Bu araştırma için genel tıbbi bilim (NIGMS) (5605100122001), bir bileşeni Nebraska Üniversitesi Kearney (UNK) yaz öğrenci araştırma programı (SSRP) ve UNK yanı sıra ulusal kurumları Sağlık (NIH) Ulusal Enstitüsü tarafından finanse edildi Lisans araştırma bursu (URF).

1. hazırlanması boyalar, tamponlar ve özel jel
<ol><li>
Aşağıdaki çözümleri DNA veya lekeli DNA hazım boyama için hazırlayın.
	<ol>
<li>1 x TE (Tris-HCl ve ethylenediaminetetraacetic asit; hazırlamak EDTA) arabelleği 10 mM Tris-HCl ve 1 mM EDTA mezun silindir veya volumetric flask kullanarak. (18-25 ° C) oda sıcaklığında saklayın.</li>
		<li>Her boya aliquots olun: TOTO-1, YOYO-1, POPO-1, BOBO-1, TOTO-3, YOYO-3, POPO-3, BOBO-3 (tablo 1). 1 mM boya koyu amber içine 4 µL pipet veya 1,5 mL tüp siyah ve 1 x TE 36 µL eklemek, pipet kullanarak karıştırın; Bu konsantrasyon 100 µM boya çözüm (40 µL toplam) yapar. Her boya için bu adımı tamamlayın. 4 ° C'de mağaza Not: photobleaching veya boya bozulma önlemek için ışık boya kullanılmasını önlemek.</li>
		<li>Arabellek 1 10 mM Bis-Tris-propan-HCl, 10 mM MgCl2ve 100 µg/mL sığır serum albumin (BSA) kullanarak hazırlayın. Arabellek 2-50 mM NaCl, kullanımı hazırlamak 10 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2ve 100 µg/mL BSA. Tampon 3 50 mM potasyum asetat, 20 mM Tris-asetat, 10 mM magnezyum asetat ve 100 µg/mL BSA kullanarak hazırlayın. Her enzim çalışması için belirli bu arabellekleri birini gerektirir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Aşağıdaki çözümleri Jel Elektroforez için hazırlayın.
	<ol>
<li>6 yükleme x boya %0.25 bromophenol birleştirerek mavi, olun % 0.25 Ksilen cyanol, % 15 Ficoll dH2O. mağaza oda sıcaklığında.</li>
		<li>Jel, dışarı yüksek jelleşme sıcaklık (HGT) özel bir Erlenmeyer flask 0,07 g tartmak % 0.7 özel yapmak için 1 x TAE arabellek 100 mL ekleyin ve ters bir kabı balonun üstüne yerleştirin.<ol>
<li>Çözüm sıcak tabakta ısı kadar şişesi ve üst için kayan nokta alt formda kabarcıklar başlayacak.</li>
			<li>Çözüm sıcak plaka kaldırmak için balonun ile çıplak bir el dokundu ve jel kuyuları oluşturmak için jel tarak ile 24.5 cm x 21,8 cm jel kalıp içine dökün kadar çözüm soğumaya bırakın.</li>
			<li>Pipet ucu ile haşhaş tarafından baloncuklar tarak ya da jel yüzeyi kaldırmak ve en az 15 dakika boyunca katılaşmaya jel izin. Bu jel veya kirlenme kurutma önlemek 1 hafta için plastik wrap sarılı bir buzdolabı (4 ° C) depolanabilir. Nasıl çalıştırılacağı hakkında daha fazla bilgi için bir jel başvurmak için Lee vd. 33 . Not: 30 bireysel wells ile jel tarak kullanın. Her şey 4.5 mm 2 mm derinliğe ile geniş olmalıdır. Kuyu yüksekliğini jel kutusu dökülür, miktarına bağlı olacaktır.</li>
		</ol>
</li>
		<li>1 x TAE (Tris - asetat - EDTA) arabelleği 40 mM Tris-HCl, 20 mM Asetik asit ve 1 mM EDTA kullanarak hazırlayın. (18-25 ° C) oda sıcaklığında saklayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. lekeli DNA hazırlanması
<ol><li>
Lambda DNA (300-800 ng) boyalar farklı aliquots kullanarak leke. Her boya (tablo 1) test, restriksiyon enzimi başına 48 reaksiyonlar olmak üzere toplam altı farklı konsantrasyonlarda olacaktır. Aşağıdaki işlem için 1 tepki (şekil 1) bir küme özetliyor.
	<ol>
<li>1 x TE 100 kullanarak lambda DNA seyreltik ng / µL. mağaza 4 ° c ' Bir çözüm 300 µL hacmi ile olun.</li>
		<li>Bazlar lambda DNA leke. "Denemeler" den beklenen her grup için 75-100 ng/bant tahmin ediyoruz. Boya konsantrasyonları 1.9 µM, 3.8 µM, 19.4 µM, 32.2 µM, 48,3 µM, 63,5 µM üretmek için uygun miktarda ekleyebilirsiniz / 100 ng DNA'ın.</li>
		<li>Gecede kuluçkaya (15 h - 18 h) 4 ° C'de</li>
		<li>Denetim25hareket günahı bir tepki bırak. Not: bazlar DNA sindirim tepki için kullanın. Metilasyon duyarlı enzimler DNA metillenmiş bölgelerde kesemezsin ve eksik bir sindirim bir görünüm verecektir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. restriksiyon enzimi tahlil hazırlanması
<ol><li>
Özet Bu enzim prestained DNA (şekil 1) sindirmek olabilir belirlemek için bir restriksiyon enzimi ile DNA lekeli.
	<ol>
<li>Ertesi gün 20 U restriksiyon enzimi, 3 µL uygun arabellek (Tablo 2) ve toplam 30 µL distile, autoclaved ve süzülmüş su ekleyin. Her enzim reaksiyon için arabellek üreticinin Web sitesinde bulunabilir en yüksek kesme verimliliği ile seçin.</li>
		<li>Maschmann ve arkiçinde kullanılan 6 enzimler için Tablo 2'de listelenen en iyi enzim aktivitesinin sıcaklığında su banyosu tepkiler yer., 2-4 h (Tablo 2)25.</li>
		<li>Reaksiyon 0,5 M EDTA pH 8.0 2 µL ekleyerek durdurmak.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. bir özel jel DNA'da lekeli Electroeluting
<ol><li>Taraf (Adım 1.2.2) 24.5 cm x 21,8 cm jel kalıptan çıkarın ve jel Jel Elektroforez kutusuna yerleştirin. 1 x TAE arabelleği 2.5 L kutusu dökün. Dikkatli bir şekilde böylece kuyu erişilebilir33jel tarak jel çıkarın.</li>
	<li>Restriksiyon enzimi tepkiler üzerine bir plastik film pipette ve her reaksiyon boya yükleme x 6 ile birleştirir. Her reaksiyon çözüm için boya başına 5-6 µL DNA çözüm (1 x) yükleme x 6 1 µL ekleyin. Öyleyse karşılıklar pipette (yükleme boya içeren < 18 µL) kuyu içine.</li>
	<li>1 kb merdivenin 1 µL, 1 x TE 9 µL ve boya yükleme x 6 2 µL karıştırın. Çözüm başka çözümler kanattan kuyu yükleyin.</li>
	<li>Koyu mavi veya siyah kağıt veya kumaş ile jel kutu örtmek. Jel kutusu 30 V güç kaynağı ayarlayın ve gecede çalıştırın bir güç kaynağı için (15-20 h) bağlayın. Jel, photocleavage etiketli DNA'ın önlemek için çalışırken ışıkları kapatın.</li>
	<li>Ertesi sabah güç kaynağını kapatmak. Tepsi kullanarak jel al ve bir konteyner ile 45 µL etidyum bromür ve 1 L 1 x TAE arabelleği aktarmak. Karanlık oda sıcaklığında veya kapak konteyner folyo ışığa maruz kalma önlemek için saklayın. Leke, oda sıcaklığında en az 45 dakika için jel izin. Dikkat: etidyum bromür kullanım ile eldiven ve koruyucu gözlük giymek. Konteynerin etidyum bromür solüsyon içeren ve jel atmadan temizlerken, kullanılan etidyum bromür ile başa çıkmak konusunda bilgi almak senin Birleşik elden çıkarma yönergelere başvurun; Ayrıca, diğer lekeleri etidyum bromür yerine yararlı.</li>
</ol>5. özel jel görüntüleme
<ol><li>Jel 400-500 nm arasında en fazla ışık verimi yayar mavi bir ışık transilluminator üstüne yerleştirin. Merkeze bağlı kamera ile fotoğraf çekmek. Dikkat: kapak ışığı için kullanın ve ışık kaynağında dönüm önce koruyucu gözlük koymak emin olun. Not: Bu adımı da herhangi bir UV ışık kaynağı veya standart jel tarayıcı kullanılarak tamamlanabilir.</li>
	<li>Dosyayı ImageJ durum çubuğuna sürükleyerek ImageJ içinde resimleri görüntüleme ve görüntü çıkacaktır.</li>
	<li>Sindirim oranı deneme için beklenen silico jel desen jöleye bands karşılaştırarak belirle. Sindirim oranı belirlemek için deneysel grup dizi DNA bantları24,25beklenen numarasına göre bölünür. Deneysel sindirilir DNA bant deseni beklenen desen varsa, sindirim oranı 1'dir. Desen beklenenden daha fazla parçaları varsa, sindirim 1'den büyük oranıdır. Desen beklenenden daha az parçaları varsa, sindirim birden oranıdır.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Teague, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+human+genome+structure+by+single-molecule+analysis.">High-resolution human genome structure by single-molecule analysis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (24), 10848-10853 (2010).</li><li>Ananiev, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+mapping+discerns+genome+wide+DNA+methylation+profiles.">Optical mapping discerns genome wide DNA methylation profiles.</a> BMC Mol Biol. 9, 68 (2008).</li><li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+rice+genome+sequence+by+optical+mapping.">Validation of rice genome sequence by optical mapping.</a> BMC Genomics. 8, 278 (2007).</li><li>Reslewic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+shotgun+optical+mapping+of+Rhodospirillum+rubrum.">Whole-genome shotgun optical mapping of Rhodospirillum rubrum.</a> Appl Environ Microbiol. 71 (9), 5511-5522 (2005).</li><li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+shotgun+optical+mapping+of+Rhodobacter+sphaeroides+strain+2.4.1+and+its+use+for+whole-genome+shotgun+sequence+assembly.">Whole-genome shotgun optical mapping of Rhodobacter sphaeroides strain 2.4.1 and its use for whole-genome shotgun sequence assembly.</a> Genome Res. 13 (9), 2142-2151 (2003).</li><li>Gupta, A., Kounovsky-Shafer, K. L., Ravindran, P., Schwartz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+mapping+and+nanocoding+approaches+to+whole-genome+analysis.">Optical mapping and nanocoding approaches to whole-genome analysis.</a> Microfluidics and Nanofluidics. 20 (44), 1-14 (2016).</li><li>Kounovsky-Shafer, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presentation+of+large+DNA+molecules+for+analysis+as+nanoconfined+dumbbells.">Presentation of large DNA molecules for analysis as nanoconfined dumbbells.</a> Macromolecules. 46 (20), 8356-8368 (2013).</li><li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanochannel+confinement:+DNA+stretch+approaching+full+contour+length.">Nanochannel confinement: DNA stretch approaching full contour length.</a> Lab Chip. 11 (10), 1721-1729 (2011).</li><li>Yu, H., Jo, K., Kounovsky, K. L., de Pablo, J. J., Schwartz, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+propulsion:+chemical+sensing+and+chemotaxis+of+DNA+driven+by+RNA+polymerase.">Molecular propulsion: chemical sensing and chemotaxis of DNA driven by RNA polymerase.</a> J Am Chem Soc. 131 (16), 5722-5723 (2009).</li><li>Lam, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+mapping+on+nanochannel+arrays+for+structural+variation+analysis+and+sequence+assembly.">Genome mapping on nanochannel arrays for structural variation analysis and sequence assembly.</a> Nat Biotechnol. 30 (8), 771-776 (2012).</li><li>Cao, H., Tegenfeldt, J. O., Austin, R. H., Chou, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gradient+nanostructures+for+interfacing+microfluidics+and+nanofluidics.">Gradient nanostructures for interfacing microfluidics and nanofluidics.</a> Applied Physics Letters. 81 (16), 3058-3060 (2002).</li><li>Gupta, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+analysis+reveals+widespread+structural+variation+in+multiple+myeloma.">Single-molecule analysis reveals widespread structural variation in multiple myeloma.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (25), 7689-7694 (2015).</li><li>Wu, C. W., Schramm, T. M., Zhou, S., Schwartz, D. C., Talaat, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+mapping+of+the+Mycobacterium+avium+subspecies+paratuberculosis+genome.">Optical mapping of the Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis genome.</a> BMC Genomics. 10, 25 (2009).</li><li>Jo, K., Schramm, T. M., Schwartz, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-molecule+barcoding+system+using+nanoslits+for+DNA+analysis+:+nanocoding.">A single-molecule barcoding system using nanoslits for DNA analysis : nanocoding.</a> Methods Mol Biol. 544, 29-42 (2009).</li><li>Jo, K., Chen, Y. L., de Pablo, J. J., Schwartz, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elongation+and+migration+of+single+DNA+molecules+in+microchannels+using+oscillatory+shear+flows.">Elongation and migration of single DNA molecules in microchannels using oscillatory shear flows.</a> Lab Chip. 9 (16), 2348-2355 (2009).</li><li>Jo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-molecule+barcoding+system+using+nanoslits+for+DNA+analysis.">A single-molecule barcoding system using nanoslits for DNA analysis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (8), 2673-2678 (2007).</li><li>Reccius, C. H., Mannion, J. T., Cross, J. D., Craighead, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compression+and+free+expansion+of+single+DNA+molecules+in+nanochannels.">Compression and free expansion of single DNA molecules in nanochannels.</a> Phys Rev Lett. 95 (26), 268101 (2005).</li><li>Staerk, D., Hamed, A. A., Pedersen, E. B., Jacobsen, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bisintercalation+of+homodimeric+thiazole+orange+dyes+in+DNA:+effect+of+modifying+the+linker.">Bisintercalation of homodimeric thiazole orange dyes in DNA: effect of modifying the linker.</a> Bioconjug Chem. 8 (6), 869-877 (1997).</li><li>Spielmann, H. P., Wemmer, D. E., Jacobsen, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solution+structure+of+a+DNA+complex+with+the+fluorescent+bis-intercalator+TOTO+determined+by+NMR+spectroscopy.">Solution structure of a DNA complex with the fluorescent bis-intercalator TOTO determined by NMR spectroscopy.</a> Biochemistry. 34, 8542-8553 (1995).</li><li>Carlsson, C., Jonsson, M., Akerman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+bands+in+DNA+gel+electrophoresis+caused+by+bis-intercalating+dyes.">Double bands in DNA gel electrophoresis caused by bis-intercalating dyes.</a> Nucleic Acids Res. 23 (13), 2413-2420 (1995).</li><li>Kundukad, B., Yan, J., Doyle, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+YOYO-1+on+the+mechanical+properties+of+DNA.">Effect of YOYO-1 on the mechanical properties of DNA.</a> Soft Matter. 10 (48), 9721-9728 (2014).</li><li>Technologies, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Molecular Probes Handbook: A guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies. , (2010).</li><li>Riehn, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restriction+mapping+in+nanofluidic+devices.">Restriction mapping in nanofluidic devices.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (29), 10012-10016 (2005).</li><li>Meng, X., Cai, W., Schwartz, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+restriction+endonuclease+activity+by+DNA+binding+fluorochromes.">Inhibition of restriction endonuclease activity by DNA binding fluorochromes.</a> J Biomol Struct Dyn. 13 (6), 945-951 (1996).</li><li>Maschmann, A., Kounovsky-Shafer, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+restriction+enzyme+activity+when+cutting+DNA+labeled+with+the+TOTO+Dye+family.">Determination of restriction enzyme activity when cutting DNA labeled with the TOTO Dye family.</a> Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. , 1-12 (2017).</li><li>Biebricker, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+DNA+intercalators+on+DNA+and+DNA-processing+enzymes+elucidated+through+force-dependent+binding+kinetics.">The impact of DNA intercalators on DNA and DNA-processing enzymes elucidated through force-dependent binding kinetics.</a> Nature Communications. 6, 7304 (2015).</li><li>Gunther, K., Mertig, M., Seidel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+and+structural+properties+of+YOYO-1+complexed+DNA.">Mechanical and structural properties of YOYO-1 complexed DNA.</a> Nucleic Acids Res. 38 (19), 6526-6532 (2010).</li><li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clone-free,+single+molecule+map+of+the+domestic+cow+(Bos+taurus)+genome.">A clone-free, single molecule map of the domestic cow (Bos taurus) genome.</a> BMC Genomics. 16, 644 (2015).</li><li>Ray, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+structural+alterations+in+solid+tumor+oligodendroglioma+by+single+molecule+analysis.">Discovery of structural alterations in solid tumor oligodendroglioma by single molecule analysis.</a> BMC Genomics. 14, 505 (2013).</li><li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequence+of+the+model+medicinal+mushroom+Ganoderma+lucidum.">Genome sequence of the model medicinal mushroom Ganoderma lucidum.</a> Nat Commun. 3, 913 (2012).</li><li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+molecule+scaffold+for+the+maize+genome.">A single molecule scaffold for the maize genome.</a> PLoS Genet. 5 (11), e1000711 (2009).</li><li>Sischka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+and+kinetics+between+DNA+and+DNA+binding+ligands.">Molecular mechanisms and kinetics between DNA and DNA binding ligands.</a> Biophys J. 88 (1), 404-411 (2005).</li><li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments.">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J Vis Exp. (62), (2012).</li><li>Zipper, H., Brunner, H., Bernhagen, J., Vitzthum, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigations+on+DNA+intercalation+and+surface+binding+by+SYBR+Green+I,+its+structure+determination+and+methodological+implications.">Investigations on DNA intercalation and surface binding by SYBR Green I, its structure determination and methodological implications.</a> Nucleic Acids Res. 32 (12), e103 (2004).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Fluorescently etiketli DNA (şekil 1)sindirmek amacıyla bir dizi adım gereklidir. İlk olarak, DNA ile bir fluorochrome gecede lekeli. DNA daha kısa bir süre için siyanür dimer ile inkübe; Ancak, Carlsson vd. DNA çift kişilik gruplar her DNA boyutu nedeniyle eksik boyama20için oluşturulan bulundu. Bu sorunu gidermek için DNA çift kişilik grup oluşmasını önlemek için gece Boyanabilen. Bu protokol kritik bir adımdır. Boya i...

TOTO serisi (TOTO-1, YOYO-1, POPO-1, BOBO-1, TOTO-3, YOYO-3, POPO-3 ve BOBO-3; Tablo 1) çeşitli deneyler DNA görselleştirme gerekli1,2,3,4,5,6,7, nerede olarak kullanılmaktadır 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17. siyanür dimer aile onların kuantum verimi, ışık hassasiyeti ve DNA molekülleri18,19,20için yüksek ilgi nedeniyle yaygın olarak kullanılır. Siyanür dimer boyalar Floresans21100-1000 kat artış var büyük seçicilik çift iplikçikli DNA için ve ne zaman ara var. Pyridinium boya maddeler, araçlar (YOYO-1, TOTO-1, YOYO-3 ve TOTO-3) onların quinolium boya daha karşılıkları (Tablo 1)22(BOBO-1, POPO-1, BOBO-3 ve POPO-3) bir daha kısa emisyon dalga boyu var. Aynı zamanda, DNA'ya ara siyanür dimer kuantum verimi yüksektir (0.2 - 0,6)22. Ancak, bir enzim bir DNA molekülü2 metilasyonu profili belirleme veya23 zaten ile floresan boya lekeli bir DNA molekülünün germek için kullanmak ne enzimler lekeli DNA sindirmek belirlemek için bir metod gerekir. DNA'ya intercalates boya herhangi bir tür veya DNA substrat discernable örnek verir herhangi bir enzim için bu yöntemi kullanabilirsiniz.
Meng vd. ilk prestained DNA yoluyla farklı boya24çeşitli kullanarak Jel Elektroforez sindirim oranı belirlenir. Maschmann ve ark. delved derin boyalar TOTO aileye bakmak için. Her ikisi de belirli bir boya ile lekeli DNA restriksiyon enzimi25ile sindirmek Eğer görmek için lekeli DNA sindirim oranı belirlenir. Diğer yöntemler optik cımbız26 veya NMR27kullanarak DNA ile ara boya etkileri bağlama çalışma. Her iki yöntem özel ekipman gerektirir; ise bu yöntem çoğu moleküler biyoloji laboratuarları bir boya olup olmadığını belirlemek zorunda ekipman sağlar, restriksiyon enzimi sindirim ile etkilemektedir.
Ayrıca, belirli bir molekül uzunluğunu ölçmek için diğer yöntemleri, optik eşleme günahı DNA molekülleri bir yüzey üzerinde uzamış ve streç ve parçaları boyutunu belirlemek için DNA sindirilir. Boya enterkalasyon kontur uzunluğu fluorescently lekeli DNA moleküllerinin ve bağlı olarak kullanılan boya artırmak için gösterilmiştir, kontur uzunlukları farklı21. Bu yöntem genleri1,3,4,6,13,28,29,30, çeşitli kullanıldığında vardır 31. molekülleri, boya ve enzim bağlı olarak önceden lekeli olsaydı, ancak, enzim DNA ile belirli bir boya lekeli kesmek mümkün olmayabilir. Bu nedenle, bu yöntem ile belirli bir boya lekeli DNA bir enzim ile sindirilmiş Eğer belirler. Ayrıca, boya ve boya DNA hareketliliğini kullanıldığında, konsantrasyon bağlı olarak bir jel bantlarında daha yavaş boya baz çifti32 arasında eklemek yer açmak için yerel DNA kısmi DNA omurgası gevşemek nedeniyle göç edecek .
Ancak, bazen bu boyalar olabilir kısmen veya tamamen belirli enzimleri7,24eylem inhibe. Bu enzim, belirli sıra tanımasını engelleyebilir floresan boyalar ve eki neden olduğu DNA yapısal bir değişiklik nedeniyle düşünülmektedir. Bu boyalar enzimleri etkilemesi anlamak metilasyonu profil veya uzatma lekeli DNA'ın gerekli olduğu deneylerde yardımcı olabilir.
Bizim yöntem, DNA faiz fluorochrome ile lekeli ve restriksiyon enzimi ile sindirilir. O zaman DNA görüntüsü, bir jel üzerinde electrophoresed ve restriksiyon enzimi sindirim oranı ölçüldü. Enzimleri dayalı bir jel üzerinde kesme desen olarak seçilmiştir. Çok fazla grup örtüşme DNA gruplarından neden ve çok az bantları DNA molekülünün tam bir resim vermek değil. Profil sindirilir DNA molekülünün belirlemek için tatlı bir nokta var; Bu nedenle, kullanılan DNA ve enzim bağlı olacaktır. Bu yöntemin bir avantajı basitliğidir; Sadece bir kısıtlama sindirim ve Jel Elektroforez cihazları gerektirir.

<table><tbody><tr><td>Unmethylated lambda DNA</td><td>NEB</td><td>N3013S</td><td></td></tr><tr><td>YOYO-1</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Y3601</td><td></td></tr><tr><td>TOTO-1</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T3600</td><td></td></tr><tr><td>POPO-1</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P3580</td><td></td></tr><tr><td>BOBO-1</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>B3582</td><td></td></tr><tr><td>YOYO-3</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Y3606</td><td></td></tr><tr><td>TOTO-3</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T3604</td><td></td></tr><tr><td>POPO-3</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P3584</td><td></td></tr><tr><td>BamHI</td><td>NEB</td><td>R0136S</td><td></td></tr><tr><td>PmlI</td><td>NEB</td><td>R0532S</td><td></td></tr><tr><td>ScaI</td><td>NEB</td><td>R3122S</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI&amp;nbsp;</td><td>NEB</td><td>R0101S</td><td></td></tr><tr><td>HindIII</td><td>NEB</td><td>R0104S</td><td></td></tr><tr><td>SmaI</td><td>NEB</td><td>R0141S</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Fisher</td><td>BP152-1</td><td>Irritant</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher</td><td>S316-212</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Fisher</td><td>S25358</td><td>Corrosive and irritant</td></tr><tr><td>Buffer 1</td><td>NEB</td><td>B7201S</td><td>NEB 1.1</td></tr><tr><td>Buffer 2</td><td>NEB</td><td>B7202S</td><td>NEB 2.1</td></tr><tr><td>Buffer 3</td><td>NEB</td><td>B7204S</td><td>NEB Cutsmart</td></tr><tr><td>High gelling temperature agarose gel</td><td>Lonza</td><td>50041</td><td></td></tr><tr><td>Acetic Acid</td><td>Fisher</td><td>S25118</td><td>Hazardous</td></tr><tr><td>Blue light transilluminator</td><td>Dark Reader</td><td>DR196</td><td>Wear correct eyewear&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Ethidium bromide</td><td>Fisher</td><td>15585011</td><td>Carcinogen; other alternatives are Nancy 520, Gel red, etc.</td></tr><tr><td>Cannon EOS Rebel T3I camera</td><td>Cannon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Apogee Model H4</td><td>Biorad</td><td>1704510</td><td></td></tr><tr><td>Power Pac Basic Power Supply</td><td>Biorad</td><td>1645050&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP525-25</td><td></td></tr><tr><td>Bromophenol blue</td><td>Fisher Scientific</td><td>B-392</td><td></td></tr><tr><td>Xylene Cyanol</td><td>Eastmen</td><td>T1579</td><td></td></tr></tbody></table>

determining if dna stained with a cyanine dye can be digested with restriction enzymes

DNA'ın görselleştirme floresan mikroskopi için boyalar siyanür boyalar gibi çeşitli kullanır. Bu boyalar onların yüksek benzeşme ve duyarlılık nedeniyle DNA için kullanılmaktadır. DNA molekülleri deney tamamlandıktan sonra tam uzunlukta olup olmadığını belirlemek için bir yöntem enzimleri ile DNA sindirerek tarafından lekeli molekülleri tam uzunlukta olup olmadığını belirlemek için gereklidir. Bir yöntem için fluorochrome ihtiyacım ne enzimler DNA lekeli belirlemek için gerekli değildir ancak, lekeli DNA enzimleri inhibe. Bu yöntemde, DNA boya ve DNA equilibrate izin veren bir siyanür boya ile bir gecede lekeli. Sonraki, lekeli DNA restriksiyon enzimi ile sindirilmiş, bir jel yüklenen ve electrophoresed. Deneysel DNA Özet bantları restriksiyon enzimi etkinliğini belirlemek için bir silico sindirimi karşılaştırılır. Beklendiği gibi grup aynı dizi Eğer reaksiyon tamamlandıktan. Kısmi sindirim belirtmek beklenenden daha fazla grup ve daha az bantları eksik sindirim gösterir. Bu yöntemin avantajı basitliğidir ve bir bilim adamı için bir restriksiyon enzimi gerekir ekipman kullanır tahlil ve Elektroforez jel. Bu yöntemin bir sınırlama enzimler için çoğu bilim adamı mevcut piyasada bulunan enzimler vardır; Ancak, herhangi bir enzimleri kullanılabilir.

İntercalating bir boya sindirerek DNA restriksiyon enzimi etkilerse, adımları doğru sırada olmalıdır belirlemek için (şekil 1) takip. Bir kez DNA lekeli ve belirli bir enzim ile sindirilmiş, jel resmini parçaları ve büyüklükleri (Şekil 2) sayısını belirlemek için alınabilir. Enzim verimlilik, beklenen görünür bant görünür grup numarasına göre bölünmüş toplam sayısı belirlemek için. Enzim veriml...

Watch this Scientific Journal Video about Determining if DNA Stained with a Cyanine Dye Can Be Digested with Restriction Enzymes at JoVE.com

Determining if DNA Stained with a Cyanine Dye Can Be Digested with Restriction Enzymes

DNA molekülleri floresan mikroskopi için boyama bir deney sırasında görüntüleyebilmesi için bir bilim adamı sağlar. Burada sunulan yönteminde DNA molekülleri ile floresan boyalar önceden lekeli ve metilasyonu ve sigara metilasyonu hassas enzimleri ile sindirilir.

DNA ile bir siyanür boya olabilir olmak sindirilmiş enzimleri ile lekeli belirleme

Visualization of DNA for fluorescence microscopy utilizes a variety of dyes such as cyanine dyes. These dyes are utilized due to their high affinity and ...

determining-if-dna-stained-with-cyanine-dye-can-be-digested-with

Research

JoVE Journal

Biochemistry

8.7K Görüntüleme.  University of Nebraska - Kearney. DNA molekülleri floresan mikroskopi için boyama bir deney sırasında görüntüleyebilmesi için bir bilim adamı sağlar. Burada sunulan yönteminde DNA molekülleri ile floresan boyalar önceden lekeli ve metilasyonu ve sigara metilasyonu hassas enzimleri ile sindirilir.

Video: Determining if DNA Stained with a Cyanine Dye Can Be Digested with Restriction Enzymes

DNA Electrophoresis Using Thiazole Orange Instead of Ethidium Bromide or Alternative Dyes

DNA gel electrophoresis using agarose is a common tool in molecular biology laboratories, allowing separation of DNA fragments by size. After separation, DNA is visualized by staining. This article demonstrates how to use thiazole orange to stain DNA. Thiazole orange compares favorably to common staining methods, in that it is sensitive, inexpensive, excitable with UV or blue light (to prevent sample damage), and safer than ethidium bromide. Labs already equipped to run DNA electrophoresis experiments using ethidium bromide can generally switch dyes with no additional changes to existing protocols, using UV light for detection. Blue-light detection to avoid sample damage can additionally be achieved with a blue-light source and emission filter. Labs already equipped for blue-light detection can simply switch dyes with no additional changes to existing protocols.

Here, we present a protocol to use thiazole orange for the detection of DNA in gel electrophoresis experiments. The use of thiazole orange allows elimination of ethidium bromide, and fluorescence detection can be achieved with either UV or blue light.

DNA Elektroforez tiyazol turuncu etidyum bromür veya alternatif boya yerine kullanma

DNA gel electrophoresis using agarose is a common tool in molecular biology laboratories, allowing separation of DNA fragments by size. After separation, ...

Biyokimya

In-Nucleus Hi-C in Drosophila Cells

The genome is organized into topologically associating domains (TADs) delimited by boundaries that isolate interactions between domains. In Drosophila, the mechanisms underlying TAD formation and boundaries are still under investigation. The application of the in-nucleus Hi-C method described here helped to dissect the function of architectural protein (AP)-binding sites at TAD boundaries isolating the Notch gene. Genetic modification of domain boundaries that cause loss of APs results in TAD fusion, transcriptional defects, and long-range topological alterations. These results provided evidence demonstrating the contribution of genetic elements to domain boundary formation and gene expression control in Drosophila. Here, the in-nucleus Hi-C method has been described in detail, which provides important checkpoints to assess the quality of the experiment along with the protocol. Also shown are the required numbers of sequencing reads and valid Hi-C pairs to analyze genomic interactions at different genomic scales. CRISPR/Cas9-mediated genetic editing of regulatory elements and high-resolution profiling of genomic interactions using this in-nucleus Hi-C protocol could be a powerful combination for the investigation of the structural function of genetic elements.

The genome is organized in the nuclear space into different structures that can be revealed through chromosome conformation capture technologies. The in-nucleus Hi-C method provides a genome-wide collection of chromatin interactions in Drosophila cell lines, which generates contact maps that can be explored at megabase resolution at restriction fragment level.

Drosophila Hücrelerinde Çekirdek içi Hi-C

The genome is organized into topologically associating domains (TADs) delimited by boundaries that isolate interactions between domains. In Drosophila, ...

Genetik

Lisans Araştırma ve Öğretimi için Kromozom Konformasyon Yakalama (3C)

Getting an A with the 3Cs: Chromosome Conformation Capture for Undergraduates

Chromosome conformation capture (3C) is a powerful tool that has spawned a family of similar techniques (e.g., Hi-C, 4C, and 5C, referred to here as 3C techniques) that provide detailed information of the three-dimensional organization of chromatin. The 3C techniques have been used in a wide range of studies, from monitoring the changes in chromatin organization in cancer cells to identifying enhancer contacts made with gene promoters. While many of the studies using these techniques are asking big genome-wide questions with intricate sample types (i.e., single-cell analysis), what is often lost is that the 3C techniques are grounded in basic molecular biology methods that are applicable to a broad range of studies. By addressing tightly focused questions of chromatin organization, this cutting-edge technique can be used to enhance the undergraduate research and teaching lab experience. This paper presents a 3C protocol and provides adaptations and points of emphasis for implementation at primarily undergraduate institutions in undergraduate research and teaching experiences.

Yazar Spotlight: 3C'lerle A Almak: Lisans Öğrencileri için Kromozom Konformasyonu Yakalama  

Here, we present an adaption of the chromosome conformation capture (3C) technique in detail with an emphasis on undergraduate involvement and learning.

3C'lerle A Almak: Lisans Öğrencileri için Kromozom Konformasyon Yakalama

Chromosome conformation capture (3C) is a powerful tool that has spawned a family of similar techniques (e.g., Hi-C, 4C, and 5C, referred to here as 3C ...

Single-Molecule Dwell-Time Analysis of Restriction Endonuclease-Mediated DNA Cleavage

This novel total internal reflection fluorescence microscopy-based assay facilitates the simultaneous measurement of the length of the catalytic cycle for hundreds of individual restriction endonuclease (REase) molecules in one experiment. This assay does not require protein labeling and can be carried out with a single imaging channel. In addition, the results of multiple individual experiments can be pooled to generate well-populated dwell-time distributions. Analysis of the resulting dwell-time distributions can help elucidate the DNA cleavage mechanism by revealing the presence of kinetic steps that cannot be directly observed. Example data collected using this assay with the well-studied REase, EcoRV - a dimeric Type IIP restriction endonuclease that cleaves the palindromic sequence GAT&#8595;ATC (where &#8595; is the cut site) - are in agreement with prior studies. These results suggest that there are at least three steps in the pathway to DNA cleavage that is initiated by introducing magnesium after EcoRV binds DNA in its absence, with an average rate of 0.17 s-1 for each step.

Using quantum-dot-labeled DNA and total internal reflection fluorescence microscopy, we can investigate the reaction mechanism of restriction endonucleases while using unlabeled protein. This single-molecule technique allows for massively multiplexed observation of individual protein-DNA interactions, and data can be pooled to generate well-populated dwell-time distributions.

Restriksiyon endonükleaz aracılı DNA bölünmesinin tek moleküllü bekleme süresi analizi

This novel total internal reflection fluorescence microscopy-based assay facilitates the simultaneous measurement of the length of the catalytic cycle for ...

DNA-based Fish Species Identification Protocol

We have developed a fast, simple, and accurate DNA-based screening method to identify the fish species present in fresh and processed seafood samples. This versatile method employs PCR amplification of genomic DNA extracted from fish samples, followed by restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis to generate fragment patterns that can be resolved on the Agilent 2100 Bioanalyzer and matched to the correct species using RFLP pattern matching software.
The fish identification method uses a simple, reliable, spin column- based protocol to isolate DNA from fish samples. The samples are treated with proteinase K to release the nucleic acids into solution. DNA is then isolated by suspending the sample in binding buffer and loading onto a micro- spin cup containing a silica- based fiber matrix. The nucleic acids in the sample bind to the fiber matrix. The immobilized nucleic acids are washed to remove contaminants, and total DNA is recovered in a final volume of 100 &mu;l. The isolated DNA is ready for PCR amplification with the provided primers that bind to sequences found in all fish genomes. The PCR products are then digested with three different restriction enzymes and resolved on the Agilent 2100 Bioanalyzer. The fragment lengths produced in the digestion reactions can be used to determine the species of fish from which the DNA sample was prepared, using the RFLP pattern matching software containing a database of experimentally- derived RFLP patterns from commercially relevant fish species.

This publication describes how to use the Agilent Fish Species Identification System to identify the species of a fish by extracting DNA and performing PCR and RFLP analysis.

DNA tabanlı Balık Türleri Tanımlama Protokolü

We have developed a fast, simple, and accurate DNA-based screening method to identify the fish species present in fresh and processed seafood samples. ...

Biyoloji

<meta charset="utf8"></head><body>Tek Moleküllü Test Kullanılarak Telomerik DNA ile TRF1/2 Etkileşimlerinin İncelenmesi

Analyzing Telomeric Protein-DNA Interactions Using Single-Molecule Magnetic Tweezers

Telomeres, the protective structures at the ends of chromosomes, are crucial for maintaining cellular longevity and genome stability. Their proper function depends on tightly regulated processes of replication, elongation, and damage response. The shelterin complex, especially Telomere Repeat-binding Factor 1 (TRF1) and TRF2, plays a pivotal role in telomere protection and has emerged as a potential anti-cancer target for drug discovery. These proteins bind to the repetitive telomeric DNA motif TTAGGG, facilitating the formation of protective structures and recruitment of other telomeric proteins. Structural methods and advanced imaging techniques have provided insights into telomeric protein-DNA interactions, but probing the dynamic processes requires single-molecule approaches. Tools like magnetic tweezers, optical tweezers, and atomic force microscopy (AFM) have been employed to study telomeric protein-DNA interactions, revealing important details such as TRF2-dependent DNA distortion and telomerase catalysis. However, the preparation of single-molecule constructs with telomeric repetitive motifs continues to be a challenging task, potentially limiting the breadth of studies utilizing single-molecule mechanical methods. To address this, we developed a method to study interactions using full-length human telomeric DNA with magnetic tweezers. This protocol describes how to express and purify TRF2, prepare telomeric DNA, set up single-molecule mechanical assays, and analyze data. This detailed guide will benefit researchers in telomere biology and telomere-targeted drug discovery.

<meta charset="utf8"></head><body>Yazar Spotlight: Telomerik Protein-DNA Etkileşimlerini Araştırmak için Gelişmiş Tek Moleküllü Teknikler

This protocol demonstrates using single-molecule magnetic tweezers to study interactions between telomeric DNA-binding proteins (Telomere Repeat-binding Factor 1 [TRF1] and TRF2) and long telomeres extracted from human cells. It describes the preparatory steps for telomeres and telomeric repeat-binding factors, the execution of single-molecule experiments, and the data collection and analysis methods.

DNA ile bir siyanür boya olabilir olmak sindirilmiş enzimleri ile lekeli belirleme

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

DNA Elektroforez tiyazol turuncu etidyum bromür veya alternatif boya yerine kullanma

Drosophila Hücrelerinde Çekirdek içi Hi-C

3C'lerle A Almak: Lisans Öğrencileri için Kromozom Konformasyon Yakalama

3C'lerle A Almak: Lisans Öğrencileri için Kromozom Konformasyon Yakalama

3C'lerle A Almak: Lisans Öğrencileri için Kromozom Konformasyon Yakalama

Restriksiyon endonükleaz aracılı DNA bölünmesinin tek moleküllü bekleme süresi analizi

DNA tabanlı Balık Türleri Tanımlama Protokolü

Tek Moleküllü Manyetik Cımbız Kullanarak Telomerik Protein-DNA Etkileşimlerinin İncelenmesi

Tek Moleküllü Manyetik Cımbız Kullanarak Telomerik Protein-DNA Etkileşimlerinin İncelenmesi

Tek Moleküllü Manyetik Cımbız Kullanarak Telomerik Protein-DNA Etkileşimlerinin İncelenmesi