この作品は、DALに授与健康/ NHLBI（1ZIAHL006126）とランファン医学博士フェローシップの国立研究所の学内研究の一部門によってサポートされていました。

1。必要なものの調製三齢幼虫の脳を外植する<ol><li>マイクロダイセクションのために必要なツールを準備します。 <ol><li>まず各ピンホルダーに一つの解剖ピンを配置することによって、2解剖のツール（小刀とフック）を偽造。手やペンチ（ 図1C）でしっかりとピンを固定します。 </li><li>約120°の角度に1解剖のピンを曲げ古いピンセットを使用してください。ピンホルダーを手で保持されている場合、ピンの上半分が平らになることを確認するために解剖顕微鏡下でこれを行います。このツールは、押したままにしたり、組織を通ってスライスする、メスとして使用されます。 </li><li>保持し、組織を削り取るために使用されるフ​​ックに第二のピンを曲げ古いピンセットを使用してください。 </li><li>損傷からツールを保護するために、ピペットチップで各解剖ツールをカバーしています。注意して、整形ツールは、無期限に切開に使用することができる。必要に応じて破損したり、変形ピンを交換してください。 </li></ol> &lt;/李&gt; <li>メディアを解剖準備します。 <ol><li>組織培養フードでは、シュナイダーの培養培地に抗生物質 - 抗真菌サプリメントを希釈する。サプリメントを組み込むために、メディアを旋回。 </li><li>補充培地のいくつかの5ミリリットルのアリコートを準備します。使用するまで4℃ですべてのメディアを保管してください。 </li><li>室温に添加した培地の5ミリリットルの分量を温める。無菌5ミリリットル注射器にメディアを描画し、滅菌0.2μmのシリンジフィルターのネジ。 </li></ol></li><li>解剖のための幼虫を選択します。脳が解剖するのが最も簡単なように3齢幼虫のクロールを選択するために解剖プローブを使用してください。オプション：ブドウの寒天プレート上の堆積物の幼虫。 注：これらが途中で出クロールする第二または第一齢幼虫を強制する傾向があるので、「ウェットフード」が過度に混雑したバイアルまたはボトルを使用しないでください。 注：一部の遺伝的背景には、若い幼虫を使用して必要となります。これは、プロトコルには影響しませんが、Dを作るんissectionより難しい。 </li></ol>中枢神経系の2。解剖<ol><li>シングルスライドガラス上に、約3cmで区切って暖かい解剖メディアの2 50ミリリットルプールを作成します。 Oneプールは、微細な切開（ 図1C）のために使用肉眼解剖およびその他のために使用される。 </li><li>メディア滴の1にいくつかの幼虫を転送します。 </li><li>解剖顕微鏡に幼虫をカバースリップを移動します。幼虫の前部と後部の端が識別可能であるように、幼虫を含むプールに拡大します。 </li><li>シングル幼虫の中間領域を把握するために鉗子のペアを使用してください。一方で鉗子の第二の対を取り、同じ領域に近い幼虫を把握する。そっと半分に幼虫を引き裂くために離れて鉗子の2ペアを引き出します。カバーガラス上のすべての幼虫のために上記の2つの手順を繰り返します。 </li><li>組織にそれらを転送することにより、幼虫の体の後半分を処分。 </li><li>目のように幼虫を拡大Eの前方mouthhooksがはっきりと見える。第三の胸部と第前歯歯状突起のバンド間の幼虫mouthhooksの反対側に小さな切開、またはノッチを作成するために鉗子の両方のペアを使用してください。 </li><li>非利き手での鉗子でmouthhooksを把握。そっと前方から後方方向にキューティクルを離れて剥離する一方で鉗子を使用してください。中枢神経系が露出するまで、ゆっくりとキューティクルをはがし続けています。 </li><li>鉗子で組織を引き裂くことによって幼虫の他の部分から、中枢神経系を分離します。中枢神経系を乱さない、十分に注意してください。 重要なステップ：中枢神経系に引っ張るしないでください！破れた腹側神経索（ 図2A）または歪んだ光ファイバのローブ（ 図2Bおよび2B &#39;）で損傷したサンプルを廃棄します。 </li><li>カバーガラス上のすべての幼虫のために上記の2つの手順を繰り返します。に健全な移植組織を転送細かい解剖段階のためのカバーガラス上に媒体の第2の（きれいな）プール。 </li><li>脳から末梢組織（ 例えば 、眼、羽、脚ディスク）を一掃するために解剖ピンツールを使用してください。カバーガラスに結合組織を固定、思った（脳）と、不要な組織との間のメスをスライドさせます。同時にのこぎりのような動きでカバースリップにメスを押しながらゆっくりと望ましくない組織を離れていじめるのフックを使用しています。 </li><li>重要なステップ：各脳からすべてのディスクを削除するには、ゆっくりと意図的に操作する。脳の形態を乱さないように、十分に注意してください。健康な脳はそのまま腹側神経索および対称、丸い光のローブ（ 図2C）を持つことになります。 </li></ol> 3。ライブイメージング用取付外植脳を<ol><li>上に向けて透明なフィルム（ 図2D）と50ミリメートルのガス透過性培養皿を反転します。 Tの上に、媒体の小滴（約30μL）を堆積させるために注射器を押し下げる皿の彼が中心に。 </li><li>皿上の培地のドロップに孤立した頭脳を1つずつ、転送します。視神経葉の下に頭をすくい上げるようにフックツールを使用します。代わりに、腹側神経索から突出する軸索を把握する鉗子を使用しています。 </li><li>培地のドロップに5月10日脳を収集します。それらの多くは、メニスカス（ 図2E）にトラップされるように、培地のドロップの底に、個々の脳をプッシュする解剖ピンツールを使用して脳を沈める。 </li><li>撮像されるのNBに応じて脳を整列させるために解剖ピンツールを使用して、東洋は脳（ 図3A）。イメージに背のNB、（膜に沿って）を下に向け腹側神経索を配置。イメージにanterio腹NBSを、（離れて膜から）上に向けて腹神経索で脳を置く。すべての腹側の神経コードがxy平面内で同じ方向を指すように脳の位置を合わせます。 </li><li>注射器やプラスチックの転送​​Pを使用して、ipetteは、ガス透過性膜上に4ハロカーボン（HC）の油滴（約30μLずつ）配置します。オイルのそれぞれの滴の体積は、互いに、中のドロップと同等でなければなりません。空間の油滴が、培養培地の液滴を中心にカバースリップの四隅に対応する。完了したら、5滴（オイルを4滴、センター内の媒体の1滴）洋風サイコロ（ 図3B）上の5小面のようになります。 </li><li>それは同時にすべての5滴を打つように、アセンブリの＃1.5 22ミリメートルのカバーガラスを下げます。サンプル全体に均一な圧力を維持することは、彼らが中断される可能性を低減します。石油や媒体がカバーガラスの重みで分散して約3分待ちます。媒体の断面のような形状は、（ 図3Cおよび3D）を形成する。 </li><li>重要なステップ：ティッシュペーパーの芯を使って余分なメディアを削除することで脳の表面上にカバースリップを下げ（ ふぃぎゅ）3Cを再び。解剖スコープの下にサンプルを見ながら、これを行う。培地が除去されるように、カバースリップを下げるであろう。カバースリップが脳に触れるいったん停止します。過ぎないことウイックこれは、組織の歪みや脳爆発の原因になります。 </li><li>イメージング背NBS（ 図3E）は 、3.9のステップに移動した場合。イメージングanterio腹のNB場合は、カバーガラスが少し腹神経索先端の方向に（静かにピンセットでそれを少しずつ動かし）移動させなければならない。これは、イメージング（ 図3F）を容易にするためにカバースリップに直接接触して脳ローブをもたらしている、脳を回転させる。 </li><li>ハロカーボンオイル（ 図3D）少量のカバーガラスを囲むことによって、チャンバをシール。カバースリップからにじみ出る余分な油は最小限にし、ティッシュで吸い取っする必要があります。 </li></ol>中央脳神経芽細胞の4。ライブイメージング注意：この作品は、ニコンのEclipseのTi回転ディスク共焦点顕微鏡（倒立顕微鏡）をライブイメージングのために使用した;私たちのセットアップの詳細は、以前に31を発表されている。あるいは、サンプルは、直立システムを用いて画像化することができる。 <ol><li>ただマウント脳の上にカバーガラスにイマージョンオイルの滴を追加します。これは直接サンプル上記目的を中心に役立ちます。 </li><li>重要なステップ：ステージインキュベーターで25℃の一定温度で脳を維持する。そっとステージインキュベーターに搭載されたサンプルを配置し、その蓋をチャンバーをカバーしています。 </li><li>光のローブの中心と内側の領域に存在する大規模な、丸い細胞に着目し、透過光を利用し、中央の脳のNBの位置を確認し、 落射蛍光を使用しないでください 。これは実際に容易になる。これは、可能な限り光の最小量にサンプルを露出させるために非常に重要である。損傷している時間イメージング脳を無駄にしないでください。 </li><li>一度場所で、共焦点をするために使用して迅速なエクスポージャーを取る適切な場所と深さを決定する。最初の10から15μmの深さを制限する。必要に応じて調整し、別のテスト画像を撮影。 <ol><li>オプションのステップ：なしXYドリフトがないことを確認するために腹側神経索のテストムービーを収集します。ドリフトが検出された場合、安定するまでのサンプル用に15〜30分待ちます。ドリフトが30分に定住していない場合、新しいサンプルを準備します。主なドリフトは通常、余分な油を添加にまで遡ることができ、油の不均等な大きさは、実装時に削除されます。 </li></ol></li><li>軸のドリフト（Zドリフト）を除去するには、赤外線LEDを使用しています連続自動焦点調節装置を使用しています。代わりに、手動で焦点面を修正します。 </li><li>興味のあるNBが識別されると、イメージング療法を進める。すべての生細胞イメージング、レーザー光の量と同様に、露光時間、カメラビニング、対物倍率、時間及び/又はzステップ間隔は、すべての実験的に手元の質問に答えるために、特定の実験のために最適化されなければならない。目標は、光のダムを最小化することである加齢まだ有用なデータを収集しながら。追加的なガイダンスのための議論を参照してください。 <ol><li>画像のZ軸方向の1程度だけ離れた12月14日の画像を収集することで、NBの全体積。同じNBの単一または複数の細胞周期を捕捉する時間分解能を調整する。一般的なガイドラインとして、単一の細胞周期のイメージングと複数の細胞サイクルの1〜3分間隔のために10から30秒間隔を使用しています。 </li></ol></li><li>重要なステップ：サンプルは、有糸分裂の継続時間を監視することにより、健康であることを確認します。有糸分裂は、15分以上かかる場合は、別の脳に移動します。健康な脳は、有糸分裂のいくつかのラウンドを受けて同じ視野内の多くのNBが表示されます。各細胞周期が少し長く、光損傷に前のものよりであることに注意してください。 </li><li>イメージングが完了すると、インキュベーションチャンバーを分解し、ガス透過性培養ディッシュ以外のすべてを破棄します。 95％エタノールで培養皿の表面を洗い流してティッシュでよく拭いてください。さらに2回繰り返します。 </李&gt; </ol>免疫蛍光のために脳の5。準備<ol><li>添加培地の約0.2ミリリットルを含む1.5 mlチューブに20以上の外植頭脳を集める。 </li><li>チューブから培地を除去し、0.5ミリリットルPBSTx（0.3％トリトンX-100を含むリン酸緩衝生理食塩水、PBS）で一回の脳をすすぐ。脳は、液体のすべての取引所間のチューブの底に沈殿してみましょう。トリトンX-100界面活性剤は、組織を透過性にするために使用される。通常、リンスすると、30秒未満かかります。脳は、チューブの底に沈殿した後、単純にPBSTxを削除します。 </li><li> PBSTxで希釈された9％の電子顕微鏡グレードホルムアルデヒドの0.5ミリリットルで溶液を交換してください。室温で15分間インキュベートして章動。 </li><li>有害廃棄物規制条例に従った固定液を廃棄してください。 </li><li> 15分間0.5ミリリットルPBSTxでサンプルを洗浄します。新鮮PBSTx 2回以上に洗浄ステップを繰り返します。 </li><li> 0.5ミリリットル、PBT（PBS、1とソリューションを交換してください％ウシ血清アルブミン（BSA）、及び0.1％のTween-20）。室温で1時間ニューテーションでインキュベートする。組織への抗体の非特異的結合、このステップをブロックします。 </li><li> 4％正常ヤギ血清（NGS）を補充したPBT中に希釈した0.5ミリリットル一次抗体とソリューションを交換してください。 4℃で一晩章動でインキュベート</li><li>希釈した一次抗体を破棄または保存します。 </li><li> 15分間0.5ミリリットルPBTでサンプルを洗浄します。新鮮PBT 2回以上と洗浄ステップを繰り返します。 </li><li>変性PBT（PBS、2％のBSA、0.1％のTween-20、および4％NGS）の0.5ミリリットルとソリューションを交換してください。室温で1時間ニューテーションでインキュベートする。 </li><li>変性PBTに希釈0.5ミリリットル二次抗体とソリューションを交換してください。室温で2時間ニューテーションでインキュベートする。 </li><li> 0.5ミリリットルのPBST（0.1％のTween-20を含むPBS）で溶液を交換してください。室温で15分間インキュベートして章動。新鮮PBSTで洗浄ステップを2回繰り返します。 </li></ol><ol><li>慎重にスライドの中央より左に向かって降下を制限する、スライドガラス上のドロップなどの試料を移す。 </li><li>スライドの中心に封入大粒（直径約2cm）（例えば、Aqua-Poly/Mount）を追加します。左にあるのPBSTプールを避ける。 </li><li>封入剤のプールにPBSTのプールから脳を転送するために鉗子を使用してください。脳の上に直接封入剤を追加すると、その方向が中断されると、避けるべきである。 </li><li>光学顕微鏡下で、上に向けて結像される側と封入剤のサンプルを配置する。 </li><li>光学顕微鏡下でスライドして、徐々にサンプルの上に＃1.5ガラスカバースリップを下げる。オプションのステップ：軽くカバースリップを押すことによって、マイナーな気泡を取り除く。 </li><li>光、フラットスライドを横にすることにより、一晩封入剤を数時間重合することができるように、または室温で、保護された。 </li><li>スライドは翌日画像化、またはそれ以前の画像に保存することができる。 </li></ol>

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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PLP+inhibits+the+activity+of+interphase+centrosomes+to+ensure+their+proper+segregation+in+stem+cells.">PLP inhibits the activity of interphase centrosomes to ensure their proper segregation in stem cells.</a> J. Cell Biol. 202, 1013-1022 (2013).</li><li>Morris, L. X., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+live+imaging+provides+new+insight+into+stem+cell+regulation+and+germline-soma+coordination+in+the+Drosophila+ovary.">Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary.</a> Development. 138, 2207-2215 (2011).</li><li>Prasad, M., Jang, A. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+culturing+Drosophila+melanogaster+stage+9+egg+chambers+for+live+imaging.">A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging.</a> Nat. Protoc. 2, 2467-2473 (2007).</li><li>Rusan, N. M., Peifer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+a+novel+centrosome+cycle+in+asymmetric+cell+division.">A role for a novel centrosome cycle in asymmetric cell division.</a> J. Cell Biol. 177, 13-20 (2007).</li><li>Martinez-Campos, M., Basto, R., Baker, J., Kernan, M., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+pericentrin-like+protein+is+essential+for+cilia/flagella+function,+but+appears+to+be+dispensable+for+mitosis.">The Drosophila pericentrin-like protein is essential for cilia/flagella function, but appears to be dispensable for mitosis.</a> J. Cell Biol. 165, 673-683 (2004).</li><li>Dix, C. I., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Spd-2+recruits+PCM+to+the+sperm+centriole,+but+is+dispensable+for+centriole+duplication.">Drosophila Spd-2 recruits PCM to the sperm centriole, but is dispensable for centriole duplication.</a> Curr. Biol. 17, 1759-1764 (2007).</li><li>Moutinho-Santos, T., Sampaio, P., Amorim, I., Costa, M., Sunkel, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+localisation+of+the+mitotic+POLO+kinase+shows+a+highly+dynamic+association+with+the+mitotic+apparatus+during+early+embryogenesis+in+Drosophila.">In vivo localisation of the mitotic POLO kinase shows a highly dynamic association with the mitotic apparatus during early embryogenesis in Drosophila.</a> Biol. Cell. 91, 585-596 (1999).</li><li>Megraw, T. L., Kilaru, S., Turner, F. R., Kaufman, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+centrosome+is+a+dynamic+structure+that+ejects+PCM+flares.">The centrosome is a dynamic structure that ejects PCM flares.</a> J. Cell Sci. 115, 4707-4718 (2002).</li></ol>

著者らは、開示することは何もありません。

生細胞イメージングは​​、幹細胞のACD、細胞系統の分化を制御するメカニズムを研究するために使用される貴重なアプローチ、および複雑な組織の形態形成である。研究グループは、歴史的にNB ACDを視覚化するために様々な技法を採用しているが、これらのアプローチは、一般的に、主に脳組織が無傷のまま又は解離されているか否かに関して異なる2つのカテゴリーに分類することができ...

幹細胞は、初期の開発中に、携帯多様性を生成し、成体組織に損傷を受けた細胞を置き換えるために、分化のバランスと自己再生を維持する。この恒常性の調節は損失および過剰膨張有害な組織変性又は腫瘍形成をもたらすことができる幹細胞集団の両方を防止する。 神経芽細胞（NBS）は、 ショウジョウバエの中枢神経系（ 図1A）は、胚の段階1、2中にその第1の形態の広く研究されている神経幹細胞である。自己再生する幹細胞と分化細胞：NBには、2つの不均等運命細胞を産生する非対称細胞分裂（ACD）の反復ラウンドを受ける。 ACDは、中心体、ほとんどのセル3の微小管組織化中心として作用する非小器官膜状に案内される。有糸分裂の際に、NBの中心体は、整理し、頂端 - 基底極性に沿って双極紡錘体の向きをITY軸。除するNBの切断の際に、幹細胞の運命を指定し、頂端の運命決定因子、および分化を指定し、基礎の運命決定因子は、不均等な娘細胞に分離される。 幼虫の中央の脳では、2つのタイプのNBは、それらの数、位置、転写因子の発現、及び細胞系統（ 図1A）4-6によって区別することができる。私のNBが最も豊富で入力して、約90それらの脳7の各視葉の前面及び後面を移入します。これらのNBSが転写因子Asense（ASE）を発現し、それらは特徴的に1自己再生NBに分割し、1より小さな神経母細胞（GMC、 図1B）。それぞれのGMCは、2つのニューロンまたはグリア細胞（ 図1B）を生成するために、単一の端末分裂を受ける。対照的に、各視葉の後側に移入8タイプIIのNBは、アセ発現を欠いている5。彼らは、ACDを受ける1自己再生NBと1の中間神経前駆（INP）を生成する。 INPは、順番に、非対称的に3〜5回に分割する。 INPの再生および単一GMC 4の製造におけるこれらの部 ​​門の結果の各。総称して、特定のNBのIDとGMCの誕生の時間的順序は、成人の中枢神経系の驚異的な神経細胞の多様性を生じさせる。 NB ACDが大幅生細胞イメージング技術の使用によって改善されている根底にある細胞生物学を理解する。画像のライブのNBに研究者によって使用される公開されたプロトコルは、大きく異なります。全体的に、しかしながら、これらの方法は、幼虫の脳は無傷のままか、機械的に分離されているか否かによって区別2つの一般的なカテゴリにグループ分けすることができる。両方の技術は、研究者の用途に応じて明確な利点と欠点がある。 ライブNB細胞ディビを明らかに初期の報告排出は、幼虫の脳のマニュアル解離のある程度を伴う。これらのプロトコルの詳細は、8を塗りつけたり、カバーガラス上のNBの短期初代培養を成長させるために離れて9の脳をからかう。画像化を改善するために、円形のNBは、通常、ガラススライド8またはアガロースパッド9のいずれかを有するカバースリップ上に平坦化されている。扁平細胞は、光学系を改善してきたが、これらの技術は、多くの場合、分裂溝の回帰および複数回に分割することができないことを含め、NB有糸分裂の欠陥をもたらす。そのため、手動の解離と幼虫の脳組織の物理的な歪みの両方を伴うプロトコルは、一般的に非常に短期的な（ すなわち 、1細胞周期以下）用途に適しています。同様に、半退治または完全にガラススライドとカバースリップとの間で完全な脳を平坦化することは、時間1は、約30分の間10に与えられた標本を画像化過ごすことが制限されます。この制限にもかかわらず、THI複数のアプローチが成功裏に使用されてきた11-14。 画像のライブへの最近の努力は、ニッポン放送の限界に単離された細胞の物理的な歪みを解離さ。これらの技術は、複数の細胞分裂周期のための細胞培養物を維持する必要がある用途に特に有用である。例えば、手動で解離した脳由来の分散した細胞は、部分的に、長期的画像化のための16のフィブリノーゲンおよびトロンビンの混合物15から作られた血餅中に埋め込 ​​まれてもよい。外植脳は最初の化学的酵素コラゲナーゼで解離していてもよい別の方法として、次の手動ピペットチップ繰り返し通すことによって破壊し、続いてポリ-L-リジンコートガラスボトムディッシュ17、18上にプレー。フィブリノゲンまたはポリ-L-リジンのいずれかでガラス食器をコーティングすることは添付ファイルや主要な物理的な歪みのない、できるだけカバーガラスに近い、それらを持って来る、丸い細胞の広がりのわずかを促進する。 additi中に、これらの方法は、容易に、薬理学的摂動実験18のために交換することができる培地でのNBを培養することを含む。全体的に、直接的に分散されたNBにめっきすることは、長期的な撮像能力を犠牲にすることなく、結像光学系を改善する。最近では、解離のNBの長期培養を記述するプロトコルは19で詳述されている。 しかし、このアプローチには限界がないわけではない。のNB解離ライブイメージングには、いくつかの注意点があります。分散した細胞の分野では、例えば、それは、空間的に無傷の脳1に編成されている特定のNB系統を識別することは困難である。同様に、タイプ解離した組織内のIIのNBに対してタイプIとを区別することは、worniu-GAL4、asense-GAL80 20などの系列のトレーサーまたはサブタイプ特異的導入遺伝子の発現なしにも困難である。これらの導入遺伝子はいくつかのアプリケーションのために非常に有用であるが、それらは、それらの導入遺伝子EXに研究者を制限しないUASエンハンサーエレメント21の制御の下に押されて、より複雑な遺伝的スキームを必要とする。のNBの空間的、時間的発展に関係する研究は、従って、無傷の組織の文脈におけるin vivoイメージングに必要とする。 また、解離した胚のNBの研究は、主要な極性の相間局在22,23を決定基に隣接するセルの物理的な接触が重要であることを示している。これらの研究は完全に分離されたNBにはもはや不変紡錘体軸を維持示さない。その代わりに、これらの細胞は、よりランダム化されたスピンドル軸と根尖中心体ポジショニング22の損失のため、おそらく、連続GMCの芽、との分離の広い角度を表示します。幼虫のNBおよびその隣接セルとの関係は広く研究されていないが、それは幼虫の幹細胞の微小環境が細胞極性又は他に衝突してもよいことを考慮する価値がある行動。幼虫のNBの生理的コンテキストを維持するために、全脳からの我々のイメージのACD。 イメージング解離したNBSで、それに関連する生来の制限を考えると、私たちの研究室などが全体の幼虫脳からNBのACDの画像連続ラウンドにプロトコルを確立しています。画像無傷の脳への技術は、多くの場合、組織の歪みや損傷を防止し、ガス交換を可能にするために、可撓性膜と培養チャンバーの一方の側のガラス表面の剛性を置き換える。いくつかの方法は、10幼虫24から分離され、脂肪組織と昆虫培養培地、血清、アスコルビン酸の混合物に取り付け外植脳を伴う。それらはNB細胞の分裂25を刺激することが知らマイトジェンを分泌するため、単離された脂肪体を添加する。このプロトコルは、3以上の時間、組織の一体性を維持し、長期的なイメージング24、26〜28の影響を受けやすいことである。最近では、プロトコルは、経度を記述するアスコルビン酸、血清、および脂肪体の存在下で、無傷の幼虫の脳gの長期イメージングは29で詳述されている。組織が ​​露出することも、固定化もされていないため、重要なのは、このアプローチは、培養培地（ 例えば 、薬剤の研究、免疫除去など ）で交換されるアプリケーションにはあまり有用である。 私たちの研究室では、長期的なイメージング30、31、ライブ幼虫の脳の全体のマウントの準備を簡素化しました。他のものよりも我々のプロトコルの主な利点は、その単純です：我々の観察は、どちらも、血清、アスコルビン酸、インスリン、また脂肪体はNBのACDの画像連続ラウンドに必要な添加剤であることを示す。我々のイメージング媒体は、駅の単純な混合物からなるように、インスリンのような添加剤は、 ショウジョウバエ卵巣における幹細胞の分裂32と集合細胞遊走33の延長されたイメージングのために有用であったが、それらは、NB ACDのために不要であると思われるndard昆虫細胞培養培地は、汚染を防ぐために抗生物質 - 抗真菌を補充した。再利用可能なガス透過性又はガラス底培養皿を用いることにより、我々は連続したNB ACDの数ラウンドを持続することができた。同じ試料は、容易に外植免疫蛍光及び固定された組織との他の手順のために使用することができる。このプロトコルでは、細部そのまま幼虫の脳の解剖だけでなく、ライブおよび固定の両方の分析のための脳の準備。

<table><tbody><tr><td>Lumox tissue culture dish 50 x 12 mm</td><td>Sarstedt</td><td>94.6077.410</td><td>A reusable culture dish with a gas-permeable and optically clear film base.</td></tr><tr><td>Schneider&#039;s S2 Medium</td><td>Invitrogen</td><td>21720-024</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Antibiotic-Antimycotic (100x)</td><td>Invitrogen</td><td>15240-062</td><td>A supplement containing penicillin (10,000 U/ml), streptomycin (10,000 &amp;#956;g/ml), and amphotericin B (25 &amp;#956;g/ml) that is added to Schneider&#039;s S2 media to prevent bacterial and fungal contamination.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Glass coverslips, #1.5 22 x 22 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-541-B</td><td></td></tr><tr><td>Halocarbon oil 700</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8898</td><td>A high viscosity inert oil that is clear and colorless.</td></tr><tr><td>Pair of nickel-plated pin holders, 17 cm long</td><td>Fine Science Tools</td><td>26018-17</td><td></td></tr><tr><td>Pair of Dumont #5 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting needle/probe with plastic handle</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-965-A</td><td></td></tr><tr><td>Syringe filter, 0.22 &amp;#956;m pore size</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-719A</td><td></td></tr><tr><td>Syringe, 5 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>Plastic transfer pipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>S30467-1</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde, 32% EM-grade</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15714</td><td>CAUTION: Formaldehyde is toxic; it should be handled in a fume hood. Follow MSDS guidelines for safe handling.</td></tr><tr><td>DAPI (4&#039;,6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride)</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>A dye that labels DNA and is excited by UV light.</td></tr></tbody></table>

live imaging of drosophila larval neuroblasts

自己再生する幹細胞と分化細胞：幹細胞は等しくない運命電位を有する2つの子孫細胞を生成するために非対称的に分割する。開発と疾病との関連性を考えると、非対称幹細胞分裂を支配するメカニズムを理解することは、研究の強固な地域となっている。それらは遺伝的に扱いであり、約時間ごとに細胞分裂の連続ラウンドを受けるので、 ショウジョウバエ中枢神経系、または神経芽細胞の幹細胞は、幹細胞分裂の研究に不可欠なモデルである。約100神経幹細胞は、ライブイメージング顕微鏡研究のために、このモデル系は、特に有用なものつ幼虫の脳葉の表面付近に位置する。本研究では、幹細胞分裂を視覚化するために広く使われているいくつかのアプローチを検討し、我々は完全な脳組織に対する解離し採用するこれらの技術の相対的な利点と欠点を解決する。また、細部たちsimplifIEDプロトコルは、生細胞イメージングのための3齢幼虫と固定分析アプリケーションからの全脳を外植するために使用する。

ライブイメージングは​​、NB、ACDを制御するメカニズムの数を明らかにしました。画像取得の前に、最適な撮影条件を決定する必要がある。これは、生細胞イメージングの持続時間を有するフレームキャプチャレートのバランスをとることが必要である。微粒子の細胞分析のために、例えば、一時的な増加と光学分解能が必要とされ得る。単一NB細胞周期（ 図4A）を可視化する?...

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Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

このプロトコルは、無傷の幼虫の脳のコンテキストで生細胞イメージングを行うために使用合理化された方法を説明します。ライブセルイメージングのアプローチは、一貫して、以前に見落とされたメカニズムを暴く、非対称神経幹細胞分裂の研究だけでなく、他の神経と発達過程のための非常に貴重である。

のライブイメージング<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;幼虫の神経芽細胞

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given ...

live-imaging-of-drosophila-larval-neuroblasts

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

14.8K ビュー.  National Institutes of Health. このプロトコルは、無傷の幼虫の脳のコンテキストで生細胞イメージングを行うために使用合理化された方法を説明します。ライブセルイメージングのアプローチは、一貫して、以前に見落とされたメカニズムを暴く、非対称神経幹細胞分裂の研究だけでなく、他の神経と発達過程のための非常に貴重である。 

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Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track during live cell imaging. These processes include: retinal rotation, cell growth and organismal movement. Additionally, irregularities in the topology of the epithelium, including subtle bumps and folds often introduced as the pupa is prepared for imaging, make it challenging to acquire in-focus images of more than a few ommatidia in a single focal plane. The workflow outlined here remedies these issues, allowing easy analysis of cellular processes during Drosophila pupal eye development. Appropriately-staged pupae are arranged in an imaging rig that can be easily assembled in most laboratories. Ubiquitin-DE-Cadherin:GFP and GMR-GAL4&#8211;driven UAS-&#945;-catenin:GFP are used to visualize cell boundaries in the eye epithelium 1-3. After deconvolution is applied to fluorescent images captured at multiple focal planes, maximum projection images are generated for each time point and enhanced using image editing software. Alignment algorithms are used to quickly stabilize superfluous motion, making individual cell behavior easier to track.

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

のライブイメージング<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;蛹アイ

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

発生生物学

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different neurological diseases. Defects in this essential process can have detrimental effects on neuronal functioning and development. We have developed a dissection protocol that is designed to expose the Drosophila larval segmental nerves to view axonal transport in real time. We have adapted this protocol for live imaging from the one published by Hurd and Saxton (1996) used for immunolocalizatin of larval segmental nerves. Careful dissection and proper buffer conditions are critical for maximizing the lifespan of the dissected larvae. When properly done, dissected larvae have shown robust vesicle transport for 2-3 hours under physiological conditions. We use the UAS-GAL4 method 1 to express GFP-tagged APP or synaptotagmin vesicles within a single axon or many axons in larval segmental nerves by using different neuronal GAL4 drivers. Other fluorescently tagged markers, for example mitochrondria (MitoTracker) or lysosomes (LysoTracker), can be also applied to the larvae before viewing. GFP-vesicle movement and particle movement can be viewed simultaneously using separate wavelengths.

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

This protocol discusses the live dissection of Drosophila larvae for the purpose of imaging the movement of GFP tagged axonal vesicles on microtubule tracks.

ショウジョウバエ幼虫分節軸索内ではシナプス小胞の in vivo可視化で

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different ...

神経科学

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of the Drosophila larva makes it an attractive model organism for live imaging studies. However, an important challenge for live imaging techniques is to noninvasively immobilize and position an animal on the microscope. This protocol presents a simple and easy to use method for immobilizing and imaging Drosophila larvae on a polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic device, which we call the 'larva chip'. The larva chip is comprised of a snug-fitting PDMS microchamber that is attached to a thin glass coverslip, which, upon application of a vacuum via a syringe, immobilizes the animal and brings ventral structures such as the nerve cord, segmental nerves, and body wall muscles, within close proximity to the coverslip. This allows for high-resolution imaging, and importantly, avoids the use of anesthetics and chemicals, which facilitates the study of a broad range of physiological processes. Since larvae recover easily from the immobilization, they can be readily subjected to multiple imaging sessions. This allows for longitudinal studies over time courses ranging from hours to days. This protocol describes step-by-step how to prepare the chip and how to utilize the chip for live imaging of neuronal events in 3rd instar larvae. These events include the rapid transport of organelles in axons, calcium responses to injury, and time-lapse studies of the trafficking of photo-convertible proteins over long distances and time scales. Another application of the chip is to study regenerative and degenerative responses to axonal injury, so the second part of this protocol describes a new and simple procedure for injuring axons within peripheral nerves by a segmental nerve crush.

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are an attractive model system for live imaging due to their translucent cuticle and powerful genetics. This protocol describes how to utilize a single-layer PDMS device, called the &#39;larva chip&#39; for live imaging of cellular processes within neurons of 3rd instar Drosophila larvae.

における損傷応答のライブイメージングや研究のためのマイクロ流体チップを使用<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;幼虫

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of ...

生物工学

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have been used to study many biological processes, such as cell proliferation, differentiation, growth, migration, apoptosis, competition, cell-cell signaling, and compartmental boundary formation. However, methods for the long-term ex vivo culture and live imaging of the imaginal discs have not been satisfactory, despite many efforts. Recently, we developed a method for the long-term ex vivo culture and live imaging of imaginal discs for up to 18 h. In addition to using a high insulin concentration in the culture medium, a low-melting agarose was also used to embed the disc to prevent it from drifting during the imaging period. This report uses the eye-antennal discs as an example. Photoreceptor R3/4-specific m&#948;0.5-Ga4 expression was followed to demonstrate that photoreceptor differentiation and ommatidial rotation can be observed during a 10 h live imaging period. This is a detailed protocol describing this simple method.

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

This protocol describes a detailed method for the long-term ex vivo culture and live imaging of a Drosophila imaginal disc. It demonstrates photoreceptor differentiation and ommatidial rotation within the 10 h period of live imaging of the eye disc. The protocol is simple and does not require expensive setup.

長期のライブイメージング<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;アイディスク

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

Live Imaging of Glial Cell Migration in the Drosophila Eye Imaginal Disc

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons. While recent progress has been made to describe the live migration of glial cells in the developing pupal wing (1), studies of Drosophila glial cell migration have typically involved the examination of fixed tissue. Live microscopic analysis of motile cells offers the ability to examine cellular behavior throughout the migratory process, including determining the rate of and changes in direction of growth. Paired with use of genetic tools, live imaging can be used to determine more precise roles for specific genes in the process of development. Previous work by Silies et al. (2) has described the migration of glia originating from the optic stalk, a structure that connects the developing eye and brain, into the eye imaginal disc in fixed tissue. Here we outline a protocol for examining the live migration of glial cells into the Drosophila eye imaginal disc. We take advantage of a Drosophila line that expresses GFP in developing glia to follow glial cell progression in wild type and in mutant animals.

Here we describe a protocol to examine the migration of glial cells into the developing Drosophila eye using live microscopic analysis paired with GFP tagged glial cells.

ショウジョウバエの眼成虫ディスクに付属してグリア細胞の移行のイメージングを生きる

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons.  While ...

生物学

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

のライブイメージングキイロショウジョウバエ胚性血球移行

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging

Drosophila is an important model system to study a vast range of biological questions. Various organs and tissues from different developmental stages of the fly such as imaginal discs, the larval brain or egg chambers of adult females or the adult intestine can be extracted and kept in culture for imaging with time-lapse microscopy, providing valuable insights into cell and developmental biology. Here, we describe in detail our current protocol for the dissection of Drosophila larval brains, and then present our current approach for immobilizing and orienting larval brains and other tissues on a glass coverslip using Fibrin clots. This immobilization method only requires the addition of Fibrinogen and Thrombin to the culture medium. It is suitable for high-resolution time lapse imaging on inverted microscopes of multiple samples in the same culture dish, minimizes the lateral drifting frequently caused by movements of the microscope stage in multi-point visiting microscopy and allows for the addition and removal of reagents during the course of imaging. We also present custom-made macros that we routinely use to correct for drifting and to extract and process specific quantitative information from time-lapse analysis.

Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging

This protocol describes applications of sample immobilization using Fibrin clots, limiting drifting, and allowing the addition and washout of reagents during live imaging. Samples are transferred to a drop of Fibrinogen containing culture medium on the surface of a coverslip, after which polymerization is induced by adding thrombin.

ライブイメージングのためのフィブリン・クロッツによる ショウジョウバエ 組織固定化の応用

Drosophila is an important model system to study a vast range of biological questions. Various organs and tissues from different developmental stages of ...

Drosophila melanogaster Third Instar Larvaeのライブ脳外植片のイメージング

Live-Cell Imaging of Drosophila melanogaster Third Instar Larval Brains

Drosophila neural stem cells (neuroblasts, NBs hereafter) undergo asymmetric divisions, regenerating the self-renewing neuroblast, while also forming a differentiating ganglion mother cell (GMC), which will undergo one additional division to give rise to two neurons or glia. Studies in NBs have uncovered the molecular mechanisms underlying cell polarity, spindle orientation, neural stem cell self-renewal, and differentiation. These asymmetric cell divisions are readily observable via live-cell imaging, making larval NBs ideally suited for investigating the spatiotemporal dynamics of asymmetric cell division in living tissue. When properly dissected and imaged in nutrient-supplemented medium, NBs in explant brains robustly divide for 12-20 h. Previously described methods are technically difficult and may be challenging to those new to the field. Here, a protocol is described for the preparation, dissection, mounting, and imaging of live third-instar larval brain explants using fat body supplements. Potential problems are also discussed, and examples are provided for how this technique can be used.

著者スポットライト:非対称細胞分裂ダイナミクスの調査:ショウジョウバエ幼虫の脳外植片のライブイメージングのためのプロトコル 

Here, we discuss a workflow to prepare, dissect, mount, and image live explant brains from Drosophila melanogaster third instar larvae to observe the cellular and subcellular dynamics under physiological conditions.

ショウジョウバエメラノガスター第3齢幼虫脳の生細胞イメージング

Drosophila neural stem cells (neuroblasts, NBs hereafter) undergo asymmetric divisions, regenerating the self-renewing neuroblast, while also forming a ...

のライブイメージング

要約

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のライブイメージング

ショウジョウバエ幼虫分節軸索内ではシナプス小胞の in vivo可視化で

における損傷応答のライブイメージングや研究のためのマイクロ流体チップを使用

長期のライブイメージング

ショウジョウバエの眼成虫ディスクに付属してグリア細胞の移行のイメージングを生きる

のライブイメージングキイロショウジョウバエ胚性血球移行

ライブイメージングのためのフィブリン・クロッツによるショウジョウバエ組織固定化の応用

ショウジョウバエメラノガスター第3齢幼虫脳の生細胞イメージング

ショウジョウバエメラノガスター第3齢幼虫脳の生細胞イメージング

ショウジョウバエメラノガスター第3齢幼虫脳の生細胞イメージング

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ショウジョウバエ幼虫分節軸索内ではシナプス小胞の in vivo可視化で

における損傷応答のライブイメージングや研究のためのマイクロ流体チップを使用

長期のライブイメージング

ショウジョウバエの眼成虫ディスクに付属してグリア細胞の移行のイメージングを生きる

のライブイメージングキイロショウジョウバエ胚性血球移行

ライブイメージングのためのフィブリン・クロッツによる ショウジョウバエ 組織固定化の応用

ショウジョウバエメラノガスター第3齢幼虫脳の生細胞イメージング

ショウジョウバエメラノガスター第3齢幼虫脳の生細胞イメージング

ショウジョウバエメラノガスター第3齢幼虫脳の生細胞イメージング

ライブイメージングのためのフィブリン・クロッツによるショウジョウバエ組織固定化の応用