この作品は、イーグルスイノベーションアワード（イーグルスの友愛会）でとメイヨー財団によってサポートされていました。

天然のタンパク質-タンパク質相互作用およびフローサイトメトリーによる多タンパク質複合体の高感度検出と定量分析：**このビデオプロトコルは、関連する出版物1に基づいています 。アダムG. Schrum、ダイアナギル、エレインP.ドップァー、デビッドL.ウィースト、ローレンスA.ツルカ、ヴォルフガングWA Schamel、エドパーマー。科学のSTKE 2007（389）：PL2 2007年6月5日、[DOI：10.1126/stke.3892007pl2]。 <a href="http://stke.sciencemag.org/cgi/content/abstract/2007/389/pl2">この文書を見るにはここをクリックしてください</a> 。 起動する前に、次の水性ストック溶液を準備します。 <table><tbody><tr><td> MESカップリングバッファ： </td><td> 25℃で保存 </td></tr><tr><td> MES、pH6.0の</td><td> 50mMの</td></tr><tr><td> EDTA </td><td> 1mMの</td></tr><tr><td> / /ストレージ（QBS）ブロッキングバッファー消光： </td><td> 4℃で </td></tr><tr><td> BSA </td><td>一パーセント</td></tr><tr><td>アジ化ナトリウム</td><td> 0.02パーセント</td></tr><tr><td> PBS、pH7.4の</td><td> 1X </td></tr><tr><td> FCMバッファー： </td><td> 4℃で </td></tr><tr><td>トリス、pH7.4の</td><td> 50mMの</td></tr><tr><td> NaClの</td><td> 100mMの</td></tr><tr><td>アジ化ナトリウム</td><td> 0.02パーセント</td></tr><tr><td> FBS </td><td> 5パーセント</td></tr><tr><td> PBS、pH7.4の</td><td> 1X </td></tr></tbody></table>すぐに使用する前の準備： <table><tbody><tr><td> EDAC - MES： </td><td> MESカップリングバッファーで50 mg / mLのEDACの粉を溶かし</td></tr><tr><td> ジギトニン溶液（2％w / v）の： </td><td> 95に加熱することによってのdH 2 Oでジギトニンの粉を溶かし℃で5分間、氷上に冷却</td></tr><tr><td> 溶解バッファー： </td><td></td></tr><tr><td>トリス、pH7.4の</td><td> 50mMの</td></tr><tr><td> NaClの</td><td> 150 mmの</td></tr><tr><td>ジギトニンのソリューション</td><td>一パーセント</td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤</td><td> 1X </td></tr><tr><td> 氷上に置きます </td><td></td></tr></tbody></table> 1。ビーズに抗体のカップリング<ol><li> PBSで希釈し、血球計でカウントすることにより、購入した株式からビーズの濃度を決定する。カウントのためのビーズの1:10000希釈で始まります。 </li><li>ピペット18 1.5 mLのマイクロ遠心チューブに× 10 6ビーズ。 </li><li>各洗浄後25℃で3分間、20,000 G · Cで遠心分離、0.5〜1.0mLのMESのカップリングバッファーでビーズを2〜3回洗浄する。 </li><li> 50μLMESのカップリングバッファーでビーズを再懸濁します。 </li><li>作りたてのEDAC - MESの20μLを加えることにより、ビーズ上のカルボキシル基を活性化する。 </li><li> 25℃を手動ピペッティングで15分間穏やかに混合する。 </li><li> 25℃で3分間、20,000 gで遠心分離° Cを各洗浄後、0.5〜1.0mLのPBS中で活性化ビーズを2〜3回洗浄する。 </li><li> 50μLのPBSで活性化ビーズを再懸濁します。 </li><li>活性化ビーズソリューションにIPモノクローナル抗体（0.2〜1.0 mg / mLの原液濃度で）を50μLを加える。 </li><li>振動シェーカーにチューブを配置することにより25℃で3〜4時間のミックス。チューブの底にビーズの沈降を防止するために十分にシェイク。 </li><li>ウォッシュ抗体結合ビーズは0.5〜1.0mLのPBSで2〜3倍は、各洗浄後25℃で3分間、20,000 gで° C遠心分離。 </li><li> 100μLQBSバッファーでビーズを再懸濁します。これらは、4℃で保存することができます</li><li>ビーズを一時停止するだけでなく、PBSで1:200-1:10,000を希釈し、血球計でカウント。濃度は、それぞれのIPまたは、プルダウン実験に使用したビーズの数を正確に制御できるように、各分取バッチを測定する必要があります。 </li></ol> 2。ポスト核ライセートの調製とIP 溶解法と最適な溶解条件は、細胞の種類や検査中のタンパク質 - タンパク質相互作用に依存します。多数のプロトコルが存在し、アプリケーションに変更することができます。 <ol><li>氷上で20分を1.5 mLのマイクロ遠心チューブに100μLの新鮮な溶解バッファーで、そのようなリンパ球、または5のような20 × 10 6&#39;small&#39;は細胞を、このようなマクロファージや腫瘍細胞など× 10 6&#39;大&#39;細胞を、溶解する。必要に応じて溶解量を拡大縮小します。 </li><li>核と不溶性の細胞残渣を除去するために、4℃で10分間、20,000 gでライセートを遠心上清をキープし、ペレットを捨てる。 </li><li>ミックスに軽くピペッティング0.5 × 10清澄溶解液5〜2.5 × 10 5抗体結合ビーズを追加します。我々の目的で使用する最小量単一のIPを実行するには、5μLです。 </li><li>寒い部屋で一晩に垂直な回転する車輪の上に置いて4時間。セトリングからビーズを防ぐのに十分な速度に設定します。それは、回転中にチューブの底に残っている少量のIPの液体に対して許容可能である。 </li></ol> 3。蛍光標識抗体とビーズに捕捉されたタンパク質のプロービング<ol><li> 4で20,000 gで遠心分離° Cを各洗浄後に3分間、0.2〜1.0mLの氷冷FCMバッファーのIPビーズを2回洗浄する。 </li><li>五人以上、1.5 mLのマイクロ遠心チューブまたは煙突、底板の各ウエルに100μLのFCMバッファー、アリコート20μlにビーズを再懸濁します。 </li><li>サンプルに蛍光色素標識モノクローナル抗体を追加。 FCMは、ベンダーの指示に従ってまたは経験的に決定した濃度に応じて染色行います。出発点として、チューブごと、またはよく株式の抗体溶液の0.2〜1μLを（0.2〜1.0 mg / mLの時）に追加し、氷上で40分間インキュベートする。 </li><li>ウォッシュは4で20,000 gで遠心分離、1.0 mlの氷冷したFCMバッファーに1.5 mlチューブに2回ビーズをプローブ·各洗浄後の3分間。優しくビーズを乱さないように注意しながら、それぞれの洗浄の後に上清を取り除く。煙突底板の場合は、4℃で5分間千グラムで遠心分離、0.2mLの氷冷FCMバッファーで2回洗浄° Cを各洗浄後。マルチチャンネルピペッターは、このステップに便利です。煙突の底板にビーズから上清を除去するには、&quot;フリック&quot;プレートは一度、その後、まだ逆さにしながら、井戸の端から任意のしずくを汚点。各ウェル内の残留量は、ビーズを含む、約20μLになります。 </li><li>サンプルあたり200μLのFCMバッファーでビーズを再懸濁します。というラベルのFACSチューブに移す。現在、サンプルFCMのための準備が整いました。 </li></ol> 4。 FCM取得このプロトコルで説明されているCMLのビーズは、直径3〜5μmの、静止マウスのリンパ球の約半分の直径です。そのため、手動でスケールを登録するためにビーズのイベントの集団のために前方散乱光（FSC）アンプゲインと側方散乱光（SSC）の電圧を増加させる必要があるかもしれません。個々のIPのビーズは、単一のしっかりとクラスタ化された人口を形成すべきである。設定とゲートがビーズダブレットと破片を除外するように調整する必要があります。 <ol><li>ビーズやビーズの基準を実行する前に、いくつかのメーターに試料導入口を囲む滴封じ込めのスリーブを取り外します。これは入口をクリアし、別のサンプルから引き継がれてからビーズを防止するようにシース液は、サンプル間に滴下することができます。 </li><li>両方否定的と肯定的な蛍光が極端に対数x軸で同時に表示されるように設定を調整するためにラベルのないビーズ、蛍光のネガティブコントロール、そして虹のキャリブレーション粒子（RCPs）、蛍光の陽性コントロールを、使用してください。これは、実験試料からの蛍光は、また規模になることが保証されます。 FSCとSSCのパラメータは、そう、RCPsはCMLのビーズよりも小さいことに注意して、同様にゲートの位置、一時的にそのサンプルのため変更する必要があるかもしれません。 </li><li> RCPsとキャリブレーションが完了すると、ラベルの付いていないビーズの設定に戻ります。サンプルごとに1つの蛍光プローブが使用されている場合、蛍光補正は必要ありません。一般的に、我々は、FCMのサンプルごとに単一の蛍光色素標識モノクローナル抗体を持つ多タンパク質複合体の検出を行ない、我々は、様々なサブユニットの特異的mAbでパラレルビーズ試料を染色することによって、複数の相互作用パートナーを調べる。 </li><li>蛍光データファイルを取得して保存。分析は、フローサイトメトリーのようなCellQuest、FlowJoなどのソフトウェア、またはCFlowを使用して実行することができます。 </li></ol> 5。代表的な結果<img src="/files/ftp_upload/2066/2066fig1.jpg" alt="図1" /> 図1。マウス系統BALB / cからTCR/CD3多タンパク質複合体のためのIP - FCM。T細胞は1％ジギトニンで溶解し、ライセートを抗CD3εのビーズを使用してIP - FCMを行った。キャプチャされた複合体は、TCR -β（紫の領域）の有意な量を含んでおり、共同で関連したCD3 -ε（緑）、それに近いバックグラウンドレベルに（無関係の免疫グロブリンのプローブ、ピンクのトレースによって定義される）などThy1.2のような他のタンパク質のCD45、またはH - 2K（D）（茶色、オレンジ、そして青のトレース、それぞれ）。同様の以前に公表された結果1-6を参照してください。

<ol>
	<li>Schrum, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-sensitivity+detection+and+quantitative+analysis+of+native+protein-protein+interactions+and+multiprotein+complexes+by+flow+cytometry.">High-sensitivity detection and quantitative analysis of native protein-protein interactions and multiprotein complexes by flow cytometry.</a> Sci STKE. , pl2-pl2 (2007).</li><li>Schrum, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+multiprotein+complexes+by+flow+cytometry.">Visualization of multiprotein complexes by flow cytometry.</a> Curr Protoc Immunol. Chapter 5, 9-9 (2009).</li><li>Teixeiro, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+division+and+death+are+segregated+by+mutation+of+TCRbeta+chain+constant+domains.">T cell division and death are segregated by mutation of TCRbeta chain constant domains.</a> Immunity. 21, 515-526 (2004).</li><li>Teixeiro, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+T+Cell+receptor+signals+determine+CD8++memory+versus+effector+development.">Different T Cell receptor signals determine CD8+ memory versus effector development.</a> Science. 323, 502-505 (2009).</li><li>Treves, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Junctate+is+a+key+element+in+calcium+entry+induced+by+activation+of+InsP3+receptors+and/or+calcium+store+depletion.">Junctate is a key element in calcium entry induced by activation of InsP3 receptors and/or calcium store depletion.</a> J Cell Biol. 166, 537-548 (2004).</li><li>Gil, D., Schrum, A. G., Alarcon, B., Palmer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+receptor+engagement+by+peptide-MHC+ligands+induces+a+conformational+change+in+the+CD3+complex+of+thymocytes.">T cell receptor engagement by peptide-MHC ligands induces a conformational change in the CD3 complex of thymocytes.</a> J Exp Med. 201, 517-522 (2005).</li></ol>

タンパク質 - タンパク質相互作用に関する情報は、このようなシグナル伝達、系統の成熟、細胞周期の進行、およびアポトーシスのカスケードのような多くの細胞プロセスの分析との関連性が高いです。 IP - FCMは、タンパク質の相互作用を調べたり、その本来のコンフォメーションで多タンパク質複合体のメンバーを定義するために、迅速な定量的、かつ高感度な方法を提供します。ビーズが結合し、細胞溶解物と共にインキュベートした一日にしてプローブと次の日に分析することができますすることができます。 96ウェルプレートフォーマットでは、統計的またはスクリーニングpurposesのために効率的なデータ収集を提供するために、一度に分析するサンプルの大規模な数値を可能にする。蛍光ビーズの基準を使用して、それぞれのビーズによって捕捉されたタンパク質の数を推定することができる。非常に小さなソースの材料は、捕捉および検出のために必要ですので、限られたサンプルと希少な検体は、依然として、複数の相互作用を分析することができます。 IP - FCMは、非生理的環境でのタンパク質の遺伝子工学、エピトープタギング、変性、またはインビトロでのミキシングを必要としないが、それはそれへの適用性を持つ貴重なとアクセス可能なツールとなって、これらと他の技術と組み合わせて使用することができます多くの生物学的システム。 トラブルシューティング： 多くのIP - FCMの実験では、有用なタンパク質相互作用のデータに彼らが試みている初めてを生成します。しかし、IP - FCMの最適化は、ビーズ、タンパク質複合体のキャプチャ、および結合性蛍光プローブに抗体結合を向上させることができます。 IP抗体結合の効率は、抗免疫グロブリン抗体と直接結合したビーズをプローブによって決定することができる。この効率性が低い場合は、カップリング反応時の抗体の濃度を増加させるとより多くのIP抗体は、それぞれのビーズに接続できるようにすることができます。これは、分析対象物の拡張された捕捉および検出の結果、IPビーズバッチの結合容量を増やすことができます。これらはビーズ添付ファイルと低い抗体の結合の結果のモノクローナル抗体と競合できるように他の主要なアミン含有分子（例えば、トリス、ウシ血清アルブミン）は、カップリング反応の間に存在すべきではない。ビーズへの抗体の結合は、他の理由から問題が判明した場合、ビーズの代わりにアビジン/ストレプトアビジンに結合することができ、そしてビオチン化抗体は、その後に非共有結合とimmunprecipitationに使用することができます。 良い抗体結合にもかかわらず、ビーズ関連蛍光の最初の検出は、低い可能性があります。最初に、複雑なキャプチャ自体は低いかもしれない。 IP - FCMは、ユニットの溶解体積あたりの溶解した細胞の数を増やし、検体の濃度に依存するため、分析物捕捉および検出を向上させることができます。さらに、キャプチャは、キャプチャが少ないビーズ間の複合体、およびプローブビーズ当たりの増加の平均蛍光の結果を配布ライセート、とインキュベートIPビーズの数を減らすことで改善されることがあります。第二に、それは、キャプチャされた複合体へのプローブの抗体のアクセスが立体的に免疫沈降抗体によって阻害されている可能性があります。この場合、問題は、および/またはプローブをキャプチャする別の抗体を使用して対処することができます。

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>carboxylate-modified polystyrene latex (CML) beads (5mm surfactant-free)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Interfacial Dynamics Corporation/Molecular Probes</td>
<td>2-5000</td>
<td>Store at 4&deg;C.</td>
</tr>
<tr>
<td>Rainbow Calibration Particles</td>
<td>Reagent</td>
<td>Spherotech, Inc.</td>
<td>RCP-30-5A</td>
<td>Store at 4&deg;C.</td>
</tr>
<tr>
<td>2-[N-Morpholino] ethanesulfonic acid (MES)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>M-5287</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropl) carbodiimide HCl (EDAC)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Pierce Sigma</td>
<td>22980 E-6383</td>
<td>Store at -20&deg;C under desiccating conditions.</td>
</tr>
<tr>
<td>Protease Inhibitor General Use Cocktail, containing AEBSF, Bestatin, Aprotinin, EDTA, E-64, and Leupeptin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P-2714</td>
<td> Prepare 100x stock solution in H2O. Aliquot and store at -20&deg;C. Handle with gloves.</td>
</tr>
<tr>
<td>PCR plates, 96-well 0.2mL, natural, tall chimney</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher</td>
<td>08-408-230</td>
<td>For use in place of microcentrifuge tubes during FCM staining</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

ip-fcm:  immunoprecipitation detected by flow cytometry

フローサイトメトリー（IP - FCM）によって検出された免疫沈降はタンパク質 - タンパク質相互作用を検出および定量するための効率的な方法です。基本的な原理は、キャプチャされた主な分析対象物が物理的に多タンパク質複合体の中で関連する他の分子と一緒に検出できる特徴と、サンドイッチELISAのことを拡張します。手順は、細胞ライセートでこれらのビーズをインキュベート蛍光標識プローブで捕捉タンパク質複合体をプロービングし、フローサイトメトリーによってビーズに関連した蛍光を分析する、目的のタンパク質に特異的なモノクローナル抗体（mAb）を免疫沈降したポリスチレンラテックスビーズの共有結合を含む。 IP - FCMは、非常に敏感であり、そのネイティブ（非変性）状態でのタンパク質の解析を可能にし、どちらかの半定量的または定量分析に適している。追加の利点として、IP - FCMは、フローサイトメーター以外の遺伝子工学や特殊な機器を、必要としない、そしてそれは容易に高スループットのアプリケーションに適合させることができる。

Watch this Scientific Journal Video about IP-FCM:  Immunoprecipitation Detected by Flow Cytometry at JoVE.com

IP-FCM:  Immunoprecipitation Detected by Flow Cytometry

IP - FCM法は、遺伝子工学や大規模なサンプルサイズを必要とせず、天然のタンパク質 - タンパク質相互作用の敏感な、堅牢な、生化学的評価を可能にする、提示される。

IP - FCM：フローサイトメトリーにより検出免疫沈降

Immunoprecipitation detected by flow cytometry (IP-FCM) is an efficient method for detecting and quantifying protein-protein interactions. The basic ...

ip-fcm-immunoprecipitation-detected-by-flow-cytometry

Research

JoVE Journal

Biology

17.4K ビュー.  Mayo Clinic. IP - FCM法は、遺伝子工学や大規模なサンプルサイズを必要とせず、天然のタンパク質 - タンパク質相互作用の敏感な、堅牢な、生化学的評価を可能にする、提示される。

ビデオ: IP-FCM:  Immunoprecipitation Detected by Flow Cytometry

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces glucose uptake by insulin-sensitive tissues, most notably the brain, skeletal muscle, and adipocytes. Patients suffering from type-2 diabetes and/or obesity often develop insulin resistance and are unable to control their glucose homeostasis. New insights into the mechanisms of insulin resistance may provide new treatment strategies for type-2 diabetes.
The GLUT family of glucose transporters consists of thirteen members distributed on different tissues throughout the body1. Glucose transporter type 4 (GLUT4) is the major transporter that mediates glucose uptake by insulin sensitive tissues, such as the skeletal muscle. Upon binding of insulin to its receptor, vesicles containing GLUT4 translocate from the cytoplasm to the plasma membrane, inducing glucose uptake. Reduced GLUT4 translocation is one of the causes of insulin resistance in type-2 diabetes2,3.
The translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane can be visualized by immunocytochemistry, using fluorophore-conjugated GLUT4-specific antibodies.
Here, we describe a technique to quantify total amounts of GLUT4 translocation to the plasma membrane of cells during a chosen duration, using flow cytometry. This protocol is rapid (less than 4 hours, including incubation with insulin) and allows the analysis of as few as 3,000 cells or as many as 1 million cells per condition in a single experiment. It relies on anti-GLUT4 antibodies directed to an external epitope of the transporter that bind to it as soon as it is exposed to the extracellular medium after translocation to the plasma membrane.

This protocol describes a rapid technique to quantify the translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane of cells by flow cytometry.

フローサイトメトリーによる細胞膜へのGLUT4転の定量的測定

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

生物学

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

マウス減数分裂細胞のフローサイトメトリーの精製

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of different cell types in vitro and in vivo.1-5 Although there are literally thousands of publications using such dyes, some of the most commonly encountered cell tracking applications include monitoring of:
<ol>
	<li>stem and progenitor cell quiescence, proliferation and/or differentiation6-8</li>
	<li>antigen-driven membrane transfer9 and/or precursor cell proliferation3,4,10-18 and</li>
	<li>immune regulatory and effector cell function1,18-21.</li>
</ol>
Commercially available cell tracking dyes vary widely in their chemistries and fluorescence properties but the great majority fall into one of two classes based on their mechanism of cell labeling. "Membrane dyes", typified by PKH26, are highly lipophilic dyes that partition stably but non-covalently into cell membranes1,2,11. "Protein dyes", typified by CFSE, are amino-reactive dyes that form stable covalent bonds with cell proteins4,16,18. Each class has its own advantages and limitations. The key to their successful use, particularly in multicolor studies where multiple dyes are used to track different cell types, is therefore to understand the critical issues enabling optimal use of each class2-4,16,18,24.
The protocols included here highlight three common causes of poor or variable results when using cell-tracking dyes. These are:
<ol>
	<li>Failure to achieve bright, uniform, reproducible labeling. This is a necessary starting point for any cell tracking study but requires attention to different variables when using membrane dyes than when using protein dyes or equilibrium binding reagents such as antibodies.</li>
	<li>Suboptimal fluorochrome combinations and/or failure to include critical compensation controls. Tracking dye fluorescence is typically 102 - 103 times brighter than antibody fluorescence. It is therefore essential to verify that the presence of tracking dye does not compromise the ability to detect other probes being used.</li>
	<li>Failure to obtain a good fit with peak modeling software. Such software allows quantitative comparison of proliferative responses across different populations or stimuli based on precursor frequency or other metrics. Obtaining a good fit, however, requires exclusion of dead/dying cells that can distort dye dilution profiles and matching of the assumptions underlying the model with characteristics of the observed dye dilution profile.</li>
</ol>
Examples given here illustrate how these variables can affect results when using membrane and/or protein dyes to monitor cell proliferation.

Successful use of cell tracking dyes to monitor immune cell function and proliferation involves several critical steps. We describe methods for: 1) obtaining bright, uniform, reproducible label-ing with membrane dyes; 2) selecting fluorochromes and data acquisition conditions; and 3) choosing a model to quantify cell proliferation based on dye dilution.

細胞トラッキング染料を使用して細胞分裂監視のための最適化された染色と増殖モデリング方法

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial function, cell death, cell metabolism and cell migration to name but a few. Cytosolic calcium is normally maintained at low nanomolar concentrations; rather it is found in high micromolar to millimolar concentrations in the endoplasmic reticulum, mitochondrial matrix and the extracellular compartment. Upon stimulation, a transient increase in cytosolic calcium serves to signal downstream events. Detecting changes in cytosolic calcium is normally performed using a live cell imaging set up with calcium binding dyes that exhibit either an increase in fluorescence intensity or a shift in the emission wavelength upon calcium binding. However, a live cell imaging set up is not freely accessible to all researchers. Alternative detection methods have been optimized for immunological cells with flow cytometry and for non-immunological adherent cells with a fluorescence microplate reader. Here, we describe an optimized, simple method for detecting changes in epithelial cells with flow cytometry using a single wavelength calcium binding dye. Adherent renal proximal tubule epithelial cells, which are normally difficult to load with dyes, were loaded with a fluorescent cell permeable calcium binding dye in the presence of probenecid, brought into suspension and calcium signals were monitored before and after addition of thapsigargin, tunicamycin and ionomycin.

Calcium is involved in numerous physiological and pathophysiological signaling pathways. Live cell imaging requires specialized equipment and can be time consuming. A quick, simple method using a flow cytometer to determine relative changes in cytosolic calcium in adherent epithelial cells brought into suspension was optimized.

フローサイトメトリーによる腎上皮細胞における細胞質ゾルカルシウム測定

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...

Immunodetection of Outer Membrane Proteins by Flow Cytometry of Isolated Mitochondria

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and pathophysiology. This protocol describes a technique where mitochondria isolated from rodent tissue are immunolabeled and analyzed by flow cytometry. Mitochondria are isolated from rodent spinal cords and subjected to a rapid enrichment step so as to remove myelin, a major contaminant of mitochondrial fractions prepared from nervous tissue. Isolated mitochondria are then labeled with an antibody of choice and a fluorescently conjugated secondary antibody. Analysis by flow cytometry verifies the relative purity of mitochondrial preparations by staining with a mitochondrial specific dye, followed by detection and quantification of immunolabeled protein. This technique is rapid, quantifiable and high-throughput, allowing for the analysis of hundreds of thousands of mitochondria per sample. It is applicable to assess novel proteins at the mitochondrial surface under normal physiological conditions as well as the proteins that may become mislocalized to this organelle during pathology. Importantly, this method can be coupled to fluorescent indicator dyes to report on certain activities of mitochondrial subpopulations and is feasible for mitochondria from the central nervous system (brain and spinal cord) as well as liver.

Described here is a method to detect and quantify mitochondrial outer membrane proteins by immunolabeling of mitochondria isolated from rodent tissue and analysis by flow cytometry. This method can be extended to assess functional aspects of mitochondrial subpopulations.

単離されたミトコンドリアのフローサイトメトリーによる外膜タンパク質の免疫検出

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and ...

LED Thermo Flow &#8212; Combining Optogenetics with Flow Cytometry

Optogenetic tools allow isolated, functional investigations of almost any signaling molecule within complex signaling pathways. A major obstacle is the controlled delivery of light to the cell sample and hence the most popular tools for optogenetic studies are microscopy-based cell analyses and in vitro experiments. The flow cytometer has major advantages over a microscope, including the ability to rapidly measure thousands of cells at single cell resolution. However, it is not yet widely used in optogenetics. Here, we present a device that combines the power of optogenetics and flow cytometry: the LED Thermo Flow. This device illuminates cells at specific wavelengths, light intensities and temperatures during flow cytometric measurements. It can be built at low cost and be used with most common flow cytometers. To demonstrate its utility, we characterized the photoswitching kinetics of Dronpa proteins in vivo and in real time. This protocol can be adapted to almost all optically controlled substances and substantially expands the set of possible experiments. More importantly, it will greatly simplify the discovery and development of new optogenetic tools.

LED Thermo Flow &amp;#8212; Combining Optogenetics with Flow Cytometry

Optically controlled substances are powerful tools to study signaling pathways. To expand the spectrum of possible experiments, we developed a device for studying optically controlled substances in real time using flow cytometry: the LED Thermo Flow.

LEDサーモフロー - フローサイトメトリーで光遺伝学を組み合わせます

Optogenetic tools allow isolated, functional investigations of almost any signaling molecule within complex signaling pathways. A major obstacle is the ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to the analysis of a few fluorochromes, currently there are dozens of different fluorescent dyes, and up to 14-18 different dyes can be combined at a time. However, several limitations still impair the analytical capabilities. Because of the multiplicity of fluorescent probes, data analysis has become increasingly complex due to the need of large, multi-parametric compensation matrices. Moreover, mutant mouse models carrying fluorescent proteins to detect and trace specific cell types in different tissues have become available, so the analysis (by flow cytometry) of auto-fluorescent cell suspensions obtained from solid organs is required. Spectral flow cytometry, which distinguishes the shapes of emission spectra along a wide range of continuous wavelengths, addresses some of these problems. The data is analyzed with an algorithm that replaces compensation matrices and treats auto-fluorescence as an independent parameter. Thus, spectral flow cytometry should be capable of discriminating fluorochromes with similar emission peaks and can provide a multi-parametric analysis without compensation requirements.
This protocol describes the spectral flow cytometry analysis, allowing for a 21-parameter (19 fluorescent probes) characterization and the management of an auto-fluorescent signal, providing high resolution in minor population detection. The results presented here show that spectral flow cytometry presents advantages in the analysis of cell populations from tissues difficult to characterize in conventional flow cytometry, such as the heart and the intestine. Spectral flow cytometry thus demonstrates the multi-parametric analytical capacity of high-performing conventional flow cytometry without the requirement for compensation and enables auto-fluorescence management.

This article describes spectral cytometry, a new approach in flow cytometry that uses the shapes of emission spectra to distinguish fluorochromes. An algorithm replaces compensations and can treat auto-fluorescence as an independent parameter. This new approach allows for the proper analysis of cells isolated from solid organs.

スペクトラルフローサイトメトリーにより固形組織から単離された細胞懸濁液の分析

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...

Measuring Endoreduplication by Flow Cytometry of Isolated Tuber Protoplasts

Endoreduplication, the replication of a cell's nuclear genome without subsequent cytokinesis, yields cells with increased DNA content and is associated with specialization, development and increase in cellular size. In plants, endoreduplication seems to facilitate the growth and expansion of certain tissues and organs. Among them is the tuber of potato (Solanum tuberosum), which undergoes considerable cellular expansion in fulfilling its function of carbohydrate storage. Thus, endoreduplication may play an important role in how tubers are able to accommodate this abundance of carbon. However, the cellular debris resulting from crude nuclear isolation methods of tubers, methods that can be used effectively with leaves, precludes the estimation of the tuber endoreduplication index (EI). This article presents a technique for assessing tuber endoreduplication through the isolation of protoplasts while demonstrating representative results obtained from different genotypes and compartmentalized tuber tissues. The major limitations of the protocol are the time and reagent costs required for sample preparation as well as relatively short lifespan of samples after lysis of protoplasts. While the protocol is sensitive to technical variation, it represents an improvement over traditional methods of nuclear isolation from these large specialized cells. Possibilities for improvements to the protocol such as recycling enzyme, the use of fixatives, and other alterations are proposed.

The protocol described herein is a method for measuring endoreduplication within tubers of potato (Solanum tuberosum). It includes plasmolysis and protoplast extraction steps to decrease the noise and debris in downstream flow cytometric analysis.

孤立した塊茎プロトプ ラストのフローサイトメトリーによる表現を測定

Endoreduplication, the replication of a cell's nuclear genome without subsequent cytokinesis, yields cells with increased DNA content and is associated ...

High-throughput Measurement of Dictyostelium discoideum Macropinocytosis by Flow Cytometry

Large-scale non-specific fluid uptake by macropinocytosis is important for the proliferation of certain cancer cells, antigen sampling, host cell invasion and the spread of neurodegenerative diseases. The commonly used laboratory strains of the amoeba Dictyostelium discoideum have extremely high fluid uptake rates when grown in nutrient medium, over 90% of which is due to macropinocytosis. In addition, many of the known core components of mammalian macropinocytosis are also present, making it an excellent model system for studying macropinocytosis. Here, the standard technique to measure internalized fluid using fluorescent dextran as a label is adapted to a 96-well plate format, with the samples analyzed by flow cytometry using a high-throughput sampling (HTS) attachment.
Cells are fed non-quenchable fluorescent dextran for a pre-determined length of time, washed by immersion in ice-cold buffer and detached using 5 mM sodium azide, which also stops exocytosis. Cells in each well are then analyzed by flow cytometry. The method can also be adapted to measure membrane uptake and phagocytosis of fluorescent beads or bacteria.
This method was designed to allow measurement of fluid uptake by Dictyostelium in a high-throughput, labor and resource efficient manner. It allows simultaneous comparison of multiple strains (e.g. knockout mutants of a gene) and conditions (e.g. cells in different media or treated with different concentrations of inhibitor) in parallel and simplifies time-courses.

High-throughput Measurement of Dictyostelium discoideum Macropinocytosis by Flow Cytometry

Macropinocytosis, large-scale non-specific fluid uptake, is important in many areas of clinical biology including immunology, infection, cancer, and neurodegenerative diseases. Here, existing techniques have been adapted to allow high-throughput, single-cell resolution measurement of macropinocytosis in the macropinocytosis model organism Dictyostelium discoideum using flow cytometry.

フローサイトメトリーによる細胞性粘菌キイロタマホコリカビマクロピノサイトーシスの高スループット測定

Large-scale non-specific fluid uptake by macropinocytosis is important for the proliferation of certain cancer cells, antigen sampling, host cell invasion ...

Detecting and Characterizing Protein Self-Assembly In Vivo by Flow Cytometry

Protein self-assembly governs protein function and compartmentalizes cellular processes in space and time. Current methods to study it suffer from low-sensitivity, indirect read-outs, limited throughput, and/or population-level rather than single-cell resolution. We designed a flow cytometry-based single methodology that addresses all of these limitations: Distributed Amphifluoric FRET or DAmFRET. DAmFRET detects and quantifies protein self-assemblies by sensitized emission FRET in vivo, enables deployment across model systems-from yeast to human cells-and achieves sensitive, single-cell, high-throughput read-outs irrespective of protein localization or solubility.

This article describes a FRET-based flow cytometry protocol to quantify protein self-assembly in both S. cerevisiae and HEK293T cells.