Esta pesquisa foi financiada pelo Instituto Nacional para geral médica ciência (NIGMS) (5605100122001), um componente do National Institutes of Health (NIH), bem como a Universidade de Nebraska em Kearney (UNK) programa de pesquisa de estudante verão (SSRP) e UNK Bolsa de iniciação científica (Al-URF).

1. preparação de corantes, Buffers e Gel de Agarose
<ol><li>
Prepare as seguintes soluções para coloração de DNA ou a digestão do DNA manchada.
	<ol>
<li>Preparar 1 x TE (Tris-HCl e ácido etilenodiaminotetracético ácido; Buffer de EDTA) usando 10 mM Tris-HCl e 1 mM de EDTA em uma proveta ou balão volumétrico. Armazenar em temperatura ambiente (18-25 ° C).</li>
		<li>Fazer alíquotas de cada tintura: TOTO-1, 1-YOYO, POPO-1, BOBO-1, TOTO-3, YOYO-3, 3-POPO, BOBO-3 (tabela 1). Pipete 4 µ l de tintura de 1 mM em um âmbar escuro ou preto tubo de 1,5 mL e adicionar µ l 36 de 1x et, misture com a pipeta; Esta concentração torna uma solução de tintura de 100 µM (40 µ l total). Conclua esta etapa para cada tintura. Loja a 4 ° C. Nota: Evite expor a tintura à luz para evitar fotobranqueamento ou degradação do corante.</li>
		<li>Prepare o tampão 1 usando 10 mM Tris-HCl-propano-Bis 10 mM MgCl2e 100 µ g/mL albumina de soro bovino (BSA). Preparar o tampão 2 usando 50mm NaCl, 10 mM Tris-HCl 10 mM MgCl2e 100 µ g/mL BSA. Prepare o tampão 3 usando 50 mM acetato de potássio, 20 mM Tris-Acetato, acetato de magnésio de 10 mM e BSA 100 µ g/mL. Cada enzima exigirá um desses buffers específicos para funcionar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Prepare as seguintes soluções para a electroforese do gel.
	<ol>
<li>Faça um 6 x carregamento tingir combinando 0,25% bromofenol azul, 0,25% de xileno cianol, 15% Ficoll em dH2O. armazenar em temperatura ambiente.</li>
		<li>Para tornar um agarose 0.7% gel, pesar 0,07 g de agarose de temperatura (HGT) coagulação alta em um Erlenmeyer, adicionar 100 mL de tampão de x TAE 1 e colocar um copo invertido no topo do balão.<ol>
<li>Aqueça a solução em uma chapa quente até que as bolhas começam a se formar no fundo do frasco e flutuar para o topo.</li>
			<li>Remover a solução da placa quente, deixe arrefecer o solução até que o balão pode ser tocado com uma mão nua e em seguida despeje o gel em um molde de gel de 24,5 x 21,8 cm com um pente de gel para criar poços.</li>
			<li>Remover bolhas perto o pente ou na superfície do gel por estourá-los com a ponta da pipeta e permitir que o gel solidificar durante pelo menos 15 minutos. Isso pode ser armazenado em um refrigerador (4 ° C), envolvido em filme plástico por 1 semana impedir a secagem do gel ou contaminação. Para obter mais informações sobre como executar um gel referir Lee et al . 33 . Nota: Use um pente de gel com 30 poços individuais. Cada um bem deve ser de 4,5 mm de largura, com uma profundidade de 2 mm. A altura do poço vai depender da quantidade de gel derramado em caixa.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Prepare 1 buffer de x TAE (Tris - Acetato - EDTA) usando 40 mM Tris-HCl, ácido acético de 20 mM e 1 mM de EDTA. Armazenar em temperatura ambiente (18-25 ° C).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. preparação do ADN manchado
<ol><li>
Mancha de lambda DNA (300-800 ng) usando diferentes alíquotas de corantes. Cada tintura (tabela 1) terá seis diferentes concentrações testadas, para um total de 48 reações por enzima de restrição. O processo a seguir descreve um conjunto acima para a 1 reação (Figura 1).
	<ol>
<li>Diluir o lambda DNA usando 1 x TE a 100 ng / µ l. loja em 4 ° C. Faça uma solução com um volume total de 300 µ l.</li>
		<li>Mancha de lambda unmethylated DNA. Para cada banda esperada de digest, estime 75-100 ng/banda. Adicionar quantidades apropriadas de corante para produzir concentrações de 1,9 µM µM 3.8, 19,4 µM, 32,2 µM, 48,3 µM, 63,5 µM / 100 ng de DNA.</li>
		<li>Incubar durante uma noite 15 h - 18 h a 4 ° C.</li>
		<li>Deixe uma reação inocente para atuar como um controle de25. Nota: Use unmethylated DNA para a reação de digestão. Enzimas sensíveis de metilação não podem cortar regiões metiladas no DNA e vão dar uma aparência de uma digestão incompleta.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. preparação do ensaio enzima de restrição
<ol><li>
Digest manchadas de DNA com uma enzima de restrição para determinar se essa enzima pode digerir prestained DNA (Figura 1).
	<ol>
<li>No dia seguinte, adicionar 20 U da enzima de restrição, 3 µ l de buffer apropriado (tabela 2) e água destilada, água esterilizada e filtrada para um total de 30 µ l. Para cada reação enzimática, escolha o buffer com a mais alta eficiência de corte, que pode ser encontrada no site do fabricante.</li>
		<li>Coloque as reações em um banho de água à temperatura de atividade enzimática ideal, listada na tabela 2 para as 6 enzimas usadas em Miranda et al., por 2-4 h (tabela 2)25.</li>
		<li>Pare a reação adicionando 2 µ l de pH de EDTA 0,5 M 8.0.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Electroeluting manchado de DNA em um Gel de Agarose
<ol><li>Remover os lados do molde gel de 24,5 x 21,8 cm (etapa 1.2.2) e coloque o gel na caixa de electroforese do gel. Despeje a caixa de 2,5 L de 1 x TAE de buffer. Retire cuidadosamente o pente gel de gel, assim que os poços são acessíveis33.</li>
	<li>Pipetar as reações de enzima de restrição em um filme plástico e combinar cada reação com 6 x tintura de carregamento. Para cada solução de reação, adicione 1 µ l de 6 x carregamento tintura por 5-6 µ l da solução de DNA (1x). Em seguida Pipetar as reações (contendo o corante de carregamento, < 18 µ l) nos poços.</li>
	<li>Misture 1 µ l de escada de 1 kb, 9 µ l de TE 1x e 2 µ l de 6 x tintura de carregamento. Carregar a solução para os poços que ladeiam as outras soluções.</li>
	<li>Cubra a caixa de gel com papel preto ou azul escuro ou tecido. A caixa de gel de conectar uma fonte de alimentação, conjunto de alimentação para 30 V e executá-lo durante a noite (15-20 h). Apague as luzes, enquanto o gel está sendo executado, para evitar a photocleavage do DNA etiquetado.</li>
	<li>Na manhã seguinte, desligue a fonte de alimentação. Pegue o gel usando a bandeja e transferi-lo para um recipiente com 45 brometo de etídio µ l e L 1 de 1 x TAE de buffer. Armazene o recipiente na temperatura ambiente no escuro ou de cobertura em papel alumínio para evitar a exposição à luz. Deixe o gel mancha pelo menos 45 min à temperatura ambiente. Cuidado: Use brometo de etídio com luvas e óculos de segurança. Quando limpar o recipiente contendo a solução de brometo de etídio e jogando fora o gel, consultar suas diretrizes de eliminação de Estados para determinar como lidar com brometo de etídio usados; Além disso, outras manchas podem ser utilizadas em vez de brometo de etídio.</li>
</ol>5. imagem latente do Gel do Agarose
<ol><li>Coloque o gel em cima de um transiluminador de luz azul, que emite luz de saída máximo entre 400-500 nm. Tire fotos com a câmera acoplada à estação. Atenção: Certifique-se de usar a capa para o iluminador e colocar óculos de proteção antes de ligar a fonte de luz. Nota: Este passo pode também ser concluído usando qualquer fonte de luz UV ou padrão do gel de scanner.</li>
	<li>Visualizar as fotos em ImageJ arrastando o arquivo para a barra de status do ImageJ e a imagem irá aparecer.</li>
	<li>Determine a taxa de digestão para a experiência, comparando as bandas no gel para o padrão esperado em silico gel. Para determinar a taxa de digestão, o número de bandas experimentais é dividido pelo número esperado de bandas de DNA24,25. Se o padrão de banda de DNA digerido experimental tem o padrão esperado, a taxa de digestão é 1. Se o padrão tem fragmentos mais do que o esperado, a taxa de digestão é maior que 1. Se o padrão tem menos fragmentos do que o esperado, a taxa de digestão é menor que 1.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Teague, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+human+genome+structure+by+single-molecule+analysis.">High-resolution human genome structure by single-molecule analysis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (24), 10848-10853 (2010).</li><li>Ananiev, G. 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Os autores não têm nada para divulgar.

A fim de digerir fluorescente etiquetadas DNA (Figura 1), uma série de passos são necessários. Primeiro, DNA está manchada com um fluorocromo durante a noite. DNA pode ser incubada com dímeros cianina, por um período mais curto de tempo; no entanto, Carlsson et al encontraram que o DNA criado bandas duplas para cada tamanho de DNA devido à coloração incompleta20. Para remediar esta situação, o DNA pode ser manchado durante a noite ...

A série TOTO (TOTO-1, YOYO-1, POPO-1, BOBO-1, TOTO-3, YOYO-3, 3-POPO e BOBO-3; A tabela 1) é utilizado em uma ampla variedade de experiências onde a visualização do DNA é necessário1,2,3,4,5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17. a família de dímero de cianina é amplamente utilizada devido a sua alta afinidade por moléculas de DNA a18,19,20, sensibilidade e rendimento quântico. Cianina dímero corantes tem grande seletividade para ADN encalhado dobro e quando intercaladas têm um aumento de 100 a 1000 vezes de fluorescência21. Corantes de piridínio (YOYO-1, TOTO-1, 3-YOYO e TOTO-3) tem um emissão comprimento de onda menor do que seus quinolium tingir (BOBO-1, 1-POPO, BOBO-3 e POPO-3) homólogos (tabela 1)22. Além disso, o rendimento quântico de dímeros cianina intercalados no DNA é alto (0,2 - 0,6)22. No entanto, usando uma enzima para determinação do perfil de metilação de uma molécula de DNA2 ou esticar23 de uma molécula de DNA já manchada com uma tintura fluorescente requer um método para determinar que enzimas digerirá DNA manchada. Qualquer tipo de corante que se intercala no ADN ou qualquer enzima que dá um padrão discernível do substrato DNA pode ser usada para este método.
Meng et al primeiro determinada a taxa de digestão de DNA prestained através de eletroforese em gel usando uma variedade de diferentes corantes24. Miranda et al analisaram no mais profundo de olhar para a família de totó de corantes. Ambos determinados a taxa de digestão de DNA manchada para ver se DNA manchada com uma tintura determinada pode ser digerido com uma enzima de restrição,25. Outros métodos de estudam efeitos vinculativos de corantes intercalados com DNA usando Pinça óptica26 ou NMR27. Qualquer método requer equipamento especializado; Considerando que, esse método permite que o equipamento que a maioria dos laboratórios de biologia molecular têm para determinar se uma tintura interfere com uma enzima de restrição de digestão.
Além disso, em outros métodos para medir o comprimento de uma determinada molécula, mapeamento óptico tem alongado imaculadas moléculas de DNA em uma superfície e digerido DNA para determinar a extensão e tamanho dos fragmentos. Intercalação de corante foi mostrada para aumentar o comprimento de contorno das moléculas de DNA fluorescente manchadas e dependendo do corante usado, os contorno dos comprimentos diferentes21. Este método tem sido utilizado em uma variedade de genomas1,3,4,6,13,28,29,30, 31. no entanto, se moléculas foram pre-manchadas, dependendo da tintura e a enzima, a enzima não pode ser capaz de cortar o DNA manchada com um determinado corante. Portanto, este método determina se o DNA manchada com uma tintura determinada pode ser digerido com uma enzima. Além disso, dependendo da concentração de corante e o corante utilizado, a mobilidade do DNA bandas em um gel irão migrar mais lentamente do que o DNA nativo devido a desenrolar parcial do backbone DNA para fazer o quarto para a tintura inserir entre pares de bases32 .
No entanto, às vezes estes corantes podem parcialmente ou completamente, inibir a ação de determinadas enzimas de restrição7,24. Isto é pensado para ser devido a uma mudança estrutural no causada pelo acessório do corante fluorescente, que pode impedir que a enzima reconhecendo sua sequência específica de DNA. Compreender como estes corantes afetam as enzimas de restrição pode ajudar em experiências onde o perfil de metilação ou trecho de DNA manchada é necessário.
Em nosso método, o DNA foi manchada com um fluorocromo de interesse e digerido com uma enzima de restrição. Então o DNA foi electrophoresed em um gel, cuja imagem, e a taxa de digestão de enzima de restrição foi medida. As enzimas de restrição foram escolhidas com base no padrão de corte em um gel. Muitas bandas causaram a sobreposição das bandas de DNA e muito poucas bandas não deu uma imagem completa da molécula de DNA. Há um ponto doce para ser capaz de determinar o perfil da molécula de DNA digerido; Portanto, dependerá do DNA usado e a enzima. Uma vantagem deste método é sua simplicidade; exige somente equipamentos utilizados em uma eletroforese de gel e digestão de restrição.

<table><tbody><tr><td>Unmethylated lambda DNA</td><td>NEB</td><td>N3013S</td><td></td></tr><tr><td>YOYO-1</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Y3601</td><td></td></tr><tr><td>TOTO-1</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T3600</td><td></td></tr><tr><td>POPO-1</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P3580</td><td></td></tr><tr><td>BOBO-1</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>B3582</td><td></td></tr><tr><td>YOYO-3</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Y3606</td><td></td></tr><tr><td>TOTO-3</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T3604</td><td></td></tr><tr><td>POPO-3</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P3584</td><td></td></tr><tr><td>BamHI</td><td>NEB</td><td>R0136S</td><td></td></tr><tr><td>PmlI</td><td>NEB</td><td>R0532S</td><td></td></tr><tr><td>ScaI</td><td>NEB</td><td>R3122S</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI&amp;nbsp;</td><td>NEB</td><td>R0101S</td><td></td></tr><tr><td>HindIII</td><td>NEB</td><td>R0104S</td><td></td></tr><tr><td>SmaI</td><td>NEB</td><td>R0141S</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Fisher</td><td>BP152-1</td><td>Irritant</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher</td><td>S316-212</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Fisher</td><td>S25358</td><td>Corrosive and irritant</td></tr><tr><td>Buffer 1</td><td>NEB</td><td>B7201S</td><td>NEB 1.1</td></tr><tr><td>Buffer 2</td><td>NEB</td><td>B7202S</td><td>NEB 2.1</td></tr><tr><td>Buffer 3</td><td>NEB</td><td>B7204S</td><td>NEB Cutsmart</td></tr><tr><td>High gelling temperature agarose gel</td><td>Lonza</td><td>50041</td><td></td></tr><tr><td>Acetic Acid</td><td>Fisher</td><td>S25118</td><td>Hazardous</td></tr><tr><td>Blue light transilluminator</td><td>Dark Reader</td><td>DR196</td><td>Wear correct eyewear&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Ethidium bromide</td><td>Fisher</td><td>15585011</td><td>Carcinogen; other alternatives are Nancy 520, Gel red, etc.</td></tr><tr><td>Cannon EOS Rebel T3I camera</td><td>Cannon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Apogee Model H4</td><td>Biorad</td><td>1704510</td><td></td></tr><tr><td>Power Pac Basic Power Supply</td><td>Biorad</td><td>1645050&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP525-25</td><td></td></tr><tr><td>Bromophenol blue</td><td>Fisher Scientific</td><td>B-392</td><td></td></tr><tr><td>Xylene Cyanol</td><td>Eastmen</td><td>T1579</td><td></td></tr></tbody></table>

determining if dna stained with a cyanine dye can be digested with restriction enzymes

Visualização do DNA para microscopia de fluorescência utiliza uma variedade de corantes como cianina corantes. Estes corantes são utilizados devido a sua alta afinidade e sensibilidade para DNA. A fim de determinar se as moléculas de DNA são comprimento total após a conclusão do experimento, um método é necessário para determinar se as moléculas manchadas são comprimento total por digestão com enzimas de restrição de DNA. No entanto, DNA manchada pode inibir as enzimas, portanto, um método é necessária para determinar que as enzimas se poderia usar para fluorocromo manchado de DNA. Neste método, o DNA está manchada com uma tintura de cianina durante a noite para permitir que o corante e DNA para equilibrar. Próximo, manchada de DNA é digerido com uma enzima de restrição, carregado em um gel e electrophoresed. As bandas de síntese de DNA experimentais são comparadas com um digest em silico para determinar a atividade de enzima de restrição. Se há o mesmo número de bandas como esperado, a reação é completa. Bandas mais do que o esperado indicam digestão parcial e menos bandas indicam digestão incompleta. A vantagem desse método é sua simplicidade e usa equipamento que precisaria de uma cientista para uma enzima de restrição do ensaio e electroforese do gel. Uma limitação deste método é que as enzimas disponíveis para a maioria dos cientistas são enzimas comercialmente disponíveis; no entanto, poderia ser usadas qualquer enzimas de restrição.

A fim de determinar que se um corante intercalante afetará uma enzima de restrição, digerindo o DNA, a ordem correta dos passos deve ser seguidos (Figura 1). Uma vez que o DNA é manchada e digerido com uma determinada enzima, uma foto do gel pode ser tomada para determinar o número de fragmentos e seu tamanho (Figura 2). A fim de determinar a eficiência da enzima, o número total de bandas visíveis esperados, dividido pelo...

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Determining if DNA Stained with a Cyanine Dye Can Be Digested with Restriction Enzymes

Moléculas de DNA para microscopia de fluorescência de coloração permite que um cientista para visualizá-las durante um experimento. O método apresentado aqui, as moléculas de DNA são previamente coradas com corantes fluorescentes e digeridas com metilação e enzimas de restrição não-metilação sensíveis.

Determinar se o DNA manchada com um cianina tintura pode ser digerido com enzimas de restrição

Visualization of DNA for fluorescence microscopy utilizes a variety of dyes such as cyanine dyes. These dyes are utilized due to their high affinity and ...

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

8.7K visualizações.  University of Nebraska - Kearney. Moléculas de DNA para microscopia de fluorescência de coloração permite que um cientista para visualizá-las durante um experimento. O método apresentado aqui, as moléculas de DNA são previamente coradas com corantes fluorescentes e digeridas com metilação e enzimas de restrição não-metilação sensíveis.

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DNA Electrophoresis Using Thiazole Orange Instead of Ethidium Bromide or Alternative Dyes

DNA gel electrophoresis using agarose is a common tool in molecular biology laboratories, allowing separation of DNA fragments by size. After separation, DNA is visualized by staining. This article demonstrates how to use thiazole orange to stain DNA. Thiazole orange compares favorably to common staining methods, in that it is sensitive, inexpensive, excitable with UV or blue light (to prevent sample damage), and safer than ethidium bromide. Labs already equipped to run DNA electrophoresis experiments using ethidium bromide can generally switch dyes with no additional changes to existing protocols, using UV light for detection. Blue-light detection to avoid sample damage can additionally be achieved with a blue-light source and emission filter. Labs already equipped for blue-light detection can simply switch dyes with no additional changes to existing protocols.

Here, we present a protocol to use thiazole orange for the detection of DNA in gel electrophoresis experiments. The use of thiazole orange allows elimination of ethidium bromide, and fluorescence detection can be achieved with either UV or blue light.

Eletroforese de DNA usando tiazol laranja em vez de brometo de etídio ou corantes alternativos

DNA gel electrophoresis using agarose is a common tool in molecular biology laboratories, allowing separation of DNA fragments by size. After separation, ...

Bioquímica

In-Nucleus Hi-C in Drosophila Cells

The genome is organized into topologically associating domains (TADs) delimited by boundaries that isolate interactions between domains. In Drosophila, the mechanisms underlying TAD formation and boundaries are still under investigation. The application of the in-nucleus Hi-C method described here helped to dissect the function of architectural protein (AP)-binding sites at TAD boundaries isolating the Notch gene. Genetic modification of domain boundaries that cause loss of APs results in TAD fusion, transcriptional defects, and long-range topological alterations. These results provided evidence demonstrating the contribution of genetic elements to domain boundary formation and gene expression control in Drosophila. Here, the in-nucleus Hi-C method has been described in detail, which provides important checkpoints to assess the quality of the experiment along with the protocol. Also shown are the required numbers of sequencing reads and valid Hi-C pairs to analyze genomic interactions at different genomic scales. CRISPR/Cas9-mediated genetic editing of regulatory elements and high-resolution profiling of genomic interactions using this in-nucleus Hi-C protocol could be a powerful combination for the investigation of the structural function of genetic elements.

The genome is organized in the nuclear space into different structures that can be revealed through chromosome conformation capture technologies. The in-nucleus Hi-C method provides a genome-wide collection of chromatin interactions in Drosophila cell lines, which generates contact maps that can be explored at megabase resolution at restriction fragment level.

In-Nucleus Hi-C em Células Drosophila

The genome is organized into topologically associating domains (TADs) delimited by boundaries that isolate interactions between domains. In Drosophila, ...

Genética

Captura de Conformação Cromossômica (3C) para Pesquisa e Ensino de Graduação

Getting an A with the 3Cs: Chromosome Conformation Capture for Undergraduates

Chromosome conformation capture (3C) is a powerful tool that has spawned a family of similar techniques (e.g., Hi-C, 4C, and 5C, referred to here as 3C techniques) that provide detailed information of the three-dimensional organization of chromatin. The 3C techniques have been used in a wide range of studies, from monitoring the changes in chromatin organization in cancer cells to identifying enhancer contacts made with gene promoters. While many of the studies using these techniques are asking big genome-wide questions with intricate sample types (i.e., single-cell analysis), what is often lost is that the 3C techniques are grounded in basic molecular biology methods that are applicable to a broad range of studies. By addressing tightly focused questions of chromatin organization, this cutting-edge technique can be used to enhance the undergraduate research and teaching lab experience. This paper presents a 3C protocol and provides adaptations and points of emphasis for implementation at primarily undergraduate institutions in undergraduate research and teaching experiences.

Autor em destaque: Obtendo um A com os 3Cs: Captura de conformação cromossômica para alunos de graduação  

Here, we present an adaption of the chromosome conformation capture (3C) technique in detail with an emphasis on undergraduate involvement and learning.

Obtendo um A com os 3Cs: Captura de Conformação Cromossômica para Graduandos

Chromosome conformation capture (3C) is a powerful tool that has spawned a family of similar techniques (e.g., Hi-C, 4C, and 5C, referred to here as 3C ...

Single-Molecule Dwell-Time Analysis of Restriction Endonuclease-Mediated DNA Cleavage

This novel total internal reflection fluorescence microscopy-based assay facilitates the simultaneous measurement of the length of the catalytic cycle for hundreds of individual restriction endonuclease (REase) molecules in one experiment. This assay does not require protein labeling and can be carried out with a single imaging channel. In addition, the results of multiple individual experiments can be pooled to generate well-populated dwell-time distributions. Analysis of the resulting dwell-time distributions can help elucidate the DNA cleavage mechanism by revealing the presence of kinetic steps that cannot be directly observed. Example data collected using this assay with the well-studied REase, EcoRV - a dimeric Type IIP restriction endonuclease that cleaves the palindromic sequence GAT&#8595;ATC (where &#8595; is the cut site) - are in agreement with prior studies. These results suggest that there are at least three steps in the pathway to DNA cleavage that is initiated by introducing magnesium after EcoRV binds DNA in its absence, with an average rate of 0.17 s-1 for each step.

Using quantum-dot-labeled DNA and total internal reflection fluorescence microscopy, we can investigate the reaction mechanism of restriction endonucleases while using unlabeled protein. This single-molecule technique allows for massively multiplexed observation of individual protein-DNA interactions, and data can be pooled to generate well-populated dwell-time distributions.

Análise de tempo de permanência de molécula única de clivagem de DNA mediada por endonuclease de restrição

This novel total internal reflection fluorescence microscopy-based assay facilitates the simultaneous measurement of the length of the catalytic cycle for ...

DNA-based Fish Species Identification Protocol

We have developed a fast, simple, and accurate DNA-based screening method to identify the fish species present in fresh and processed seafood samples. This versatile method employs PCR amplification of genomic DNA extracted from fish samples, followed by restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis to generate fragment patterns that can be resolved on the Agilent 2100 Bioanalyzer and matched to the correct species using RFLP pattern matching software.
The fish identification method uses a simple, reliable, spin column- based protocol to isolate DNA from fish samples. The samples are treated with proteinase K to release the nucleic acids into solution. DNA is then isolated by suspending the sample in binding buffer and loading onto a micro- spin cup containing a silica- based fiber matrix. The nucleic acids in the sample bind to the fiber matrix. The immobilized nucleic acids are washed to remove contaminants, and total DNA is recovered in a final volume of 100 &mu;l. The isolated DNA is ready for PCR amplification with the provided primers that bind to sequences found in all fish genomes. The PCR products are then digested with three different restriction enzymes and resolved on the Agilent 2100 Bioanalyzer. The fragment lengths produced in the digestion reactions can be used to determine the species of fish from which the DNA sample was prepared, using the RFLP pattern matching software containing a database of experimentally- derived RFLP patterns from commercially relevant fish species.

This publication describes how to use the Agilent Fish Species Identification System to identify the species of a fish by extracting DNA and performing PCR and RFLP analysis.

Baseados em DNA Peixe Protocolo Identificação de Espécies

We have developed a fast, simple, and accurate DNA-based screening method to identify the fish species present in fresh and processed seafood samples. ...

Biologia

<meta charset="utf8"></head><body>Estudando as interações TRF1/2 com DNA telomérico usando ensaio de molécula única

Analyzing Telomeric Protein-DNA Interactions Using Single-Molecule Magnetic Tweezers

Telomeres, the protective structures at the ends of chromosomes, are crucial for maintaining cellular longevity and genome stability. Their proper function depends on tightly regulated processes of replication, elongation, and damage response. The shelterin complex, especially Telomere Repeat-binding Factor 1 (TRF1) and TRF2, plays a pivotal role in telomere protection and has emerged as a potential anti-cancer target for drug discovery. These proteins bind to the repetitive telomeric DNA motif TTAGGG, facilitating the formation of protective structures and recruitment of other telomeric proteins. Structural methods and advanced imaging techniques have provided insights into telomeric protein-DNA interactions, but probing the dynamic processes requires single-molecule approaches. Tools like magnetic tweezers, optical tweezers, and atomic force microscopy (AFM) have been employed to study telomeric protein-DNA interactions, revealing important details such as TRF2-dependent DNA distortion and telomerase catalysis. However, the preparation of single-molecule constructs with telomeric repetitive motifs continues to be a challenging task, potentially limiting the breadth of studies utilizing single-molecule mechanical methods. To address this, we developed a method to study interactions using full-length human telomeric DNA with magnetic tweezers. This protocol describes how to express and purify TRF2, prepare telomeric DNA, set up single-molecule mechanical assays, and analyze data. This detailed guide will benefit researchers in telomere biology and telomere-targeted drug discovery.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor em destaque: Técnicas avançadas de molécula única para investigar interações proteína-DNA telomérico

This protocol demonstrates using single-molecule magnetic tweezers to study interactions between telomeric DNA-binding proteins (Telomere Repeat-binding Factor 1 [TRF1] and TRF2) and long telomeres extracted from human cells. It describes the preparatory steps for telomeres and telomeric repeat-binding factors, the execution of single-molecule experiments, and the data collection and analysis methods.

Determinar se o DNA manchada com um cianina tintura pode ser digerido com enzimas de restrição

Resumo

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Eletroforese de DNA usando tiazol laranja em vez de brometo de etídio ou corantes alternativos

In-Nucleus Hi-C em Células Drosophila

Obtendo um A com os 3Cs: Captura de Conformação Cromossômica para Graduandos

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Análise de tempo de permanência de molécula única de clivagem de DNA mediada por endonuclease de restrição

Baseados em DNA Peixe Protocolo Identificação de Espécies

Analisando interações proteína-DNA telomérico usando pinças magnéticas de molécula única

Analisando interações proteína-DNA telomérico usando pinças magnéticas de molécula única

Analisando interações proteína-DNA telomérico usando pinças magnéticas de molécula única