心臓には、心臓の炎症や修復において重要な役割を果たす免疫細胞の異種集団が含まれています。免疫細胞の異質性を理解し、その機能に関するさらなる洞察を得るためには、これらの細胞を心臓から回復させる方法を持つことは重要です。この技術は、健康または病気の心臓に存在する免疫および非免疫細胞の多様性を明らかにするのに役立ちます。
この手法には、主に 3 つの利点があります。第1に、それは3時間以内に様々な細胞タイプの単一細胞の中断の生成につながる単純な単一のワークフローです。第二に、それは生存可能な免疫および非免疫細胞集団の高い回復をもたらす。
そして第三に、それは非常に汎用性の高い方法であり、同様に他の種の心臓組織に適用することができます。単一の消化反応に使用される組織の量に注意を払うことが重要です。滅菌はさみ、冷たい生理学またはHBSSで左心室の補助または側壁から組織標本を解剖する。
慎重に標本から外心脂肪と脊索体テンディネエを解剖します。滅菌刃またははさみの助けを借りて、約200ミリグラムの重さの部分に組織の塊を解剖する。マウスを安楽死させた後、鋭いはさみの助けを借りて胸腔を開きます。
鈍い止止めを使って心臓を上に持ち上げます。5ミリリットルの注射器に取り付けられた25ゲージの針を使用して、冷たいPBSで心臓を浸透します。心臓が色でブランチ表示されるまで浸透します。
心臓を取り除き、氷の上の無菌ペトリ皿に入れます。無菌ペトリ皿にヒト心臓組織の塊またはネズミの心臓の200ミリグラムを置きます。滅菌刃またははさみを使用して組織を細かくミンチします。
消化を設定するには、15ミリリットルの円錐管で、すべてのヒト心臓組織チャンクまたは酵素コラゲナーゼI、DNase I、およびヒアルロニダーゼを1ミリリットル当たり450、60、60単位の濃度で1つのマウス心臓ごとに3ミリリットルの最終的な消化量を調製する。チューブに2.5ミリリットルのDMEMを加えます。きれいな鉗子の助けを借りて、細かく刻んだティッシュを各反応管に入れる。
穏やかな渦によってよく混ぜます。振動インキュベーターで摂氏37度で1時間消化し、低い攪拌速度から中程度の攪拌速度に設定します。1時間の消化の後、インキュベーターからチューブを取り出し、氷の上に置きます。
上に40ミクロンの細胞ストレーナーと50ミリリットルの円錐チューブを設定します。酵素を失活させるバッファーの 2 ミリリットルでフィルターを湿水.次に、各消化管に8ミリリットルの酵素不活性化バッファーを添加することにより、消化酵素を非活性化する。
その後、得られた13ミリリットルの全混合物を40ミクロンの細胞ストレーナーを通して50ミリリットルの円錐管に注ぎます。濾過サンプルを新鮮な15ミリリットルの円錐管に戻します。400回gでサンプルを摂氏4度で6分間回転させます。
0.5ミリリットルのメディアを残して上澄み物を捨てます。穏やかなピペットによって細胞ペレットを再懸濁し、ACKのライシスバッファーの1ミリリットルを追加します。穏やかにチューブを旋回し、赤血球のリシスを行うために5分間室温でインキュベートします。
ACKバッファーで5分後、サンプルに9ミリリットルのDMEMを加えます。蓋をチューブに戻し、チューブをそっと反転して混ぜます。40ミクロンの細胞ストレーナーを通してフィルターし、15ミリリットルの円錐管の濾液を集める。
チューブを400回gで6分間遠心し、上清を捨てます。FACSバッファーを1ミリリットル加え、ペレットを再懸濁します。その後、1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移します。
5分間400回gで再び遠心分離機。上清を捨て、100マイクロリットルのFACSバッファーにペレットを再懸濁します。単一細胞懸濁液は抗体染色の準備が整いました。
典型的なヒト抗体パネルを1~50希釈で心臓サンプルに追加します。間質細胞とマウス心臓マクロファージに対して異なる抗体を使用してください。暗闇の中で摂氏4度で30~40分間インキュベートします。
FACSバッファーの1ミリリットルを追加し、穏やかに渦と遠心分離機を400倍gで5分間追加します。この洗浄手順をもう一度繰り返します。その後、サンプルを350マイクロリットルのFACSバッファーに再懸濁し、DAPIを加えて1マイクロモルの最終濃度に達します。
サンプルは FACS 分析の準備が整いました。このプロトコルでは、マウスとヒト心筋からのマクロファージの分離が達成された。この図は、未処理で処理された人間の LVAD コアを示しています。
ヒト虚血性心筋症のCD45陰性間質細胞に対するヒト心筋からのCCR2陰性およびCCR2陽性ヒトマクロファージのフロー選別に関する格子化スキームが提示された。ライト染色されたFACSの画像は、CD45陽性およびCD45陰性細胞を選別し、生存率を示す無傷の細胞膜を示す。マウスの心臓からマクロファージをソートする格言スキームも成功しました。
酵素反応に使用される組織の重量は、効率的な消化のために重要です。プロトコルで示された酵素濃度の組織の200ミリグラム以下を使用してください。この方法に従って、細胞は、インビトロ刺激アッセイのために培養することができる。
細胞はバルクRNAシーケンシングまたは単一細胞シーケンシングのためにソートすることができる。この方法は、健康または罹患したヒトの心臓に存在する、これまで認識されていなかったマクロファージの異種性を発見する上で非常に貴重な技術として役立った。この方法に続いて単一細胞シーケンシングを使用して、様々な免疫細胞および非免疫細胞が病気の心臓と健康な心臓とどのように異なるかを明らかにする研究が進行中です。
