この研究は国立研究所の一般的な医療科学 (日の出) (5605100122001)、ネブラスカ大学カーニー (UNK) 夏学生研究プログラム (SSRP) と UNK と同様、国民衛生の健康 (NIH)、コンポーネントによって資金を供給学部研究員 (ウルフ)。

1. 染料、バッファー、Agarose のゲルの準備
<ol><li>
DNA や染色の DNA の消化力の汚損のための次のソリューションを準備します。
	<ol>
<li>1 x テ (酸トリス-HCl とエチレンジアミン; を準備します。10 mM メスシリンダーやメスフラスコでトリス-HCl と 1 mM EDTA を使用して EDTA) バッファー。常温 (18-25 ° C) で保存します。</li>
		<li>各色素の因数を作る: TOTO 1、ヨーヨー 1、ポポ 1、ボボ 1、トト 3、ヨーヨー 3、ポ-3、ボーボボ 3 (表 1)。濃い黄色に 1 mM 染料の 4 μ L をピペットまたは 1.5 mL チューブを黒し 1 x テの 36 μ L を追加、ピペット; を使用してミックスこの濃度 100 μ M 染料液 (40 μ L 合計) になります。この手順では、各色素のため。4 ° C でのストア 注: は、色素退色や色素の劣化を防ぐために光の露出を避けます。</li>
		<li>10 mM ビス トリス プロパン塩酸、10 mM MgCl2、および 100 μ g/mL ウシ血清アルブミン (BSA) を使用して 1 のバッファーを準備します。2 50 mM NaCl を使用してバッファーを準備 10 mM トリス塩酸、10 mM MgCl2、および 100 μ g/mL BSA。3 50 mM 酢酸カリウム、20 mM トリス酢酸、酢酸マグネシウム 10 mM と 100 μ g/mL BSA を使用してバッファーを準備します。各酵素には、機能するこれらの特定のバッファーが必要です。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
次の解決策をゲル電気泳動に備えます。
	<ol>
<li>確認荷重 x 6 0.25% ブロモフェノールを組み合わせることによって染料の青、0.25% キシレンシアノール 15% dH2O. ストア常温で Ficoll。</li>
		<li>0.7% の agarose のゲル、三角フラスコに高いゲル化 (先ず) か温度の agarose の 0.07 g を量り 100 mL の 1 x TAE バッファーを追加し、フラスコの上に倒立ビーカーを配置します。<ol>
<li>ホット プレート上にあるソリューションを熱泡はフラスコ、上にフロートの下部に形成し始めるまで。</li>
			<li>ホット プレートからソリューションを削除、フラスコは、素手で触れることでき、井戸を作成するゲル櫛で 24.5 cm x 21.8 cm ゲル鋳型にゲルを注ぎなさいまでソリューションを冷ます。</li>
			<li>ピペット チップでそれらを飛び出るで櫛の近くまたはゲルの表面の泡を削除し、ゲルを許可する、少なくとも 15 分間を固めます。これは、汚染やジェルの乾燥を防ぐために 1 週間のためのプラスチック製のラップに包んで冷蔵庫 (4 ° C) に格納できます。ゲルを実行する方法の詳細については李らを参照してください。33. 注: は、30 個々 の井戸のゲル櫛を使用します。4.5 mm 幅 2 mm の深さでよくする必要があります。井戸の高さは、ボックスに注がれるゲルの量に依存します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>40 mM トリス-HCl、20 mM 酢酸と 1 mM EDTA を使用して 1 x TAE (トリス酢酸 EDTA) バッファーを準備します。常温 (18-25 ° C) で保存します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. ステンド グラス DNA の準備
<ol><li>
ラムダ DNA (300-800 ng) 染料の異なる因数を使用して染色します。各染料 (表 1) でお越しの際にもテスト、制限酵素あたり 48 反応の合計六つの異なる濃度。次のプロセスは、1 反応 (図 1) をセットをについて説明します。
	<ol>
<li>100 に 1 x TE を使用してラムダ DNA を希釈 ng/μ L 4 ° c で保存。300 μ L の容量を持つソリューションを確認します。</li>
		<li>非メチル化ラムダ DNA を染色します。ダイジェストから期待される各バンドの 75-100 ng/バンドを推定します。1.9 μ M、3.8 μ M、μ 19.4 M、32.2 μ M、48.3 μ M、63.5 μ M の濃度を生成する色素の適切な量を追加/100 ng の DNA の。</li>
		<li>一晩インキュベート (15 18 h) 4 ° C で</li>
		<li>1 つの反作用制御25として無染色のままします。 注: は、消化反応の非メチル化 DNA を使用します。メチル化敏感な酵素は DNA のメチル化領域を切り取ることはできません、不完全な消化の外観を与えます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 制限酵素試金の準備
<ol><li>
ダイジェストは、その酵素が prestained DNA (図 1) を消化できるかどうかを決定するための制限の酵素と DNA を染色します。
	<ol>
<li>次の日は制限酵素、(表 2)、適切なバッファーの 3 μ L の 20 U を追加し、30 μ L の合計のために蒸留水オートクレーブおよびフィルター処理。それぞれの酵素反応では、製造元の web サイトで見つけることができます最高の切削効率とバッファーを選択します。</li>
		<li>反応が、Maschmannらに使用される 6 酵素の表 2 に記載されている最適の酵素活性の温水浴。、2-4 h (表 2)25。</li>
		<li>0.5 M EDTA pH 8.0 の 2 μ L の追加によって反作用を停止します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Electroeluting Agarose のゲルの DNA を染色
<ol><li>24.5 cm x 21.8 cm ゲル型 (ステップ 1.2.2) から側面を削除し、ジェルをゲル電気泳動のボックスにします。ボックスに 1 x TAE バッファーの 2.5 L を注ぐ。井戸がアクセス可能な33を慎重に、ゲルからゲル櫛を取り外します。</li>
	<li>プラスチック フィルム上に制限酵素反応のピペットし、ローディングの染料 × 6 とそれぞれ反応を組み合わせます。各反応液 1 μ L の DNA 溶液 (1 x) の 5-6 μ L ごとに染料を読み込んで x 6 を追加します。その後、ピペットの反応 (読み込み色素を含む < 18 μ L) 井戸に。</li>
	<li>1 kb のはしごの 1 μ L、1 x テ, 9 μ L とローディングの染料 × 6 の 2 μ L を混ぜます。井戸フランクの他のソリューションをソリューションに読み込みます。</li>
	<li>濃い青や黒い紙や布でジェル ボックスをカバーします。ジェル ボックス電源 30 V、電源をセットして一晩実行 (15-20 h) に接続します。ラベル付けされた DNA の電子スピンダイナミクスを防ぐために、ゲルの実行中、ライトをオフにします。</li>
	<li>次の朝は、電源をオフに。トレイを使用してゲルを取るし、45 臭化エチジウム μ L と 1 L 1 x TAE バッファーのコンテナーにそれを転送します。光への露出を防ぐために箔で暗闇の中で部屋の温度やカバーのコンテナーを格納します。部屋の温度の少なくとも 45 分の汚れをジェルができます。 注意: 臭化エチジウムを使用し手袋と安全メガネを着用します。エチジウム ブロマイド溶液とゲルを捨てて容器をきれいにするとき使用エチジウム ブロマイド; に対処する方法を決定する状態破棄のガイドラインを参照してください。また、その他の汚れは、エチジウム ブロマイド代わりに利用されるかもしれない。</li>
</ol>5. Agarose のゲルのイメージング
<ol><li>400-500 nm の間最大光出力を発する青い光の transilluminator の上にジェルを配置します。駅に接続されているカメラで写真を撮る。 注意: 照明器具のカバーを使用し、光源の電源を入れる前に保護眼鏡をかけることを確認してください。 注: この手順も完了するかもしれない紫外光源または標準的なゲルのスキャナーを使用しています。</li>
	<li>ImageJ ImageJ のステータスバーにファイルをドラッグすると、写真を表示、画像がポップアップ表示。</li>
	<li>予想されるインシリコゲル パターンにゲルのバンドを比較することによって実験の消化率を決定します。消化率を確認するのに実験的なバンドの数は DNA バンド24,25の数で分けられます。実験的消化の DNA のバンド パターンが予想されるパターンは、消化率は 1 です。消化率が 1 より大きいパターンに予想よりもさらにフラグメントがあるか。パターンに予想よりも少ないのフラグメントがある場合、消化率が 1 より小さいです。</li>
</ol>

<ol>
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蛍光に分類された DNA (図 1)を消化するために一連の手順が必要です。最初に、DNA は染色、螢光色素の一夜。DNA は、時間の短い期間のためシアニン ダイマーで培養できます。しかし、カールソンらは DNA が不完全な染色20による DNA サイズごとに二重のバンドを作成することを発見しました。この問題を解決するため、DNA は二重バン?...

トト シリーズ (TOTO 1 ヨーヨー 1 ポポ 1、ボボ 1、トト 3、ヨーヨー 3、ポ-3、ボボ-3;表 1)さまざまな DNA の可視化が必要な1,2,3,4,5,6,7、の実験に利用されています。8,9,10,11,12,13,14,15,16,17. シアニン ダイマー家族はその量子収率、感度、および DNA 分子18,19,20の親和性が高いため広く使用されています。シアニン ダイマー色素蛍光21の 100 〜 1000 倍の増加を持っている偉大な選択インターカ レートしたとき、二本鎖 DNA があります。ピリジニウム染料 (ヨーヨー 1、TOTO 1、ヨーヨー-3、およびトト 3)、quinolium (ボボ 1、ポポ 1、ボボ-3、およびポポ 3) (表 1) のカウンター パート22よりも短い波長があります。また、DNA にインターカ レートしたシアニン ダイマー量子収率は高い (0.2 - 0.6)22。ただし、既に蛍光染料で染色、DNA の分子の23を拡大または DNA 分子2のメチル化プロファイルを決定する酵素を使用すると、どのような酵素はステンド グラスの DNA を消化を判断する方法が必要です。DNA に主体の染料の任意の型、または DNA 基板の識別可能なパターンを提供する酵素は、このメソッドを使用できます。
孟らはまず、さまざまな異なる染料24を使用してゲルの電気泳動による prestained DNA の消化率を決定します。Maschmannらに掘り下げたを染料のトト家族見て深い。両方には、DNA の特定の色素で染色でした25の制限の酵素と消化されるかどうかを参照してくださいに汚された DNA の消化率が決定されます。他の方法は、光ピンセット26または27NMR を用いた DNA にインターカ レートした色素の結合効果を検討します。どちらの方法でも特殊な装置が必要です。このメソッドを使用する場合は染料を判断しなければならないほとんどの分子生物学実験室機器に対し、制限酵素消化を妨げます。
また、任意の分子の長さを測定する他の方法で光マッピングは表面に無染色の dna を伸長、ストレッチとフラグメントのサイズを決定する DNA を消化します。輪郭の長さが異なる21染料のインターカレーションは DNA 分子の蛍光染色の使用染料によって輪郭の長さを増加する示されています。このメソッドは様々 なゲノム1,3,4,6,13,28,29,30,に利用されています。31します。 ただし、分子の色素と酵素によって、あらかじめ染色なら、酵素できないことがあります特定の色素に染まった DNA を切断します。したがって、このメソッドは、特定の色素に染まった DNA 酵素と消化できないかどうかを決定します。さらに、染料と染料の利用、DNA の移動度の濃度に応じてゲルのバンド移行されます32 の塩基対の間に挿入するための染料のための部屋を作る DNA のバックボーンの部分的なアンワインドのためネイティブ DNA よりもゆっくりと.
しかし、時々 これらの染料を部分的または完全にある特定の制限の酵素7,24の作用を抑制します。これは蛍光染料、酵素を特定の順序を認識できない場合がありますの添付ファイルによって引き起こされる DNA の構造変化が原因であると考えられます。これらの染料が制限の酵素にどのような影響を与えるかを理解することは、実験でメチル化プロファイルまたは汚された DNA のストレッチが必要です助けることができます。
手法では, DNA は興味の螢光色素で染色され制限の酵素と消化されます。DNA がゲル、イメージの electrophoresed だったし、制限の酵素の消化率を測定しました。制限酵素は、ゲルの切断面パターンに基づいて選ばれました。バンドが多すぎる原因 DNA バンドの重なりとあまりにもいくつかのバンドは DNA の分子の完全な画像を与えていません。消化の DNA 分子のプロファイルを決定することができるにスイート スポットがあります。したがって、それは使用される DNA や酵素に依存されます。この方法の利点はその単純さです。それだけ制限消化とゲルの電気泳動で使用する機器が必要です。

<table><tbody><tr><td>Unmethylated lambda DNA</td><td>NEB</td><td>N3013S</td><td></td></tr><tr><td>YOYO-1</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Y3601</td><td></td></tr><tr><td>TOTO-1</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T3600</td><td></td></tr><tr><td>POPO-1</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P3580</td><td></td></tr><tr><td>BOBO-1</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>B3582</td><td></td></tr><tr><td>YOYO-3</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Y3606</td><td></td></tr><tr><td>TOTO-3</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T3604</td><td></td></tr><tr><td>POPO-3</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P3584</td><td></td></tr><tr><td>BamHI</td><td>NEB</td><td>R0136S</td><td></td></tr><tr><td>PmlI</td><td>NEB</td><td>R0532S</td><td></td></tr><tr><td>ScaI</td><td>NEB</td><td>R3122S</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI&amp;nbsp;</td><td>NEB</td><td>R0101S</td><td></td></tr><tr><td>HindIII</td><td>NEB</td><td>R0104S</td><td></td></tr><tr><td>SmaI</td><td>NEB</td><td>R0141S</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Fisher</td><td>BP152-1</td><td>Irritant</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher</td><td>S316-212</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Fisher</td><td>S25358</td><td>Corrosive and irritant</td></tr><tr><td>Buffer 1</td><td>NEB</td><td>B7201S</td><td>NEB 1.1</td></tr><tr><td>Buffer 2</td><td>NEB</td><td>B7202S</td><td>NEB 2.1</td></tr><tr><td>Buffer 3</td><td>NEB</td><td>B7204S</td><td>NEB Cutsmart</td></tr><tr><td>High gelling temperature agarose gel</td><td>Lonza</td><td>50041</td><td></td></tr><tr><td>Acetic Acid</td><td>Fisher</td><td>S25118</td><td>Hazardous</td></tr><tr><td>Blue light transilluminator</td><td>Dark Reader</td><td>DR196</td><td>Wear correct eyewear&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Ethidium bromide</td><td>Fisher</td><td>15585011</td><td>Carcinogen; other alternatives are Nancy 520, Gel red, etc.</td></tr><tr><td>Cannon EOS Rebel T3I camera</td><td>Cannon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Apogee Model H4</td><td>Biorad</td><td>1704510</td><td></td></tr><tr><td>Power Pac Basic Power Supply</td><td>Biorad</td><td>1645050&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP525-25</td><td></td></tr><tr><td>Bromophenol blue</td><td>Fisher Scientific</td><td>B-392</td><td></td></tr><tr><td>Xylene Cyanol</td><td>Eastmen</td><td>T1579</td><td></td></tr></tbody></table>

determining if dna stained with a cyanine dye can be digested with restriction enzymes

蛍光顕微鏡用 DNA の可視化は、さまざまなシアニン色素などの色素を利用しています。これらの染料は、DNA の彼らの親和性が高いと感度のため利用されます。DNA 分子実験の完了の後の完全な長さをかを決定するためには、ステンド グラスの分子が DNA の制限の酵素と消化によって完全な長さをあるかどうかをメソッドが必要です。しかし、ステンド グラスの DNA は酵素が阻害する可能性があるため、螢光色素の 1 つ使用できるどのような酵素は、DNA を染色する方法が必要です。このメソッドでは、DNA は染料と平衡に DNA を許可する一晩シアニン系感光色素と汚れます。次に、ステンド グラスの DNA は制限の酵素と消化され、ゲルに読み込まれ、electrophoresed。実験的 DNA ダイジェスト バンドは、制限酵素活性を決定するインシリコダイジェストと比較されます。期待どおりに、バンドの同じ数がある、反作用は完了です。部分消化を示す予想よりもより多くのバンドおよびより少ないバンド不完全な消化力を示します。この方法の利点は、そのシンプルさと科学者が制限の酵素の必要な機器を使用して試金およびゲルの電気泳動。このメソッドの制限はほとんどの科学者に利用可能な酵素が市販の酵素;ただし、任意の制限酵素を使用可能性があります。

正しい順序で手順を実行する必要がありますデュアルインターカレーションの色素は DNA を消化制限の酵素に影響を与える場合を決定するために (図 1) に続いた。DNA を染色し、特定の酵素と消化され、一度は、フラグメントとサイズ (図 2) の数を決定するゲルの画像を取得できます。ために酵素の効率、予想される目に見?...

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Determining if DNA Stained with a Cyanine Dye Can Be Digested with Restriction Enzymes

蛍光顕微鏡用 dna を染色科学者実験中にそれらを表示することができます。今回紹介した方法で DNA 分子は事前に蛍光染料で染色された、メチル化および非メチル化敏感な制限の酵素と消化されます。

DNA 染色、シアニン色素が消化される制限の酵素とかどうかを決定します。

Visualization of DNA for fluorescence microscopy utilizes a variety of dyes such as cyanine dyes. These dyes are utilized due to their high affinity and ...

determining-if-dna-stained-with-cyanine-dye-can-be-digested-with

Research

JoVE Journal

Biochemistry

8.7K ビュー.  University of Nebraska - Kearney. 蛍光顕微鏡用 dna を染色科学者実験中にそれらを表示することができます。今回紹介した方法で DNA 分子は事前に蛍光染料で染色された、メチル化および非メチル化敏感な制限の酵素と消化されます。

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DNA Staining Method Based on Formazan Precipitation Induced by Blue Light Exposure

DNA staining methods are very important for biomedical research. We designed a simple method that allows DNA visualization to the naked eye by the formation of a colored precipitate. It works by soaking the acrylamide or agarose DNA gel in a solution of 1x (equivalent to 2.0 &#181;M) SYBR Green I (SG I) and 0.20 mM nitro blue tetrazolium that produces a purple precipitate of formazan when exposed to sunlight or specifically blue light. Also, DNA recovery tests were performed using an ampicillin resistant plasmid in an agarose gel stained with our method. A larger number of colonies was obtained with our method than with traditional staining using SG I with ultraviolet illumination. The described method is fast, specific, and non-toxic for DNA detection, allowing visualization of biomolecules to the "naked eye" without a transilluminator, and is inexpensive and appropriate for field use. For these reasons, our new DNA staining method has potential benefits to both research and industry.

This method allows selective staining and quantification of DNA in gels by soaking the gel in a SYBR Green I/Nitro Blue Tetrazolium solution and then exposing it to sunlight or a blue light source. This produces a visible precipitate and requires almost no equipment, making it ideal for field use.

DNA 染色青い光曝露による塩の沈殿物に基づく法

DNA staining methods are very important for biomedical research. We designed a simple method that allows DNA visualization to the naked eye by the ...

生化学

Detection of Bacteria Using Fluorogenic DNAzymes

Outbreaks linked to food-borne and hospital-acquired pathogens account for millions of deaths and hospitalizations as well as colossal economic losses each and every year. Prevention of such outbreaks and minimization of the impact of an ongoing epidemic place an ever-increasing demand for analytical methods that can accurately identify culprit pathogens at the earliest stage. Although there is a large array of effective methods for pathogen detection, none of them can satisfy all the following five premier requirements embodied for an ideal detection method: high specificity (detecting only the bacterium of interest), high sensitivity (capable of detecting as low as a single live bacterial cell), short time-to-results (minutes to hours), great operational simplicity (no need for lengthy sampling procedures and the use of specialized equipment), and cost effectiveness. For example, classical microbiological methods are highly specific but require a long time (days to weeks) to acquire a definitive result.1 PCR- and antibody-based techniques offer shorter waiting times (hours to days), but they require the use of expensive reagents and/or sophisticated equipment.2-4 Consequently, there is still a great demand for scientific research towards developing innovative bacterial detection methods that offer improved characteristics in one or more of the aforementioned requirements. Our laboratory is interested in examining the potential of DNAzymes as a novel class of molecular probes for biosensing applications including bacterial detection.5
DNAzymes (also known as deoxyribozymes or DNA enzymes) are man-made single-stranded DNA molecules with the capability of catalyzing chemical reactions.6-8 These molecules can be isolated from a vast random-sequence DNA pool (which contains as many as 1016 individual sequences) by a process known as "in vitro selection" or "SELEX" (systematic evolution of ligands by exponential enrichment).9-16 These special DNA molecules have been widely examined in recent years as molecular tools for biosensing applications.6-8
Our laboratory has established in vitro selection procedures for isolating RNA-cleaving fluorescent DNAzymes (RFDs; Fig. 1) and investigated the use of RFDs as analytical tools.17-29 RFDs catalyze the cleavage of a DNA-RNA chimeric substrate at a single ribonucleotide junction (R) that is flanked by a fluorophore (F) and a quencher (Q). The close proximity of F and Q renders the uncleaved substrate minimal fluorescence. However, the cleavage event leads to the separation of F and Q, which is accompanied by significant increase of fluorescence intensity.
More recently, we developed a method of isolating RFDs for bacterial detection.5 These special RFDs were isolated to "light up" in the presence of the crude extracellular mixture (CEM) left behind by a specific type of bacteria in their environment or in the media they are cultured (Fig. 1). The use of crude mixture circumvents the tedious process of purifying and identifying a suitable target from the microbe of interest for biosensor development (which could take months or years to complete). The use of extracellular targets means the assaying procedure is simple because there is no need for steps to obtain intracellular targets.
Using the above approach, we derived an RFD that cleaves its substrate (FS1; Fig. 2A) only in the presence of the CEM produced by E. coli (CEM-EC).5 This E. coli-sensing RFD, named RFD-EC1 (Fig. 2A), was found to be strictly responsive to CEM-EC but nonresponsive to CEMs from a host of other bacteria (Fig. 3).
Here we present the key experimental procedures for setting up E. coli detection assays using RFD-EC1 and representative results.

We have recently reported a novel approach for generating fluorogenic DNAzyme probes that can be applied to set up a simple, "mix-and-read" fluorescent assay for bacterial detection. These special DNA probes catalyze the cleavage of a chromophore-modified DNA-RNA chimeric substrate in the presence of crude extracellular mixture (CEM) produced by a specific bacterium, thereby translating bacterial detection into fluorescence signal generation. In this report we will describe key experimental procedures where a specific DNAzyme probe denoted "RFD-EC1" is employed for the detection of the model bacterium, Escherichia coli (E. coli).

蛍光性DNAzymesを使用した細菌の検出

Outbreaks linked to food-borne and hospital-acquired pathogens account for millions of deaths and hospitalizations as well as colossal economic losses ...

免疫・感染学

DNA Electrophoresis Using Thiazole Orange Instead of Ethidium Bromide or Alternative Dyes

DNA gel electrophoresis using agarose is a common tool in molecular biology laboratories, allowing separation of DNA fragments by size. After separation, DNA is visualized by staining. This article demonstrates how to use thiazole orange to stain DNA. Thiazole orange compares favorably to common staining methods, in that it is sensitive, inexpensive, excitable with UV or blue light (to prevent sample damage), and safer than ethidium bromide. Labs already equipped to run DNA electrophoresis experiments using ethidium bromide can generally switch dyes with no additional changes to existing protocols, using UV light for detection. Blue-light detection to avoid sample damage can additionally be achieved with a blue-light source and emission filter. Labs already equipped for blue-light detection can simply switch dyes with no additional changes to existing protocols.

Here, we present a protocol to use thiazole orange for the detection of DNA in gel electrophoresis experiments. The use of thiazole orange allows elimination of ethidium bromide, and fluorescence detection can be achieved with either UV or blue light.

エチジウム ブロマイドや代替染料ではなくチアゾール オレンジを用いた DNA 電気泳動

DNA gel electrophoresis using agarose is a common tool in molecular biology laboratories, allowing separation of DNA fragments by size. After separation, ...

In-Nucleus Hi-C in Drosophila Cells

The genome is organized into topologically associating domains (TADs) delimited by boundaries that isolate interactions between domains. In Drosophila, the mechanisms underlying TAD formation and boundaries are still under investigation. The application of the in-nucleus Hi-C method described here helped to dissect the function of architectural protein (AP)-binding sites at TAD boundaries isolating the Notch gene. Genetic modification of domain boundaries that cause loss of APs results in TAD fusion, transcriptional defects, and long-range topological alterations. These results provided evidence demonstrating the contribution of genetic elements to domain boundary formation and gene expression control in Drosophila. Here, the in-nucleus Hi-C method has been described in detail, which provides important checkpoints to assess the quality of the experiment along with the protocol. Also shown are the required numbers of sequencing reads and valid Hi-C pairs to analyze genomic interactions at different genomic scales. CRISPR/Cas9-mediated genetic editing of regulatory elements and high-resolution profiling of genomic interactions using this in-nucleus Hi-C protocol could be a powerful combination for the investigation of the structural function of genetic elements.

The genome is organized in the nuclear space into different structures that can be revealed through chromosome conformation capture technologies. The in-nucleus Hi-C method provides a genome-wide collection of chromatin interactions in Drosophila cell lines, which generates contact maps that can be explored at megabase resolution at restriction fragment level.

ショウジョウバエ細胞におけるイン核Hi-C

The genome is organized into topologically associating domains (TADs) delimited by boundaries that isolate interactions between domains. In Drosophila, ...

遺伝学

学部研究および教育のための染色体コンフォメーションキャプチャー(3C)

Getting an A with the 3Cs: Chromosome Conformation Capture for Undergraduates

Chromosome conformation capture (3C) is a powerful tool that has spawned a family of similar techniques (e.g., Hi-C, 4C, and 5C, referred to here as 3C techniques) that provide detailed information of the three-dimensional organization of chromatin. The 3C techniques have been used in a wide range of studies, from monitoring the changes in chromatin organization in cancer cells to identifying enhancer contacts made with gene promoters. While many of the studies using these techniques are asking big genome-wide questions with intricate sample types (i.e., single-cell analysis), what is often lost is that the 3C techniques are grounded in basic molecular biology methods that are applicable to a broad range of studies. By addressing tightly focused questions of chromatin organization, this cutting-edge technique can be used to enhance the undergraduate research and teaching lab experience. This paper presents a 3C protocol and provides adaptations and points of emphasis for implementation at primarily undergraduate institutions in undergraduate research and teaching experiences.

著者スポットライト:3CでAを取得する:学部生のための染色体コンフォメーションキャプチャ  

Here, we present an adaption of the chromosome conformation capture (3C) technique in detail with an emphasis on undergraduate involvement and learning.

3CでAを取得する:学部生のための染色体コンフォメーションキャプチャ

Chromosome conformation capture (3C) is a powerful tool that has spawned a family of similar techniques (e.g., Hi-C, 4C, and 5C, referred to here as 3C ...

Single-Molecule Dwell-Time Analysis of Restriction Endonuclease-Mediated DNA Cleavage

This novel total internal reflection fluorescence microscopy-based assay facilitates the simultaneous measurement of the length of the catalytic cycle for hundreds of individual restriction endonuclease (REase) molecules in one experiment. This assay does not require protein labeling and can be carried out with a single imaging channel. In addition, the results of multiple individual experiments can be pooled to generate well-populated dwell-time distributions. Analysis of the resulting dwell-time distributions can help elucidate the DNA cleavage mechanism by revealing the presence of kinetic steps that cannot be directly observed. Example data collected using this assay with the well-studied REase, EcoRV - a dimeric Type IIP restriction endonuclease that cleaves the palindromic sequence GAT&#8595;ATC (where &#8595; is the cut site) - are in agreement with prior studies. These results suggest that there are at least three steps in the pathway to DNA cleavage that is initiated by introducing magnesium after EcoRV binds DNA in its absence, with an average rate of 0.17 s-1 for each step.

Using quantum-dot-labeled DNA and total internal reflection fluorescence microscopy, we can investigate the reaction mechanism of restriction endonucleases while using unlabeled protein. This single-molecule technique allows for massively multiplexed observation of individual protein-DNA interactions, and data can be pooled to generate well-populated dwell-time distributions.

制限エンドヌクレアーゼ媒介性DNA切断の1分子滞留時間解析

This novel total internal reflection fluorescence microscopy-based assay facilitates the simultaneous measurement of the length of the catalytic cycle for ...

DNA-based Fish Species Identification Protocol

We have developed a fast, simple, and accurate DNA-based screening method to identify the fish species present in fresh and processed seafood samples. This versatile method employs PCR amplification of genomic DNA extracted from fish samples, followed by restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis to generate fragment patterns that can be resolved on the Agilent 2100 Bioanalyzer and matched to the correct species using RFLP pattern matching software.
The fish identification method uses a simple, reliable, spin column- based protocol to isolate DNA from fish samples. The samples are treated with proteinase K to release the nucleic acids into solution. DNA is then isolated by suspending the sample in binding buffer and loading onto a micro- spin cup containing a silica- based fiber matrix. The nucleic acids in the sample bind to the fiber matrix. The immobilized nucleic acids are washed to remove contaminants, and total DNA is recovered in a final volume of 100 &mu;l. The isolated DNA is ready for PCR amplification with the provided primers that bind to sequences found in all fish genomes. The PCR products are then digested with three different restriction enzymes and resolved on the Agilent 2100 Bioanalyzer. The fragment lengths produced in the digestion reactions can be used to determine the species of fish from which the DNA sample was prepared, using the RFLP pattern matching software containing a database of experimentally- derived RFLP patterns from commercially relevant fish species.

This publication describes how to use the Agilent Fish Species Identification System to identify the species of a fish by extracting DNA and performing PCR and RFLP analysis.

DNAベースの魚種の識別プロトコル

We have developed a fast, simple, and accurate DNA-based screening method to identify the fish species present in fresh and processed seafood samples. ...

生物学

<meta charset="utf8"></head><body>1分子アッセイを用いたテロメアDNAとのTRF1/2相互作用の研究

Analyzing Telomeric Protein-DNA Interactions Using Single-Molecule Magnetic Tweezers

Telomeres, the protective structures at the ends of chromosomes, are crucial for maintaining cellular longevity and genome stability. Their proper function depends on tightly regulated processes of replication, elongation, and damage response. The shelterin complex, especially Telomere Repeat-binding Factor 1 (TRF1) and TRF2, plays a pivotal role in telomere protection and has emerged as a potential anti-cancer target for drug discovery. These proteins bind to the repetitive telomeric DNA motif TTAGGG, facilitating the formation of protective structures and recruitment of other telomeric proteins. Structural methods and advanced imaging techniques have provided insights into telomeric protein-DNA interactions, but probing the dynamic processes requires single-molecule approaches. Tools like magnetic tweezers, optical tweezers, and atomic force microscopy (AFM) have been employed to study telomeric protein-DNA interactions, revealing important details such as TRF2-dependent DNA distortion and telomerase catalysis. However, the preparation of single-molecule constructs with telomeric repetitive motifs continues to be a challenging task, potentially limiting the breadth of studies utilizing single-molecule mechanical methods. To address this, we developed a method to study interactions using full-length human telomeric DNA with magnetic tweezers. This protocol describes how to express and purify TRF2, prepare telomeric DNA, set up single-molecule mechanical assays, and analyze data. This detailed guide will benefit researchers in telomere biology and telomere-targeted drug discovery.

<meta charset="utf8"></head><body>著者スポットライト:テロメアタンパク質-DNA相互作用を調査するための高度な単一分子技術

This protocol demonstrates using single-molecule magnetic tweezers to study interactions between telomeric DNA-binding proteins (Telomere Repeat-binding Factor 1 [TRF1] and TRF2) and long telomeres extracted from human cells. It describes the preparatory steps for telomeres and telomeric repeat-binding factors, the execution of single-molecule experiments, and the data collection and analysis methods.

DNA 染色、シアニン色素が消化される制限の酵素とかどうかを決定します。

要約

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DNA 染色青い光曝露による塩の沈殿物に基づく法

蛍光性DNAzymesを使用した細菌の検出

エチジウムブロマイドや代替染料ではなくチアゾールオレンジを用いた DNA 電気泳動

ショウジョウバエ細胞におけるイン核Hi-C

3CでAを取得する:学部生のための染色体コンフォメーションキャプチャ

3CでAを取得する:学部生のための染色体コンフォメーションキャプチャ

3CでAを取得する:学部生のための染色体コンフォメーションキャプチャ

制限エンドヌクレアーゼ媒介性DNA切断の1分子滞留時間解析

DNAベースの魚種の識別プロトコル

1分子磁気ピンセットを用いたテロメアタンパク質-DNA相互作用の解析

DNA 染色、シアニン色素が消化される制限の酵素とかどうかを決定します。

要約

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DNA 染色青い光曝露による塩の沈殿物に基づく法

蛍光性DNAzymesを使用した細菌の検出

エチジウム ブロマイドや代替染料ではなくチアゾール オレンジを用いた DNA 電気泳動

ショウジョウバエ細胞におけるイン核Hi-C

3CでAを取得する:学部生のための染色体コンフォメーションキャプチャ

3CでAを取得する:学部生のための染色体コンフォメーションキャプチャ

3CでAを取得する:学部生のための染色体コンフォメーションキャプチャ

制限エンドヌクレアーゼ媒介性DNA切断の1分子滞留時間解析

DNAベースの魚種の識別プロトコル

1分子磁気ピンセットを用いたテロメアタンパク質-DNA相互作用の解析

エチジウムブロマイドや代替染料ではなくチアゾールオレンジを用いた DNA 電気泳動