このプロトコルは、数時間の輸送時間後でも、人間と動物の心臓からのサンプルで動作します。ミリグラム当たり最大200個の筋細胞をビブラートカット組織スライスから分離することができます。心筋細胞の電気生理学的、構造的および生化学的分析は、心疾患のメカニズムを発見し、よりよく理解するのに役立ちます。
100ミリの組織培養皿を充填した後、20ミリリットルの冷たい切断溶液を用いて、培養皿に組織サンプルを入れる。文化皿を4度に冷却した皿の上に置いておきます。動物、特にヒトの生体組織サンプルは感染する可能性があることを覚えておいてください。
はさみまたはメスを使用して、過剰な線維組織および外心脂肪をサンプルから除去する。より大きな組織サンプルの最適なビブラート処理のために、メスを使用して組織から8ミリメートルの立方体を切断します。生検からの小さいサンプルのために、これは必要ではない。
一つは、外膜脂肪層によって外心を識別することができます.余分な脂肪を取り除いた後、組織ブロックを皿の中に入れ、心外膜を下に向けます。組織埋め込みの準備のために、切断溶液の10ミリリットルで低融点アガロースの400ミリグラムを沸騰させる。
熱く溶解したアガロースゲルで10ミリリットルの注射器を充填します。注射器を密封し、少なくとも15分間摂氏37度の水浴に入れ、アガロースが平衡化できるようにします。鉗子を使用して、トリム標本をきれいな35ミリメートルのティッシュ培養皿に移し、心外膜を下向きにする。
次いで、滅菌綿棒で、試料から余分な液体を除去する。鉗子でそれを保持することによって、動きに対して標本を固定します。そして、アガロースの注射器をその上に空にし、標本を完全に浸すことを確認します。
すぐに皿を氷の上に置き、アガロースを10分間固めます。ビブラートメのブレードホルダーに未使用のカミソリの刃を取り付けます。可能であれば、ビブラートメをキャリブレーションし、ブレードのZ偏向を調整する。
メスを使用して、ビブラートメの標本ホルダーに合ったアガロース組織ブロックを切除します。安定性を確保するために、組織がまだ十分にアガロースに浸存していることを確認してください。アガロースマージンで、少なくとも8ミリメートルです。
シアノアクリル酸接着剤の薄い層を標本ホルダーに塗布します。そして、アガロース組織ブロックをホルダーにそっと押し込みます。カッティングソリューションでビブラートメ浴を作ります。
次に、ビブラートメの外冷タンクを砕いた氷で満たし、4〜6°Cの温度を維持し、切断工程全体を通して。アガロース組織ブロックを含む標本ホルダーをビブラートメ浴中に入れる。原稿に記載されているビブラートメの設定を用いて、厚さ300マイクロリットルのスライスを生成する。
心室壁に心筋細胞繊維が整列する方法であるため、並列外心のセクションを作成することが重要です。そうしないと、損傷が多すぎます。標準的な光顕微鏡を使用して、心筋細胞と組織スライスの位置合わせを確認します。
組織を損傷しないように、組織自体の代わりにアガロースを保持します。心筋細胞繊維は、一様に整列させるべきであり、筋細胞は、収縮してはならない。ラボシェーカーにヒートプレートを置き、摂氏37度に温めます。
ラボシェーカーを65 RPMで起動します。プロテイナーゼを溶液1の2ミリリットルに溶解する。コラゲターゼを2ミリリットルの溶液1に溶解する。
しかし、プロテイナーゼとコラゲナーゼを混ぜないでください。クロコラゲーゼ溶液に塩化カルシウムを加え、最終的な濃度を求めて、5マイクロモルを加える。両方のソリューションを摂氏37度でインキュベートします。
鉗子を使用して、きれいな60ミリメートルの組織培養皿に組織スライスを移します。5ミリメートルの予冷切断液を使用。皿を氷や冷たい皿の上に置いておき、ブレードまたは鉗子を使用して、組織からアガロースを慎重に取り除きます。
組織スライスの最初の洗浄を行うために、ヒートブレード上に清潔な35ミリメートルの組織培養皿を置きます。そして、事前に温めた溶液1の2ミリメートルでそれを満たします。1つまたは2つの組織スライスを準備した皿に移します。
その後、洗浄ステップのために、1ミリメートルのピペットを使用してください。スライスを洗浄した後、皿から溶液1を取り出し、2ミリリットルのプロテイナーゼ溶液を加えます。65 RPMのシェーカーで、ヒートブレードでスライスを12分間インキュベートします。
組織スライスをさらに2回洗い、2ミリリットルの予め温めた溶液1で洗います。次に、溶液1を皿から取り出し、2ミリリットルのコラゲターゼ溶液を加えます。65 RPMで振って、熱ブレード上で少なくとも30分間、スライスをインキュベートします。
15分間のインキュベーションの後、軽い顕微鏡で皿を調べることによって、遊離の個々の筋細胞を点検する。個々の筋細胞が見えるまで、5分ごとにチェックを続けます。次いで、スライスを2回洗浄することによりalt消化し、2ミリリットルの予熱溶液2を用いた。
そして、溶液2の2ミリリットルで、皿を補充します。慎重に細かい鉗子を使用して、組織スライスの繊維を引き離します。心筋細胞に損傷を与えないように、慎重に作業を続けます。
そして、あなたのピペットを過ぎて単一の使用で、数回ピペット。次に、棒状の心筋細胞が分離していることを確認し、皿を調べることによって、軽顕微鏡下で。皿を熱板の上に37度に戻し、揺して動揺させます。
10ミリモルおよび100ミリモル塩化カルシウムストック溶液を添加することにより、組織懸濁液のカルシウム濃度を5マイクロモルから1.5ミリモルにゆっくりと増加させる。カルシウムの増加が完了したら、残りの未消化組織チャンクを除去するために鉗子を使用してください。まず、懸濁液の撹拌を停止する。
次に、1000マイクロリットルのピペットを使用して、溶液の1/3を、懸濁液の上部からゆっくりと取り除いた。心筋細胞の吸引を避けてください。その後、700マイクロリットルの溶液3を細胞に加える。
10分間の撹拌の後、これらの洗浄手順を繰り返します。懸濁液を15ミリリットルの遠心管に移します。そして、心筋細胞は、最低10分と最大30分間、室温で沈下します。
上清を完全に取り除く。そして、改変されたタイロード溶液または所望の実験バッファー中のペレットを再懸濁させる。軽い顕微鏡を使用して、細胞の品質を確認してください。
心筋細胞の30〜50%は、膜ブレブなしで滑らかなロッド成形する必要があります。そして、表示、明確なクロスストリオン。分離効率を検証するために、プロトコルをラット心筋に適用した。
そして、冠状動脈灌流および単離を介した分離と比較して、小さな組織塊から。プロトコルを使用する場合、ロッド状の細胞の割合が低く、次いで灌流によって分離した後に観察された。しかし、総数はまだ高かった。
対照的に、組織チャンクからの分離は、より少ない棒状細胞を生み出した。フローサイトメトリーは、その結果を定量的に比較するために使用した。組織スライスからの心筋細胞の単離は、冠状灌流によって得られた収量に達しない。
しかし、組織チャンクから筋細胞分離よりも有意に高い収率を提供する。次に、プロトコルをヒト心筋に適用した。心筋切れから分離し、ハイド数と棒状のヒト筋細胞の大部分を生み出した。
そして、丸みを帯びた心筋細胞のごく一部。心筋切れから分離すると、組織の塊から分離するよりも、棒状の筋細胞の数が著しく多くなった。フォトメトリック定量化は、心筋スライスから分離した後に実質的に高い筋細胞生存率を確認した。
ヒト細胞は、記載されたプロトコルで単離され、構造解析を行うことができる。アルファアクチニン染色は、静休み心筋細胞において、緻密な規則的なZ線パターンおよび1.92マイクロメートルの平均サルコメア長さを明らかにした。LTCCおよびRyR染色は、明確なクラスターが細胞膜とT細管の近くに共局在していることを示した。
分離された心筋細胞は興奮性であり、細胞電生理学または興奮収縮結合に関する研究に使用することができた。作用電位形状および持続時間は、他者によって報告された範囲にあったが、心室心筋細胞に対して、人間の心臓の障害から。カーン声線スキャンによって記録されたカルシウム過渡症は、刺激後に晴れたアップストロークを示した。
そして、許容可能な信号対ノイズ比。収縮による心筋細胞の短縮は、下側細胞境界のたわみから見ることができる。このプロトコルによって得られるアイソレータ心筋細胞の数が多いため、細胞培養が可能である。
これにより、ヒト心筋細胞の遺伝子導入、薬理学的検査、組織工学が可能になる可能性があります。重要なアプリケーションは、ヒト細胞の動物モデルからの発見の検証である。心不全は、治療オプションが非常に限られている臨床症候群です。
改善された心筋細胞分離技術は、診断および将来の治療法のための細胞標的を特定するのに役立つであろう。
