著者らは、漣サン（カリフォルニア大学、ロサンゼルス）とSeungmin黄（ワシントン大学）から技術的なアドバイスとサポートに感謝します。この作品は、バクスター財団、健康補助金の国立研究所（C.梁にR01 CA140964とR21 AI083841）によって賄われていた。

以下のプロトコルは、理論的にγHV68と同様のライフスタイルを共有する他のウイルスによる感染を評価するために使用できるマウスのγHV68の溶菌と潜伏感染サイクル、のウイルスの力価およびウイルスゲノムの負荷の調査を説明します。 1。 γHV68の増幅<ol><li> 37℃の水浴中でγHV68の凍結バイアルを解凍。 </li><li> 37℃で10cmの皿、培養感染細胞でNIH3T12または3T3細胞培養（〜50％コンフルエント）にウイルスinoculumsを追加° Cで5％CO 2。 </li><li>細胞変性効果（CPE）のための顕微鏡による文化を調べ、細胞の80％以上は、〜5日間感染後にCPE 4を示す時にメディアを収集する。ウイルスの収量を最大にするために、感染した細胞培養はすべての細胞関連γHV68を解放するために二回凍結と融解することができます。 </li><li>細胞破片を除去するために室温（RT）で5分間1000rpmで収集されたメディアを遠心。 </li><li>慎重に下部の細胞の破片に触れることなく、新しいチューブ（高速遠心分離管）に上清を移す。 </li><li> 4℃、12,000 rpmで高速遠心機は、（ソーバルSA - 600用）℃で少なくとも1.5時間のウイルス粒子を集中する。 </li><li> 10γ漂白剤の溶液中に上清を捨て、慎重に1ミリリットルの無血清DMEMでペレットを（ウイルスおよび残存細胞の破片）に再懸濁する。 1.5 mlマイクロ遠心チューブに再懸濁したペレットを移し、ボルテックスでよく混和する。 </li><li>残存細胞破片を除去し、新しいチューブに上清（ウイルスストックを）転送する最高速度で2分間遠心。これは感染の最終的なウイルスストックです。ウイルスストックの力価はプラークアッセイ（下記参照）によって決定されます。 </li></ol> 2。 γHV68とマウスの鼻腔内感染<ol><li> 1,000以上のパーティションを持つ年齢の〜6週間で、マウスに感染〜γHV68あたりのマウスの5,000プラーク形成単位（P​​FU）を。 </li><li>麻酔をかける腹腔内にケタミン/キシラジン（80 mg / mlのケタミンおよび12 ​​mg / mlのキシラジンの混合物の60μlの/マウス）の注入によるマウス。マウスのつま先をつまんで麻酔を監視します。これは通常、5〜10分かかります。マウスが完全に麻酔されていない場合、それらはウイルスをくしゃみをされます。 </li><li>マウスが完全に麻酔のときは、ゆっくりと、しかし着実に、マウスのドロップでドロップするγHV68（各鼻孔に15μl）を含むPBS中〜30μlを接種するピペットを使用してください。マウスは確かに気泡を形成しようとせずに滴を吸入されていることを確認します。 </li><li>マウスは10〜15分で回復してケージに戻す前に、マウス（例えば意識、呼吸、等）の福祉を監視することができます。動物は食物、水、および寝具の条件の病気と妥当性のために毎日チェックされます。病気、痛みや苦痛の臨床症状が進行した場合は、病因を決定するためにルーチンの診断が実施される。自分の体重の20％以上を失う動物は、最大体重減少のために記録されます。と安楽死。安楽死を実行するための最終決定は、臨床獣医師の裁量であり、主任研究者との協議を行っています。 </li></ol> 3。急性感染肺におけるウイルス力価を決定するためにプラークアッセイ<ol><li>ウイルスの感染力価はVero細胞の単層上でプラークの形成によって決定されます。 </li><li> Vero細胞/ウェル、12ウェルプレートに2.5x10 4細胞のプラークアッセイ前日に播種されています。細胞が均等に分配されるべきですし、細胞密度が30に到達する必要があります - 40％のプラークアッセイの日に。 </li><li> 0.5％（w / v）のメチルセルロース（MC）オーバーレイの培地（表1）を準備します。 </li><li>肺に急性期のウイルス力価を決定するために鼻腔感染後5-7日間γHV68感染マウスを生け贄に捧げる。安楽死のためにケタミン塩酸（80-100 mg / kgのSC、IM、IP）は、ペントバルビタールナトリウム（30〜50 mg / kgのIP）の静脈内過剰投与に続いてIM投与されます。このメソッドは、tで承認されています彼のアメリカ獣医師会。 </li><li>肺を回収し、血液細胞を除去する1 × PBSで2回すすいでください。 1mlの氷冷完全DMEM培地で肺の片側を収集し、氷上に置きます。迅速に定量PCR（下記参照）によって肺内にウイルスDNAの負荷を調べるために-80 ° Cで肺や店舗の反対側を凍結する。 </li><li> 1秒、凍結と融解3回最高速度で肺組織を均質化する組織ホモジナイザーを使用してください。サンプルを変更する際に、各ステップで70％エタノールでホモジナイザーを洗ってください。 </li><li>で10分間4℃で3,000 rpmでホモジナイズした組織を遠心上清を収集し、プラークアッセイのために新しいチューブに移す。 </li><li>渦によってプレーンDMEM 1.5 mlマイクロ遠心管に肺ホモジネート試料の希釈系列を（通常は10℃から10 -8まで）の準備。プレフィル540μLDMEMを持つチューブの適切な数と最初のチューブに60μlのホモジネートを希釈する。私は、最初のチューブから60μlをない次のもの、というように。 </li><li> 12ウェルプレートの準備ベロ単層から培地を吸引除去し、逆の順序（10 -8〜10℃から）で感染性ウイルスを含む/ウェル希釈ホモジネート液200μlをロードする。各滴定（重複の）のために2つのウェルを使用してください。 </li><li> 37℃でウイルスinoculums 1時間でVero細胞をインキュベート℃に優しくスワールプレートを15分ごとに均等に単分子層を介してウイルスを配布する。 </li><li> inoculumsを削除し、/ウェルオーバーレイ培地2ml（表1）に交換してください。 37一週間のためのプレートをインキュベート℃に</li><li>オーバーレイのメディアを削除する（完全である必要はありません）と修正/プラークアッセイの染色培地（表1）で置き換えると、室温で少なくとも1時間インキュベートする。 </li><li>プレートを乾燥している場合、各希釈でよく分離したプラークの数を数えます。エラーを最小限に抑えるために、10から100プラークの間に含まれている唯一の井戸がカウントされます。 </li><li> folloを使用してウイルス力価を計算する翼式：タイター（pfu / ml）を= [（プラーク/ウェルの数）/（inoculums /ウェルの量）] ×希釈率。 </li></ol> 4。潜在的に感染した脾細胞でのウイルス負荷を測定するために感染症センターのアッセイ<ol><li>ウイルス潜伏の負荷は、Vero細胞の単層上で感染症センター（IC）アッセイによって決定されます。 ICアッセイ前日に、6ウェルプレート（1シードのベロ細胞- 。我々は通常、脾臓のサンプルあたり11ウェルを使用する2.5 × 10 5細胞/ウェル、10ウェルを希釈脾細胞の懸濁液およびテストのためにもいずれかに使用されます。凍結融解後のウイルスの自発的な再活性化。 </li><li> （ - 感染後14日間12）の待ち時間が確立された後に感染したマウスを生け贄に捧げる。マウスの脾臓とプール、それらDMEMを冷やして1mlにして回収する。 </li><li>マウスの脾臓の機械的解離。 10cmのプレートに、新たに分離したマウスの脾臓を移し、2％FBS含有DMEMなどの目的の培地10mlを加える。ウェットtwoすりガラスエンドガラスmicrosc氷冷培地とオペコードのスライド。あるスライドとニック他のスライドの曇らされた最後のエッジとカプセルのフロスト側の脾臓を置きます。すべての赤い塊が粉砕されるまで、機械的に（存在する場合も、脂肪粒子を除去）は、2つのスライドの間に脾臓を解離する。 </li><li>両方のスライド上で残りの細胞を回収するDMEMでスライドを洗浄します。 </li><li> 50 mlコニカルスクリューキャップチューブにセルストレーナー（40μmのナイロンメッシュ）を通して穏やかに全体組織懸濁液を移す。フィルタリングながら10 mlのPBSと転送と脾臓のホモジネートを含む10 cmの皿を洗ってください。 </li><li> 375 × gで、単一の細胞懸濁液を10分を遠心し、上清を捨てる。既存の細胞塊を分割するために細胞ペレットをはじく。赤血球を溶解するために5ミリリットルACKバッファー（表1）を追加します。 5分間インキュベートし、375 xgで再び遠心</li><li>上清を捨て、PBSで穏やかにまだ徹底的に再サスペンドペレット、、、2％FBSを持つ。 4℃の細胞℃を保つにピペットを使用して、もしあれば、破片を取り除く。自動セルカウンター（Bio - Rad）を用いて生細胞を数える。 </li><li> 4分間375 × gでPBS -再懸濁された脾細胞をスピンダウン。上清を捨て、4 mlの完全DMEM（2 × 1 mlを、元の懸濁液のIC分析に使用される細胞を再懸濁、0.6ミリリットルのICアッセイでシリアル5倍希釈で使用される、ウイルスDNAの調製と定量PCRは0.4 mlのと1 mlの懸濁液）を3回の凍結融解サイクル後の潜伏ウイルスの自然再活性化を評価するために使用されます。 </li><li>重複の脾細胞懸濁液のシリアルを5倍希釈（すなわち1 / 5、1 / 25、1 / 125、1 / 250）を準備する。 2.4ミリリットルDMEMとプレフィル15 mlコニカルチューブを、最初のチューブに600μlの脾細胞懸濁液を希釈し、よく混ぜる。次管に前のチューブから600μlのを転送する、などはボルテックスしないでください！ </li><li> Vero細胞の準備を6ウェル単層から培地を吸引除去する。各希釈duplとVero細胞上に連続的に希釈した脾細胞の種子1ミリリットルicated（10ウェルを0、1 / 5、1 / 25、1 / 125、1 / 250希釈のために使用されます）。 </li><li> 37プレートを℃、5％CO 2を 8から12時間インキュベートする。 24時間を超えないようにしてください。シードされた脾細胞懸濁液を吸引除去し、各ウェルに4ミリリットルオーバーレイメディア（表1）をロードする。さらに6日間インキュベートする。 </li><li>プラークアッセイに示すように、クリスタルバイオレット0.2％（w / v）のとプレートを染色することによって脾臓感染センターのレベルを決定する。 </li></ol> 5。ウイルスゲノムの定量化<ol><li>この実験ではそのような肺と脾臓のサンプルとしてγHV68感染組織からの全ゲノムDNAを抽出します。製造業者のプロトコルに従ってDNeasy血液および組織キット（Qiagen）を、使用してください。 </li><li>定量PCRアッセイに使用されているDNAの同じ量を確保するために各サンプルのDNA濃度を決定する。ウイルス特異的プライマーを設計する（〜200 bpのアンプリコンは、定量PCRアッセイのために好まれる）。 5＆PR：私達は（フォワードプライマーγHV68ORF56 -特異的プライマーを用いIME; - GTAACTCGAGACTGAAACCTCGCAGAGGTCC - 3&#39;、リバースプライマー：5&#39; - CCGAAGCTTGCACGGTGCAATGTGTCACAG - 3&#39;）このアッセイおよびβ-アクチンのプライマー用（フォワードプライマー：5&#39; - cacccacactgtggcccatcat - 3&#39;リバースプライマー：5&#39; - gtgaggatcttcatgaggtagtc - 3&#39;）のような定量PCR反応の制御。 </li><li> （ - 500 ngの良い100）と2 × SYBRマスターミックス（Bio - Rad社iQはSYBRグリーンスーパーミックス）と適切なプライマーDNAサンプルを混ぜる。感染組織内のウイルス量を定量化するためのBio - Rad社製リアルタイムPCRシステムを使用してください。以下の条件でPCRを行います：15分、95の45サイクル95℃℃で30分間、60℃で30分間、および72℃のウイルスとの両方のために、曲線解析を溶融し、次いで30分、用アクチンのアンプリコン。 </li><li>ウイルスゲノムの定量化のための標準曲線を作成するには、連続して非感染細胞から単離したゲノムDNAをγHV68バクミドDNAの既知量を希釈する。感染から取り出されたDNAと並​​行して定量PCRを実行するウイルス特異的プライマーの同じセットを使用して、TEDの組織。 </li><li>アクチンの正規化後のゲノムDNAの単位当たりのウイルスDNAのコピー数（例えば100 ngのまたは500ngの）などの組織におけるウイルスゲノムの負荷を提示。 </li></ol> 6。代表的な結果： 図1は、in vivoでのマウスのγHV68感染の測定のための実験の全体的なスキームを示しています。としてプラークアッセイによって決定さγHV68、の急性感染時の肺におけるウイルス力価の代表的な結果は、図2Aで示されていた。含むγHV68の変異株、非機能的なウイルス性Bcl - 2の7日間BALB / cマウス（6 - グループあたり7匹）の鼻腔内感染後の肺の中に野生型γHV68に匹敵するレベルでの複製（VBCL - 2）。ウイルスの肺の力価には統計的に有意な差は両群間で検出されなかった。このデータは、VBCL - 2でγHV68の急性感染症のための重要な要素ではないことを示してマウス。しかし、28日間の感染後で、脾臓のVBCL - 2変異ウイルスの力価は6ドロップ - 10に - 倍などの感染中心アッセイ（図2B）によって測定されたWTに比べて、示唆しているVBCL - 2変異体γHV68ウイルス感染後の脾臓の待ち時間の維持に障害があります。削減感染中心の力価との合意では、VBCL - 2変異ウイルスのウイルスゲノムの負荷が著しく、図2Cに示すように、繰り返し実験で28日目WTウイルス、のそれに比べて減少した。感染症の潜在的な段階で潜像HV68vBcl - 2変異ウイルスの再活性化のex vivoでのウイルスゲノムの負荷と周波数の間に密接な相関関係は、この変異ウイルスの感染の待ち時間の欠陥を強調しています。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3472/3472fig1.jpg" /> 図1。プラーク形成、感染症センター、および定量PCRアッセイによるマウスのγHV68感染の測定のための模式図S. <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3472/3472fig2.jpg" /> 図2 in vivoでの WTと変異γHV68ウイルスの溶菌と潜伏感染。 7解像度（日、感染後）で、BALB / cマウスの肺でWTと変異VBCL - 2γHV68ウイルスの急性複製は、（）プラークアッセイによって決定した。 （BおよびC）脾臓の感染症センター（B）及び感染マウスの脾臓におけるウイルスゲノムの負荷は、（C）はそれぞれ、感染症センターのアッセイおよび定量PCRは28 dpiで測定した。赤い線、指示値の平均。 NS、有意ではない。

<ol>
	<li>Damania, B., Choi, J. K., Jung, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+activities+of+gammaherpesvirus+membrane+proteins.">Signaling activities of gammaherpesvirus membrane proteins.</a> J. Virol. 74, 1593-1601 (2000).</li><li>Stevenson, P. G., Efstathiou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+mechanisms+in+murine+gammaherpesvirus-68+infection.">Immune mechanisms in murine gammaherpesvirus-68 infection.</a> Viral. Immunol. 18, 445-456 (2005).</li><li>Flano, E., Husain, S. M., Sample, J. T., Woodland, D. L., Blackman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Latent+murine+gamma-herpesvirus+infection+is+established+in+activated+B+cells,+dendritic+cells,+and+macrophages.">Latent murine gamma-herpesvirus infection is established in activated B cells, dendritic cells, and macrophages.</a> J. Immunol. 165, 1074-1081 (2000).</li><li>Sunil-Chandra, N. P., Efstathiou, S., Nash, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+gammaherpesvirus+68+establishes+a+latent+infection+in+mouse+B+lymphocytes+in+vivo.">Murine gammaherpesvirus 68 establishes a latent infection in mouse B lymphocytes in vivo.</a> J. Gen. Virol. 73, 3275-3279 (1992).</li><li>Simas, J. P., Swann, D., Bowden, R., Efstathiou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+murine+gammaherpesvirus-68+transcription+during+lytic+and+latent+infection.">Analysis of murine gammaherpesvirus-68 transcription during lytic and latent infection.</a> J. Gen. Virol. 80, 75-82 (1999).</li><li>Ganem, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KSHV+and+the+pathogenesis+of+Kaposi+sarcoma:+listening+to+human+biology+and+medicine.">KSHV and the pathogenesis of Kaposi sarcoma: listening to human biology and medicine.</a> J. Clin. Invest. 120, 939-949 (2010).</li><li>Wen, K. W., Damania, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kaposi+sarcoma-associated+herpesvirus+(KSHV):+molecular+biology+and+oncogenesis.">Kaposi sarcoma-associated herpesvirus (KSHV): molecular biology and oncogenesis.</a> Cancer. Lett. 289, 140-150 (2009).</li><li>E, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+Bcl-2-mediated+evasion+of+autophagy+aids+chronic+infection+of+gammaherpesvirus+68.">Viral Bcl-2-mediated evasion of autophagy aids chronic infection of gammaherpesvirus 68.</a> PLoS. Pathog. 5, e1000609-e1000609 (2009).</li><li>Marques, S., Efstathiou, S., Smith, K. G., Haury, M., Simas, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+gene+expression+of+latent+murine+gammaherpesvirus+68+in+B+lymphocytes.">Selective gene expression of latent murine gammaherpesvirus 68 in B lymphocytes.</a> J. Virol. 77, 7308-7318 (2003).</li><li>McCausland, M. M., Crotty, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+PCR+technique+for+detecting+lymphocytic+choriomeningitis+virus+in+vivo.">Quantitative PCR technique for detecting lymphocytic choriomeningitis virus in vivo.</a> J. Virol. Methods. 147, 167-176 (2008).</li><li>Weck, K. E., Kim, S. S., Virgin, H. I., Speck, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cells+regulate+murine+gammaherpesvirus+68+latency.">B cells regulate murine gammaherpesvirus 68 latency.</a> J. Virol. 73, 4651-4661 (1999).</li><li>Weck, K. E., Kim, S. S., Virgin, H. I., Speck, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+are+the+major+reservoir+of+latent+murine+gammaherpesvirus+68+in+peritoneal+cells.">Macrophages are the major reservoir of latent murine gammaherpesvirus 68 in peritoneal cells.</a> J. Virol. 73, 3273-3283 (1999).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

γHV68は広くヒトγ-ハイブリッド自動車2,4,5の病因を理解するモデルとして使用されています。このプロトコルでは、我々はマウスの鼻腔内接種後γHV68の急性および潜伏感染を評価するために、感染性ウイルスの力価のためのプラークアッセイ、ウイルスの潜在的な負荷のためのICアッセイ、およびウイルスゲノムの負荷の定量PCRを含む3つの日常的に使用される方法を、説明した。 ...

<table border="1"><tbody><tr><td> 材料名 </td><td> 準備の手順 </td></tr><tr><td>ウイルスのプラークアッセイ用のメチルセルロース（MC）オーバーレイ媒体</td><td><ol><li>熱〜TCボトルに蒸留水250ml&gt; 80 ° C（電子レンジで3分間沸騰）へ</li><li>溶けるまで弱火で攪拌し、加熱した水に徐々に2.5グラムMCパウダーを追加。 </li><li>液体サイクルで15分間、直ちにオートクレーブ。 </li><li> 4℃で一晩オートクレーブMCのメディアを攪拌する。 </li><li> 200ミリリットル2で250ミリリットルMCメディアを組み合わせたX MEM（ギブコ- BRL）+ 500mlのオーバーレイのメディアを与えるために50ミリリットルFBS。 </li></ol></td></tr><tr><td>プラークアッセイ用培地を修正/染色</td><td> 0.2％（w / v）の20％エタノールでクリスタルバイオレット。 </td></tr><tr><td> ACK溶解バッファー</td><td> NH 4 Clを 0.15M、KHCO 3 10mMの、EDTA 0.1mmの</td></tr><tr><td>完全DMEM </td><td>ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、10％ウシ胎児血清（FBS; Invitrogen社）を補充し、2mM L -グルタミン、及び1％ペニシリン - ストレプトマイシン（ギブコ- BRL）。 </td></tr></tbody></table> 表1。このプロトコルで使用する特定のメディア<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td>ケタミン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> K2753 </td></tr><tr><td>キシラジン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> X1251 </td></tr><tr><td>メチルセルロース</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> M0512 - 250グラム</td></tr><tr><td> 2 × MEM </td><td>ライフテクノロジーズ</td><td> 11935 </td></tr><tr><td>セルストレーナー</td><td> BD Faclon </td><td> 352340 </td></tr><tr><td>オムニ組織ホモジナイザー</td><td> OMNIインターナショナル</td><td> TH115 </td></tr><tr><td> DNeasy血液および組織キット</td><td> QIAジェン</td><td> 69504 </td></tr><tr><td> iQTM SYBRHグリーンスーパーミックス</td><td> BioRad社</td><td> 170-8882 </td></tr><tr><td> CFX96リアルタイムPCRシステム</td><td> Bio - Rad社</td><td> 184-5072 </td></tr><tr><td>セルカウンター</td><td> Bio - Rad社</td><td> 145-0001 </td></tr><tr><td>ソーバルSA - 600 </td><td>サーモサイエンティフィック</td><td> 096-124022 </td></tr></tbody></table> 表2。特異的な試薬と装置

measurement of &#947;hv68 infection in mice

γ-ヘルペスウイルスは、（γ- HVS）リンパ系細胞1の潜伏感染を確立する能力が特徴です。このようなEBVとKSHVとしてヒトγ-ハイブリッド自動車、の狭い宿主範囲は、深刻な詳細な病原性の研究を妨げている。マウスγ-ヘルペスウイルス68（γHV68）株のヒトγ-ハイブリッド自動車との広範な遺伝学的および生物学的な類似点とネズミ科齧歯類2の自然病原体です。このように、ウイルス感染のさまざまな段階でマウスのγHV68感染近交系の評価は、γ-ハイブリッド自動車の感染時にウイルスのライフサイクルと病因を理解するための重要なモデルが用意されています。 鼻腔内接種すると、肺の急性ウイルス血症のγHV68感染の結果は、後に脾細胞とホスト3,4のライフサイクル全体で再活性化することができる他の細胞、の潜伏感染に解決されている。このプロトコルでは、私たちはロバにプラークアッセイを使用する方法について説明します後鼻腔内感染（解像度）の - 早期（7日間5）でのベロ細胞単層上肺ホモジネート中の感染性ウイルスの力価。急性感染症は、主に2クリアされている間 - 3週間の感染後、γHV68の潜伏感染を14解像度の周りに確立され、後にマウスの脾臓の上に維持される。潜伏感染は通常、ウイルスが休眠状態にとどまり、その遺伝子発現のほとんどを遮断することにより、感染組織中の細胞の非常に小さな人口に影響を与えます。潜伏感染した脾細胞は、自発的にウイルスの潜在的な負荷を決定するために感染症センター（IC）アッセイによりrecapitulatedできる組織培養、にexplantingによってウイルスを再アクティブ化します。さらに急性および/または潜在的に感染した組織を、定量的リアルタイムPCRでウイルスゲノムのコピーの量を推定する（定量PCR）、その最大の感度と精度のために使用されます。定量PCRおよびプラークアッセイ、および/またはICアッセイの結果を組み合わせた解析は、ウイルス性の時空間プロファイルを明らかにする生体内での複製と感染。

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Measurement of &amp;#947;HV68 Infection in Mice

γ-ヘルペスウイルス（γ- HVS）生涯その宿主に持続性を確立する。 γ- HV68とマウスの感染症は、遺伝的に扱いやすいが用意されています<em&gt; in vivoで</emγHVsのライフサイクル/病因の特性評価のための&gt;モデル。このプロトコルは、プラーク形成、感染症センター、およびqPCRアッセイによる感染後の急性および潜在的な段階でγHV68感染の検出および定量を説明します。

マウスにおけるγHV68感染の測定

&gamma;-Herpesviruses (&gamma;-HVs) are notable for their ability to establish latent infections of lymphoid cells1. The narrow host range of human ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measurement of &#947;HV68 Infection in Mice

13.5K ビュー.  University of Southern California, Los Angeles. γ-ヘルペスウイルス（γ- HVS）生涯その宿主に持続性を確立する。 γ- HV68とマウスの感染症は、遺伝的に扱いやすいが用意されています in vivoでモデル。このプロトコルは、プラーク形成、感染症センター、およびqPCRアッセイによる感染後の急性および潜在的な段階でγHV68感染の検出および定量を?...

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A Method for Labeling Vasculature in Embryonic Mice

The establishment of a functional blood vessel network is an essential part of organogenesis, and is required for optimal organ function. For example, in the thymus proper vasculature formation and patterning is essential for thymocyte entry into the organ and mature T-cell exit to the periphery. The spatial arrangement of blood vessels in the thymus is dependent upon signals from the local microenvironment, namely thymic epithelial cells (TEC). Several recent reports suggest that disruption of these signals results in thymus blood vessel defects 1,2. Previous studies have described techniques used to label the neonatal and adult thymus vasculature 1,2. We demonstrate here a technique for labeling blood vessels in the embryonic thymus. This method combines the use of FITC-dextran or Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I (GSL 1 - isolectin B4) facial vein injections and CD31 antibody staining to identify thymus vascular structures and PDGFR-&beta; to label thymic perivascular mesenchyme 3-5. The option of using cryosections or vibratome sections is also provided. This protocol can be used to identify thymus vascular defects, which is critical for defining the roles of TEC-derived molecules in thymus blood vessel formation. As the method labels the entire vasculature, it can also be used to analyze the vascular networks in multiple organs and tissues throughout the embryo including skin and heart 6-10.

This article describes a method for labeling embryonic skin and thymus blood vessels.

マウス胎児の血管系を標識する方法

The establishment of a functional blood vessel network is an essential part of organogenesis, and is required for optimal organ function. For example, in ...

免疫・感染学

Measurement of Cytosolic Ca2+ in Isolated Contractile Lymphatics

Lymphatic vessels comprise a multifunctional transport system that maintains fluid homeostasis, delivers lipids to the central circulation, and acts as a surveillance system for potentially harmful antigens, optimizing mucosal immunity and adaptive immune responses1. Lymph is formed from interstitial fluid that enters blind-ended initial lymphatics, and then is transported against a pressure gradient in larger collecting lymphatics. Each collecting lymphatic is made up of a series of segments called lymphangions, separated by bicuspid valves that prevent backflow. Each lymphangion possesses a contractile cycle that propels lymph against a pressure gradient toward the central circulation2. This phasic contractile pattern is analogous to the cardiac cycle, with systolic and diastolic phases, and with a lower contraction frequency4. In addition, lymphatic smooth muscle generates tone and displays myogenic constriction and dilation in response to increases and decreases in luminal pressure, respectively5. A hybrid of molecular mechanisms that support both the phasic and tonic contractility of lymphatics are thus proposed.
Contraction of smooth muscle is generally regulated by the cytosolic Ca2+ concentration ([Ca2+]i) plus sensitivity to Ca2+, of the contractile elements in response to changes in the environment surrounding the cell6. [Ca2+]i is determined by the combination of the movement of Ca2+ through plasma membrane ligand or voltage gated Ca2+ channels and the release and uptake of Ca2+ from internal stores. Cytosolic Ca2+ binds to calmodulin and activates enzymes such as myosin light chain (MLC) kinase (MLCK), which in turn phosphorylates MLC leading to actin-myosin-mediated contraction8. However, the sensitivity of this pathway to Ca2+ can be regulated by the MLC phosphatase (MLCP)9. MLCP activity is regulated by Rho kinase (ROCK) and the myosin phosphatase inhibitor protein CPI-17.
Here, we present a method to evaluate changes in [Ca2+]i over time in isolated, perfused lymphatics in order to study Ca2+-dependent and Ca2+-sensitizing mechanisms of lymphatic smooth muscle contraction. Using isolated rat mesenteric collecting lymphatics we studied stretch-induced changes in [Ca2+]i and contractile activity. The isolated lymphatic model offers the advantage that pressure, flow, and the chemical composition of the bath solution can be tightly controlled. [Ca2+]i was determined by loading lymphatics with the ratiometric, Ca2+-binding dye Fura-2. These studies will provide a new approach to the broader problem of studying the different molecular mechanisms that regulate phasic contractions versus tonic constriction in lymphatic smooth muscle.

Measurement of Cytosolic Ca2+ in Isolated Contractile Lymphatics

We introduce an approach to evaluate the cytosolic Ca2+ concentration in isolated lymphatics to study Ca2+-dependent and Ca2+-sensitizing mechanisms of lymphatic smooth muscle contraction.

細胞質のCaの測定 2 +絶縁収縮リンパ管における

Lymphatic vessels comprise a multifunctional transport system that maintains fluid homeostasis, delivers lipids to the central circulation, and acts as a ...

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

This protocol outlines the steps required to longitudinally monitor a bioluminescent bacterial infection using composite 3D diffuse light imaging tomography with integrated &mu;CT (DLIT-&mu;CT) and the subsequent use of this data to generate a four dimensional (4D) movie of the infection cycle. To develop the 4D infection movies and to validate the DLIT-&mu;CT imaging for bacterial infection studies using an IVIS Spectrum CT, we used infection with bioluminescent C. rodentium, which causes self-limiting colitis in mice. In this protocol, we outline the infection of mice with bioluminescent C. rodentium and non-invasive monitoring of colonization by daily DLIT-&mu;CT imaging and bacterial enumeration from feces for 8 days.
The use of the IVIS Spectrum CT facilitates seamless co-registration of optical and &mu;CT scans using a single imaging platform. The low dose &mu;CT modality enables the imaging of mice at multiple time points during infection, providing detailed anatomical localization of bioluminescent bacterial foci in 3D without causing artifacts from the cumulative radiation. Importantly, the 4D movies of infected mice provide a powerful analytical tool to monitor bacterial colonization dynamics in vivo.

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

Multi-modality imaging is a valuable approach for studying bacterial colonization in small animal models. This protocol outlines infection of mice with bioluminescent Citrobacter rodentium and the longitudinal monitoring of bacterial colonization using composite 3D diffuse light imaging tomography with &mu;CT imaging to create a 4D movie of C. rodentium infection.

の4Dのマルチモダリティイメージング<em&gt;シトロバクターrodentium</emマウスにおける&gt;感染症

This protocol outlines the steps required to  longitudinally monitor a bioluminescent bacterial infection using composite 3D diffuse light imaging ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model itself. Early phases of inflammation and infection have been widely studied by using the Pseudomonas aeruginosa agar-beads mouse model, while only few reports have focused on the long-term chronic infection in vivo. The main challenge for long term chronic infection remains the low bacterial burden by P. aeruginosa and the low percentage of infected mice weeks after challenge, indicating that bacterial cells are progressively cleared by the host.
This paper presents a method for obtaining efficient long-term chronic infection in mice. This method is based on the embedding of the P. aeruginosa clinical strains in the agar-beads in vitro, followed by intratracheal instillation in C57Bl/6NCrl mice. Bilateral lung infection is associated with several measurable read-outs including weight loss, mortality, chronic infection, and inflammatory response. The P. aeruginosa RP73 clinical strain was preferred over the PAO1 reference laboratory strain since it resulted in a comparatively lower mortality, more severe lesions, and higher chronic infection. P. aeruginosa colonization may persist in the lung for over three months. Murine lung pathology resembles that of CF patients with advanced chronic pulmonary disease.
This murine model most closely mimics the course of the human disease and can be used both for studies on the pathogenesis and for the evaluation of novel therapies.

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

We describe the agar-beads method to establish persistent long-term chronic Pseudomonas aeruginosa airway infection in the mouse model.

長期的な慢性<em&gt;緑膿菌</emマウスにおける&gt;気道感染

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

A Method for the Measurement of Salivary Gland Function in Mice

Patients with Sj&#246;gren&#39;s syndrome, an autoimmune disease affecting the exocrine glands, develop salivary gland inflammation and have reduced saliva production. Similarly, saliva production is severely compromised in patients receiving radiation treatment for head and neck cancers. Rodent models, developed to mimic these clinical conditions, facilitate an understanding of the disease pathogenesis and allow for the development of new therapeutic strategies. Therefore, the ability to accurately, reproducibly, and repeatedly measure salivary gland function in animal models is critical. Building on procedures previously described in the literature, a method was developed that meets these criteria and was used to evaluate salivary gland function in mice. An additional advantage of this new method is that it is easily mastered, and has little inter-operator variation. Salivary gland function is evaluated as the amount (weight or volume) or rate (mL/min) of saliva produced in response to pilocarpine stimulation. The collected saliva is a good source for the analyses of protein content, immunoglobulin concentrations, and other biomolecules.

Salivary gland hypofunction is a frequent consequence of autoimmune disease and radiation therapy. Reproducible evaluation of salivary gland function in mouse models of these diseases is a technical challenge. Here, a simple method for accurate and reproducible measurement of saliva production in mice is described.

マウスの唾液腺機能の測定法

Patients with Sj&#246;gren&#39;s syndrome, an autoimmune disease affecting the exocrine glands, develop salivary gland inflammation and have reduced ...

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In response to these damages, complex molecular machineries rapidly reseal the plasma membrane to restore its barrier function and maintain cell survival. Despite 60 years of research in this field, we still lack a thorough understanding of the cell resealing machinery. With the goal of identifying cellular components that control plasma membrane resealing or drugs that can improve resealing, we have developed a fluorescence-based high-throughput assay that measures the plasma membrane resealing efficiency in mammalian cells cultured in microplates. As a model system for plasma membrane damage, cells are exposed to the bacterial pore-forming toxin listeriolysin O (LLO), which forms large 30-50 nm diameter proteinaceous pores in cholesterol-containing membranes. The use of a temperature-controlled multi-mode microplate reader allows for rapid and sensitive spectrofluorometric measurements in combination with brightfield and fluorescence microscopy imaging of living cells. Kinetic analysis of the fluorescence intensity emitted by a membrane impermeant nucleic acid-binding fluorochrome reflects the extent of membrane wounding and resealing at the cell population level, allowing for the calculation of the cell resealing efficiency. Fluorescence microscopy imaging allows for the enumeration of cells, which constitutively express a fluorescent chimera of the nuclear protein histone 2B, in each well of the microplate to account for potential variations in their number and allows for eventual identification of distinct cell populations. This high-throughput assay is a powerful tool expected to expand our understanding of membrane repair mechanisms via screening for host genes or exogenously added compounds that control plasma membrane resealing.

Here we describe a high-throughput fluorescence-based assay that measures the plasma membrane resealing efficiency through fluorometric and imaging analyses in living cells. This assay can be used for screening drugs or target genes that regulate plasma membrane resealing in mammalian cells.

哺乳類細胞における効率を再封止膜の高スループット測定

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a striking increase in life expectancy around the globe. Nonetheless, determining vaccine efficacy remains a challenge. Emerging evidence suggests that the current acellular vaccine (aPV) for Bordetella pertussis (B. pertussis) induces suboptimal immunity. Therefore, a major challenge is designing a next-generation vaccine that induces protective immunity without the adverse side effects of a whole-cell vaccine (wPV). Here we describe a protocol that we used to test the efficacy of a promising, novel adjuvant that skews immune responses to a protective Th1/Th17 phenotype and promotes a better clearance of a B. pertussis challenge from the murine respiratory tract. This article describes the protocol for mouse immunization, bacterial inoculation, tissue harvesting, and analysis of immune responses. Using this method, within our model, we have successfully elucidated crucial mechanisms elicited by a promising, next-generation acellular pertussis vaccine. This method can be applied to any infectious disease model in order to determine vaccine efficacy.

Here we present an elegant protocol for in vivo evaluation of vaccine effectiveness and host immune responses. This protocol can be adapted for vaccine models that study viral, bacterial, or parasitic pathogens.

宿主-病原体応答とマウスでワクチンの有効性の評価

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

Adoptive Immunotherapy of iNKT Cells in Glucose-6-Phosphate Isomerase (G6PI)-Induced RA Mice

Rheumatoid arthritis (RA) is a complex chronic inflammatory autoimmune disease. The pathogenesis of the disease is related to invariant natural killer T (iNKT) cells. Patients with active RA present fewer iNKT cells, defective cell function, and excessive polarization of Th1. In this study, an RA animal model was established using a mixture of hGPI325-339 and hGPI469-483 peptides. The iNKT cells were obtained by in vivo induction and in vitro purification, followed by infusion into RA mice for adoptive immunotherapy. The in vivo imaging system (IVIS) tracking revealed that iNKT cells were mainly distributed in the spleen and liver. On day 12 after cell therapy, the disease progression slowed down significantly, the clinical symptoms were alleviated, the abundance of iNKT cells in the thymus increased, the proportion of iNKT1 in the thymus decreased, and the levels of TNF-&#945;, IFN-&#947;, and IL-6 in the serum decreased. Adoptive immunotherapy of iNKT cells restored the balance of immune cells and corrected the excessive inflammation of the body.

Adoptive Immunotherapy of iNKT Cells in Glucose-6-Phosphate Isomerase G6PI-Induced RA Mice

This protocol uses G6PI mixed peptides to construct rheumatoid arthritis models that are closer to that of human rheumatoid arthritis in CD4+ T cells and cytokines. High purity invariant natural killer T cells (mainly iNKT2) with specific phenotypes and functions were obtained by in vivo induction and in vitro purification for adoptive immunotherapy.

グルコース-6-リン酸イソメラーゼ(G6PI)誘発RAマウスにおけるiNKT細胞の導入免疫療法

Rheumatoid arthritis (RA) is a complex chronic inflammatory autoimmune disease. The pathogenesis of the disease is related to invariant natural killer T ...

Measurement of Chitinase Activity in Biological Samples

Chitinases are the enzymes that cleave chitin. Even in the absence of chitin, mammalians have significant amounts of chitinases present in the body including at baseline. The precise role of chitinase is not known, however it was believed to play important role in digestion and host defense against chitin-containing food and pathogens, respectively. Recent work, including ours, has shown an important role of chitinase and chitinase-like proteins in host immunity and allergic diseases. Importantly, chitinase activities serve as important biomarkers of disease severity in a wide-range of diseases including type 2 inflammatory diseases such as asthma and pulmonary fibrosis. Similarly, patients with genetic disorders like Gaucher disease have significantly elevated chitinase levels, which not only correlate with disease severity but also serve as a reliable biomarker for therapeutic effectiveness. The protocol outlined here describes a simple, quick, and straightforward way to measure chitinase activity in BAL or serum samples of mice and can be widely adapted to human subjects and other model organisms due to the highly conserved nature of the enzymes.

Presented here is a simple method to measure chitinase activity in biological fluids such as bronchoalveolar lavage or serum.

生体試料中のキチナセ活性の測定

Chitinases are the enzymes that cleave chitin. Even in the absence of chitin, mammalians have significant amounts of chitinases present in the body ...

Evaluation of T Follicular Helper Cells and Germinal Center Response During Influenza A Virus Infection in Mice

T Follicular Helper (Tfh) cells are an independent CD4+&#160;T cell subset specialized in providing help for germinal center (GC) development and generation of high-affinity antibodies. In influenza virus infection, robust Tfh and GC B cell responses are induced to facilitate effective virus eradication, which confers a qualified mouse model for Tfh-associated study. In this paper, we described protocols in detection of basic Tfh-associated immune response during influenza virus infection in mice. These protocols include: intranasal inoculation of influenza virus; flow cytometry staining and analysis of polyclonal and antigen-specific Tfh cells, GC B cells and plasma cells; immunofluorescence detection of GCs; enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) of influenza virus-specific antibody in serum. These assays basically quantify the differentiation and function of Tfh cells in influenza virus infection, thus providing help for studies in elucidating differentiation mechanism and manipulation strategy.

This paper describes protocols of evaluating Tfh and GC B response in mouse model of influenza virus infection.