本研究「ヘテロ接合性、対立の構図とジャガイモのコピー数変化を解明」の国立科学財団賞数 1237969 によって資金を供給された、米国農務省特別助成 2014年-34141-22266 大学 (メイン州) を撮って

注: それは通常実験サンプルとして同じ倍数性の葉組織のフォームに適切なコントロールを含めることが重要です。塊茎のサンプルの 2 C ピークは小さいと識別することは困難かもしれないためにです。
1. 準備
注: ここに記載されてソリューションは早めに準備、4 ° C で保存される可能性があります、後続のステップの説明は当日使用の新鮮ななされなければなりません。
<ol><li>適切なボリュームの原形質分離培養ソリューション (PI) を作る (15 mL/サンプル): 0.55 M のマンニトール 2 mM CaCl2、1 mM KH2PO4、1 mM MgCl2、50 mM Tris バッファー pH 7.5 (HCl で調整)。</li>
	<li>原形質分離洗浄ソリューション (PWS) の適切なボリュームを作る (15 mL/サンプル) 小僧に 0.71 M のマンニトールの付加を除いて同一であります。</li>
	<li>変更したガルブレイスの流れ Cytometry バッファー11 (FCB) の 250 mL を作る: 13.6 mM クエン酸ナトリウム (ナトリウム)、8 mM モップ、18 mM MgCl20.4 %v/v トリトン X-100。トリトン X-100 を配布する、少なくとも 30 分間かき混ぜます。</li>
	<li>フィルターは、0.22 μ m フィルターを非対称ポリエーテルサルホン (猿) 小僧と PWS のソリューションを滅菌します。真空駆動ろ過ユニットを使用します。</li>
	<li>
106 μ m メッシュ フィルター分離プロトプ ラストを準備します。しかし懸濁液の 106 μ m フィルターを通過法を使用可能性がありますコレクション チューブに直接入れ子にすることができる遠心管 1.5 mL を準備します。 注: これらは滅菌する必要はありません。<ol>
<li>1.5 mL 遠心管を使用している場合は、先端から 1 cm 各微量遠心チューブをカットします。ホット プレートまたは他の熱の熱源を使用して、1 cm2作品 106 μ m 鋼は、アルミ箔の部分にメッシュします。メッシュに、管の切断端に押してに癒合しました。</li>
	</ol>
</li>
	<li>すべての土および残骸の取り外し、サンプリングされるジャガイモを洗います。 注: 塊茎の大きさおよび年齢実験の目的に適したする必要がありますが、結果の質に影響を与えるしていないましょう。正常に 8 ヶ月を冷蔵 (4 ° C、相対湿度 95%) にされている塊茎にこのプロトコルを行った.欠陥 (例えば塊茎の端の腐敗、中空の中心、黒い壊死部分) と塊茎は敏感かもしれないが、彼らは避けてください、可能であれば。</li>
</ol>2. 1 日目: Plasmolyze 塊茎組織
注: コントロールの葉のサンプルをここで記載してプロトプ ラストの生成または粗野な準備が好ましい場合は 5.2 でステップすることができます。これは、層流フードなどの無菌環境で無菌のツールで行う必要があります。
<ol><li>表面には、少なくとも 5 分 75% エタノールに浸漬によるジャガイモ塊茎が殺菌します。</li>
	<li>エタノールから塊茎を外し、エアーで乾燥させます。通常、塊茎が 100 g を超える場合 〜 5 分、長くかかります。</li>
	<li>準備し、各サンプルのフィルターの分注 15 mL ラベル滅菌 50 mL の円錐管にそれぞれ小僧を滅菌します。</li>
	<li>
滅菌メスまたはコルクの穴あけ器を使用して滅菌の塊茎から目的の組織の約 1 cm3 をサンプルします。 注: サンプリングされる組織によって 1 つがまたはを使用して滅菌コルクボーラー ナイフ/メス。例えば、力強さが必要な場合コルクの穴あけ器を使用して、塊茎の遠位端に頂端からコアをコアの中心部の一部をサンプリングする場合があります。ただし、ジャガイモ塊茎の非対称の内部形態によるは、サンプルの実質により正確な可能性がありますまたは皮質塊茎を半減し、目的の組織を切除します。内部塊茎形態の描写は、図 1を参照してください。<ol>
<li>約 3 mm の3ピース、PI を含む円錐管に転送組織に滅菌メスを使用して組織を粗く切る。4 ° C で一晩インキュベートします。 注: これは表面積を最大化するためには、PI、後酵素液が完全により完全な消化力、組織に浸透し、。</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57134/57134fig1.jpg"> 図 1: ジャガイモ塊茎組織の内部形態。(P) の力強さとー柔組織 (PM) 間の分離は、黒い線で示されています。(C) 皮質から実質を隔てる血管リングは黒の矢印で示されます。ストロン終わり (S) と塊茎の目 (E) も付いています。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57134/57134fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
3. 2 日目: かんしょプロトプ ラストを生成します。
注: これは層流フードなどの無菌環境で無菌のツールで実行する必要があります。
<ol><li>準備し、フィルター (0.45 μ m 猿フィルター) 適切な量の酵素ソリューション (ES) (10 mL/サンプル): 0.71 M のマンニトール、3 mM CaCl2、1 mM KH2PO4、1 mM MgCl2, 4% 小野塚 R 10 セルラーゼ, 0.8% macerozyme R-10 1% hemicululase 10pH 5.8 mM MES バッファーこの手順で適切なフィルターを使用することを確認します。フィルター孔 0.45 μ m、猿などの低蛋白結合膜濾過における酵素の損失を最小限に抑えるに対し目詰まりを起こしよりも小さいサイズです。</li>
	<li>血清学的滅菌ピペットを使用して円錐管のサンプルから PI を離れて吸い出しなさい。</li>
	<li>各サンプルし、反転する ES の 10 mL を追加し 2-3 回。</li>
	<li>180 rpm 水平加振 29 ° C で一晩サンプルをインキュベートします。少なくとも 16 h のためのサンプルをインキュベートします。</li>
</ol>4 3 日目: 収穫プロトプ ラストとプロトプ ラスト洗浄
注: 無菌条件がない長い必要なこの時点で。
<ol><li>シェーカーからサンプルを削除し、〜 10 分のために解決できるようにします。</li>
	<li>
できるだけ ES ソリューションの多くを離れて吸い出しなさい。
	<ol>
<li>血清ピペット、消化組織を削除することを避けるために世話を可能な限り ES ソリューションの多くを削除します。</li>
		<li>マイクロ ピペットを使用、残りの ES ソリューションは、再び消化組織を回避します。角度でチューブを押しながら ES ソリューションが、消化の組織のまま下部に蓋の方に流れるので、これは最も簡単です。</li>
	</ol>
</li>
	<li>各サンプルに PWS の 15 の mL を追加し、軽く反転 2-3 回。プロトプ ラスト 10 分のために解決を許可します。</li>
	<li>血清ピペットで PWS を削除します。マイクロ ピペットを使用して、残りの液体を削除します。 注: この手順は cytometry 流れの中にサンプルの核の整合性の確保に不可欠です。トラブルシューティングでは、この手順はサンプルのエラーの最も可能性の高いソースをことが判明しました。</li>
</ol>5. 3 日目: フローサイトメトリー用のサンプルを準備します。
注意: サンプル保管すべきここから氷の上明記されていない限り。
<ol><li>Propidium ヨウ化 (0.4 mg propidium ヨウ化/mL FCB) と RNase ソリューションを準備 (RNase A 0.8 mg/mL FCB) FCB のそれぞれを溶解することにより。 注意: Propidium ヨウ化は非常に有毒です。皮膚や目に接触を避けます。適切な PPE を着用します。</li>
	<li>
氷の 1.5 mL を追加各サンプルに冷たい FCB。簡単に手ふれや渦を分割する各サンプル集計組織。塊茎組織の塊を破る FCB が完全に細胞に浸透し、核を解放することが重要です。別のサンプルはもっとまたはより少なく組織および遺伝子型によって撹拌を必要があります。 注: FCB は核を解放、プロトプ ラストを溶かします。したがって維持の必要性の劣化を防ぐために氷の上サンプルします。<ol>
<li>制御流れ cytometry サンプルがプロトプ ラストの生成手順に含まれていない場合ここに含まれているかもしれない。氷の 1.5 mL の小葉 (2〜 3 cm) をみじんコントロールを追加する場合は、かみそりの刃を使用して冷たい FCB。コントロールのサンプルは、好ましくは、同じ遺伝子実験のサンプルとして同じ倍数性をする必要があります。培養幼植物体は、温室や圃場栽培した植物よりもクリーンなピークを与える傾向があります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
FCB/組織懸濁液の 1 mL を 106 μ m のメッシュ フィルターを通過します。カットの先端と 1.5 mL 遠心チューブを使用し、1.5.1 の手順で説明するよう下部に金網が溶けています。この微量遠心チューブは、2 mL 遠心チューブに直接入れ子にすることし、サンプルを直接通過。ろ過の別のメソッドを使用すると、すると、その濾液が冷えたペトリ プレートで収集され 2 mL チューブに転送されます。 注: 時々 残りの集計および細胞残骸が詰まらせるメッシュ フィルター。この場合、数回タップ 2 つの入れ子になったマイクロ遠心チューブ用が単に破片を取り除くため。</li>
	<li>RNase ソリューションの 250 μ L を各サンプルに追加します。反転し、室温 (RT) で 30 分間インキュベートします。 注: この手順は、cytometry 流れの中に存在するノイズの少ないサンプルから RNA を削除するものです。但し、核は短命、研究者はインキュベーション時間を短縮したり、氷の上、サンプルの劣化が発生する場合それを実行するかもしれない。</li>
	<li>Propidium ヨウ化ソリューションの 125 μ L を各サンプルに追加します。反転し、氷上で 30 分間インキュベートします。 注: サンプルは、劣化を氷の上にも、2 時間以内に感じ取ることが、できるだけ早くフローサイトメトリー用使用必要があります。</li>
</ol>6 ジャガイモ塊茎の核の 3 日目: フローサイトメトリー
注: 流れの cytometer 操作およびソフトウェアは機器やメーカーによって異なります。流れの cytometer の特定の操作の詳細については、計測器のユーザー ガイドで提供されます。
<ol><li>対側方散乱と propidium ヨウ化 (PI) 対側方散乱前方散乱の対数目盛を使用して 2 つのドット プロットを作成します。また x 軸に PI とヒストグラムを作成します。対数スケールは、確実にすべてのイベントがスケール内に核は蛍光で大幅に異なる場合があります必要があります。</li>
	<li>
知られているコントロール サンプル チューブをロードし、すべてのイベントのスケールでは、電圧を調整します。サンプルの遺伝子型から体外葉のティッシュを使用します。異なるにともなってのサンプルを実行する場合は、各コントロールのサンプルが含まれてする必要があります。
	<ol>
<li>コントロールのサンプルで 2 C ピークのチャネルを確認します。実験サンプルの 2 C ピークは、同じ場所に落ちる必要があります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>実験 (塊茎) サンプルをロードし、再度すべてのイベントがスケール上にあることを確認します。調整が必要な繰り返し手順 2 C のチャネルを識別する 6.2 がピークします。</li>
	<li>手動でゲート側対 PI 散布プロトプ ラストの核。</li>
	<li>PI ヒストグラムのみゲート プロトプ ラストの核の領域を表示するに設定します。</li>
	<li>各サンプルからのイベントの数を収集します。頻繁に研究者使用; フローサイトメトリー用 10,000 ゲート イベントただしより多くのサンプルと低濃度のサンプルに対応するのに塊茎プロトプ ラスト試料 2,000 イベントを使用します。</li>
	<li>次の数式を使用して PI のヒストグラムから各サンプルの EI を計算します。 EI =<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57134/57134eq1.jpg"> 4 C が 4 C (表現の単一の円形を表す) である核の割合は、8 C は 8 C との比率です。ピークの C 値のヒストグラムの例については図 4を参照してください。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Wilson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The karyoplasmic ratio. 727, (1925).</li><li>Szymanski, D. B., Marks, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GLABROUS1+overexpression+and+TRIPTYCHON+alter+the+cell+cycle+and+trichome+cell+fate+in+Arabidopsis.">GLABROUS1 overexpression and TRIPTYCHON alter the cell cycle and trichome cell fate in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 10 (12), 2047-2062 (1998).</li><li>Melaragno, J. E., Mehrotra, B., Coleman, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+endopolyploidy+and+cell+size+in+epidermal+tissue+of+Arabidopsis.">Relationship between endopolyploidy and cell size in epidermal tissue of Arabidopsis.</a> Plant Cell. 5 (11), 1661-1668 (1993).</li><li>Grafi, G., Larkins, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoreduplication+in+maize+endosperm:+involvement+of+M+phase--promoting+factor+inhibition+and+induction+of+S+phase--related+kinases.">Endoreduplication in maize endosperm: involvement of M phase--promoting factor inhibition and induction of S phase--related kinases.</a> Science. 269 (5228), 1262-1264 (1995).</li><li>Schweizer, L., Yerk-Davis, G., Phillips, R., Srienc, F., Jones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+maize+endosperm+development+and+DNA+endoreduplication.">Dynamics of maize endosperm development and DNA endoreduplication.</a> Proc Natl Acad Sci. 92 (15), 7070-7074 (1995).</li><li>Chen, C. T., Setter, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+of+potato+tuber+cell+division+and+growth+to+shade+and+elevated+CO2.">Response of potato tuber cell division and growth to shade and elevated CO2.</a> Ann Bot. 91 (3), 373-381 (2003).</li><li>Chen, C. T., Setter, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+of+potato+dry+matter+assimilation+and+partitioning+to+elevated+CO2+at+various+stages+of+tuber+initiation+and+growth.">Response of potato dry matter assimilation and partitioning to elevated CO2 at various stages of tuber initiation and growth.</a> Environ Exp Bot. 80, 27-34 (2012).</li><li>Cheniclet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+expansion+and+endoreduplication+show+a+large+genetic+variability+in+pericarp+and+contribute+strongly+to+tomato+fruit+growth.">Cell expansion and endoreduplication show a large genetic variability in pericarp and contribute strongly to tomato fruit growth.</a> Plant Physiol. 139 (4), 1984-1994 (2005).</li><li>Pirrello, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+fruit+developmental+biology+makes+use+of+flow+cytometry+approaches.">How fruit developmental biology makes use of flow cytometry approaches.</a> Cytometry Part A. 85 (2), 115-125 (2014).</li><li>Chevalier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoreduplication+and+fruit+growth+in+tomato:+evidence+in+favour+of+the+karyoplasmic+ratio+theory.">Endoreduplication and fruit growth in tomato: evidence in favour of the karyoplasmic ratio theory.</a> J Exp Bot. 65 (10), 2731-2746 (2014).</li><li>Galbraith, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+flow+cytometric+analysis+of+the+cell+cycle+in+intact+plant+tissues.">Rapid flow cytometric analysis of the cell cycle in intact plant tissues.</a> Science. 220 (4601), 1049-1051 (1983).</li><li>Dole&#382;el, J., Greilhuber, J., Suda, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Cytometry+with+Plants:+An+Overview.">Flow Cytometry with Plants: An Overview.</a> Flow Cytometry with Plant Cells. , 41-65 (2007).</li><li>Dole&#382;el, J., Barto&#353;, J. A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+DNA+flow+cytometry+and+estimation+of+nuclear+genome+size.">Plant DNA flow cytometry and estimation of nuclear genome size.</a> Ann Bot. 95 (1), 99-110 (2005).</li><li>Doke, N., Tomiyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+hyphal+wall+components+from+Phytophthora+infestans+on+protoplasts+of+potato+tuber+tissues.">Effect of hyphal wall components from Phytophthora infestans on protoplasts of potato tuber tissues.</a> Phys Plant Path. 16 (2), 169-176 (1980).</li><li>Davis, D. A., Currier, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+the+phytoalexin+elicitors,+arachidonic+and+eicosapentaenoic+acids,+and+other+unsaturated+fatty+acids+on+potato+tuber+protoplasts.">The effect of the phytoalexin elicitors, arachidonic and eicosapentaenoic acids, and other unsaturated fatty acids on potato tuber protoplasts.</a> Physiol Mol Plant Pathol. 28 (3), 431-441 (1986).</li><li>Laimbeer, F. P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protoplast+isolation+prior+to+flow+cytometry+reveals+clear+patterns+of+endoreduplication+in+potato+tubers,+related+species,+and+some+starchy+root+crops.">Protoplast isolation prior to flow cytometry reveals clear patterns of endoreduplication in potato tubers, related species, and some starchy root crops.</a> Plant Methods. 13 (1), 27 (2017).</li><li>Uijtewaal, B. A., Huigen, D. J., Hermsen, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+potato+monohaploids+(2n=x=12)+through+prickle+pollination.">Production of potato monohaploids (2n=x=12) through prickle pollination.</a> Theor Appl Genet. 73 (5), 751-758 (1987).</li><li>Karp, A., Risiott, R., Jones, M. G. K., Bright, S. W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+doubling+in+monohaploid+and+dihaploid+potatoes+by+regeneration+from+cultured+leaf+explants.">Chromosome doubling in monohaploid and dihaploid potatoes by regeneration from cultured leaf explants.</a> Plant Cell Tiss Org Cult. 3 (4), 363-373 (1984).</li><li>Doke, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+superoxide+anion+by+potato+tuber+protoplasts+during+the+hypersensitive+response+to+hyphal+wall+components+of+Phytophthora+infestans+and+specific+inhibition+of+the+reaction+by+suppressors+of+hypersensitivity.">Generation of superoxide anion by potato tuber protoplasts during the hypersensitive response to hyphal wall components of Phytophthora infestans and specific inhibition of the reaction by suppressors of hypersensitivity.</a> Phys Plant Path. 23 (3), 359-367 (1983).</li><li>Doke, N., Tomiyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+the+hypersensitive+response+of+potato+tuber+protoplasts+to+hyphal+wall+components+by+water+soluble+glucans+isolated+from+Phytophthora+infestans.">Suppression of the hypersensitive response of potato tuber protoplasts to hyphal wall components by water soluble glucans isolated from Phytophthora infestans.</a> Phys Plant Path. 16 (2), 177-186 (1980).</li><li>Saxena, P. K., King, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reuse+of+enzymes+for+isolation+of+protoplasts.">Reuse of enzymes for isolation of protoplasts.</a> Plant Cell Rep. 4 (6), 319-320 (1985).</li><li>Sgorbati, S., Levi, M., Sparvoli, E., Trezzi, F., Lucchini, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytometry+and+flow+cytometry+of+4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole+(DAPI)-stained+suspensions+of+nuclei+released+from+fresh+and+fixed+tissues+of+plants.">Cytometry and flow cytometry of 4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)-stained suspensions of nuclei released from fresh and fixed tissues of plants.</a> Physiol Plant. 68 (3), 471-476 (1986).</li><li>Bhojwani, S. S., Dantu, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+and+cell+culture.">Tissue and cell culture.</a> Plant Tissue Culture: An Introductory Text. , 39-50 (2013).</li><li>Flores, H. E., Kaur-Sawhney, R., Galston, A. W., Maramorosch, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protoplasts+as+Vehicles+for+Plant+Propagation+and+Improvement.">Protoplasts as Vehicles for Plant Propagation and Improvement.</a> Advances in Cell Culture. 1, 241-279 (1981).</li><li>Reeve, R. M., Timm, H., Weaver, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parenchyma+cell+growth+in+potato+tubers+I.+Different+tuber+regions.">Parenchyma cell growth in potato tubers I. Different tuber regions.</a> Am Potato J. 50 (2), 49-57 (1973).</li><li>Scholes, D. R., Paige, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+in+ploidy:+a+generalized+response+to+stress.">Plasticity in ploidy: a generalized response to stress.</a> Trends Plant Sci. 20 (3), 165-175 (2015).</li></ol>

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

ここに提示されたプロトコルは、研究者が変更した携帯コンテンツと増加したセル サイズ一見ジャガイモ塊茎内表現を評価する手段を妨げ他の流れの cytometry 準備を提供します。プロトコルは、核の整合性を維持しながらノイズや破片を削減する手段としてプロトプ ラストの生成に依存します。以前は、研究者は特に反抗的な流れの cytometry のサンプルと同様の準備を説明だけでなく、さまざまな病因19,20などのトピックを勉強する塊茎プロトプ ラストを利用が。しかし、私たちの知識表現を勉強するためのフローサイトメトリーによるこのような塊茎のプロトプ ラストの使用を組み合わせてなし。さらに、私たちは技術と同様、粗野な典型的な準備利用 2 つの塊茎表現6,7を評価するためにのみ他の研究よりもより信頼性の高いするプロトプ ラストの使用を発見しました。ここでのプロトコルは、その実行と試料の調製とそれを用いる典型的な実験結果に潜在的な落とし穴の欠点を議論します。
ユーティリティと塊茎の流れの cytometry のプロトコルの再現性、にもかかわらず議論すべきいくつかの弱点があります。まず、プロトコルは時間がかかり、2 つ夜通し孵化を必要とします。さらに、プロトコルには、いくつかの高価な試薬、特にセルラーゼと macerozyme が必要です。さらに、準備では、多くのイベントが必要な場合は特に、1 日の内でスループットが制限される場合、数時間以内、時間高感度、分解を使用しています。プロトコルを最後に、作成しながら信頼性の高い核と低品質の結果に結果の損傷に見えるすべての試料内のエラーに敏感です。たとえば、不適切な無菌技術による原形質分離と原形質体の生成手順 (1-3.4) 中に微生物汚染が発生します。サンプルについては、成功を常に排除しながら、サンプルの汚染は再び核への損傷をせいでしょう、得られたヒストグラムの品質を劇的に減少させるようです。
前述したように、プロトコルの主要な欠点は、コスト、時間、およびエラーの感度。研究者は、これらの各を軽減する手順を実行するがあります。費用、というは多くのサンプルをプロトコルを適用しようとする研究者がさまざまな組織として酵素濃度および/または消化ステップの期間を変更することを検討することし、応答性の遺伝子型が異なる場合があります。21がここに採用はない実証されて以前 ES をリサイクルし、フィルタ リングの可能性も含まれます。私たちの観測の時間それは最初の潜伏 (原形質分離のステップ) を省略し、まだプロトプ ラスト; を抽出することが可能ただし、整合性と豊かさが低下します、結果に悪影響を及ぼす影響を与えます。サンプルの劣化を低減するには、研究者は、いくつかの流れの cytometry アプローチが22サンプルの整合性を維持するために定着剤 (ホルムアルデヒドなど) の使用を含む検討すること。劣化を防ぐためし、の発表と同じ日に発生するサンプル プロトプ ラストよりもむしろ貯蔵強請とフローサイトメトリーを可能にする両方に便利な手段があります。ES や FBC; ヌクレアーゼ阻害剤を含むように核の離職を防止する別の手段があります。2-メルカプトエタノールは、開発中に顕著な変更を行なわれず、一方、他の阻害剤が本テストされていません。
私たちの観測の単一の最も重要なステップは流れの cytometry バッファー (FCB) を追加する前にすべての原形質分離洗浄ソリューションの手順 4.4、除去です。場合も少量 (< 10 μ L) のまま、サンプルがはるかに貧しいまたはも失敗例につながることができる低下する可能性があります。これは酵素液内不純物による可能性が高い(例えば核酸分解酵素、プロテアーゼ)23,24平均潜伏期と低濃度でも、サンプル実行の間の時間の間に核をすぐに低下します。もう一つの重要な考慮事項は、PI および RNase の潜伏ステップの期間です。前述のプロトコルでは、サンプル残っていない安定した低核から添加 FCB 研究者はサンプル以上の長いフローサイトメトリーに合わせて手順の期間を短縮する可能性がありますので実行される後よりも、数時間の濃度。これもサンプルあたりのイベント数と実行するまたは前述の定着剤の使用を検討するためのサンプルの合計数のトレードオフを検討する研究が必要です。
組織と遺伝子型の違い
プロトコルの結果代表を提供するために組織によって以前に報告された変化を確認し、倍数性と遺伝子多型の影響を検討の 2 つの簡単な実験を考案しました。組織実験の結果は、髄再び発見された最高の EI としてプロトコルが再現可能な結果を生成することを示します。いた以前評価されていない驚くべきこと実質の組織は、皮質組織に似ており力強さよりかなり低い EI 値を持っていた。柔細胞が成熟で少なくとも通常髄または皮質の細胞よりも大きいように、これは予想ではなかったです。1 つの可能な説明は、塊茎 (90-130 g) も完全に膨張し、その最大の C 値25に到達するため、満期時塊茎ボリュームの大部分を構成している柔細胞が成熟したです。これはまた理由を説明するかもしれない確認 (VT_SUP_19) と 2 倍の確認 (VT_SUP_19 4 x) 品種の優れた塊茎; よりも有意に大きい EI を実証ほぼ同じサイズの塊茎は、各遺伝子からサンプリングされた、VT_SUP_19 または同質四倍体の塊茎の最大サイズは、前駆細胞のそれよりもはるかに小さい。したがって、彼らが単に大きい EI を表示されることがあります彼らは、最大達成可能なサイズを基準にして大きかったので。また、違い VT_SUP_19 がその四倍体の前駆細胞から受け取った遺伝的補完の結果であるかもしれない。別の可能性は、確認の抽出、四倍体から発生したゲノムの削減が有害な対立遺伝子の高架の EI26に貢献するまた示されている植物全体の応力の結果をマスク可能性があります。それにもかかわらず、これは慎重に検討研究者が遺伝子型、特に間、EI 値の比較に使用する塊茎と組織を選択するときを施す必要があります示しています。
将来のアプリケーション
この資料に記載されているプロトコルは、ジャガイモの理解表現の研究者の重要なツールを提供します。塊茎組織全体で開発の経過と自然変動の評価研究、表現の遺伝と環境のコンポーネントに可能性があります。最終的には、表現はジャガイモ改善、評価の信頼性の高い手段を必要とする事業のための有望なターゲットをすることができます。

表現は、セルが典型的な細胞周期を好まれる場合、代わりに細胞分裂することがなく DNA 複製の繰り返しラウンドから成る開発の代替コースを受けるプロセス。結果セルが DNA を増加している量と核面積細胞制御、拡張、および専門の役割を果たすと考えられています。一般的に、表現 (、シロイナズナと呼ばれる) および DNA 量の増加に対応のラウンドはより大きいセルのボリュームに関連付けられている、DNA 量を増加した「karyoplasmic 説」の原因となった観測必要です適切大きく、おそらくより複雑なセル1に調節します。この現象は、高等植物、構造/防御 (毛)23,,を含め組織の範囲で観察された一般的な飼料 (トウモロコシの胚乳)4、5、およびシンク/ストレージ (トマト果皮;ジャガイモ塊茎)6,7,8関数。果実、その表現は否定的な表現と果実発育期間9関係によって証明されるように果皮の急速な拡大を促進する役割を果たしているが示唆されています。例えば細胞核 DNA 量トマト果皮8で最大 512 C (半数体のゲノムの 512 倍) が観察されています。さらにシュヴァリエら (2014 年) を示した細胞周期遺伝子の発現の変化が大きいフルーツ10で、結果果皮内の表現のレベルの増加につながることができます。したがって、表現を促進する遺伝子の変化は、バイオマスや植物の繁殖や遺伝的な操作で収量の改善の潜在的なターゲットを提供します。しかし、このような改善は偶発の原因のより深い理解と表現の結果です。
表現よく propidium ヨウ化12 (PI) などの DNA 結合 fluorophore と粗組織準備11, にリリースされた核を培養するというフローサイトメトリーによって測定します。フィルターが適用されたサンプルは、蛍光体に固有の発光波長を観測できる流れの cytometer のレーザーによって渡されます。各イベント (すなわち核) の蛍光強度の直接粒子の DNA 量と相関しています。したがって、既知の標準に比較すると、指定されたサンプル内のセルの相対と絶対の DNA 量を計算することがあります。表現インデックス (EI) は、細胞の DNA の内容 (C 値) 1 C が半数体細胞 (プロトコルの手順 6.7 で提示される式) の DNA の内容を観察することによって発生: サンプル内のセルあたりの平均数を確立することによって決定されます。例えば、二倍体生物の体細胞の DNA の基本内容は 2 c. です。表現の単一の円形に対応する以上、0; に近い EI 必要があるサンプルに 4 C でいくつかのセルがある場合しかしほぼすべての細胞が 4 C EI は約 1 になります。しかし、表現の複数のラウンドはより高い植物観察 EI 値で共通がはるかに大きいかもしれません。表現の指標を計算しながら比較的簡単ですが、それは核の相対的な存在量 C 値が確実に必要とする確認する、特定の種や組織 (ジャガイモ塊茎を含む) には排除します。それは細胞の解剖学、化学または細胞壁組成13の違いが一般的に使用される適切なバッファーに直接核を解放するかみそりの刃を使用して典型的な準備に反抗するこれらのサンプルを引き起こす可能性が高いトマト果皮など組織は、表現のためのモデルは8を研究します。
ジャガイモ, 塊茎内表現の検討は、前述の粗野な準備に一貫性のない結果が得られるよう信頼性の高いプロトコルの欠如の一部でおそらくためだけのカップルの研究に限られています。一方、このようなアプローチは、塊茎サンプル体験劣化や異なる C 値はほぼ不可能の核の構成のピークの分化を作る破片状のノイズの豊富な葉に適しています。これはおそらく、細胞構成と塊茎細胞内細胞の残骸の豊富さの違い (e.g。 デンプン蓄積アミロプ)。このハードルを克服するために我々 は最近ジャガイモ塊茎のフローサイトメトリーの区別可能なピークを取得するためのより信頼性の高いプロトコルを開発しました。各ピーク内細胞の頻度は、異なる遺伝子型または塊茎を構成するさまざまな組織の正確な表現レベルを計算するため使用できます。プロトコルは、変更したプロトプ ラスト抽出法の14,15先行詞を採用して前述の流れ cytometry11、ジャガイモ親戚, 品種および組織16内ではかなりの変動を示した.ここで倍数性、組織、および塊茎の大きさのコンテキストで EI を評価することによって詳細にプロトコルを紹介します。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Serological pipette</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-676-10k</td>
			<td>(sterile)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet Aid XP (autopipettor)</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>4-000-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes (50 ml)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>339652</td>
			<td>(sterile)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes (1.5 ml)</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>111558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes (2 ml)</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>111552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum filtration unit (0.22&#181;m)(aPES)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>564-0020</td>
			<td>(sterile)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum filtration unit (0.45&#181;m)(aPES)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>168-0045</td>
			<td>(sterile)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulase &#34;Onozuka R-10&#34;</td>
			<td>Yakult</td>
			<td></td>
			<td>contact company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macerozyme &#34;Onozuka R-10&#34;</td>
			<td>Yakult</td>
			<td></td>
			<td>contact company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemicellulase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H2125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES buffer</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>172590250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>MP Biochemicals</td>
			<td>194854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride (hexahydrate)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M35-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride (dihydrate)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Mannitol</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>423922500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>17263-0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate (monobasic, anhydrous)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-5379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4170</td>
			<td>For flow cytometry preparations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonuclease A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R5000</td>
			<td>For flow cytometry preparations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cork borers with punch</td>
			<td>American Scientific</td>
			<td>2093-02</td>
			<td>For smapling desired tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16-31</td>
			<td>For smapling desired tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>08-920B</td>
			<td>For smapling desired tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>106um stainless steel mesh or other seive of same pore size</td>
			<td>New Jersey Wire Mesh Co.</td>
			<td></td>
			<td>contact company</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring endoreduplication by flow cytometry of isolated tuber protoplasts

表現、以降分裂することがなく、細胞の核ゲノムの複製 DNA 量の増加と細胞を生成、細胞サイズの特殊化、開発および増加と関連付けられる。植物では、表現は特定の組織や器官の拡大を容易にしましょう。その中で炭水化物ストレージの機能を果たす上でかなり細胞拡張を経るポテト (ジャガイモ) の塊茎です。したがって、表現は、塊茎がこの豊富な炭素を収容することができる方法で重要な役割を果たす可能性があります。ただし、塊茎の粗核分離メソッドから生じる細胞の残骸、葉を効果的に使用することができる方法は、塊茎表現インデックス (EI) の推定をできなくなります。この記事では、異なった遺伝子型から得られる代表的な結果を実証して、塊茎組織を区分化プロトプ ラストの分離により塊茎表現を評価するための手法を示します。プロトコルの主要な制限は、プロトプ ラストの溶解後試料とサンプルの比較的短い寿命のために必要な時間と試薬コストです。プロトコルは技術の変化に敏感ですが、これらの大規模な特殊化した細胞から核分離の従来の方法で改善を表します。酵素、定着剤の使用、等のリサイクルなどのプロトコルへの改善のための可能性を提案します。

プロトプ ラストの生産
プロトプ ラストの生成は、ジャガイモの塊茎、一般的な形態は、図 1に表示されますから繰り返し流れ cytometry 結果を達成するために必要です。研究者は、特にイベントでトラブルシューティングが必要な高品質のプロトプ ラストは、FCP の添加する前に生産されていることを確認するがあります。プロトプ ラストの大半は最低限突起 (図 2) 球形、EI の相違の反射は、おそらくサイズが大きく異なる場合があります。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57134/57134fig2.jpg"> 図 2: 代表的な葉と塊茎プロトプ ラストで取得ステップ プロトコルの 4.4 。プロトプ ラストの分離が球対称プラズマ膜そのまま必要があります。(A ~ C) の葉と塊茎 (D, E) プロトプ ラストと表現のさまざまなレベルを示す可能性のある組織内でサイズの違いの大きさの違いに注意してください。葉プロトプ ラストには葉緑体が含まれている対しアミロプは塊茎プロトプ ラスト内で表示されます。スケール バー = 1,000 μ m.<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57134/57134fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
流れの cytometry の結果の評価
実験の成否は、ピークと流れの cytometry ヒストグラムでの分離の幅から正確に測ることがあります。測定の表現、各ピークの核の相対的な豊かさの計算に必要なピークの単なる存在の有無は不十分であるそれらの間の有意義な境界を描画するあまりにも多くのノイズがある場合。図 3は、流れ cytometry 散布とヒストグラムの両方で発生する可能性の研究者の結果の変化を表示します。失敗したサンプルの潜在的な原因は、議論の中で掲載されています。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57134/57134fig3.jpg"> 図 3: 代表の結果そのままのプロトプ ラストの核のフローサイトメトリーから得られ、髄のサンプルが低下します。そのまま核 (A) 表示各劣化サンプル (B) のピーク表示シフト、幅広く、重なり合って拠点に対し適切なソフトウェアを用いた細胞の相対的な豊かさを定量化するピークの間を明確に分離します。そのまま (C) と劣化 (D) サンプルの散布図、ブラック ボックスはヒストグラムのピークの幅ヒストグラムとイベントのクラスタ リングのゲーティング原子力事象を反映することを示します。門の外のイベントは、破片、荒廃の核、またはその他の集計を示します。PI-H は、任意の単位で測定される蛍光の強度に対応します。テキスト内でサンプル劣化を防ぐためのトラブルシューティング方法を説明します。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57134/57134fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
組織の違いを表現
以前塊茎髄組織ある皮質組織16より表現の非常に高いレベルであることを報告した.確認し、我々 は優れた品種で 3 つの異なったティッシュの表現レベルを見たこの展開: 髄、ー実質、皮質、サンプルごとの 2,000 のゲート イベントで 3 通でレプリケートされます。我々 の結果確認髄組織が 1.79 と 1.12 の発生: の手段で大脳皮質組織よりも有意に大きい EI、セル当たりそれぞれ私たちの以前の観測 (p = 0.018;スチューデントの t 検定)。幾分意外にも、実質組織皮質と同様のプロファイルを実証され、また髄と大幅に異なる (意味 = 1.14; p = 0.013;スチューデントの t 検定)。図 4は、これらの結果をまとめたものです。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57134/57134fig4.jpg"> 図 4: 3 体内における優れた表現します。葉 (A)、塊茎皮質 (B)、(C) の実質と髄 (D) 組織のヒストグラムは、それらのヒストグラムから計算された EI 値と共に表示されます。各ピークを構成する核の相対的な豊かさの違いは容易に明らかに、特に間葉と塊茎の組織です。各ピークの C 値も表示されます。PI-H は、任意の単位で測定される蛍光の強度に対応します。電子印は有意差に塊茎組織の EI の比較が表示されることを意味 (p < 0.05) とエラーバーは標準偏差を示します。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57134/57134fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
塊茎の大きさおよび倍数性の影響
我々 は、特定の遺伝子型の異なるサイズが似たような成熟塊茎が表示されませんでした EI16に対応する違いを報告しました。この結果を確認するだけでなく、倍数性と表現との関係を評価する目的とします。この実験では、3 つの異なる遺伝子型から実質組織の 3 つの複製を使用しました: 品種スーペリアー (4 x)、VT_SUP_19 (2 x) 4 x 2 倍確認である棘受粉17、および VT_SUP_19 によって優れたから抽出されます、確認18 VT_SUP_19 に同質。大きい (90-130 g) と小さいのための複製のセットを含めました (< 35 g) 塊茎収量優れた他の 2 つの品種の塊茎が 90-130 g。塊茎がすべて温室効果すなわち完全な成熟で育てられた植物から採取した植物のトップは senesced。VT_SUP_19 とその前駆スーペリアーの大きな違いを見ました (p = 0.04);しかし、VT_SUP_19 と VT_SUP_19 の間に有意差はありませんでした 4 x (p = 0.69)。これは、ゲノムの低減によるマスクとして表現する可能性が高い遺伝の部品がある間ないによって決まるです倍数、少なくともこの背景を示します。最後に、もう一度は認められなかった大小さまざまな品種間に有意差優れた塊茎図 5に示されているように。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57134/57134fig5.jpg"> 図 5: 品種の優れた (VT_Sup_19) 二倍体と四倍体の塊茎の 2 つのサイズで表現 (VT_Sup_19 4 x) デリバティブ。バーチャートは小型の意味 (< 35 g) 確認 VT_SUP_19 と同質の 2 倍確認 VT_SUP_19 の大きい (90-130 g) 塊茎と同様、大きい (90-130 g) 品種の優れた塊茎および 4 x。有意差 (p < 0.05) 接続の手紙レポートで示されます。エラーバーは標準偏差を表しています。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57134/57134fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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Measuring Endoreduplication by Flow Cytometry of Isolated Tuber Protoplasts

孤立した塊茎プロトプ ラストのフローサイトメトリーによる表現を測定

記載プロトコルは、じゃがいも (ジャガイモ) の塊茎内の表現を測定するための方法です。ノイズや下流フローサイトメトリーによる解析の残骸を減らすため原形質分離と原形質体の抽出手順が含まれています。

Endoreduplication, the replication of a cell's nuclear genome without subsequent cytokinesis, yields cells with increased DNA content and is associated ...

measuring-endoreduplication-flow-cytometry-isolated-tuber

Research

JoVE Journal

Biology

10.1K ビュー.  Virginia Tech. 記載プロトコルは、じゃがいも (ジャガイモ) の塊茎内の表現を測定するための方法です。ノイズや下流フローサイトメトリーによる解析の残骸を減らすため原形質分離と原形質体の抽出手順が含まれています。

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IP-FCM:  Immunoprecipitation Detected by Flow Cytometry

Immunoprecipitation detected by flow cytometry (IP-FCM) is an efficient method for detecting and quantifying protein-protein interactions. The basic principle extends that of sandwich ELISA, wherein the captured primary analyte can be detected together with other molecules physically associated within multiprotein complexes. The procedure involves covalent coupling of polystyrene latex microbeads with immunoprecipitating monoclonal antibodies (mAb) specific for a protein of interest, incubating these beads with cell lysates, probing captured protein complexes with fluorochrome-conjugated probes, and analyzing bead-associated fluorescence by flow cytometry. IP-FCM is extremely sensitive, allows analysis of proteins in their native (non-denatured) state, and is amenable to either semi-quantitative or quantitative analysis. As additional advantages, IP-FCM requires no genetic engineering or specialized equipment, other than a flow cytometer, and it can be readily adapted for high-throughput applications.

The IP-FCM method is presented, which allows a sensitive, robust, biochemical assessment of native protein-protein interactions, without requiring genetic engineering or large sample sizes.

IP - FCM：フローサイトメトリーにより検出免疫沈降

Immunoprecipitation detected by flow cytometry (IP-FCM) is an efficient method for detecting and quantifying protein-protein interactions. The basic ...

生物学

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces glucose uptake by insulin-sensitive tissues, most notably the brain, skeletal muscle, and adipocytes. Patients suffering from type-2 diabetes and/or obesity often develop insulin resistance and are unable to control their glucose homeostasis. New insights into the mechanisms of insulin resistance may provide new treatment strategies for type-2 diabetes.
The GLUT family of glucose transporters consists of thirteen members distributed on different tissues throughout the body1. Glucose transporter type 4 (GLUT4) is the major transporter that mediates glucose uptake by insulin sensitive tissues, such as the skeletal muscle. Upon binding of insulin to its receptor, vesicles containing GLUT4 translocate from the cytoplasm to the plasma membrane, inducing glucose uptake. Reduced GLUT4 translocation is one of the causes of insulin resistance in type-2 diabetes2,3.
The translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane can be visualized by immunocytochemistry, using fluorophore-conjugated GLUT4-specific antibodies.
Here, we describe a technique to quantify total amounts of GLUT4 translocation to the plasma membrane of cells during a chosen duration, using flow cytometry. This protocol is rapid (less than 4 hours, including incubation with insulin) and allows the analysis of as few as 3,000 cells or as many as 1 million cells per condition in a single experiment. It relies on anti-GLUT4 antibodies directed to an external epitope of the transporter that bind to it as soon as it is exposed to the extracellular medium after translocation to the plasma membrane.

This protocol describes a rapid technique to quantify the translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane of cells by flow cytometry.

フローサイトメトリーによる細胞膜へのGLUT4転の定量的測定

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

マウス減数分裂細胞のフローサイトメトリーの精製

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Measuring Cell Cycle Progression Kinetics with Metabolic Labeling and Flow Cytometry

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating cells. Cell cycle division is an integral part of growth and reproduction and deregulation of key cell cycle components have been implicated in the precipitating events of carcinogenesis 1,2. Molecular agents in anti-cancer therapies frequently target biological pathways responsible for the regulation and coordination of cell cycle division 3. Although cell cycle kinetics tend to vary according to cell type, the distribution of cells amongst the four stages of the cell cycle is rather consistent within a particular cell line due to the consistent pattern of mitogen and growth factor expression. Genotoxic events and other cellular stressors can result in a temporary block of cell cycle progression, resulting in arrest or a temporary pause in a particular cell cycle phase to allow for instigation of the appropriate response mechanism. 
The ability to experimentally observe the behavior of a cell population with reference to their cell cycle progression stage is an important advance in cell biology. Common procedures such as mitotic shake off, differential centrifugation or flow cytometry-based sorting are used to isolate cells at specific stages of the cell cycle 4-6. These fractionated, cell cycle phase-enriched populations are then subjected to experimental treatments. Yield, purity and viability of the separated fractions can often be compromised using these physical separation methods. As well, the time lapse between separation of the cell populations and the start of experimental treatment, whereby the fractionated cells can progress from the selected cell cycle stage, can pose significant challenges in the successful implementation and interpretation of these experiments.
Other approaches to study cell cycle stages include the use of chemicals to synchronize cells. Treatment of cells with chemical inhibitors of key metabolic processes for each cell cycle stage are useful in blocking the progression of the cell cycle to the next stage. For example, the ribonucleotide reductase inhibitor hydroxyurea halts cells at the G1/S juncture by limiting the supply of deoxynucleotides, the building blocks of DNA. Other notable chemicals include treatment with aphidicolin, a polymerase alpha inhibitor for G1 arrest, treatment with colchicine and nocodazole, both of which interfere with mitotic spindle formation to halt cells in M phase and finally, treatment with the DNA chain terminator 5-fluorodeoxyridine to initiate S phase arrest 7-9. Treatment with these chemicals is an effective means of synchronizing an entire population of cells at a particular phase. With removal of the chemical, cells rejoin the cell cycle in unison. Treatment of the test agent following release from the cell cycle blocking chemical ensures that the drug response elicited is from a uniform, cell cycle stage-specific population. However, since many of the chemical synchronizers are known genotoxic compounds, teasing apart the participation of various response pathways (to the synchronizers vs. the test agents) is challenging. 
Here we describe a metabolic labeling method for following a subpopulation of actively cycling cells through their progression from the DNA replication phase, through to the division and separation of their daughter cells. Coupled with flow cytometry quantification, this protocol enables for measurement of kinetic progression of the cell cycle in the absence of either mechanically- or chemically- induced cellular stresses commonly associated with other cell cycle synchronization methodologies 10. In the following sections we will discuss the methodology, as well as some of its applications in biomedical research.

Tracking subtle changes in the progression and kinetics of cell cycle stages can be accomplished by use of a combination of metabolic labeling of nucleic acids with BrdU and total genomic DNA staining via Propidium Iodide. This method avoids the need of chemical synchronization of cycling cells, thereby preventing the introduction of non-specific DNA damage, which in turn affects cell cycle progression.

代謝標識とフローサイトメトリーで細胞周期の進行速度を測定

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of different cell types in vitro and in vivo.1-5 Although there are literally thousands of publications using such dyes, some of the most commonly encountered cell tracking applications include monitoring of:
<ol>
	<li>stem and progenitor cell quiescence, proliferation and/or differentiation6-8</li>
	<li>antigen-driven membrane transfer9 and/or precursor cell proliferation3,4,10-18 and</li>
	<li>immune regulatory and effector cell function1,18-21.</li>
</ol>
Commercially available cell tracking dyes vary widely in their chemistries and fluorescence properties but the great majority fall into one of two classes based on their mechanism of cell labeling. "Membrane dyes", typified by PKH26, are highly lipophilic dyes that partition stably but non-covalently into cell membranes1,2,11. "Protein dyes", typified by CFSE, are amino-reactive dyes that form stable covalent bonds with cell proteins4,16,18. Each class has its own advantages and limitations. The key to their successful use, particularly in multicolor studies where multiple dyes are used to track different cell types, is therefore to understand the critical issues enabling optimal use of each class2-4,16,18,24.
The protocols included here highlight three common causes of poor or variable results when using cell-tracking dyes. These are:
<ol>
	<li>Failure to achieve bright, uniform, reproducible labeling. This is a necessary starting point for any cell tracking study but requires attention to different variables when using membrane dyes than when using protein dyes or equilibrium binding reagents such as antibodies.</li>
	<li>Suboptimal fluorochrome combinations and/or failure to include critical compensation controls. Tracking dye fluorescence is typically 102 - 103 times brighter than antibody fluorescence. It is therefore essential to verify that the presence of tracking dye does not compromise the ability to detect other probes being used.</li>
	<li>Failure to obtain a good fit with peak modeling software. Such software allows quantitative comparison of proliferative responses across different populations or stimuli based on precursor frequency or other metrics. Obtaining a good fit, however, requires exclusion of dead/dying cells that can distort dye dilution profiles and matching of the assumptions underlying the model with characteristics of the observed dye dilution profile.</li>
</ol>
Examples given here illustrate how these variables can affect results when using membrane and/or protein dyes to monitor cell proliferation.

Successful use of cell tracking dyes to monitor immune cell function and proliferation involves several critical steps. We describe methods for: 1) obtaining bright, uniform, reproducible label-ing with membrane dyes; 2) selecting fluorochromes and data acquisition conditions; and 3) choosing a model to quantify cell proliferation based on dye dilution.

細胞トラッキング染料を使用して細胞分裂監視のための最適化された染色と増殖モデリング方法

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is a simple and very efficient method for the determination of the osmotic water permeability coefficient (Pf) in plant protoplasts, applicable in principle also to other spherical cells such as frog oocytes. The first step of the assay is the isolation of protoplasts from the plant tissue of interest by enzymatic digestion into a chamber with an appropriate isotonic solution. The second step consists of an osmotic challenge assay: protoplasts immobilized on the bottom of the chamber are submitted to a constant perfusion starting with an isotonic solution and followed by a hypotonic solution. The cell swelling is video recorded. In the third step, the images are processed offline to yield volume changes, and the time course of the volume changes is correlated with the time course of the change in osmolarity of the chamber perfusion medium, using a curve fitting procedure written in Matlab (the &#8216;PfFit&#8217;), to yield Pf.

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the osmotic water permeability coefficient (Pf) of cells can help understand the regulatory mechanisms of aquaporins (AQPs). Pf determination in spherical plant cell protoplasts presented here involves protoplasts isolation and numerical analysis of their initial rate of volume change as a result of an osmotic challenge during constant bath perfusion.

浸透水透過係数（Pの測定<sub&gt; F</sub&gt;）球状細胞の：例として単離された植物プロトプラスト

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial function, cell death, cell metabolism and cell migration to name but a few. Cytosolic calcium is normally maintained at low nanomolar concentrations; rather it is found in high micromolar to millimolar concentrations in the endoplasmic reticulum, mitochondrial matrix and the extracellular compartment. Upon stimulation, a transient increase in cytosolic calcium serves to signal downstream events. Detecting changes in cytosolic calcium is normally performed using a live cell imaging set up with calcium binding dyes that exhibit either an increase in fluorescence intensity or a shift in the emission wavelength upon calcium binding. However, a live cell imaging set up is not freely accessible to all researchers. Alternative detection methods have been optimized for immunological cells with flow cytometry and for non-immunological adherent cells with a fluorescence microplate reader. Here, we describe an optimized, simple method for detecting changes in epithelial cells with flow cytometry using a single wavelength calcium binding dye. Adherent renal proximal tubule epithelial cells, which are normally difficult to load with dyes, were loaded with a fluorescent cell permeable calcium binding dye in the presence of probenecid, brought into suspension and calcium signals were monitored before and after addition of thapsigargin, tunicamycin and ionomycin.

Calcium is involved in numerous physiological and pathophysiological signaling pathways. Live cell imaging requires specialized equipment and can be time consuming. A quick, simple method using a flow cytometer to determine relative changes in cytosolic calcium in adherent epithelial cells brought into suspension was optimized.

フローサイトメトリーによる腎上皮細胞における細胞質ゾルカルシウム測定

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...

Immunodetection of Outer Membrane Proteins by Flow Cytometry of Isolated Mitochondria

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and pathophysiology. This protocol describes a technique where mitochondria isolated from rodent tissue are immunolabeled and analyzed by flow cytometry. Mitochondria are isolated from rodent spinal cords and subjected to a rapid enrichment step so as to remove myelin, a major contaminant of mitochondrial fractions prepared from nervous tissue. Isolated mitochondria are then labeled with an antibody of choice and a fluorescently conjugated secondary antibody. Analysis by flow cytometry verifies the relative purity of mitochondrial preparations by staining with a mitochondrial specific dye, followed by detection and quantification of immunolabeled protein. This technique is rapid, quantifiable and high-throughput, allowing for the analysis of hundreds of thousands of mitochondria per sample. It is applicable to assess novel proteins at the mitochondrial surface under normal physiological conditions as well as the proteins that may become mislocalized to this organelle during pathology. Importantly, this method can be coupled to fluorescent indicator dyes to report on certain activities of mitochondrial subpopulations and is feasible for mitochondria from the central nervous system (brain and spinal cord) as well as liver.

Described here is a method to detect and quantify mitochondrial outer membrane proteins by immunolabeling of mitochondria isolated from rodent tissue and analysis by flow cytometry. This method can be extended to assess functional aspects of mitochondrial subpopulations.

単離されたミトコンドリアのフローサイトメトリーによる外膜タンパク質の免疫検出

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and ...

LED Thermo Flow &#8212; Combining Optogenetics with Flow Cytometry

Optogenetic tools allow isolated, functional investigations of almost any signaling molecule within complex signaling pathways. A major obstacle is the controlled delivery of light to the cell sample and hence the most popular tools for optogenetic studies are microscopy-based cell analyses and in vitro experiments. The flow cytometer has major advantages over a microscope, including the ability to rapidly measure thousands of cells at single cell resolution. However, it is not yet widely used in optogenetics. Here, we present a device that combines the power of optogenetics and flow cytometry: the LED Thermo Flow. This device illuminates cells at specific wavelengths, light intensities and temperatures during flow cytometric measurements. It can be built at low cost and be used with most common flow cytometers. To demonstrate its utility, we characterized the photoswitching kinetics of Dronpa proteins in vivo and in real time. This protocol can be adapted to almost all optically controlled substances and substantially expands the set of possible experiments. More importantly, it will greatly simplify the discovery and development of new optogenetic tools.

Optically controlled substances are powerful tools to study signaling pathways. To expand the spectrum of possible experiments, we developed a device for studying optically controlled substances in real time using flow cytometry: the LED Thermo Flow.

LEDサーモフロー - フローサイトメトリーで光遺伝学を組み合わせます

Optogenetic tools allow isolated, functional investigations of almost any signaling molecule within complex signaling pathways. A major obstacle is the ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to the analysis of a few fluorochromes, currently there are dozens of different fluorescent dyes, and up to 14-18 different dyes can be combined at a time. However, several limitations still impair the analytical capabilities. Because of the multiplicity of fluorescent probes, data analysis has become increasingly complex due to the need of large, multi-parametric compensation matrices. Moreover, mutant mouse models carrying fluorescent proteins to detect and trace specific cell types in different tissues have become available, so the analysis (by flow cytometry) of auto-fluorescent cell suspensions obtained from solid organs is required. Spectral flow cytometry, which distinguishes the shapes of emission spectra along a wide range of continuous wavelengths, addresses some of these problems. The data is analyzed with an algorithm that replaces compensation matrices and treats auto-fluorescence as an independent parameter. Thus, spectral flow cytometry should be capable of discriminating fluorochromes with similar emission peaks and can provide a multi-parametric analysis without compensation requirements.
This protocol describes the spectral flow cytometry analysis, allowing for a 21-parameter (19 fluorescent probes) characterization and the management of an auto-fluorescent signal, providing high resolution in minor population detection. The results presented here show that spectral flow cytometry presents advantages in the analysis of cell populations from tissues difficult to characterize in conventional flow cytometry, such as the heart and the intestine. Spectral flow cytometry thus demonstrates the multi-parametric analytical capacity of high-performing conventional flow cytometry without the requirement for compensation and enables auto-fluorescence management.

This article describes spectral cytometry, a new approach in flow cytometry that uses the shapes of emission spectra to distinguish fluorochromes. An algorithm replaces compensations and can treat auto-fluorescence as an independent parameter. This new approach allows for the proper analysis of cells isolated from solid organs.

スペクトラルフローサイトメトリーにより固形組織から単離された細胞懸濁液の分析

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...

孤立した塊茎プロトプラストのフローサイトメトリーによる表現を測定

要約

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IP - FCM：フローサイトメトリーにより検出免疫沈降

フローサイトメトリーによる細胞膜へのGLUT4転の定量的測定

マウス減数分裂細胞のフローサイトメトリーの精製

代謝標識とフローサイトメトリーで細胞周期の進行速度を測定

細胞トラッキング染料を使用して細胞分裂監視のための最適化された染色と増殖モデリング方法

浸透水透過係数（Pの測定

フローサイトメトリーによる腎上皮細胞における細胞質ゾルカルシウム測定

単離されたミトコンドリアのフローサイトメトリーによる外膜タンパク質の免疫検出

LEDサーモフロー - フローサイトメトリーで光遺伝学を組み合わせます

スペクトラルフローサイトメトリーにより固形組織から単離された細胞懸濁液の分析

孤立した塊茎プロトプ ラストのフローサイトメトリーによる表現を測定

要約

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IP - FCM：フローサイトメトリーにより検出免疫沈降

フローサイトメトリーによる細胞膜へのGLUT4転の定量的測定

マウス減数分裂細胞のフローサイトメトリーの精製

代謝標識とフローサイトメトリーで細胞周期の進行速度を測定

細胞トラッキング染料を使用して細胞分裂監視のための最適化された染色と増殖モデリング方法

浸透水透過係数（Pの測定

フローサイトメトリーによる腎上皮細胞における細胞質ゾルカルシウム測定

単離されたミトコンドリアのフローサイトメトリーによる外膜タンパク質の免疫検出

LEDサーモフロー - フローサイトメトリーで光遺伝学を組み合わせます

スペクトラルフローサイトメトリーにより固形組織から単離された細胞懸濁液の分析

孤立した塊茎プロトプラストのフローサイトメトリーによる表現を測定