核Hi-Cプロトコルは、クロマチンループ、ドメイン、およびゲノムを組織するコンパートメントの特徴付けのための異なる解像度で染色体確認の探査を可能にする。このプロトコルは、異なるスケールでのゲノム相互作用の高解像度プロファイリングを提供し、より少ない技術的なノイズを持つゲノム距離とデータの全範囲にわたって、より一貫したカバレッジを生み出します。このプロトコルと遺伝子編集を組み合わせることは、遺伝的要素の構造的機能をテストするための強力な戦略です。
また、疾患を引き起こす構造変化の特性評価にも適用できる。核Hi-Cプロトコルは、真核ゲノムのゲノム組織を探索するために適用することができます。SDSおよびTriton処理を行うと、凝集体が酵素反応効率を妨げるので、核塊を細分化し、シーケンシング前に適切な品質管理を行います。
メタノールフリーホルムアルデヒドを10倍に10回に加えて、シュナイダー培地の17.5ミリリットルのシュナイダーの7つのシュナイダーのライン2プラスショウジョウバエ細胞に10回加え、60秒ごとに混合するか、回転ホイールでグリシンを室温で10分間インキュベートし、グリシンを0.12モルとの最終濃度に加えます。室温で5分後、氷上で15分後、遠心分離によって細胞を収集し、慎重に冷たいPBSの25ミリリットルでペレットを再中断し、別の遠心分離で細胞を収集します。遠心分離の終わりに、カウントするための氷冷ライシスバッファーの1ミリリットルで細胞を再中断し、ミリリットル濃度当たり6細胞に10倍に細胞を調整します。
氷上の細胞を30分間インキュベートし、2分ごとにチューブを反転させ、別の遠心分離で細胞を混合して収集します。新鮮な氷冷間リシスバッファーの 1 ミリリットルでペレットを再懸濁します。遠心分離後、1ミリリットルの1ミリリットルの制限バッファーでライセートを洗浄します。
再び遠心分離機を使用して、ライセートを収集する。ペレットを新鮮な制限バッファーの360マイクロリットルと慎重なピペットで10%SDSの11マイクロリットルに再懸濁し、時折ピペットで毎分7〜950回転で45分間インキュベートします。インキュベーションの終わりに、75マイクロリットルの非イオン性界面活性剤で透過化を停止し、時折ピペットで毎分950回転で揺れ動いてさらに45分間、チューブをインキュベーターに戻します。
クロマチン消化の場合は、回転で摂氏37度で4〜16時間インキュベーションのためにチューブにMbo1の200単位を追加します。インキュベーションの終了時に、摂氏60度で20分間のインキュベーションで酵素を不活性化する。制限フラグメントの突出しを埋め、DNAの終点をビオチンで標識するには、 10ミリモルdCTP、dGTP、dTTP、0.4ミリモルビオチンdATPの20マイクロリットル、トリス低EDTAバッファーの17.5マイクロリットル、およびDNAポリメラーゼのマイクロリットルあたり5単位の10マイクロリットルを1.5マイクロリットルずつ加えます。
30秒毎に毎分700回転で振ると、摂氏37度で75分間の反応をインキュベートします。インキュベーションの最後に、クロマチンにライゲーションミックスを加え、徹底的に穏やかな混合で1ミリリットルの最終反応量に調整し、摂氏16度で一晩インキュベートします。サンプルタンパク質を分解するには、1ミリリットルプロテイナーゼKあたり10ミリグラムの50マイクロリットルをチューブに加えて、摂氏37度で2時間のインキュベーションを行います。
インキュベーションの終わりに、一晩で温度を摂氏65度に上げ、サンプルを逆リンクします。翌朝、1ミリリットルのRNAA10ミリリットルでRNAを分解し、37°Cで1時間後に、チューブにフェノールクロロホルムを1回加え、反転によって十分に混合して均質な白相を得る。標準的なプロトコルに従ってDNAを沈殿させた後、メーカーの指示に従ってDNAと蛍光計に選択的に結合する蛍光色素を使用してDNAを定量化します。
未消化および消化されたアリコートからDNAを精製するには、100ナノグラムの未消化、消化、連結サンプルを1.5%アガロースゲルにロードし、消化されたサンプル中の500塩基対を中心としたスミアを探します。既知の相互作用の増幅と消化によるHi-Cマーキングおよびライゲーション効率を検証するために、PCR後、Mbo1、Cla1、またはその両方で生成物を消化し、新しい1.5〜2%ゲルでサンプルを実行して、3CおよびHi-Cライゲーション接合部の相対数を推定できるようにします。サンプルを超音波処理した後、200〜500塩基対DNA断片を得るために、 各サンプルから5マイクログラムのDNAを含む130マイクロリットルを、10Xライゲーションバッファーの16マイクロリットル、10ミリモルdATPの2マイクロリットル、T4 DNAポリメラーゼの5マイクロリットル、20°Cで30分間の二重蒸留水7マイクロリットルを含む新しいマイクロ遠心分離チューブに移します。
インキュベーションの最後に、10ミリモルdNTPsの5マイクロリットル、10Xライゲーションバッファーの4マイクロリットル、T4ポリヌクレオチドキナーゼの5マイクロリットル、DNAポリメラーゼ1つの大きな断片の1マイクロリットル、および25マイクロリットルの二重蒸留水をチューブに加え、20°Cで2回目の30分間のインキュベーションを行います。主に250〜550ベースペアサイズの範囲で断片を選択するには、0.6Xで連続固相可逆および動員サイズ選択を行い、メーカーの指示に従って0.9Xを行い、100マイクロリットルのTRIS低EDTAでDNAを溶出させます。各ライブラリのビオチンプルダウンの場合、ストレプトアビジン結合磁気ビーズ150マイクロリットルを400マイクロリットルの1X Tweenバッファで2回洗浄し、回転ホイールでサンプルを3分間回転させます。
インキュベーションの最後に、ビーズを2XのTweenバッファーの300マイクロリットルに再懸濁し、300マイクロリットルのHi-C材料と混合して、回転ホイールで30分回転します。インキュベーションの最後に、0.5X Tweenバッファーの400マイクロリットルでビーズを洗浄し、摂氏55度で3分間、毎分750回転でインキュベーションし、続いて1回の洗浄ごとに1X制限バッファーの200マイクロリットルで2回洗浄します。2回目の洗浄後、ビーズを100マイクロリットルのdATPテーリングミックスで再懸濁し、30分間のインキュベーションを摂氏37度で行います。
インキュベーションの最後に、ビーズを50マイクロリットルの1Xライゲーションバッファーに再中断し、4マイクロリットルのプレアニールペアエンドアダプタとT4リガーゼの2マイクロリットルを含む新しいチューブにサスペンションを移します。室温で2時間後、上澄み液を取り出し、400マイクロリットルのTweenバッファーでビーズを2回洗い、1回はTweenバッファーなしの200マイクロリットルでビーズを1回洗浄し、1X制限バッファーの40マイクロリットルでビーズを再中断する前に100マイクロリットルの制限バッファーでビーズを1回洗います。Mbo1の制限が成功すると、200~1,000塩基対のスミアが観察されます。
ライゲーションが成功した場合、ゲルの上部に高分子量帯が観察される。消化効率は定量PCRでも確認できる。許容可能な消化効率は80%以上である。
図示したように、Hi-Cライゲーション産物における既知の中域相互作用の増幅は、増幅で回収されたPCR産物の消化によって推定することができる。70%以上の消化効率は、シーケンス後にライブラリの有用でない読み取りの大部分を持つことを避けるために推奨されます。最終的な増幅のための PCR サイクルの数は、スミアが見えるサイクル数より 1 サイクル少ない必要があります。
ライブラリの消化のレベルは有効なHi-Cペアの豊富さを示し、ライブラリから得られる有用な読み取りの割合を反映しています。一意の有効なHi-Cペアを使用して、ペア分布の基本的な分析を行うことができます。この代表的な例で観察されるように、NOTCH遺伝子座は、建築タンパク質、ドメイン1および2、および軌跡に沿ったヒストン修飾と共に見ることができる。
CTCFおよびM1BPDNA結合部位の両方を含む領域を欠失すると、クロマチン接触の劇的な変化が観察される。Hi-C実験の後、aは、例えばプロモーター領域からの接触の特定のセットに到達するために行うことができる。これは、大きなゲノムを評価する際に特に便利です。
実証されているように、Hi-Cプロトコルと遺伝的追加を組み合わせることで、ゲノム要素の構造的および調節機能を評価することができます。
