この方法は、細胞保護経路、酸化ストレス、および創傷治癒応答の間の関連に関する組織修復および再生分野の重要な質問に答える助けとなる。この強力な技術の主な利点は、傷口の活性酸素種をリアルタイムで測定して、組織再生への影響を判断できることです。私と一緒に手順を実証することは、私の研究室の研究アシスタントであるジェニファー・クォンです。
グルコメーターを使用して、8〜12週齢の糖尿病マウスの各麻酔薬の血糖値を測定します。そして、最初の動物から後毛を除去するためにヘアトリマーと脱毛クリームを使用してください。アルコール拭き取り2回を使用して、露出した皮膚をきれいにし、手術領域だけが露出するように動物をドレープします。
アルコールが乾燥したら、滅菌10ミリメートル生検パンチを使用して、十分に確立された切除傷治癒技術に従ってパンニクルカルノーサスを通って延びる2、10ミリメートルの完全な厚さの創傷を作成する。厚さ0.5ミリメートルのシリコーンシートを使用し、10ミリメートルの円形の切り抜きを使用して傷口を開き、4/0シルク縫合糸を中断してスティントを固定します。その後、マウスを完全に回復するまでモニタリングしてヒートパッドに置き、個々のケージに戻り、ペーパータオルを2週間追加のネスティング材料として提供します。
翌日、各動物の創傷の上部にナンセンス小さな干渉RNAゲルまたは実験的な小さな干渉Keap1ゲルを制御し、各胴体を透明なフィルムドレッシングで包み、手足を自由にしたままゲルを所定の位置に保ちます。実験の3日目に、27ゲージの針を取り付けた1ミリメートルの注射器に作りたてのL-012溶液を積み込み、注射器を包んで溶液を光から守ります。創傷を画像化するには、各マウスから透明フィルムドレッシングを傷を邪魔することなく穏やかに除去し、マウスを生物発光イメージングシステムのイメージングチャンバーに入れます。
撮像システムの流入と誘導室の酸素レベルを毎分1リットルに設定し、ベースラインで生物発光と明るいフィールドでマウスを画像化します。次に、アルコール拭きで腹部を拭き、アルコールが乾燥したら、体重200グラムあたり5ミリグラムのL-012溶液(IP)を各マウスに注入します。任意の歪みが創傷の治癒軌道とデータ解釈に影響を与えるので、後ろ肌の傷を乱すことなくL-012溶液を注入することは重要です。
注射前に動物が安全に下振れ状態にあることを確認してください。注射の直後に、マウスをイメージングチャンバーのそれぞれの位置に戻し、60分間のイメージング期間にわたって4分間1分間動物を画像化し、10ミリメートルの創傷を活性酸素種のレベルを決定するための関心領域として定義する。その後、動物を個々のケージに戻す前に、完全な回復まで監視するヒートパッドにマウスを置きます。
確立された切除創傷モデルに従って両側創傷を作成した3日後、L-012注射の前に生物発光は認められない。インニントニールL-012溶液注射後、活性酸素種が検出された創傷の領域に生物発光が認められる。60分間にわたって4〜5分間に1分間の生物発光の記録は、約50分で観察された完全なL-012飽和に達するまでの最適なイメージング時間で、時間の経過とともに関心のある領域の生物発光飽和を示しています。
対象となる各創傷領域における生物発光は、L-012をナンセンスな小さな干渉RNA処理またはKeap1小干渉RNA処置マウスに注入する前および後に、その領域で光強度の総カウントを割ることによって計算することができる。H&E染色による活性酸素種レベル測定の正確性を確認するための創傷組織切片の分析は、小さな干渉性ナンセンス処理組織と比較して、小さな干渉性Keap1処置された創傷への細胞浸潤の減少を明らかにし、実験的なゲル処理動物における炎症形態の減少を示す。創傷組織切片上のタンパク質マクロファージマーカーであるF4/80の免疫反応性の分析は、小さな干渉性のキアプ1処置創傷と比較して治療された小さな干渉性Keap1のマクロファージの数が減少したことを示し、この方法の有効性をさらに下げる。
この手順を試みるとき、L-012が期限切れではないことを確認し、光から保護された場所で溶液をかき混ぜるようにしてください。この手順に従って、標的プローブおよび免疫アッセイに基づく方法を使用して、活性酸素種およびその相関の細胞下局在化を研究し、創傷のリダックス統計に影響を与える介入およびメカニズムの迅速な評価を可能にする。
