approaches to quantify growth kinetics becomes mandatory in order to better understand fungal cell growth. Furthermore, it is well-known that filamentous fungi, including Aspergillus spp., have distinct modes of growth and differentiation under sub-aerial conditions on solid media or submerged cultures. Here, we detail a quantitative microscopic method for analyzing growth kinetics of&#160;the model fungus Aspergillus nidulans, using live imaging in both submerged cultures and solid media. We capture images, analyze, and quantify growth rates of different fungal strains in a reproducible and reliable manner using an open source, free software for bio-images (e.g., Fiji), in a way that does not require any prior image analysis expertise from the user.

Quantitative Analysis of Aspergillus nidulans Growth Rate using Live Microscopy and Open-Source Software

We present a label-free live imaging protocol using transmitted light microscopy techniques to capture images, analyze and quantify growth kinetics of the filamentous fungus A. nidulans in both submerged cultures and solid media. This protocol can be used in conjunction with fluorescence microscopy.

ライブ顕微鏡とオープンソースソフトウェアを用いた アスペルギルスニデュラン の成長率の定量分析

It is well established that colony growth of filamentous fungi, mostly dependent on changes in hyphae/mycelia apical growth rate, is macroscopically ...

Assessing the Putative Anticryptococcal Properties of Crude and Clarified Extracts from Mollusks

Cryptococcus neoformans is an encapsulated human fungal pathogen with a global distribution that primarily infects immunocompromised individuals. The widespread use of antifungals in clinical settings, their use in agriculture, and strain hybridization have led to increased evolution of resistance. This rising rate of resistance against antifungals is a growing concern among clinicians and scientists worldwide, and there is heightened urgency to develop novel antifungal therapies. For instance, C. neoformans produces several virulence factors, including intra- and extra-cellular enzymes (e.g., peptidases) with roles in tissue degradation, cellular regulation, and nutrient acquisition. The disruption of such peptidase activity by inhibitors perturbs fungal growth and proliferation, suggesting this may be an important strategy for combating the pathogen. Importantly, invertebrates such as mollusks produce peptidase inhibitors with biomedical applications and anti-microbial activity, but they are underexplored in terms of their usage against fungal pathogens. In this protocol, a global extraction from mollusks was performed to isolate potential peptidase inhibitors in crude and clarified extracts, and their effects against classical cryptococcal virulence factors were assessed. This method supports the prioritization of mollusks with antifungal properties and provides opportunities for the discovery of anti-virulence agents by harnessing the natural inhibitors found in mollusks.

The human fungal pathogen Cryptococcus neoformans produces a variety of virulence factors (e.g., peptidases) to promote its survival within the host. Environmental niches represent a promising source of novel natural peptidase inhibitors. This protocol outlines the preparation of extracts from mollusks and the assessment of their effect on fungal virulence factor production.

軟体動物からの粗および清澄抽出物の推定抗クリプトコッカス特性の評価

Cryptococcus neoformans is an encapsulated human fungal pathogen with a global distribution that primarily infects immunocompromised individuals. The ...

クリプトコッカス・ネオフォルマンスでカプセルの直径のサイズの問題: 測定

要約

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この動画の章

不連続密度勾配を使用してカプセルの量による細菌の分離

宿主細胞に関連して病原性真菌の定量化のための画像サイトメトリーの使用

の非溶解性エキソサイトーシスの可視化

マクロファージコレステロール枯渇との食作用への影響

クリプトコッカスの種多糖類カプセルと細胞体の自動測定

数百個の C.アルビカン細胞に対するバイオ原子間力顕微鏡測定の自動化

クリプトコッカスの研究における顕微鏡技術と蛍光読解の補完的利用-アメーバ相互作用

スープ希釈の in Vitroスクリーニング: 新しい抗真菌化合物を検出するための簡単かつ高速メソッド

ライブ顕微鏡とオープンソースソフトウェアを用いたアスペルギルスニデュランの成長率の定量分析

軟体動物からの粗および清澄抽出物の推定抗クリプトコッカス特性の評価

クリプトコッカス ・ ネオフォルマンスでカプセルの直径のサイズの問題: 測定

要約

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不連続密度勾配を使用してカプセルの量による細菌の分離

宿主細胞に関連して病原性真菌の定量化のための画像サイトメトリーの使用

の非溶解性エキソサイトーシスの可視化

マクロファージコレステロール枯渇との食作用への影響

クリプトコッカスの種多糖類カプセルと細胞体の自動測定

数百個の C.アルビカン 細胞に対するバイオ原子間力顕微鏡測定の自動化

クリプトコッカスの研究における顕微鏡技術と蛍光読解の補完的利用-アメーバ相互作用

スープ希釈の in Vitroスクリーニング: 新しい抗真菌化合物を検出するための簡単かつ高速メソッド

ライブ顕微鏡とオープンソースソフトウェアを用いた アスペルギルスニデュラン の成長率の定量分析

軟体動物からの粗および清澄抽出物の推定抗クリプトコッカス特性の評価

クリプトコッカス・ネオフォルマンスでカプセルの直径のサイズの問題: 測定

数百個の C.アルビカン細胞に対するバイオ原子間力顕微鏡測定の自動化

ライブ顕微鏡とオープンソースソフトウェアを用いたアスペルギルスニデュランの成長率の定量分析