我々は、先行性包装技術によって個々のマウス心臓細胞を単離するための簡単なランゲンドルフフリーの方法を開発した。この方法は、若年性マウスから古いマウスに心臓細胞を分離することを可能にする。ランゲンドルフ系逆行灌流は、様々な実験動物において心臓筋細胞を単離するためのゴールドスタンダードと考えられている。
しかし、LTAのカヌレーションは、マウスのサイズが小さいため技術的に困難です。マウスの心臓収穫のために、安楽死を確認し、腹部を剃った後、胸腔を素早く開いて心臓を露出させ、心臓のおよその大きさに切られたプラスチックトランスファーピペットを使用して心臓をピペットに吸い込む。ピペットを上げて曲がったはさみを挿入するのに十分なスペースを作り、心房を損傷しないように注意して後側から心臓を切除するのにはさみを使用します。
すぐに、約1分間、氷冷CIB-EGTAを含む30ミリリットルのガラスビーカーに心臓を入れます。収縮が止まったら、氷冷CIB-EGTAを含む35ミリリットル培養皿に心臓を入れ、肺および他の目に見える組織を取り除く。おおよそ洗浄した心臓を、冷やしたCIB-EGTAの頂点側で満たされた心臓スタンドの上に置き、立体顕微鏡の下に置きます。
大大ターの周りから脂肪と結合組織を取り除きます。切り抜いた大動脈の長さが長すぎる場合は、腕頭筋動脈のすぐ下で大動脈をトリミングし、前表面が前方を向いることができるように心臓を向けます。ピンセットを使用して大動脈の端を持ち上げ、小さな血管クランプを使用してアトリア付近の大動脈を静かに押し下げながら、大動脈をクランプします。
その後、前側を上に向けた灌流プレートにクランプされた心臓を置き、CIB-EGTAの数滴で心臓を水分補給します。前向き灌流の場合、柔軟な延長チューブに接続された温め込まれたCIB-EGTAを含む20ミリリットルのシリンジを注入ポンプにロードし、毎分流量0.5ミリリットルでポンプを開始します。針とポンプが充填されたら、注射針を前に斜めの形状の短い側の灌流板に置き、針が心臓の頂点に触れるまでスライドさせます。
慎重に、左心室の頂点付近の針を、プレートから針をねじったり取り外したりすることなく、心室室に挿入し、針の挿入の深さを推定するマークを見ます。針の挿入が完了すると、冠状動脈から血液が流れ始めるはずです。テープを使用して注入針をプレートに固定し、ポンプ速度を1分あたり1ミリリットルに上げます。
心臓が正常に浸透した場合、毛細血管内の緩衝液の流れは、心外膜のすぐ下に見えるべきである。CIB-EGTA灌流を2~3ミリリットルで灌流した後、酵素ミックスで灌流バッファーを交換します。1~2ミリリットルを浸透させた後、ポンプ速度を1分あたり1.5ミリリットルに上げます。
必要に応じて心臓から流れる蓄積された血液含有パーズを除去し、灌流酵素の総量が10ミリリットルに達したときに灌流を停止するためにピペットを使用してください。灌流の終わりに、シリンジからヒーターマットの60ミリメートル培養皿に酵素ミックスの10ミリリットルを移し、皿にBSAの20ミリグラムを追加します。皿をそっと渦巻いて粉末を溶かし、注射針を取り除き、心臓からクランプします。
心臓から心室と心房を取り除き、BSA補充酵素ミックスに組織を入れる。心室筋細胞を分離するには、2組のピンセットを使用して心外膜をつかみ、心室を小さく引っ張ります。すべての心室断片が生成されたら、穏やかなピペットで約30回細胞を分散させ、100ミクロンのメッシュセルストレーナーを通して未消化の破片を15ミリリットルの遠心分離管にろ過します。
遠心分離後、カルシウムとBSAを補った前温化されたCIBの心筋細胞ペレットを再中断し、摂氏37度で5分間培養する。インキュベーションの終わりに、再び細胞を遠心分離し、沈殿した心筋細胞を適切な量の細胞再懸濁液で再懸濁させ、下流分析まで摂氏37度で維持する。心房筋細胞を単離するには、カルシウムとBSAを補った温暖化したCIBの容器に心房を移し、実証したように心房を粉々に引き裂く。
10マイクロリットルに設定した20マイクロリットルのピペットを使用して、ピペット処理によって組織を破壊し、遠心分離によって解約細胞を収集します。次いで、適切な量の細胞再懸濁液中の心房細胞を再懸濁させる。この画像では、新たに単離された心室筋細胞が観察される。
この分離手順により、約5時間以内に8~10週齢のマウスの棒状静止心室筋細胞の収率が70~80%となる。新たに単離された生存細胞の比率は、2歳以上のマウスでは低い。心室および心房筋細胞に記録された作用電位は、ランゲンドルフ系の方法で得られた細胞で測定されるものと類似している。
免疫染色解析は、心室筋細胞の肉体構造の組織と、サブカルチャー後の心線維芽細胞の筋線維芽細胞への変換を評価するために使用することができる。ウェスタンブロット分析は、処理後の心房および心室での目的のタンパク質の特異的発現を決定するために推奨される。酵素を灌流した後、心房および心室からのタンパク質は、タンパク質抽出のための軽い力を有するリシスバッファーで容易に均質化することができる。
針の挿入の方向および深さを制御することは重要である。左心室に針を挿入する場合は、心室中隔を貫通したり、弁を貫通したりしないように注意してください。実験の目的に応じて、パーフューズの組成を変更することができます。
例えば、EGTA補充洗剤は、心臓の無細胞足場を作るために使用することができる。
