この作品は、イタリアの Ricerca グラーヴェ セントロ Cardiologico Monzino IRCCS に保健省によって賄われていた。

このアプローチは、ヘルシンキ宣言に準拠しているし、右室サンプルのコレクションだった「セントロ Cardiologico Monzino IRCCS」倫理委員会承認 (2012/07/06).
1. ソリューション
<ol><li>C MSC 文化の媒体と Iscove の変更ダルベッコ媒体 (IMDM)、20% を添加した胎仔ウシ血清 (FBS)、10 ng/mL 塩基性繊維芽細胞成長因子、10,000 U/mL ペニシリン、10,000 μ g/mL ストレプトマイシン、0.02 M L-グルタミン。0.22 μ m の滅菌フィルター ユニットを使用してこのメディアをフィルター処理し、4 ° C で保存</li>
	<li>コラゲナーゼの解決を準備するには、3 mg/mL の濃度で最終的な解を得るための IMDM 媒質中のコラゲナーゼ NB4 ミックスを再懸濁します。優しく、粉溶解して 0.2 μ m のシリンジ フィルターを用いたコラゲナーゼの解決をフィルターする渦。分注 1 mL 量 2 mL 滅菌チューブに-20 ° c まで使用するために必要なストア。</li>
	<li>10 %fbs、0.5 mM 3-イソブチル-1-メチルキサンチン (事前 0.5 M の濃度でジメチルスルホキシド (DMSO) で希釈し、使用するまで-20 ° C で保管)、1 μ M ヒドロコルチゾン (前希釈で補われる t. 裏打ちメディアの準備、IMDM 中脂肪分化培地を作る100 mM とさらに 10 mm の滅菌希釈で DMSO で蒸留水し、使用するまで-20 ° C で保管) と 0.1 mM インドメタシン (済み DMSO 0.5 M の濃度で希釈品し、使用するまで-20 ° C で保存)。0.22 μ m の滅菌フィルター ユニットを使用して t. 裏打ち媒体をフィルター処理し、4 ° C で保存</li>
	<li>リン酸緩衝生理食塩水 0.0067 M PO4 (PBS)、エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) から成る洗浄バッファーを準備 5 mM と 5% ウシ血清アルブミンおよび 4 ° C でのストア</li>
	<li>60% イソプロパノールで 1% のオロの粉末を溶解、2 h の混合、0.22 μ m のフィルター ユニットを使用して沈殿物を削除するフィルタ リング オイル赤い O (オロ) 実用的なソリューションを準備します。保管常温 (RT) 作業ソリューションです。</li>
</ol>2. 間葉系間質細胞の分離
<ol><li>
心筋生検の収集と処理 注:前に、コラゲナーゼの解決と準備ができてこの媒体を持っているを確認します。<ol>
<li>ACM 心内膜心筋生検を置く (通常約 5 mg の組織) 生殖不能の管に手ごろでいっぱいし、研究室にそれを輸送。 注:ACM の生検は、以前のレポート10によると電気生理学手術室で収集されます。簡単に言えば、電気解剖学的マッピングと右心室の心腔内エコーの統合を使用して心内膜心筋生検 (ビデオ 1参照) (ビデオ 2、参照透視) の国境地帯への対応で、病的心筋。健康な制御 (HC) サンプルは、死体ドナー死亡 (事故死、健常者) の 24 時間以内の右室自由壁から得られる組織バイオ-銀行、によって提供されます。輸送中および郭清の前に、4 ° C で手ごろで生検を格納します。生検コレクションとティッシュの処理 (最大 24 時間) の間の時間を制限します。</li>
		<li>酵素消化までの手順を実行する必要なソリューションとキャビネット生物学的安全性を設定します。</li>
		<li>フードの下で殺菌剤を入れて、楽器使用前に 15 分に回して温度上昇 200-250 ° c.</li>
		<li>消毒はさみとピンセット 10 s. 作る確か滅菌器具は使用前に冷たい。使い捨て滅菌メスを準備します。</li>
		<li>無菌フードに生検でチューブを配置します。管を開き、滅菌プレートに生検を転送します。</li>
		<li>3 mL の滅菌 PBS で 2 回右心室生検を洗います。顕微鏡で生検の写真を撮る場合。</li>
		<li>生検の結果, 右心室のコラゲナーゼ溶液 1 mL を含む滅菌 2 mL チューブに滅菌ピンセットを使用して転送します。</li>
		<li>滅菌ハサミで 0.5 - 1 mm の3個セットにサンプルをカットします。</li>
		<li>連続回転攪拌下の 37 ° C で 1.5 時間孵化させなさい。</li>
		<li>消化液室温 10 分 400 × g で遠心分離します。</li>
		<li>上澄みを除去し、ペレットを洗浄する滅菌 PBS の 1 mL を追加します。</li>
		<li>室温 10 分 400 × g で遠心します。</li>
		<li>上澄みを除去し、この中の 1 mL にペレットを再懸濁します。</li>
		<li>処理滅菌 60 mm 組織培養プレート上に得られた懸濁液をプレート、この媒体を 3 mL の最終的なボリュームに追加します。プレート 5% CO2と 37 ° C で細胞文化のインキュベーターで孵化させなさい。 注:媒体の高いボリュームは、生検消化断片の正しい接着を防ぐことができます。</li>
		<li>24 h 後非付着性のセルおよび残骸を削除する媒体を破棄します。 注:単一の解離の間葉系細胞ことができるプラスチック面にアタッチしてクローン; を生じまた、未消化の小さな生検フラグメントは、プラスチックの皿にアタッチし、セル萌芽を許可できます。</li>
		<li>滅菌 PBS の 5 mL で 2 回洗浄して新鮮なこの媒体の 3 mL を加えます。</li>
		<li>セルが 80% 合流まで週に何回この中 3 つを交換してください。 注:接続されているセルの数は品質、組織の量と消化の効率に依存します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 細胞伸長
注:開始する前に、この媒体の準備を持っていることを確認します。
<ol><li>セルが 80% 合流、転送新しい滅菌 60 mm 組織培養に消化された小さな生検サンプル プレートを扱われ、新鮮なこの媒体の 3 mL を加えます。 注:生検サンプルはさらに C MSC 分離再利用することができます。単離細胞のかなりの数になるまでこの手順を繰り返すことが可能です。</li>
	<li>3 mL の滅菌 PBS で 2 回添付セルを洗浄してください。トリプシン EDTA 溶液 (60 mm ディッシュ用 0.5 mL) を加え、細胞の剥離を許可する 3-5 分の 37 ° C で孵化させなさい。</li>
	<li>プレートの表面から細胞を取り外したら、トリプシンを不活化し、新しい 50 mL 滅菌チューブに細胞を収集する滅菌 FBS の 0.5 mL を追加します。</li>
	<li>同じチューブに残りのセルを追加する滅菌 PBS の 5 mL で 2 回洗浄します。</li>
	<li>室温 10 分 400 x g で細胞を遠心分離します。</li>
	<li>上澄みを除去し、この中の 1 mL にペレットを再懸濁します。</li>
	<li>商工会議所を数えるセルの細胞懸濁液の 10 μ L をロードします。 注:セルは、あまりにも集中している場合、初期懸濁液 1:10 PBS で希釈し、カウント部屋のセルに希薄化後の細胞の 10 μ L を読み込みます。</li>
	<li>顕微鏡で 3 大きな正方形とその両側の 2 つの行のセルをカウントし、平均細胞数を計算します。 注:セル/mL の数を得るためには、カウントが設定されたセルの平均値に 10 を掛ける4、カウント部屋セルの希釈係数。セルがさらに希釈されている場合は、希釈倍率の乗算します。シードする細胞数と細胞濃度 (セル/mL の数) 間の比率は、次のステップ (3.9 ポイント) にメッキする初期懸濁液量 (mL) でに対応します。</li>
	<li>5,000-10,000 のセル/cm2の最終的な集中で扱われる滅菌 100 mm 組織培養プレートに巻き上がりをプレート、この媒体を 8 mL の最終巻に追加します。細胞文化のインキュベーターでプレートを孵化させなさい。 注:セルが 70-80% の合流は、セル拡張手順を繰り返します。すべての通路 (P) では、セルとプレート残りの金額の一部を凍結保存することをお勧めします。P3 や P4 までセルを展開し、蛍光活性化細胞選別機 (FACS) 解析 (セクション 4)、脂肪細胞分化 (セクション 5) を使用します。</li>
	<li>剥離後凍結、室温 10 分 400 x g で細胞を遠心分離します。</li>
	<li>としてセルを数える (ステップ 3.7 3.8) と 900 μ L 滅菌 FBS の 1 x 106細胞を再懸濁します。無菌低温バイアルに転送し、100 μ L の滅菌の DMSO とミックスを追加します。</li>
	<li>すぐに、少なくとも 2 日間-80 ° c の凍結容器にクライオ バイアルを格納し、液体窒素にバイアルを転送します。</li>
</ol>4. フローサイトメトリーを用いた間葉系間質細胞のキャラクタリゼーション
注:始める前に、細胞解離試薬、洗浄バッファー、および準備特定の抗体を持っていることを確認します。
<ol><li>細胞の数に達すると、少なくとも 3 x 106 (3.7 3.8 で説明したセルとしてカウント) は 10 mL の滅菌 PBS で 2 回 100 mm プレートを洗います。</li>
	<li>細胞解離試薬の 5 mL を追加し、細胞の剥離を許可する RT で 7 ~ 10 分を待ちます。</li>
	<li>プレートの表面から細胞を取り外したら、15 mL の滅菌洗浄バッファーを追加し、新しい 50 mL 滅菌チューブに懸濁液を収集します。</li>
	<li>洗浄液 10 mL で 2 回洗浄し、残りのセルを同じ管に追加します。</li>
	<li>RT で 10 分の 400 x g で細胞を遠心し、洗浄液の 1 mL にペレットを再懸濁します。</li>
	<li>説明されている (手順 3.7 3.8)、としてセルをカウントし、新しい生殖不能の管に 3 x 10 の6セルを転送 1.5 mL の最終巻に洗浄バッファーを追加します。 注:総細胞数と洗浄バッファーの容量解析 (3 x 105セル各 FACS ポリスチレン管用 100 μ L) に使用される選択したマーカーの数に依存します。</li>
	<li>配布 12 異なる FACS ポリスチレン管、細胞懸濁液を 100 μ l 添加し製品データシートに示された濃度で特定の抗体を追加します。 注:C MSC 特性評価用抗体、CD34、CD105、CD45、(cd29)、CD90、CD44、CD31、CD14、および HLA-DR (表 1)。再懸濁細胞シグナルの特異性をチェックするアイソタイプ コントロールで染色の 100 μ L から成るコントロールのサンプルを準備することが重要です。</li>
	<li>暗闇の中で 15 分間サンプルをインキュベートします。</li>
	<li>反応を停止する各管に 1 mL の滅菌洗浄バッファーを追加します。</li>
	<li>室温 10 分 400 x g で細胞を遠心分離します。</li>
	<li>上澄みを除去し、洗浄バッファーの 250 μ L でペレットを再懸濁します。</li>
	<li>フローサイトメトリーによる C MSC 特性に進みます。</li>
</ol>5. 心臓間葉系間質細胞が分化
注:始める前に、t. 裏打ち媒体とオロ実用的なソリューションを用意してください。
<ol><li>
T. 同定培地で培養
	<ol>
<li>デタッチし、セクション 3 で説明したセルをカウントします。</li>
		<li>プレート 3 × 105セル 6 ウェル組織培養の各ウェルには、T. 裏打ち培地 2 mL にプレートを扱われます。</li>
		<li>C MSC t. 裏打ち中 72 時間または 1 週間変更中 2 〜 3 日ごとに区別ができます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
オイル赤 O 染色 注:使用オイル赤い O (オロ) C MSC の脂質蓄積をテストする染色します。<ol>
<li>6 ウェル培養 plateunder ヒューム フードを配置します。</li>
		<li>脂肪細胞の培地を取り除き、2 mL の PBS で 2 回細胞を洗浄します。</li>
		<li>4% のパラホルムアルデヒド (PFA) それぞれをカバーするための十分なボリュームを追加も。室温 5 分のセルを修復します。</li>
		<li>PFA を破棄し、2 mL の PBS で 2 回細胞を洗浄します。</li>
		<li>RT、それぞれをカバーする十分なボリュームを使用して、1 時間オロ実用的なソリューションと固定セルを孵化も。 注:オロ オロ作業溶液の蒸発を避けるために潜伏中にヒューム フードの下で 6 も組織培養プレートを保持しません。</li>
		<li>すべてオロ実用的なソリューションを取除き、洗浄 2 ml の PBS 3 - 5 回までプレートが完全にクリーンアップ。洗浄を破棄します。使用される PBS が明らかなときと非特異的細胞から染色顕微鏡の下で、表示されない場合は、洗浄を停止します。</li>
		<li>培養倒立位相差顕微鏡を使用して各ウェルの 20 倍の倍率で 20 枚の画像をキャプチャします。</li>
		<li>セル オロ蓄積を定量化するための画像処理プログラムで写真を開きます。</li>
		<li>255 赤チャネルの輝度のみを定量化するために「チャンネルを分割」機能で別の色チャンネルを分離します。</li>
		<li>核を数えることによって各画像のセルの数をカウントします。セル数にオロ信号強度を標準化します。</li>
		<li>同じサンプルの各画像の結果の平均を計算します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Brooke, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+applications+of+mesenchymal+stromal+cells.">Therapeutic applications of mesenchymal stromal cells.</a> Semin Cell Dev Biol. 18 (6), 846-858 (2007).</li><li>Rossini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cardiac+and+bone+marrow+stromal+cells+exhibit+distinctive+properties+related+to+their+origin.">Human cardiac and bone marrow stromal cells exhibit distinctive properties related to their origin.</a> Cardiovasc Res. 89 (3), 650-660 (2010).</li><li>Dominici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+criteria+for+defining+multipotent+mesenchymal+stromal+cells.+The+International+Society+for+Cellular+Therapy+position+statement.">Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. 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著者が明らかに何もありません。

MSC と C MSC:MSC は、多能性細胞骨髄、脂肪、軟骨、脳、皮膚、胎児附属心12など、さまざまなアダルト組織の間質の一部に居住。分離し、基礎やトランスレーショナル研究12,13の潜在的なアプリケーションのためにそれらを特徴付けるさまざまな研究を行った。
MSC は健康な状態に静止、低金利14自己更新。以来、彼らは環境の病理学的変化にさらされている、彼らは育成組織は、直接分化転換、マトリックス析出パラクライン効果14のいずれかを介しての改造反応します。
心臓 MSC (C MSC) は、大規模な非心筋細胞集団の心4を表します。心外膜から発信し、上皮間葉移行15のプロセスを受けている心筋に移行します。彼らは、心臓の構造、生理学的と病理学的状態は、心筋細胞と細胞外マトリックスの恒常性7,16との相互作用での機械的および電気的整合性に貢献します。ただし、C-MSC の広い範囲機能はまだ完全には分かっていません。生理学的および病理学的条件の両方が生体外での研究によって促進することの役割のより深い知識は、彼らの分離の後実行されます。
C MSC は心耳2,17右心室18など、人間の心の別の地区から得られています。
最近では、C-MSC 人間右室心内膜心筋生検標本から得られている8、ソース組織 3-5 mg として、小さなことを示します。
可能なアプリケーション:本稿で説明する方法は、非常に小さなハートの標本から消化とプラスチックの遵守のための選択など、いくつかの簡単な文章とセルを取得ことができます。
増幅し、生体外で、メンテナンスが容易、間葉系の系統 (血管内皮細胞、骨細胞、脂肪細胞) の細胞に分化することができるので、C MSC 細胞モデルを検討できます。また、患者から直接細胞を得る可能性はパーソナライズ/精密医学のコンテキストで解明のための偉大な体外ツールを構成します。確かに、これらの細胞は遺伝的背景と、ドナーの最終的に特定の突然変異を運ぶし、臨床症状、年齢、性別、ライフ スタイル、薬などの特定の患者の特性によって影響を受けます。また、別のマーカーにそれらを並べ替えの可能性特定 C MSC サブセット19の研究ができます。
C MSC がほとんど心の不利な改造によって特徴付けられる別の心血管疾患で現役選手として知られています。したがって、心疾患8,20に対抗する新しい治療戦略のための候補者目標を表すものです。
C MSC 幹のような性質と重要な免疫原性の欠如は、心臓再生医療の細胞療法の潜在的な応用を示唆しています。確かに、MSC 骨髄や他の情報源のような C-MSC される可能性があります潜在的自己とドナーと受信者21とのマッチングを必要とせず、同種の設定で。
また、C-MSC、直接心臓組織から分離されている心臓微小環境とエピジェネティックなプロファイルで前処理されているという利点があります。心臓再生医療の中では、これは特に成功した結果を取得することが重要かもしれない。
日には、再生医療の臨床研究は、C MSC とその傍分泌活動18,22,23で有用な治療の可能性を識別されます。重要なは、セルのソースで心の臨床試験が進行中 cardiosfere 由来細胞もしくは C MSC13,24,25の集団。しかし、骨骨髄由来 MSC はさまざまなプロトコルは、臨床グレード C MSC26を取得する必要あります。
ACM で C MSC:提案するプロトコルは、心内膜生検は示されている病態の研究に適しています主です。ACM の患者は診断目的27生検手術します。その心筋は、徐々 に脂肪細胞と線維化から成る電気的不活性組織瘢痕組織に置き換えられます。診断の収量が最大、瘢痕領域に生検のサンプリングを導くために心筋マッピングは使用10,28,29です。このプロトコルで使用されるサンプルは、病的心筋の国境地帯で撮影されます。
ソンマリーヴァら最近 ACM8、それら心の脂肪前駆細胞は間葉系由来の C MSC が ACM 心臓脂肪細胞形成の現役選手である証明の病因に C MSC の極めて重要な役割を定義しました。また、C MSC は、コントロールよりも脂質蓄積と脂肪細胞形成により傾向を認め, ACM 患者の生検から議定書で分離されました。このため、これらの細胞が分子機構解明9細胞モデルの適合性を証明する、ACM のいくつかを確認するためにされる可能性があります。
制限と重要なステップ:(「用途」段落を参照) の患者から直接 C MSC を得る利点にもかかわらずこのプロトコルは、別制限を受けます。
まず、心筋生検の手順は侵襲的なしばしば厳密に必要ではない場合は回避します。確かに、心臓組織をサンプリング、倫理的、技術的に問題があります。心筋生検を行う理由鑑別診断、心臓移植の状態の監視や心臓腫瘍30の存在を確かめるに心筋症の確定診断の実績があります。したがって、C MSC 研究心内膜心筋生検がコンセンサス ステートメント31で示されます患者のみを登録できます。さらに、心筋生検の手順は心筋症心の中で上記のすべての合併症を持つことができます。したがって、electrophysiologist のサンプリングは常に慎重、生検サンプルは非常に小さく、細胞の分離を損なう可能性があります。今後の実験計画は、コラゲナーゼの濃度を調整する消化のタイミングによってこの問題を克服できます。
C-MSC、すべてひと初代細胞として、すべての表現型で異なる科目間で高い可変性を示します。確かに、別の科目からの細胞は、遺伝的に異なるのみならず、また受ける変数環境をご利用いただけます。具体的には、この実験では、内細胞の分離、成長、および脂肪細胞の分化の高い可変性が観察されます。
この議定書の重要なステップは了承する必要があります。生検標本には、毛細血管が含まれている場合、は、血管内皮細胞、C MSC 文化を汚染する可能性があります、FACS 解析 (CD31 陽性) によって証明することができますの並列の分離を避けるために削除する必要があります。効率的な分化を得るためには、細胞は活発な成長期である必要があります。合流の度も脂質蓄積に影響を与える可能性があります。
法の意義:間葉系間質細胞の分離の前の方法に関して、これは初めてひと心室の生検試料から直接 C MSC 取得の説明の詳細提案です。ACM 患者サンプルの処理にこのメソッドお勧め、心筋生検が示されているすべての患者に適用できる可能性です。
このプロトコルは、収集することは困難が多い大きな心臓サンプル32に必要な細胞の入手する以前の方法の有用な実装を表します。
また、サンプル ソースは、興味深い技術革新を構成します。生検を心室中隔33行われます、このプロトコル右室自由壁からアカウント試料にかかります。病気にかかった右心室地区から派生したセルより右心室を含む疾患の病理学的状態の代表があります。
さらに、議定書で使用される試薬のいくつかが他 C MSC 分離と分化の方法32に関して異なります。たとえば、本稿で提案するコラゲナーゼの種類のミックス クラス I およびクラス II コラーゲン蛋白分解活性のバランスのとれた比率を持つ。また、消化ソリューションは、将来の成長条件に適応する分離 C MSC をできるように C MSC 培地の調製に使用同じ基本培地 (IMDM) に溶解したコラゲナーゼ ミックスで構成されます。
さらに、C MSC 母集団全体を使用して細胞のバッチを標準化できるプロシージャを並べ替え、これらの細胞のプラスチック付着プロパティを介してのみ分離、肺浸潤を変更することがなく簡素化を構成します。C MSC の特性。本稿で提案する t. 裏打ちの組成は、脂肪細胞分化、インスリンなど他のコンポーネントによる代謝不全の回避につながることです。
また、割合のみに基づく方法と比較するとオロ比色強度の評価に基づく脂質蓄積定量化の手法は蓄積された脂質の量の詳細についてを提供しますオロの汚損に肯定的な細胞。ORO を抽出することにより多くの場合脂質蓄積を定量化によりイソプロパノールとその吸光度を測定します。ただし、このメソッドは、複数の通路が必要です、イソプロパノール蒸発による変動を受けます。

間葉系間質細胞 (MSC) は、多くの組織1で重要な支援機能を持つ大人のセルです。骨髄は、MSC の歴史的源を表しますが、彼らは胎盤、脂肪組織、臍帯血、肝臓、心臓1,2などさまざまな組織から分離することができます。
2006 年に国際学会細胞療法 (ISCT) の指定、初めて、人間 MSC3を定義する最低限の条件。特に、MSC プラスチックに付着する能力が必要です。彼らは特定の表面抗原を表現: 陽性 CD14、CD45、CD34 陰性 CD44、CD105、CD90 (cd29)、間葉系のマーカーは、CD31 造血と内皮マーカーが MSC を特徴付けます。HLA-DR の欠如表現、ためは、MSC が alloreactivity をトリガーすることができます。脂肪細胞、軟骨細胞、骨芽細胞の血統1,3の方向へ分化する可能性を持つ多能性細胞である。
心臓の細胞の構成に焦点を当て、心臓間葉系間質細胞 (C MSC) が正常な大人の心4,5で豊富です。彼らは正常な心臓機能と病態の両方重要な役割を果たします。しばらくの間、生理学的、C MSC は心筋の構造と機能の整合性をサポートする微小環境を提供、心疾患における心損傷創傷治癒と線維化改造6 に参加するのに応答をアクティブにします。 ,7。
最近、催不整脈性心筋症 (ACM) 脂肪置換の C MSC の関与は、示された8をされています。特に、ACM は主に右心室9を中心に、心筋の線維脂肪置換につながるデスモソーム遺伝子の突然変異によって引き起こされる遺伝的疾患です。この置換は、心外膜から心内膜に及ぶは、進行性の心不全を誘発し、重度の場合、突然の死につながることができる、心室性不整脈を悪化させる非導べ電性基板を作成します。ソンマリーヴァら前脂肪細胞の間葉系の起源を示す ACM 患者 explanted 中心セクションに存在します。また、C MSC ACM 心エクスプレス デスモソーム遺伝子の心内膜心筋生検から分離した、したがって彼らの突然変異によって影響を受けることができます。特に、脂肪分化条件下で ACM C MSC は制御心からのそれらよりより多くの脂質を蓄積します。この証拠は、病気の発症の積極的な役割があるし、ACM を研究に有効な細胞モデルを表すの両方、C MSC の結論に します。
このコンテキストまたは心筋生検は示されているその他の心疾患の研究を進めるため、詳細なプロトコルを心筋組織の拡大、その免疫-表現型の小さな断片から C MSC の分離の提示します。特性、および脂肪細胞分化。

<table><tbody><tr><td>IMDM</td><td>Gibco by Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>12440053</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>PENICILLIN STREPTOMYCIN</td><td>Life Technologies Italia</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase NB4</td><td>Serva</td><td>17454.02</td><td></td></tr><tr><td>Basic fibroblast growth factor</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>L-glutammine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Lonza</td><td>17-516F</td><td></td></tr><tr><td>Tryple select 1X (cell dissociation reagent)</td><td>Gibco</td><td>12563029</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA solution&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6689</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2058</td><td></td></tr><tr><td>3-Isobutyl-1-methylxanthine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortisone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4001</td><td></td></tr><tr><td>Indomethacin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7378</td><td></td></tr><tr><td>Oil Red O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O0625</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA) Solution 4% in PBS</td><td>D.b.a. Italia S.r.l.</td><td>sc-281692</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>276855</td><td></td></tr><tr><td>Antibody CD14-FITC (M&amp;phi;P9)</td><td>Becton Dickinson</td><td>345784</td><td></td></tr><tr><td>Antibody Integrin &amp;beta;1 (CD29)-PE (clone MAR4)</td><td>Becton Dickinson</td><td>561795</td><td></td></tr><tr><td>Antibody PECAM-1 (CD31)- APC&amp;nbsp; (clone 9G11)</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>FAB3567A</td><td></td></tr><tr><td>Antibody Hematopoietic progenitor cell antigen (CD34)-APC (clone 581)</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>CD34-581-05</td><td></td></tr><tr><td>Antibody H-CAM (CD44)-PE&amp;nbsp; (clone G44-26)</td><td>Becton Dickinson</td><td>561858</td><td></td></tr><tr><td>Antibody L-CA (CD45)-APC (clone HI30)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MHCD4505-4</td><td></td></tr><tr><td>Antibody THY1 (CD90)-FITC (clone 5E10)</td><td>Becton Dickinson</td><td>561969</td><td></td></tr><tr><td>Antibody Endoglin (CD105)-APC (clone 266)</td><td>Becton Dickinson</td><td>562408</td><td></td></tr><tr><td>Antibody HLA-DR-FITC (clone L243)</td><td>Becton Dickinson</td><td>&lt;br/&gt; 347400</td><td></td></tr><tr><td>Gima Quick Plus sterilizer</td><td>Gima&amp;nbsp;</td><td>35642</td><td></td></tr><tr><td>Bench centrifuge Sigma 3-16K</td><td>Sigma Centrifuges</td><td>10330</td><td></td></tr><tr><td>Mr. Frosty Freezing Container</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>AxioVert 200M microscope&amp;nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>B 40-080 e 03/01</td><td></td></tr><tr><td>FACS Gallios</td><td>Beckman Coulter&amp;nbsp;</td><td>773231AF</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ (image processing program)</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stericup filter units</td><td>Merck S.P.A.&amp;nbsp;</td><td>SCGPU05RE</td><td></td></tr><tr><td>Conical Tubes, 50 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30122178</td><td></td></tr><tr><td>Conical Tubes, 15 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30122151</td><td></td></tr><tr><td>Safe-Lock Tubes, 2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30120094</td><td></td></tr><tr><td>100 mm TC-Treated Cell Culture Dish</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>60 mm TC-Treated Cell Culture Dish</td><td>Corning</td><td>430166</td><td></td></tr><tr><td>6 well TC-Treated Multiple Well Plates</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Polystyrene Round-Bottom Tubes, 5 mL</td><td>BD Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>BRAND&amp;nbsp;counting chamber BLAUBRAND B&amp;uuml;rker-T&amp;uuml;rk</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BR719520</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and characterization of cardiac mesenchymal stromal cells from endomyocardial bioptic samples of arrhythmogenic cardiomyopathy patients

正常な成人の心臓は、その中で心臓間葉系間質細胞は豊富な人口を表すいくつかの異なったセルタイプで構成されます。これらの細胞の分離勉強心疾患における関与の可能性を提供し、加えて、生物学的メカニズムを調査するための有用な一次電池モデルを提供します。
ここでは、C MSC の催不整脈性心筋症患者の生検試料からの分離の手法を説明しています。心内膜心筋生検、電気解剖学的マッピングで可視化した跡に隣接する右室エリアに導かれます。コラゲナーゼと C MSC 成長できるように培地のプラスチックの皿上のめっきで生検の消化が説明されています。隔離されたセルは、いくつかの通路の文化で拡張できます。その間葉系の表現型を確認、免疫表現型特性の説明が提供されます。C MSC は骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞のようないくつかの種類の細胞に分化することができる: ACM のコンテキスト、患者の心の中で脂肪の預金、C MSC の脂肪細胞分化のためのプロトコルによって特徴付けられると脂質液滴集積の特性を説明します。

心筋間質細胞の分離:心内膜心筋生検の手順から C MSC 分離は、図 1のとおりです。
心筋間質細胞間葉系評価:細胞療法 (ISCT) の国際協会によって設立され、その免疫表現型特性3間葉系間質細胞の多能性を定義するための最低限の条件が含まれます。特に、間葉系血統を確認するセルに適切な FITC/PE/APC 結合抗体培養し、フローサイトメトリーで分析しました。C MSC 特性評価に使用される抗体のすべては材料表に表示されます。
図 2に示すように、生検から得られた C MSC は CD105、CD44、(cd29) 特定間葉系表面抗原に陽性。CD90 陽性細胞の割合は、11を既に報告されている変数です。内皮細胞 (CD31、CD34)、単球/マクロファージ (CD14)、造血 (CD45) マーカーと主要組織適合複合体 (HLA) はありません (図 2) を表明しました。
心間葉系間質細胞が分化:T. 同定培地で培養すること持っている ACM と HC によって被害を受けた患者から得られた C MSC の脂肪細胞の分化を確認する (ソリューションのセクションを参照)。セルは交換媒体週 2 回 72 時間または 1 週間の文化で維持されます。
細胞内の脂肪滴の蓄積はオロ (図 3) を染色によって立証されます。ACM と HC から得られる細胞の分化の程度だけでなく、能力の違いが観察できます。代表的なイメージのように、ACM C MSC は脂肪分化培地 (図 3) で文化の 72 時間後より脂質小滴よりも HC C-MSC を蓄積します。これらの違いは、細胞は、長期間 (1 週間) (図 3) 脂肪細胞分化の条件にさらされているときも維持されます。
<img alt="Video 1" src="/files/ftp_upload/57263/57263video1.jpg"> ビデオ 1:Electroanatomical 地図と心腔内エコーの統合。心内膜心筋生検 (下のパネル) を受ける患者に右心室 (左前方斜めと右前方斜めのビュー) のマップは心内膜のユニポーラ electroanatomical。低電圧 (赤/緑) の一部エリアが頂点で表示されます。心内膜心筋生検サンプル (サークルとしてタグ付き) は、病的心筋および心室中隔に対応で収集されます。リアルタイムの心腔内エコーは、対象地域 (上部パネル) で bioptome の正しい位置を確認できます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57263/Video_1.avi" target="_blank">してくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。(右クリックしてダウンロード)</a>
<img alt="Video 2" src="/files/ftp_upload/57263/57263video2.jpg"> ビデオ 2: 右前斜位像で透視動画。Bioptome は長い偏向シースから挿入し、心室に進出。心筋と bioptome の接触の注意チェック後顎が開かれ、サンプルを収集するためにしっかりと閉じます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57263/Video_2.avi" target="_blank">してくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。(右クリックしてダウンロード)</a>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57263/57263fig1.jpg"> 図 1:手順ドラフトします。心内膜心筋生検標本は bioptome カテーテル、小さなピンセット形切断器を使用して収集されます。得られた生検の重量は、約 5 mg (A) です。心内膜心筋生検標本は滅菌ハサミ (B)、0.5 - 1 mm3断片にみじん切り、コラゲナーゼの解決が追加されます。サンプルは 1.5 時間消化 (C) の回転プラットフォーム ミキサーの 37 ° C の定温器に配置されます。消化ソリューションは遠心分離し、プラスチックの皿 (D) で手ごろにメッキします。C MSC は単一細胞やクローン、または小さな未消化生検断片 (E) から発芽のプラスチック付着特性のおかげで得られます。C MSC は、フローサイトメトリー (F) によって特徴付けられます。C MSC の脂肪分化培地でメッキパーツ、脂質液滴集積がオイル赤 O 染色 (G) によるテストです。スケール バーを示す 50 μ m<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57263/57263fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57263/57263fig2.jpg"> 図 2: C MSC の代表的な細胞蛍光プロファイル。各ヒストグラム示されたチャネルでの蛍光強度と細胞数を示しています (PE: フィコエ リスリン;APC: アロフィコシアニン;FITC: フルオレセイン-isothyocyanate)。特定のセルと共役アイソタイプ コントロール (白) とサンプル各グラフの表面マーカー抗体 (赤) が表示されます。CD31、CD34、CD14、CD45、HLA 博士表現しないに対し、C MSC は、間葉系細胞表面抗原 (cd29)、CD44、CD105 と、部分的に、CD90、肯定的な<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57263/57263fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57263/57263fig3.jpg"> 図 3: C MSC の脂肪細胞分化。ACM と HC C-MSC 72 時間、1 週間の脂肪分化培地中で培養の代表的なイメージに染まったオロ (左画像; n = 3)。右グラフで染色 255 赤チャネルの輝度の定量化は報告する: 強度、任意の単位 (A.U.) で表されます。ACM C MSC は、コントロールよりも多くの脂肪滴を蓄積されます。スチューデントの T 検定を用いて、*: p < 0.05。スケール バーを示す 50 μ m<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57263/57263fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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Isolation and Characterization of Cardiac Mesenchymal Stromal Cells from Endomyocardial Bioptic Samples of Arrhythmogenic Cardiomyopathy Patients

催不整脈性心筋症患者の心内膜心筋生検サンプルから心臓の間葉系間質細胞の分離と性状

この記事では、催不整脈性心筋症患者の心内膜心筋生検サンプルから心臓の間葉系間質細胞を分離するメソッドが提供されます。その特性とその脂肪細胞分化を促進するためのプロトコルを説明します。

A normal adult heart is composed of several different cell types, among which cardiac mesenchymal stromal cells represent an abundant population. The ...

isolation-characterization-cardiac-mesenchymal-stromal-cells-from

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

7.6K ビュー.  Centro Cardiologico Monzino-IRCCS. この記事では、催不整脈性心筋症患者の心内膜心筋生検サンプルから心臓の間葉系間質細胞を分離するメソッドが提供されます。その特性とその脂肪細胞分化を促進するためのプロトコルを説明します。

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Isolation of Perivascular Multipotent Precursor Cell Populations from Human Cardiac Tissue

Multipotent mesenchymal stem/stromal cells (MSC) were conventionally isolated, through their plastic adherence, from primary tissue digests whilst their anatomical tissue location remained unclear. The recent discovery of defined perivascular and MSC cell marker expression by perivascular cells in multiple tissues by our group and other researchers has provided an opportunity to prospectively isolate and purify specific homogenous subpopulations of multipotent perivascular precursor cells. We have previously demonstrated the use of fluorescent activated cell sorting (FACS) to purify microvascular CD146+CD34- pericytes and vascular CD34+CD146- adventitial cells from human skeletal muscle. Herein we describe a method to simultaneously isolate these two perivascular cell subsets from human myocardium by FACS, based on the expression of a defined set of cell surface markers for positive and negative selections. This method thus makes available two specific subpopulations of multipotent cardiac MSC-like precursor cells for use in basic research and/or therapeutic investigations.

Human cardiac tissue harbours multipotent perivascular precursor cell populations that may be suitable for myocardial regeneration. The technique described here allows for the simultaneous isolation and purification of two multipotent stromal cell populations associated with native blood vessels, i.e. CD146+CD34- pericytes and CD34+CD146- adventitial cells, from the human myocardium.

ヒト心臓組織からの血管周囲多能前駆細胞集団の単離

Multipotent mesenchymal stem/stromal cells (MSC) were conventionally isolated, through their plastic adherence, from primary tissue digests whilst their ...

発生生物学

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

Myocardial infarction and the subsequent ischemic cascade result in the extensive loss of cardiomyocytes, leading to congestive heart failure, the leading cause of mortality worldwide. Mesenchymal stem cells (MSCs) are a promising option for cell-based therapies to replace current, invasive techniques. MSCs can differentiate into mesenchymal lineages, including cardiac cell types, but complete differentiation into functional cells has not yet been achieved. Previous methods of differentiation were based on pharmacological agents or growth factors. However, more physiologically relevant strategies can also enable MSCs to undergo cardiomyogenic transformation. Here, we present a differentiation method using MSC aggregates on cardiomyocyte feeder layers to produce cardiomyocyte-like contracting cells.
Human umbilical cord perivascular cells (HUCPVCs) have been shown to have a greater differentiation potential than commonly investigated MSC types, such as bone marrow MSCs (BMSCs). As an ontogenetically younger source, we investigated the cardiomyogenic potential of first-trimester (FTM) HUCPVCs compared to older sources. FTM HUCPVCs are a novel, rich source of MSCs that retain their in utero immunoprivileged properties when cultured in vitro. Using this differentiation protocol, FTM and term HUCPVCs achieved significantly increased cardiomyogenic differentiation compared to BMSCs, as indicated by the increased expression of cardiomyocyte markers (i.e., myocyte enhancer factor 2C, cardiac troponin T, heavy chain cardiac myosin, signal regulatory protein &#945;, and connexin 43). They also maintained significantly lower immunogenicity, as demonstrated by their lower HLA-A expression and higher HLA-G expression. Applying aggregate-based differentiation, FTM HUCPVCs showed increased aggregate formation potential and generated contracting cells clusters within 1 week of co-culture on cardiac feeder layers, becoming the first MSC type to do so. 
Our results demonstrate that this differentiation strategy can effectively harness the cardiomyogenic potential of young MSCs, such as FTM HUCPVCs, and suggests that in vitro pre-differentiation could be a potential strategy to increase their regenerative efficacy in vivo.

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

Here, we present a method to efficiently harness the cardiac differentiation potential of young sources of human mesenchymal stem cells in order to generate functional, contracting, cardiomyocyte-like cells in vitro.

体外ヒト間葉系幹細胞の心筋細胞のような細胞への分化

Myocardial infarction and the subsequent ischemic cascade result in the extensive loss of cardiomyocytes, leading to congestive heart failure, the leading ...

Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and membrane ion currents. Those changes are likely&#160;to be responsible for the increased arrhythmogenic risk and the contractile alterations leading to systolic and diastolic dysfunction in cardiac patients. However, most information on the alterations of myocyte function in cardiac diseases has come from animal models.
Here we describe and validate a protocol to isolate viable myocytes from small surgical samples of ventricular myocardium from patients undergoing cardiac surgery operations. The protocol is described in detail. Electrophysiological and intracellular calcium measurements are reported to demonstrate the feasibility of a number of single cell measurements in human ventricular cardiomyocytes obtained with this method.
The protocol reported here can be useful for future investigations of the cellular and molecular basis of functional alterations of the human heart in the presence of different cardiac diseases. Further, this method can be used to identify novel therapeutic targets at cellular level and to test the effectiveness of new compounds on human cardiomyocytes, with direct translational value.

Current knowledge on the cellular basis of cardiac diseases mostly relies on studies on animal models. Here we describe and validate a novel method to obtain single viable cardiomyocytes from small surgical samples of human ventricular myocardium. Human ventricular myocytes can be used for electrophysiological studies and drug testing.

離と新鮮な外科的試料からのヒト心室の心筋細胞の機能解析

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and ...

医学

Isolation of Macrophage Subsets and Stromal Cells from Human and Mouse Myocardial Specimens

Macrophages represent the most heterogeneous and abundant immune cell populations in the heart and are central in driving inflammation and reparative responses after cardiac injury. How various subsets of macrophages orchestrate the immune responses after cardiac injury is an active area of research. Presented here is a simple protocol that our lab performs routinely, for the extraction of macrophages from mouse and human myocardium specimens obtained from healthy and diseased individuals. Briefly, this protocol involves enzymatic digestion of cardiac tissue to generate a single cell suspension, followed by antibody staining, and flow cytometry. This technique is suitable for functional assays performed on sorted cells as well as bulk and single cell RNA sequencing. A major advantage of this protocol is its simplicity, minimal day to day variation and wide applicability allowing investigation of macrophage heterogeneity across various mouse models and human disease entities.

Presented here is a protocol to isolate various subsets of macrophages and other non-immune cells from human and mouse myocardium by preparing a single cell suspension through enzymatic digestion. Gating schemes for flow cytometry based identification and characterization of isolated macrophages are also presented.

ヒトおよびマウスの心筋標本からのマクロファージサブセットおよび間質細胞の分離

Macrophages represent the most heterogeneous and abundant immune cell populations in the heart and are central in driving inflammation and reparative ...

免疫・感染学

Isolation of Atrial Cardiomyocytes from a Rat Model of Metabolic Syndrome-related Heart Failure with Preserved Ejection Fraction

In this article, we describe an optimized, Langendorff-based procedure for the isolation of single-cell atrial cardiomyocytes (ACMs) from a rat model of metabolic syndrome (MetS)-related heart failure with preserved ejection fraction (HFpEF). The prevalence of MetS-related HFpEF is rising, and atrial cardiomyopathies associated with atrial remodeling and atrial fibrillation are clinically highly relevant as atrial remodeling is an independent predictor of mortality. Studies with isolated single-cell cardiomyocytes are frequently used to corroborate and complement in vivo findings. Circulatory vessel rarefication and interstitial tissue fibrosis pose a potentially limiting factor for the successful single-cell isolation of ACMs from animal models of this disease.
We have addressed this issue by employing a device capable of manually regulating the intraluminal pressure of cardiac cavities during the isolation procedure, substantially increasing the yield of morphologically and functionally intact ACMs. The acquired cells can be used in a variety of different experiments, such as cell culture and functional Calcium imaging (i.e., excitation-contraction-coupling).
We provide the researcher with a step-by-step protocol, a list of optimized solutions, thorough instructions to prepare the necessary equipment, and a comprehensive troubleshooting guide. While the initial implementation of the procedure might be rather difficult, a successful adaptation will allow the reader to perform state-of-the-art ACM isolations in a rat model of MetS-related HFpEF for a broad spectrum of experiments.

Here, we describe an optimized, Langendorff-based procedure for the isolation of single-cell atrial cardiomyocytes from a rat model of metabolic syndrome-related heart failure with preserved ejection fraction. A manual regulation of intraluminal pressure of cardiac cavities is implemented to yield functionally intact myocytes suitable for excitation-contraction-coupling studies.

保存された駆出率とメタボリック症候群関連心不全ラットモデルから心房の心筋細胞の単離

In this article, we describe an optimized, Langendorff-based procedure for the isolation of single-cell atrial cardiomyocytes (ACMs) from a rat model of ...

Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force used to pump blood. Individual cardiomyocytes were first isolated over 40 years ago in order to better study the physiology and structure of heart muscle. Techniques have rapidly improved to include enzymatic digestion via coronary perfusion. More recently, analyzing the contractility and calcium flux of isolated myocytes has provided a vital tool in the cellular and sub-cellular analysis of heart failure. Echocardiography and EKGs provide information about the heart at an organ level only. Cardiomyocyte cell culture systems exist, but cells lack physiologically essential structures such as organized sarcomeres and t-tubules required for myocyte function within the heart. In the protocol presented here, cardiomyocytes are isolated via Langendorff perfusion. The heart is removed from the mouse, mounted via the aorta to a cannula, perfused with digestion enzymes, and cells are introduced to increasing calcium concentrations. Edge and sarcomere detection software is used to analyze contractility, and a calcium binding fluorescent dye is used to visualize calcium transients of electrically paced cardiomyocytes; increasing understanding of the role cellular changes play in heart dysfunction. Traditionally used to test drug effects on cardiomyocytes, we employ this system to compare myocytes from WT mice and mice with a mutation that causes dilated cardiomyopathy. This protocol is unique in its comparison of live cells from mice with known heart function and known genetics. Many experimental conditions are reliably compared, including genetic or environmental manipulation, infection, drug treatment, and more. Beyond physiologic data, isolated cardiomyocytes are easily fixed and stained for cytoskeletal elements. Isolating cardiomyocytes via perfusion is an extremely versatile method, useful in studying cellular changes that accompany or lead to heart failure in a variety of experimental conditions.

Individual cardiomyocytes from wild type and mutant mice can be isolated from the heart in order to study their contractility and calcium transients. This allows characterization of the contribution of cellular dysfunction to heart dysfunction from any cause.

マウス心筋細胞の単離と生理解析

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force ...

生物学

Isolation, Characterization, and Differentiation of Cardiac Stem Cells from the Adult Mouse Heart

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead myocardium after MI. Although several strategies have been used to regenerate myocardium, stem cell therapy remains a major approach to replenish the dead myocardium of an MI heart. Accumulating evidence suggests the presence of resident cardiac stem cells (CSCs) in the adult heart and their endocrine and/or paracrine effects on cardiac regeneration. However, CSC isolation and their characterization and differentiation toward myocardial cells, especially cardiomyocytes, remains a technical challenge. In the present study, we provided a simple method for the isolation, characterization, and differentiation of CSCs from the adult mouse heart. Here, we describe a density gradient method for the isolation of CSCs, where the heart is digested by a 0.2% collagenase II solution. To characterize the isolated CSCs, we evaluated the expression of CSCs/cardiac markers Sca-1, NKX2-5, and GATA4, and pluripotency/stemness markers OCT4, SOX2, and Nanog. We also determined the proliferation potential of isolated CSCs by culturing them in a Petri dish and assessing the expression of the proliferation marker Ki-67. For evaluating the differentiation potential of CSCs, we selected seven- to ten-days cultured CSCs. We transferred them to a new plate with a cardiomyocyte differentiation medium. They are incubated in a cell culture incubator for 12 days, while the differentiation medium is changed every three days. The differentiated CSCs express cardiomyocyte-specific markers: actinin and troponin I. Thus, CSCs isolated with this protocol have stemness and cardiac markers, and they have a potential for proliferation and differentiation toward cardiomyocyte lineage.

The overall goal of this article is to standardize the protocol for the isolation, characterization, and differentiation of cardiac stem cells (CSCs) from the adult mouse heart. Here, we describe a density gradient centrifugation method to isolate murine CSCs and elaborated methods for CSC culture, proliferation, and differentiation into cardiomyocytes.

分離と性質、大人マウス心臓から心臓の幹細胞の分化

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead ...

Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that mitigate fibrosis. However, fibroblast research has been hindered due to the lack of universally acceptable fibroblast markers to identify quiescent as well as activated fibroblasts. Fibroblasts are a heterogenous cell population, making them difficult to isolate and characterize. The presented protocol describes three different methods to enrich fibroblasts and myofibroblasts from uninjured and injured mouse hearts. Using a standard and reliable protocol to isolate fibroblasts will enable the study of their roles in homeostasis as well as fibrosis modulation.

Obtaining a pure population of fibroblasts is crucial to studying their role in wound repair and fibrosis. Described here is a detailed method to isolate fibroblasts and myofibroblasts from uninjured and injured mouse hearts followed by characterization of their purity and functionality by immunofluorescence, RTPCR, fluorescence-assisted cell sorting, and collagen gel contraction.

成人心臓線維芽細胞と筋線維芽細胞の分離と特徴付け

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that ...

Isolation of Human Ventricular Cardiomyocytes from Vibratome-Cut Myocardial Slices

The isolation of ventricular cardiac myocytes from animal and human hearts is a fundamental method in cardiac research. Animal cardiomyocytes are commonly isolated by coronary perfusion with digestive enzymes. However, isolating human cardiomyocytes is challenging because human myocardial specimens usually do not allow for coronary perfusion, and alternative isolation protocols result in poor yields of viable cells. In addition, human myocardial specimens are rare and only regularly available at institutions with on-site cardiac surgery. This hampers the translation of findings from animal to human cardiomyocytes. Described here is a reliable protocol that enables efficient isolation of ventricular myocytes from human and animal myocardium. To increase the surface-to-volume ratio while minimizing cell damage, myocardial tissue slices 300 &#181;m thick are generated from myocardial specimens with a vibratome. Tissue slices are then digested with protease and collagenase. Rat myocardium was used to establish the protocol and quantify yields of viable, calcium-tolerant myocytes by flow-cytometric cell counting. Comparison with the commonly used tissue-chunk method showed significantly higher yields of rod-shaped cardiomyocytes (41.5 &#177; 11.9 vs. 7.89 &#177; 3.6%, p &#60; 0.05). The protocol was translated to failing and non-failing human myocardium, where yields were similar as in rat myocardium and, again, markedly higher than with the tissue-chunk method (45.0 &#177; 15.0 vs. 6.87 &#177; 5.23 cells/mg, p &#60; 0.05). Notably, with the protocol presented it is possible to isolate reasonable numbers of viable human cardiomyocytes (9&#8211;200 cells/mg) from minimal amounts of tissue (&#60;50 mg). Thus, the method is applicable to healthy and failing myocardium from both human and animal hearts. Furthermore, it is possible to isolate excitable and contractile myocytes from human tissue specimens stored for up to 36 h in cold cardioplegic solution, rendering the method particularly useful for laboratories at institutions without on-site cardiac surgery.

Presented is a protocol for the isolation of human and animal ventricular cardiomyocytes from vibratome-cut myocardial slices. High yields of calcium-tolerant cells (up to 200 cells/mg) can be obtained from small amounts of tissue (&#60;50 mg). The protocol is applicable to myocardium exposed to cold ischemia for up to 36 h.

ビブラートムカット心筋切れ切り切れからヒト心室心筋細胞を分離

The isolation of ventricular cardiac myocytes from animal and human hearts is a fundamental method in cardiac research. Animal cardiomyocytes are commonly ...

Simultaneous Isolation and Culture of Atrial Myocytes, Ventricular Myocytes, and Non-Myocytes from an Adult Mouse Heart

The isolation and culturing of cardiac myocytes from mice has been essential for furthering the understanding of cardiac physiology and pathophysiology. While isolating myocytes from neonatal mouse hearts is relatively straightforward, myocytes from the adult murine heart are preferred. This is because compared to neonatal cells, adult myocytes more accurately recapitulate cell function as it occurs in the adult heart in vivo. However, it is technically difficult to isolate adult mouse cardiac myocytes in the necessary quantities and viability, which contributes to an experimental impasse. Furthermore, published procedures are specific for the isolation of either atrial or ventricular myocytes at the expense of atrial and ventricular non-myocyte cells. Described here is a detailed method for isolating both atrial and ventricular cardiac myocytes, along with atrial and ventricular non-myocytes, simultaneously from a single mouse heart. Also provided are the details for optimal cell-specific culturing methods, which enhance cell viability and function. This protocol aims not only to expedite the process of adult murine cardiac cell isolation, but also to increase the yield and viability of cells for investigations of atrial and ventricular cardiac cells.

A method is described for the simultaneous isolation of myocytes and non-myocytes from both the atria and ventricles of a single adult mouse heart. This protocol results in consistent yields of highly viable cardiac myocytes and non-myocytes and details optimal cell-specific culture conditions for phenotyping and in vitro analysis.

心房筋細胞、心室筋細胞、および非筋細胞の同時分離と培養

The isolation and culturing of cardiac myocytes from mice has been essential for furthering the understanding of cardiac physiology and pathophysiology. ...