מחקר זה מומן על ידי המכון הלאומי עבור כללי רפואי מדעי (NIGMS) (5605100122001), מרכיב של נבחרת מכונים לבריאות (NIH), כמו גם אוניברסיטת נברסקה קירני (UNK) קיץ תלמיד מחקר התוכנית (SSRP), ו UNK מלגת מחקר לתואר ראשון (URF).

1. הכנת צבעי, Buffers ו- Agarose ג'ל
<ol><li>
להכין את הפתרונות הבאים מכתים דנ א או העיכול של DNA מוכתם.
	<ol>
<li>להכין x 1 TE (טריס-HCl וחומצה ethylenediaminetetraacetic; מאגר EDTA) באמצעות 10 מ מ EDTA טריס-HCl ו- 1 מ מ משורה או סטריליות. לאחסן בטמפרטורת החדר (18-25 ° C).</li>
		<li>להפוך את aliquots של כל צבע: טוטו-1, YOYO-1, פופו-1, בובו-1, טוטו-3, YOYO-3, פופו-3, בובו-3 (טבלה 1). פיפטה 4 µL של 1 מ מ צבע לתוך ענבר כהה או שחור 1.5 mL צינור, להוסיף µL 36 של טה 1 x, לערבב בעזרת פיפטה; ריכוז זה הופך פתרון לצבוע 100 מיקרומטר (סה כ 40 µL). להשלים שלב זה עבור כל צבע. חנות ב 4 º C. הערה: למנוע חשיפת צבע אור כדי למנוע photobleaching או השפלה של לצבוע.</li>
		<li>להכין מאגר 1 באמצעות 10 מ מ Bis-טריס-פרופאן-HCl, 10 מ מ MgCl2ו- 100 µg/mL אלבומין שור (BSA). הכנת מאגר 2 באמצעות 50 מ"מ NaCl, 10 מ מ טריס-HCl, 10 מ מ MgCl2ו- µg 100-מ/ל BSA. להכין מאגר 3 באמצעות 50 מ מ אשלגן אצטט, 20 מ מ טריס-אצטט, אצטט מגנזיום 10 מ מ, 100 של µg מ ל BSA. לכל אנזים ידרוש אחד של מאגרים ספציפיים אלה לתפקד.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
להכין את הפתרונות הבאים בג'ל.
	<ol>
<li>להפוך 6 x הטעינה לצבוע על ידי שילוב של 0.25% bromophenol כחול, קסילן cyanol 0.25%, 15% Ficoll ב dH2חנות או בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>כדי להפוך את agarose כ- 0.7% ג'ל, שוקל לצאת 0.07 גר' agarose טמפרטורה (HGT) ג'לי גבוהה בתוך הבקבוק Erlenmeyer, להוסיף 100 מ של מאגר x TAE 1 והצב כוס כימית הפוכה על-גבי הבקבוקון.<ol>
<li>מחממים את הפתרון על פלטה חמה עד בועות מתחילים להיווצר על החלק התחתון של הבקבוק, לצוף למעלה.</li>
			<li>הסר את הפתרון הכיריים, ומצננים עצמו את הפתרון נשאר ללא שינוי עד הבקבוקון יכול להיות נגע ביד חשופה, ואז לשפוך את הג'ל לתוך תבנית ג'ל 24.5 ס"מ 21.8 ס"מ עם מסרק ג'ל ליצירת בארות.</li>
			<li>להסיר את הבועות ליד המסרק או על פני השטח של הג'ל הבוקעים אותם עם טיפ פיפטה ולאפשר את הג'ל שבמהלכו במשך 15 דקות לפחות. זה ניתן לאחסן במקרר (4 ° C) עטופה בניילון נצמד במשך שבוע למנוע התייבשות של ג'ל או זיהום. לקבלת מידע נוסף על אופן הפעלת ג'ל להפנות לי. et al. 33 . הערה: השתמש מסרק ג'ל עם 30 וולס בודדים. כל אחד צריך להיות רחב עם עומק של 2 מ מ 4.5 מ מ הגובה של הבאר יהיה תלוי כמות ג'ל שפכו לתוך התיבה.</li>
		</ol>
</li>
		<li>להכין מאגר x TAE (טריס - אצטט - EDTA) 1 באמצעות 40 מ מ טריס-HCl, חומצה אצטית 20 מ מ 1 מ"מ EDTA. לאחסן בטמפרטורת החדר (18-25 ° C).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. הכנת ויטראז'ים דנ א
<ol><li>
כתם למדא דנ א (300-800 ng) באמצעות aliquots שונים של צבע. כל צבע (טבלה 1) יש שישה ריכוזים שונים שנבדקו, עבור סכום כולל של 48 תגובות לכל אנזים הגבלה. התהליך הבא מתאר ערכה למעלה עבור התגובה 1 (איור 1).
	<ol>
<li>לדלל למדא הדנ א באמצעות טה x 1 ל- 100 ng / µL. לאחסן 4 ° C. להפוך את פתרון עם נפח כולל של 300 µL.</li>
		<li>כתם למדא unmethylated DNA. עבור כל הלהקה צפויה מן התקציר, מעריכים 75-100 ng/להקה. להוסיף כמויות מתאימות של צבע כדי לייצר ריכוזים של 1.9 מיקרומטר, 3.8 מיקרומטר, 19.4 מיקרומטר, 32.2 מיקרומטר, מיקרומטר: 48.3, 63.5 מיקרומטר / 100 ננוגרם של ה-DNA.</li>
		<li>דגירה בין לילה (15 h - 18 h) ב 4 º C.</li>
		<li>להשאיר תגובה אחת מוכתם לשמש שליטה25. הערה: השתמש unmethylated DNA עבור התגובה לעיכול. אנזימים רגיש מתילציה אין אפשרות לגזור מפוגל אזורים ב- DNA, ייתן הופעה של עיכול לא שלם.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. הכנת וזמינותו אנזים הגבלה
<ol><li>
תקציר מוכתם DNA באנזים הגבלה כדי לקבוע אם את האנזים יכולה לעכל prestained דנ א (איור 1).
	<ol>
<li>למחרת, להוסיף 20 U של אנזים הגבלה, 3 µL של המאגר המתאים (טבלה 2), וכן מים מזוקקים, בלוק, מסוננות עבור סכום כולל של 30 µL. עבור כל תגובה אנזימטית, לבחור את המאגר עם חיתוך היעילות הגבוהה ביותר, אשר ניתן למצוא באתר האינטרנט של היצרן.</li>
		<li>מקום לתגובות באמבט מים בטמפרטורה אופטימלית אנזימטי של הפעילות, רשומים בטבלה מס ' 2 אנזימים 6 בשימוש Maschmann et al., עבור 2-4 h (טבלה 2)25.</li>
		<li>לעצור את התגובה על ידי הוספת 2 µL של 0.5 M EDTA pH 8.0.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Electroeluting צבעונית-DNA ג'ל Agarose
<ol><li>הסר את הצדדים כייר ג'ל 24.5 ס"מ 21.8 ס"מ (שלב 1.2.2) ומניחים את הג'ל לתוך התיבה ג'ל אלקטרופורזה. שופכים 2.5 L מאגר x TAE 1 לתוך התיבה. בזהירות להסיר את המסרק ג'ל הג'ל, כך הבארות הם נגישים33.</li>
	<li>Pipette את התגובות אנזים הגבלה על גבי סרט פלסטיק ולשלב בכל תגובה עם 6 x טוען לצבוע. עבור כל הפתרונות התגובה, להוסיף 1 µL של 6 x בטעינת צבע לכל 5-6 µL של פתרון ה-DNA (1 x). ואז pipette את התגובות (המכיל את צבען הטעינה, < 18 µL) לתוך הבארות.</li>
	<li>מערבבים 1 µL של הסולם 1 kb, µL 9 של 1 x TE ו 2 µL של 6 x טוען לצבוע. לטעון פתרון לתוך הבארות לאגף את פתרונות אחרים.</li>
	<li>מכסים את תיבת ג'ל עם נייר כחול או שחור כהה או בד. להתחבר תיבת ג'ל ספק כוח, הגדר את אספקת החשמל 30 וולט, ולהפעיל אותו בן לילה (15-20 שעות). לכבות את האורות בזמן פועל הג'ל, כדי למנוע photocleavage של ה-DNA עם תוויות.</li>
	<li>למחרת בבוקר לבטל את אספקת החשמל. בג'ל החוצה באמצעות המגש ולהעביר אותו במיכל עם 45 µL אתידיום ברומיד, 1 ליטר 1 מאגר x TAE. לאחסן את המיכל בטמפרטורת החדר בחושך או לכסות בנייר כסף כדי למנוע חשיפה לאור. תן ג'ל הכתם למשך לפחות 45 דקות בטמפרטורת החדר. התראה: שימוש אתידיום ברומיד עם כפפות, בטיחות משקפיים. כאשר מנקים את הגורם המכיל אתידיום ברומיד פתרון ולזרוק את הג'ל, להתייעץ עם ההנחיות לרשות הברית שלך כדי לקבוע כיצד להתמודד עם שימוש אתידיום ברומיד; בנוסף, כתמים אחרים עשויים להיות מנוצל במקום אתידיום ברומיד.</li>
</ol>5. הדמיה הג'ל Agarose
<ol><li>מקם את הג'ל על גבי transilluminator אור כחול, אשר פולט פלט אור מקסימלית בין 400-500 ננומטר. צלם תמונות עם המצלמה מחוברת לתחנה. התראה: הקפד להשתמש את הכיסוי עבור המאיר ולהניח על משקפי מגן לפני הפעלת מקור האור. הערה: שלב זה עשוי גם ניתן להשלים באמצעות כל מקור אור UV או סורק ג'ל רגיל.</li>
	<li>הצג את התמונות ב- ImageJ על-ידי גרירת הקובץ בשורת המצב ImageJ, התמונה תופיע.</li>
	<li>לקבוע את קצב העיכול עבור הניסוי על-ידי השוואת הלהקות הג'ל לתבנית ג'ל הצפוי סיליקו . כדי לקבוע את שיעור עיכול, מספר להקות ניסיוני מחולק על ידי המספר הצפוי של ה-DNA להקות24,25. אם התבנית ניסיוני DNA מתעכל הלהקה הדפוס הצפוי, שיעור עיכול הוא 1. אם התבנית יש קטעים יותר מהצפוי, שיעור עיכול הוא גדול מ- 1. אם התבנית יש קטעים פחות מהצפוי, שיעור עיכול הוא קטן מ-1.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Teague, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+human+genome+structure+by+single-molecule+analysis.">High-resolution human genome structure by single-molecule analysis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (24), 10848-10853 (2010).</li><li>Ananiev, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+mapping+discerns+genome+wide+DNA+methylation+profiles.">Optical mapping discerns genome wide DNA methylation profiles.</a> BMC Mol Biol. 9, 68 (2008).</li><li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+rice+genome+sequence+by+optical+mapping.">Validation of rice genome sequence by optical mapping.</a> BMC Genomics. 8, 278 (2007).</li><li>Reslewic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+shotgun+optical+mapping+of+Rhodospirillum+rubrum.">Whole-genome shotgun optical mapping of Rhodospirillum rubrum.</a> Appl Environ Microbiol. 71 (9), 5511-5522 (2005).</li><li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+shotgun+optical+mapping+of+Rhodobacter+sphaeroides+strain+2.4.1+and+its+use+for+whole-genome+shotgun+sequence+assembly.">Whole-genome shotgun optical mapping of Rhodobacter sphaeroides strain 2.4.1 and its use for whole-genome shotgun sequence assembly.</a> Genome Res. 13 (9), 2142-2151 (2003).</li><li>Gupta, A., Kounovsky-Shafer, K. L., Ravindran, P., Schwartz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+mapping+and+nanocoding+approaches+to+whole-genome+analysis.">Optical mapping and nanocoding approaches to whole-genome analysis.</a> Microfluidics and Nanofluidics. 20 (44), 1-14 (2016).</li><li>Kounovsky-Shafer, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presentation+of+large+DNA+molecules+for+analysis+as+nanoconfined+dumbbells.">Presentation of large DNA molecules for analysis as nanoconfined dumbbells.</a> Macromolecules. 46 (20), 8356-8368 (2013).</li><li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanochannel+confinement:+DNA+stretch+approaching+full+contour+length.">Nanochannel confinement: DNA stretch approaching full contour length.</a> Lab Chip. 11 (10), 1721-1729 (2011).</li><li>Yu, H., Jo, K., Kounovsky, K. L., de Pablo, J. J., Schwartz, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+propulsion:+chemical+sensing+and+chemotaxis+of+DNA+driven+by+RNA+polymerase.">Molecular propulsion: chemical sensing and chemotaxis of DNA driven by RNA polymerase.</a> J Am Chem Soc. 131 (16), 5722-5723 (2009).</li><li>Lam, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+mapping+on+nanochannel+arrays+for+structural+variation+analysis+and+sequence+assembly.">Genome mapping on nanochannel arrays for structural variation analysis and sequence assembly.</a> Nat Biotechnol. 30 (8), 771-776 (2012).</li><li>Cao, H., Tegenfeldt, J. O., Austin, R. H., Chou, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gradient+nanostructures+for+interfacing+microfluidics+and+nanofluidics.">Gradient nanostructures for interfacing microfluidics and nanofluidics.</a> Applied Physics Letters. 81 (16), 3058-3060 (2002).</li><li>Gupta, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+analysis+reveals+widespread+structural+variation+in+multiple+myeloma.">Single-molecule analysis reveals widespread structural variation in multiple myeloma.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (25), 7689-7694 (2015).</li><li>Wu, C. W., Schramm, T. M., Zhou, S., Schwartz, D. C., Talaat, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+mapping+of+the+Mycobacterium+avium+subspecies+paratuberculosis+genome.">Optical mapping of the Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis genome.</a> BMC Genomics. 10, 25 (2009).</li><li>Jo, K., Schramm, T. M., Schwartz, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-molecule+barcoding+system+using+nanoslits+for+DNA+analysis+:+nanocoding.">A single-molecule barcoding system using nanoslits for DNA analysis : nanocoding.</a> Methods Mol Biol. 544, 29-42 (2009).</li><li>Jo, K., Chen, Y. L., de Pablo, J. J., Schwartz, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elongation+and+migration+of+single+DNA+molecules+in+microchannels+using+oscillatory+shear+flows.">Elongation and migration of single DNA molecules in microchannels using oscillatory shear flows.</a> Lab Chip. 9 (16), 2348-2355 (2009).</li><li>Jo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-molecule+barcoding+system+using+nanoslits+for+DNA+analysis.">A single-molecule barcoding system using nanoslits for DNA analysis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (8), 2673-2678 (2007).</li><li>Reccius, C. H., Mannion, J. T., Cross, J. D., Craighead, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compression+and+free+expansion+of+single+DNA+molecules+in+nanochannels.">Compression and free expansion of single DNA molecules in nanochannels.</a> Phys Rev Lett. 95 (26), 268101 (2005).</li><li>Staerk, D., Hamed, A. A., Pedersen, E. B., Jacobsen, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bisintercalation+of+homodimeric+thiazole+orange+dyes+in+DNA:+effect+of+modifying+the+linker.">Bisintercalation of homodimeric thiazole orange dyes in DNA: effect of modifying the linker.</a> Bioconjug Chem. 8 (6), 869-877 (1997).</li><li>Spielmann, H. P., Wemmer, D. E., Jacobsen, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solution+structure+of+a+DNA+complex+with+the+fluorescent+bis-intercalator+TOTO+determined+by+NMR+spectroscopy.">Solution structure of a DNA complex with the fluorescent bis-intercalator TOTO determined by NMR spectroscopy.</a> Biochemistry. 34, 8542-8553 (1995).</li><li>Carlsson, C., Jonsson, M., Akerman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+bands+in+DNA+gel+electrophoresis+caused+by+bis-intercalating+dyes.">Double bands in DNA gel electrophoresis caused by bis-intercalating dyes.</a> Nucleic Acids Res. 23 (13), 2413-2420 (1995).</li><li>Kundukad, B., Yan, J., Doyle, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+YOYO-1+on+the+mechanical+properties+of+DNA.">Effect of YOYO-1 on the mechanical properties of DNA.</a> Soft Matter. 10 (48), 9721-9728 (2014).</li><li>Technologies, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Molecular Probes Handbook: A guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies. , (2010).</li><li>Riehn, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restriction+mapping+in+nanofluidic+devices.">Restriction mapping in nanofluidic devices.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (29), 10012-10016 (2005).</li><li>Meng, X., Cai, W., Schwartz, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+restriction+endonuclease+activity+by+DNA+binding+fluorochromes.">Inhibition of restriction endonuclease activity by DNA binding fluorochromes.</a> J Biomol Struct Dyn. 13 (6), 945-951 (1996).</li><li>Maschmann, A., Kounovsky-Shafer, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+restriction+enzyme+activity+when+cutting+DNA+labeled+with+the+TOTO+Dye+family.">Determination of restriction enzyme activity when cutting DNA labeled with the TOTO Dye family.</a> Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. , 1-12 (2017).</li><li>Biebricker, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+DNA+intercalators+on+DNA+and+DNA-processing+enzymes+elucidated+through+force-dependent+binding+kinetics.">The impact of DNA intercalators on DNA and DNA-processing enzymes elucidated through force-dependent binding kinetics.</a> Nature Communications. 6, 7304 (2015).</li><li>Gunther, K., Mertig, M., Seidel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+and+structural+properties+of+YOYO-1+complexed+DNA.">Mechanical and structural properties of YOYO-1 complexed DNA.</a> Nucleic Acids Res. 38 (19), 6526-6532 (2010).</li><li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clone-free,+single+molecule+map+of+the+domestic+cow+(Bos+taurus)+genome.">A clone-free, single molecule map of the domestic cow (Bos taurus) genome.</a> BMC Genomics. 16, 644 (2015).</li><li>Ray, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+structural+alterations+in+solid+tumor+oligodendroglioma+by+single+molecule+analysis.">Discovery of structural alterations in solid tumor oligodendroglioma by single molecule analysis.</a> BMC Genomics. 14, 505 (2013).</li><li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequence+of+the+model+medicinal+mushroom+Ganoderma+lucidum.">Genome sequence of the model medicinal mushroom Ganoderma lucidum.</a> Nat Commun. 3, 913 (2012).</li><li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+molecule+scaffold+for+the+maize+genome.">A single molecule scaffold for the maize genome.</a> PLoS Genet. 5 (11), e1000711 (2009).</li><li>Sischka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+and+kinetics+between+DNA+and+DNA+binding+ligands.">Molecular mechanisms and kinetics between DNA and DNA binding ligands.</a> Biophys J. 88 (1), 404-411 (2005).</li><li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments.">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J Vis Exp. (62), (2012).</li><li>Zipper, H., Brunner, H., Bernhagen, J., Vitzthum, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigations+on+DNA+intercalation+and+surface+binding+by+SYBR+Green+I,+its+structure+determination+and+methodological+implications.">Investigations on DNA intercalation and surface binding by SYBR Green I, its structure determination and methodological implications.</a> Nucleic Acids Res. 32 (12), e103 (2004).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

על מנת לעכל DNA fluorescently שכותרתו (איור 1), סדרה של צעדים נדרשים. ראשית, ה-DNA היא מוכתמת עם fluorochrome בן לילה. דנ א יכול להיות מודגרות עם cyanine הדימרים לתקופה קצרה של זמן; אולם, Carlsson. et al. נמצא כי ה-DNA נוצר להקות כפול עבור כל גודל ה-DNA עקב מכתימים לא שלם20. כדי לתקן ?...

הסדרה טוטו (טוטו-1, YOYO-1, פופו-1, בובו-1, טוטו-3, YOYO-3, פופו-3 ובובו-3; טבלה 1) הוא מנוצל במגוון רחב של ניסויים איפה הפריט החזותי של ה-DNA נדרש1,2,3,4,5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17. משפחת דימר cyanine נעשה שימוש נרחב שלהם תשואה קוונטית, רגישות וכתוצאה זיקה גבוהה עבור ה-DNA מולקולות18,19,20. צבעי דימר cyanine יש סלקטיביות נהדר עבור DNA נטושים כפול, כאשר intercalated יש עלייה 100 עד 1000 קיפול של קרינה פלואורסצנטית21. Pyridinium צבענים (YOYO-1, טוטו-1, YOYO-3 וטוטו-3) יש פליטה אורך גל קצר יותר מאשר שלהם quinolium לצבוע את עמיתיהם (טבלה 1) (בובו-1, פופו-1, בובו-3 ו- 3 פופו)22. כמו כן, התשואה קוונטית של הדימרים cyanine intercalated לתוך ה-DNA הוא גבוה (0.2 - 0.6)22. עם זאת, באמצעות אנזים כדי לקבוע את הפרופיל מתילציה של מולקולת ה-DNA2 או למתוח23 של מולקולה DNA כבר מוכתם הפלורסנט דורש שיטה לקביעת אנזימים מה לעכל DNA מוכתם. ניתן להשתמש בכל סוג של צבע זה intercalates לתוך ה-DNA או כל אנזים זה נותן דפוס ניכרת של המצע DNA עבור שיטה זו.
מנג. et al. קודם נקבע שיעור עיכול של DNA prestained באמצעות אלקטרופורזה בג'ל באמצעות מגוון של צבעים שונים24. . Maschmann et al. צלל ב עמוק יותר להסתכל על משפחת טוטו של צבע. שניהם נקבע שיעור עיכול של ויטראז'ים דנ א כדי לראות אם ה-DNA צבעונית עם צבע נתון יכול ובינינו עם אנזים הגבלה25. שיטות אחרות ללמוד איגוד אפקטים של צבעים intercalated עם ה-DNA בעזרת מלקחיים אופטיים26 או NMR27. אחת מהשיטות דורש ציוד מיוחד; ואילו, שיטה זו מאפשרת ציוד שיש רוב מעבדות ביולוגיה מולקולרית כדי לקבוע אם צבע מפריע לעיכול אנזים הגבלה.
בנוסף, בשיטות אחרות כדי למדוד את האורך של מולקולה נתונה, מיפוי אופטי מאורך, מוכתם במולקולות דנ א על משטח, מתעכל דנ א כדי לקבוע את המתיחה והגודל של קטעים. העיבור של צבע הוכח להגדיל את אורך מתאר של מולקולות DNA fluorescently ויטראז'ים ובהתאם את הצבע המשמש, אורך מתאר שונה21. בשיטה זו יש כבר מנוצל במגוון של הגנום1,3,4,6,13,28,29,30, 31. אולם, אם המולקולות היה מוכתם מראש, בהתאם לצבוע אנזים, האנזים לא יוכלו לגזור DNA צבעונית עם צבע נתון. לכן, בשיטה זו קובעת אם הדנ א צבעונית עם צבע נתון יכול להיות מתעכל עם אנזים. בנוסף, בהתאם לריכוז לצבוע, לצבוע מנוצל, הניידות של ה-DNA להקות בג'ל להעביר לאט יותר מאשר DNA יליד בשל ההתרה חלקית של עמוד השדרה ה-DNA כדי לפנות מקום לצבוע להוסיף בין בסיסי זוגות32 .
עם זאת, לפעמים אלה צבעי יכול חלקית או לחלוטין לעכב את הפעולה של אנזימי הגבלה מסוימת,7,24. זה נחשב להיות עקב שינוי מבני ב- DNA הנגרם על ידי ההחזקה של הפלורסנט, אשר עשוי למנוע את האנזים מהכרה רצף מסוים שלו. הבנה כיצד צבע אלה משפיעים על אנזימי הגבלה יכול לסייע בניסויים שבו נדרשת לפרופיל מתילציה או את המתיחה של DNA מוכתם.
בשיטה שלנו, ה-DNA היה מוכתם fluorochrome עניין, מתעכל עם אנזים ההגבלה. אז הדנ א היה electrophoresed-ג'ל, עם תמונה, נמדד קצב העיכול אנזים הגבלה. אנזימי הגבלה נבחרה בהתבסס על התבנית שנגזרו על ג'ל. מדי להקות גרם החפיפה של להקות DNA ולא מעט מדי להקות נתנו תמונה שלמה של ה-dna. יש חניה טובה. כדי להיות מסוגל לקבוע את הפרופיל של מולקולת הדנ א מתעכל; לכן, זה יהיה תלוי על ה-DNA בשימוש ואת האנזים. היתרון בשיטה זו הוא הפשטות שלה; זה רק דורש ציוד בשימוש של הגבלת לעיכול, ג'ל אלקטרופורזה.

<table><tbody><tr><td>Unmethylated lambda DNA</td><td>NEB</td><td>N3013S</td><td></td></tr><tr><td>YOYO-1</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Y3601</td><td></td></tr><tr><td>TOTO-1</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T3600</td><td></td></tr><tr><td>POPO-1</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P3580</td><td></td></tr><tr><td>BOBO-1</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>B3582</td><td></td></tr><tr><td>YOYO-3</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Y3606</td><td></td></tr><tr><td>TOTO-3</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T3604</td><td></td></tr><tr><td>POPO-3</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P3584</td><td></td></tr><tr><td>BamHI</td><td>NEB</td><td>R0136S</td><td></td></tr><tr><td>PmlI</td><td>NEB</td><td>R0532S</td><td></td></tr><tr><td>ScaI</td><td>NEB</td><td>R3122S</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI&amp;nbsp;</td><td>NEB</td><td>R0101S</td><td></td></tr><tr><td>HindIII</td><td>NEB</td><td>R0104S</td><td></td></tr><tr><td>SmaI</td><td>NEB</td><td>R0141S</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Fisher</td><td>BP152-1</td><td>Irritant</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher</td><td>S316-212</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Fisher</td><td>S25358</td><td>Corrosive and irritant</td></tr><tr><td>Buffer 1</td><td>NEB</td><td>B7201S</td><td>NEB 1.1</td></tr><tr><td>Buffer 2</td><td>NEB</td><td>B7202S</td><td>NEB 2.1</td></tr><tr><td>Buffer 3</td><td>NEB</td><td>B7204S</td><td>NEB Cutsmart</td></tr><tr><td>High gelling temperature agarose gel</td><td>Lonza</td><td>50041</td><td></td></tr><tr><td>Acetic Acid</td><td>Fisher</td><td>S25118</td><td>Hazardous</td></tr><tr><td>Blue light transilluminator</td><td>Dark Reader</td><td>DR196</td><td>Wear correct eyewear&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Ethidium bromide</td><td>Fisher</td><td>15585011</td><td>Carcinogen; other alternatives are Nancy 520, Gel red, etc.</td></tr><tr><td>Cannon EOS Rebel T3I camera</td><td>Cannon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Apogee Model H4</td><td>Biorad</td><td>1704510</td><td></td></tr><tr><td>Power Pac Basic Power Supply</td><td>Biorad</td><td>1645050&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP525-25</td><td></td></tr><tr><td>Bromophenol blue</td><td>Fisher Scientific</td><td>B-392</td><td></td></tr><tr><td>Xylene Cyanol</td><td>Eastmen</td><td>T1579</td><td></td></tr></tbody></table>

determining if dna stained with a cyanine dye can be digested with restriction enzymes

ויזואליזציה של ה-DNA על ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ מנצל במגוון צבעים כגון צבעי cyanine. צבעים אלה מנוצלים בשל שלהם זיקה גבוהה ורגישות לדנ א. על מנת לקבוע אם מולקולות DNA הן באורך מלא לאחר סיום הניסוי, שיטה נדרשת כדי לקבוע אם מולקולות מוכתמים הם באורך מלא על ידי ה-DNA עם אנזימי הגבלה. עם זאת, DNA מוכתם עלול לעכב האנזימים, כך שיטה נדרשת כדי לקבוע איזה אנזימים אחד תוכל להשתמש עבור fluorochrome צבעונית הדנ א. בשיטה זו, ה-DNA הוא מוכתם צבע cyanine בין לילה כדי לאפשר את צבען ואת ה-DNA כדי equilibrate. דנ א הבא, ויטראז'ים מתעכל עם אנזים ההגבלה, נטען לתוך ג'ל, electrophoresed. הלהקות תקציר DNA ניסיוני מושווים לעיכול סיליקו כדי לקבוע את פעילות אנזים הגבלה. אם יש מספר זהה של להקות, כצפוי, ואז התגובה היא מלאה. עוד להקות מהצפוי מצביעים על עיכול חלקי ולהקות פחות מצביעים על עיכול לא שלם. היתרון של שיטה זו הוא הפשטות שלה, היא משתמשת בציוד מדען צריכה בשביל באנזים הגבלה assay, ג'ל אלקטרופורזה. מגבלה של שיטה זו הוא זמין למדענים רוב האנזימים הם אנזימים זמינים מסחרית; עם זאת, אפשר להשתמש אנזימי הגבלה כלשהי.

על מנת לקבוע שאם צבע intercalating ישפיע באנזים הגבלה לעכל את ה-DNA, הסדר הנכון של שלבים בטח בעקבות (איור 1). לאחר ה-DNA היא צבעונית, מתעכל עם אנזים מסוים, ניתן לקחת תמונה של הג'ל כדי לקבוע את מספר קטעים ואת גודלם (איור 2). על מנת לקבוע את יעילות האנזים, המ?...

Watch this Scientific Journal Video about Determining if DNA Stained with a Cyanine Dye Can Be Digested with Restriction Enzymes at JoVE.com

Determining if DNA Stained with a Cyanine Dye Can Be Digested with Restriction Enzymes

צביעת במולקולות דנ א על ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ מאפשר מדען להציג אותם במהלך ניסוי. השיטה המוצגת כאן, במולקולות דנ א מראש צבעונית עם צבעי פלורסנט, מתעכל מתילציה, אנזימי הגבלה רגיש שאינו מתילציה.

קביעה אם הדנ א מוכתם Cyanine צבע יכול להיות מתעכל עם אנזימי הגבלה

Visualization of DNA for fluorescence microscopy utilizes a variety of dyes such as cyanine dyes. These dyes are utilized due to their high affinity and ...

determining-if-dna-stained-with-cyanine-dye-can-be-digested-with

Research

JoVE Journal

Biochemistry

8.7K Views.  University of Nebraska - Kearney. צביעת במולקולות דנ א על ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ מאפשר מדען להציג אותם במהלך ניסוי. השיטה המוצגת כאן, במולקולות דנ א מראש צבעונית עם צבעי פלורסנט, מתעכל מתילציה, אנזימי הגבלה רגיש שאינו מתילציה.

Video: Determining if DNA Stained with a Cyanine Dye Can Be Digested with Restriction Enzymes

DNA Staining Method Based on Formazan Precipitation Induced by Blue Light Exposure

DNA staining methods are very important for biomedical research. We designed a simple method that allows DNA visualization to the naked eye by the formation of a colored precipitate. It works by soaking the acrylamide or agarose DNA gel in a solution of 1x (equivalent to 2.0 &#181;M) SYBR Green I (SG I) and 0.20 mM nitro blue tetrazolium that produces a purple precipitate of formazan when exposed to sunlight or specifically blue light. Also, DNA recovery tests were performed using an ampicillin resistant plasmid in an agarose gel stained with our method. A larger number of colonies was obtained with our method than with traditional staining using SG I with ultraviolet illumination. The described method is fast, specific, and non-toxic for DNA detection, allowing visualization of biomolecules to the "naked eye" without a transilluminator, and is inexpensive and appropriate for field use. For these reasons, our new DNA staining method has potential benefits to both research and industry.

This method allows selective staining and quantification of DNA in gels by soaking the gel in a SYBR Green I/Nitro Blue Tetrazolium solution and then exposing it to sunlight or a blue light source. This produces a visible precipitate and requires almost no equipment, making it ideal for field use.

DNA מכתים שיטה המבוססת על משקעים Formazan הנגרם על ידי חשיפה אור כחול

DNA staining methods are very important for biomedical research. We designed a simple method that allows DNA visualization to the naked eye by the ...

Detection of Bacteria Using Fluorogenic DNAzymes

Outbreaks linked to food-borne and hospital-acquired pathogens account for millions of deaths and hospitalizations as well as colossal economic losses each and every year. Prevention of such outbreaks and minimization of the impact of an ongoing epidemic place an ever-increasing demand for analytical methods that can accurately identify culprit pathogens at the earliest stage. Although there is a large array of effective methods for pathogen detection, none of them can satisfy all the following five premier requirements embodied for an ideal detection method: high specificity (detecting only the bacterium of interest), high sensitivity (capable of detecting as low as a single live bacterial cell), short time-to-results (minutes to hours), great operational simplicity (no need for lengthy sampling procedures and the use of specialized equipment), and cost effectiveness. For example, classical microbiological methods are highly specific but require a long time (days to weeks) to acquire a definitive result.1 PCR- and antibody-based techniques offer shorter waiting times (hours to days), but they require the use of expensive reagents and/or sophisticated equipment.2-4 Consequently, there is still a great demand for scientific research towards developing innovative bacterial detection methods that offer improved characteristics in one or more of the aforementioned requirements. Our laboratory is interested in examining the potential of DNAzymes as a novel class of molecular probes for biosensing applications including bacterial detection.5
DNAzymes (also known as deoxyribozymes or DNA enzymes) are man-made single-stranded DNA molecules with the capability of catalyzing chemical reactions.6-8 These molecules can be isolated from a vast random-sequence DNA pool (which contains as many as 1016 individual sequences) by a process known as "in vitro selection" or "SELEX" (systematic evolution of ligands by exponential enrichment).9-16 These special DNA molecules have been widely examined in recent years as molecular tools for biosensing applications.6-8
Our laboratory has established in vitro selection procedures for isolating RNA-cleaving fluorescent DNAzymes (RFDs; Fig. 1) and investigated the use of RFDs as analytical tools.17-29 RFDs catalyze the cleavage of a DNA-RNA chimeric substrate at a single ribonucleotide junction (R) that is flanked by a fluorophore (F) and a quencher (Q). The close proximity of F and Q renders the uncleaved substrate minimal fluorescence. However, the cleavage event leads to the separation of F and Q, which is accompanied by significant increase of fluorescence intensity.
More recently, we developed a method of isolating RFDs for bacterial detection.5 These special RFDs were isolated to "light up" in the presence of the crude extracellular mixture (CEM) left behind by a specific type of bacteria in their environment or in the media they are cultured (Fig. 1). The use of crude mixture circumvents the tedious process of purifying and identifying a suitable target from the microbe of interest for biosensor development (which could take months or years to complete). The use of extracellular targets means the assaying procedure is simple because there is no need for steps to obtain intracellular targets.
Using the above approach, we derived an RFD that cleaves its substrate (FS1; Fig. 2A) only in the presence of the CEM produced by E. coli (CEM-EC).5 This E. coli-sensing RFD, named RFD-EC1 (Fig. 2A), was found to be strictly responsive to CEM-EC but nonresponsive to CEMs from a host of other bacteria (Fig. 3).
Here we present the key experimental procedures for setting up E. coli detection assays using RFD-EC1 and representative results.

We have recently reported a novel approach for generating fluorogenic DNAzyme probes that can be applied to set up a simple, "mix-and-read" fluorescent assay for bacterial detection. These special DNA probes catalyze the cleavage of a chromophore-modified DNA-RNA chimeric substrate in the presence of crude extracellular mixture (CEM) produced by a specific bacterium, thereby translating bacterial detection into fluorescence signal generation. In this report we will describe key experimental procedures where a specific DNAzyme probe denoted "RFD-EC1" is employed for the detection of the model bacterium, Escherichia coli (E. coli).

זיהוי של חיידקים באמצעות DNAzymes Fluorogenic

Outbreaks linked to food-borne and hospital-acquired pathogens account for millions of deaths and hospitalizations as well as colossal economic losses ...

Immunology and Infection

DNA Electrophoresis Using Thiazole Orange Instead of Ethidium Bromide or Alternative Dyes

DNA gel electrophoresis using agarose is a common tool in molecular biology laboratories, allowing separation of DNA fragments by size. After separation, DNA is visualized by staining. This article demonstrates how to use thiazole orange to stain DNA. Thiazole orange compares favorably to common staining methods, in that it is sensitive, inexpensive, excitable with UV or blue light (to prevent sample damage), and safer than ethidium bromide. Labs already equipped to run DNA electrophoresis experiments using ethidium bromide can generally switch dyes with no additional changes to existing protocols, using UV light for detection. Blue-light detection to avoid sample damage can additionally be achieved with a blue-light source and emission filter. Labs already equipped for blue-light detection can simply switch dyes with no additional changes to existing protocols.

Here, we present a protocol to use thiazole orange for the detection of DNA in gel electrophoresis experiments. The use of thiazole orange allows elimination of ethidium bromide, and fluorescence detection can be achieved with either UV or blue light.

אלקטרופורזה הדנ א באמצעות Thiazole תפוז במקום אתידיום ברומיד או צבע חלופי

DNA gel electrophoresis using agarose is a common tool in molecular biology laboratories, allowing separation of DNA fragments by size. After separation, ...

In-Nucleus Hi-C in Drosophila Cells

The genome is organized into topologically associating domains (TADs) delimited by boundaries that isolate interactions between domains. In Drosophila, the mechanisms underlying TAD formation and boundaries are still under investigation. The application of the in-nucleus Hi-C method described here helped to dissect the function of architectural protein (AP)-binding sites at TAD boundaries isolating the Notch gene. Genetic modification of domain boundaries that cause loss of APs results in TAD fusion, transcriptional defects, and long-range topological alterations. These results provided evidence demonstrating the contribution of genetic elements to domain boundary formation and gene expression control in Drosophila. Here, the in-nucleus Hi-C method has been described in detail, which provides important checkpoints to assess the quality of the experiment along with the protocol. Also shown are the required numbers of sequencing reads and valid Hi-C pairs to analyze genomic interactions at different genomic scales. CRISPR/Cas9-mediated genetic editing of regulatory elements and high-resolution profiling of genomic interactions using this in-nucleus Hi-C protocol could be a powerful combination for the investigation of the structural function of genetic elements.

The genome is organized in the nuclear space into different structures that can be revealed through chromosome conformation capture technologies. The in-nucleus Hi-C method provides a genome-wide collection of chromatin interactions in Drosophila cell lines, which generates contact maps that can be explored at megabase resolution at restriction fragment level.

In-Nucleus Hi-C בתאי דרוסופילה

The genome is organized into topologically associating domains (TADs) delimited by boundaries that isolate interactions between domains. In Drosophila, ...

Genetics

לכידת קונפורמציה של כרומוזומים (3C) למחקר והוראה לתואר ראשון

Getting an A with the 3Cs: Chromosome Conformation Capture for Undergraduates

Chromosome conformation capture (3C) is a powerful tool that has spawned a family of similar techniques (e.g., Hi-C, 4C, and 5C, referred to here as 3C techniques) that provide detailed information of the three-dimensional organization of chromatin. The 3C techniques have been used in a wide range of studies, from monitoring the changes in chromatin organization in cancer cells to identifying enhancer contacts made with gene promoters. While many of the studies using these techniques are asking big genome-wide questions with intricate sample types (i.e., single-cell analysis), what is often lost is that the 3C techniques are grounded in basic molecular biology methods that are applicable to a broad range of studies. By addressing tightly focused questions of chromatin organization, this cutting-edge technique can be used to enhance the undergraduate research and teaching lab experience. This paper presents a 3C protocol and provides adaptations and points of emphasis for implementation at primarily undergraduate institutions in undergraduate research and teaching experiences.

מחבר זרקור: מקבל A עם 3Cs: לכידת קונפורמציה כרומוזומים עבור סטודנטים לתואר ראשון  

Here, we present an adaption of the chromosome conformation capture (3C) technique in detail with an emphasis on undergraduate involvement and learning.

קבלת A עם 3Cs: לכידת קונפורמציה כרומוזומים לסטודנטים לתואר ראשון

Chromosome conformation capture (3C) is a powerful tool that has spawned a family of similar techniques (e.g., Hi-C, 4C, and 5C, referred to here as 3C ...

Single-Molecule Dwell-Time Analysis of Restriction Endonuclease-Mediated DNA Cleavage

This novel total internal reflection fluorescence microscopy-based assay facilitates the simultaneous measurement of the length of the catalytic cycle for hundreds of individual restriction endonuclease (REase) molecules in one experiment. This assay does not require protein labeling and can be carried out with a single imaging channel. In addition, the results of multiple individual experiments can be pooled to generate well-populated dwell-time distributions. Analysis of the resulting dwell-time distributions can help elucidate the DNA cleavage mechanism by revealing the presence of kinetic steps that cannot be directly observed. Example data collected using this assay with the well-studied REase, EcoRV - a dimeric Type IIP restriction endonuclease that cleaves the palindromic sequence GAT&#8595;ATC (where &#8595; is the cut site) - are in agreement with prior studies. These results suggest that there are at least three steps in the pathway to DNA cleavage that is initiated by introducing magnesium after EcoRV binds DNA in its absence, with an average rate of 0.17 s-1 for each step.

Using quantum-dot-labeled DNA and total internal reflection fluorescence microscopy, we can investigate the reaction mechanism of restriction endonucleases while using unlabeled protein. This single-molecule technique allows for massively multiplexed observation of individual protein-DNA interactions, and data can be pooled to generate well-populated dwell-time distributions.

ניתוח זמן שהייה של מולקולה בודדת של מחשוף DNA בתיווך אנדונוקלאז הגבלה

This novel total internal reflection fluorescence microscopy-based assay facilitates the simultaneous measurement of the length of the catalytic cycle for ...

DNA-based Fish Species Identification Protocol

We have developed a fast, simple, and accurate DNA-based screening method to identify the fish species present in fresh and processed seafood samples. This versatile method employs PCR amplification of genomic DNA extracted from fish samples, followed by restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis to generate fragment patterns that can be resolved on the Agilent 2100 Bioanalyzer and matched to the correct species using RFLP pattern matching software.
The fish identification method uses a simple, reliable, spin column- based protocol to isolate DNA from fish samples. The samples are treated with proteinase K to release the nucleic acids into solution. DNA is then isolated by suspending the sample in binding buffer and loading onto a micro- spin cup containing a silica- based fiber matrix. The nucleic acids in the sample bind to the fiber matrix. The immobilized nucleic acids are washed to remove contaminants, and total DNA is recovered in a final volume of 100 &mu;l. The isolated DNA is ready for PCR amplification with the provided primers that bind to sequences found in all fish genomes. The PCR products are then digested with three different restriction enzymes and resolved on the Agilent 2100 Bioanalyzer. The fragment lengths produced in the digestion reactions can be used to determine the species of fish from which the DNA sample was prepared, using the RFLP pattern matching software containing a database of experimentally- derived RFLP patterns from commercially relevant fish species.

This publication describes how to use the Agilent Fish Species Identification System to identify the species of a fish by extracting DNA and performing PCR and RFLP analysis.

ה-DNA מבוססי פרוטוקול זיהוי דגים המינים

We have developed a fast, simple, and accurate DNA-based screening method to identify the fish species present in fresh and processed seafood samples. ...

Biology

<meta charset="utf8"></head><body>חקר אינטראקציות TRF1/2 עם דנ"א טלומרי באמצעות בדיקת מולקולה יחידה

Analyzing Telomeric Protein-DNA Interactions Using Single-Molecule Magnetic Tweezers

Telomeres, the protective structures at the ends of chromosomes, are crucial for maintaining cellular longevity and genome stability. Their proper function depends on tightly regulated processes of replication, elongation, and damage response. The shelterin complex, especially Telomere Repeat-binding Factor 1 (TRF1) and TRF2, plays a pivotal role in telomere protection and has emerged as a potential anti-cancer target for drug discovery. These proteins bind to the repetitive telomeric DNA motif TTAGGG, facilitating the formation of protective structures and recruitment of other telomeric proteins. Structural methods and advanced imaging techniques have provided insights into telomeric protein-DNA interactions, but probing the dynamic processes requires single-molecule approaches. Tools like magnetic tweezers, optical tweezers, and atomic force microscopy (AFM) have been employed to study telomeric protein-DNA interactions, revealing important details such as TRF2-dependent DNA distortion and telomerase catalysis. However, the preparation of single-molecule constructs with telomeric repetitive motifs continues to be a challenging task, potentially limiting the breadth of studies utilizing single-molecule mechanical methods. To address this, we developed a method to study interactions using full-length human telomeric DNA with magnetic tweezers. This protocol describes how to express and purify TRF2, prepare telomeric DNA, set up single-molecule mechanical assays, and analyze data. This detailed guide will benefit researchers in telomere biology and telomere-targeted drug discovery.

<meta charset="utf8"></head><body>Author Spotlight: Advanced Single-Molecule Techniques for Investigation Telomeric Protein-DNA Interactions

This protocol demonstrates using single-molecule magnetic tweezers to study interactions between telomeric DNA-binding proteins (Telomere Repeat-binding Factor 1 [TRF1] and TRF2) and long telomeres extracted from human cells. It describes the preparatory steps for telomeres and telomeric repeat-binding factors, the execution of single-molecule experiments, and the data collection and analysis methods.

קביעה אם הדנ א מוכתם Cyanine צבע יכול להיות מתעכל עם אנזימי הגבלה

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

DNA מכתים שיטה המבוססת על משקעים Formazan הנגרם על ידי חשיפה אור כחול

זיהוי של חיידקים באמצעות DNAzymes Fluorogenic

אלקטרופורזה הדנ א באמצעות Thiazole תפוז במקום אתידיום ברומיד או צבע חלופי

In-Nucleus Hi-C בתאי דרוסופילה

קבלת A עם 3Cs: לכידת קונפורמציה כרומוזומים לסטודנטים לתואר ראשון

קבלת A עם 3Cs: לכידת קונפורמציה כרומוזומים לסטודנטים לתואר ראשון

קבלת A עם 3Cs: לכידת קונפורמציה כרומוזומים לסטודנטים לתואר ראשון

ניתוח זמן שהייה של מולקולה בודדת של מחשוף DNA בתיווך אנדונוקלאז הגבלה

ה-DNA מבוססי פרוטוקול זיהוי דגים המינים

ניתוח אינטראקציות חלבון-דנ"א טלומריות באמצעות פינצטה מגנטית של מולקולה אחת