Name: following endocardial tissue movements via cell photoconversion in the zebrafish embryo
Uploaded: 2018-02-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
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我々 はこのプロトコルで記述されている金型を助けるためバジーレ Gurchenkov ナタリー Faggianelli、デニス · Duchemin アン ロール Duchemin を感謝したいです。この作品は FRM (DEQ20140329553)、(ANR-15-CE13-0015-01、ANR-12-ISV2-0001-01) ANR、エンボ若い調査官プログラム ERC CoG N ° 682938 欧州共同体によってサポートされない Evalve ・ グラント ANR-10-LABX-0030-INRT、フランスの州の資金管理ANR-10-アイデックス-0002-02 というラベルの付いたフレーム プログラム Investissements d'Avenir の下のアジャンス ナシオナル デ ラ凝った。

1. 金型の製作やアガロースをマウント
<ol><li>3 D プリンターまたは伝統的な機械的ワーク ショップ ツールを使用して図 1に示す寸法の金型を作成します。</li>
	<li>35 mm プラスチック製取り付け皿に溶かし 1% アガロースゲルの約 1.5 mL のピペットします。金型と agarose の間の空気を避けるために世話液体の agarose のプラスチック金型を配置します。4 ° C で皿を配置、agarose 硬化 (この所要時間約 5 分) まで待つプラスチック金型を削除します。</li>
	<li>後で使用できるマウント料理を保存するには、カバー、ふた付き皿を皿とパラフィルムでしっかりと蓋をラップします。取り付け皿を格納、ことができます蓋面 4 ° C で最大 5 日間を下</li>
	<li>事前に 1.5 mL で 0.7% 低融点アガロースの因数を 1 mL エッペン チューブ取り付けの日に使用準備します。 注: パラフィルムがしっかりと料理の周りラップされていない場合、水が蒸発する、取り付け皿の agarose の井戸が時間の経過とともに変形をします。</li>
</ol>2. 光変換の胚を取得
<ol><li>Tg (fli1a:gal4FFubsUAS:kaede)異なる線し、約 200 胚胚中 28.5 ° C で暗闇の中での成長ゼブラフィッシュのラインを交差させる方法の詳細については、ゼウス科学教育データベース11を参照してください。</li>
	<li>5 時間後、24 時間前に、1-フェニル-2-チオ尿素 (PTU) 色素形成を防ぐために胚を扱う (0.003% 胚中 PTU)。</li>
	<li>明るい緑の蛍光性を表現する表示される光電、蛍光万国実体写真下画面胚、選択 5 健康な胚の開始前に約 1 時間。Photoconverting 非特異的細胞で楓を避けるために胚の周囲の光への露出を避けるために胚を視覚化するときの強度の低い光の使用お勧めします。</li>
</ol>3. 埋め込み
<ol><li>メディアのマウントの 10 mL を準備: 0.02 %tricaine と 50 mM BDM 胚中。</li>
	<li>取り付け皿にメディアをマウントの 2 mL を追加でき、agarose に拡散して解決のための 15-30 分。</li>
	<li>一方で、約 5 分の 70 ° C の熱ブロックに管を置くことによって 0.7% (LMP) 低融点アガロースの 1 mL の約数を溶かします。<ol>
<li>わずかに冷却する LMP agarose のため待機し、低融点アガロースのチューブに 8 mg/mL tricaine ソリューションを 25 μ l 添加し 1 M BDM 溶液 40 μ L を追加します。上下、ピペッティングによるミックスは、液体状態で LMP アガロースを保つために 38 ° C の熱ブロックにチューブを転送します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ペトリネットの胚を損傷しないように注意を取って、鉗子を用いた顕微鏡下で事前に選択された胚を胚中、慎重に dechorionate と料理します。</li>
	<li>メディアのマウントの 2 mL を含む別の皿に胚を転送します。<ol>
<li>胚の心を停止する時 (約 5-10 分を取る)、取付に胚料理、彼らは 25 度の角度でうそをつくように鉗子を使用して井戸に胚を手配転送ツインテールだけでなく、上向き卵黄の深部に向かって指しています。</li>
		<li>胚が大体の場所でメディアを削除、tricaine と、BDM を含む 0.7% LMP agarose の 〜 200 μ L に胚を埋め込むし、胚の位置を再調整は、必要に応じて左右に胚を傾斜します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>LMP agarose セット (所要時間約 5 分) は、メディアをマウントを料理に追加されるまで待ちます。胚は、photoconverted をする準備が整いました。 注: tricaine と、BDM 胚を麻酔してそれぞれ胚の心臓を停止する使用されます。マウント メディア イメージング、前日を準備することができますが、メディアを光から保護してください。 注: は胚の正しい位置 photoconvert たいセルへ明確なレーザーのパスを許可することが重要です。レーザー光は、胚に到達するまで旅行する必要はありません、胚は光電後簡単にマウントされませんすることができます、ので、井戸の開始の近くに胚の頭を位置します。</li>
</ol>4. 光電
<ol><li>装備されて、405 (ライカ SP8) のような正立型共焦点顕微鏡の 488 nm nm と 561 nm レーザー ソースを見つける胚白色光 (明視野観察) と対物レンズに透過心による (ライカ HCX IRAPO L、25 × 0.95 エヌ ・ エイのような目的)。561 nm レーザー (すなわち、~ 5% 強度、589 728 nm での DPSS 561 レーザー) を用いた赤い楓蛍光性をチェックします。その後、488 nm レーザー (すなわち、~ 5% 強度、502-556 nm に設定器で 30 mW マルチライン アルゴン レーザー) を用いて心内膜を視覚化します。</li>
	<li>顕微鏡集録ソフトウェアに「縛る」モードを入力します。両方 488 の ~ 1% のレーザー出力を選択して nm と 561 nm のレーザーです。</li>
	<li>興味の面に焦点を当てる、その後、405 nm のダイオードを用いた photoconvert 細胞レーザー スキャン、投資収益率を 3 倍の 25% レーザー出力で利益率 (ROI) の地域を選択します。不十分な楓は、投資収益率で photoconverted をする必要があります、405 nm レーザー領域の上 3 回再びスキャンします。僅かにこの手順を繰り返します。</li>
	<li>ソフトウェアに「TCS SP8」モード戻るし、、561 を使用して z スタックを取得 nm、488 nm レーザーの順番に。画像処理速度を上げるため 'の双方向' オプションを選択することを確認します。 メモ: どのくらいそれは photoconvert にかかるし、それぞれの胚をイメージが違います。心臓の鼓動が正常な心臓弁の開発にとって重要である、それを意味する必要はありません時間を photoconvert すべて 5 胚場合でも 30 分以上停止して心を維持しないように知られています。 注: 使用 PMT 検出器、光電過程光電後しばらくお勧め 'カウント' モードに設定ハイブリッド検出器を使用します。これは、ハイブリッド検出器より敏感なより良い品質の画像を作り出すことができるが露出オーバーで簡単に破損しているためにです。</li>
</ol>5. photoconverted 胚のアンマウント
<ol><li>光電後に、、LMP アガロースを破るし、胎児をやさしく吸う胚の頭の上に少しだけ押しにガラス ピペットを使用します。<ol>
<li>ガラス ピペットから胚を胚媒体 (媒体を含んでいる BDM を洗い流す) に PTU を含む 35 mm のペトリ皿に取り出します。</li>
		<li>PTU と胚媒体を含んでいる 6 ウェル プレートには井戸に胚を転送します。このステップの間に胚のノートを保つことを確認は、これは後で発達段階で photoconverted のセルの位置を関連付けるに不可欠なまあに入ります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>今では、胚は、BDM 含む媒体から削除されます、彼らの心は戻り胚胚は通常を開発し続けることを許可するように 28.5 ° C で暗闇の中を約 5 分で再び暴行を始めるべきです。</li>
</ol>6 その後の胚の段階で photoconverted 細胞のイメージング
<ol><li>必要な段階では、心臓を停止させるし、胚が胚を追跡する別のマーク付きの料理で BDM と見なす必要がある重要な違いがこのプロトコルの手順 3 の下のような胚を再埋め込みます。</li>
	<li>62 までの胚の hpf 561 を使用して心内膜の z スタックを取得 nm、488 nm の赤と緑の蛍光信号をそれぞれ。62 より古い段階で胚の hpf、多光子を使用してレーザー セット 940 nm 488 nm レーザーではなく緑の楓をイメージします。</li>
</ol>7. 画像解析による胚下 48 hpf
注: AVC の組織の動きが複雑な三次元構造を分析することは困難にすることができます。2 つの非 photoconverted 領域または 2 つの photoconverted の地域間 avc 非 photoconverted 領域の長さ間の AVC の photoconverted 領域の長さを定量化することができます上に立体の構造をマップするが望ましい、二次元の地図。Photoconverted 胚の画像取得 48 前に hpf は、次の方法を使用して分析できます。
<ol><li>Matlab または任意の同様のソフトウェアで取得した画像をインポートします。</li>
	<li>投資収益率、すなわち、心内膜を手動で外縁し、この地域外の信号を削除するマスクを適用します。</li>
	<li>心内膜上の点を識別し、3 次元にそれらをプロットする画像を輝度しきい値を適用します。アトリウムとソフトウェアの消去コマンドを使用して心室に興味のポイントを手動で消去することによって、AVC の狭いとほとんどストレートの部分に対応する箇所を特定します。</li>
	<li>ように入手された AVC を表す点に合わせてシリンダーを使用します。</li>
	<li>いくつかのサンプルを比較するための参照システムを定義します。たとえば、参照系の原点と z 軸として装着シリンダーの軸として AVC ポイントの重心を採用します。<ol>
<li>心臓 (心房または心室筋) の同じ側に正の z 位置が常に対応していることを確認します。</li>
		<li>X y 平面上の AVC ポイントのプロジェクトし、それらに合わせて楕円を使用してください。</li>
		<li>楕円の長軸と参照系の y 軸が平行し、正の y 値は胎児に関して AVC 内部側に対応心内膜ポイント z 軸の周りを回転します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>半平面を回転させることにより得られるいくつかの面で三次元データセットをカット、AVC をセグメント化、{y = 0、x > 0} z 方向で。<ol>
<li>これらの平面の隣接ピクセルの強度をプロジェクトし、一貫した方法で、内皮を定義します。たとえば、手動でからラインを描く、心房内皮の半分の厚さで AVC の心室側に。</li>
		<li>表面と AVC を表すスプライン ツールボックスを使用して 3 次元スプラインと内皮を表すラインのポイントを補間します。 注: 分割の精度とこのステップの時間消費の両方切断面の数を決定します。通常、飛行機 8、良い結果を達成するために十分であります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>円筒座標を使用して AVC 表面の各ポイントの方位の位置を定義します。<ol>
<li>各方位の位置でサーフェス間の連続する点の円弧の長さを計算することによって、AVC の表面に沿ってパラメトリック曲線を定義します。</li>
		<li>各のパラメトリック曲線曲線ゼロに AVC の中心に最も近いポイントを定義します。AVC のポイントはこうしてパラメトリック曲線上の方位の位置とその位置によって完全に説明しました。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ポイントのパラメトリック位置を使用して二次元のイメージに、AVC を展開します。</li>
	<li>バイナリ イメージの閾値のエッジとして、photoconverted の強度と非 photoconverted チャンネル間の比率を定量化する領域のエッジを見つけます。必要に応じて、手動で結果を修正します。</li>
	<li>方位角の位置の関数として組織の長さを計算するためのエッジ間の円弧の長さを計算します。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Chow, R. W., Vermot, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rise+of+photoresponsive+protein+technologies+applications+in+vivo:+a+spotlight+on+zebrafish+developmental+and+cell+biology.">The rise of photoresponsive protein technologies applications in vivo: a spotlight on zebrafish developmental and cell biology.</a> F1000Res. 6, (2017).</li><li>Sehnert, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+troponin+T+is+essential+in+sarcomere+assembly+and+cardiac+contractility.">Cardiac troponin T is essential in sarcomere assembly and cardiac contractility.</a> Nat Genet. 31, 106-110 (2002).</li><li>Peal, D. S., Lynch, S. N., Milan, D. 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利害の対立が宣言されていません。

光電のタイミング: 96 でも内分泌かく乱化学物質の鮮やかな表現が楓のまま hpf、胚が大きくなると、レーザー光を拡散させるより楓の限られた光電をより困難になり、AVC に達する前にそれに注意してください。At 萌芽期段階の 55 以降 hpf、心室と心房のバルーニングもの光電用バイオレット レーザー ビームが心房または心室のどちらかを最初の通過せず AVC 細胞を達することができな...

ゼブラフィッシュは現在体内細胞および進化のプロセスを勉強する最も重要な脊椎動物モデルの一つです。これがゼブラフィッシュの光透過性の主因と遺伝学は、遺伝子を含む光学的手法を適用するための強力なモデルはそれにこうしてエンコード光応答性タンパク質技術1。心臓の研究に固有のゼブラフィッシュを受け取る拡散を介して十分な酸素ハートビートなしも突然変異体は発達遺伝子および摂動の影響に関する分析を許可、開発の最初の週を生き残ることができるようにほとんどの脊椎動物2で可能ではない心臓の形態形成に関する血流。
ゼブラフィッシュの心臓の管は 24 時間ポスト受精 (hpf) によって形成されます。その形成直後後心臓の管は、積極的に暴行を開始します。36 で hpf、明確な収縮心室から心房を分離します。収縮のこの地域は、立方形態3房室運河 (AVC) とこの地域の変更細胞扁平上皮の形態から呼び出されます。ゼブラフィッシュ房室弁の形態形成開始 48 時間前後は、受精を投稿します。5 日ポスト受精、2 つの弁尖は、AVC に拡張し、4心周期の間に、心室から心房への血液の逆流を防ぐ。AVC と弁形成過程における細胞の追跡を介して伝統的なタイムラプス顕微鏡5,6セルに従うことが困難な心の急速な打撃としては困難です。このプロトコルは、スティードら2016年7から適応で楓の蛍光蛋白質の表現に使用されるなTg (fli1a:gal4FFubsUAS:kaede)8ゼブラフィッシュ遺伝子組換え回線を使用する方法を記述します。血管内皮細胞は、心内膜を含みます。36 55 の hpf と発生時間の特定ポイントで photoconverted 内分泌かく乱化学物質の高分解能イメージングの内分泌かく乱化学物質の正確な光電に暴行、心臓を一時的に停止、薬 2, 3-butanedione-2-ジアセチルモノオキシム (BDM) が使用されます。以前、内分泌かく乱化学物質 photoconverted このメソッドを使用してが変換されていない近所の人たちと区別することができますまま光電7時間後 5 日間以上に示されています。このプロトコル 48 より若い胚における内分泌かく乱化学物質 photoconverted の画像解析に使用するメソッドの詳細も hpf は、AVC 開発 (Boselliらプレスで)9中に組織の動きに従う正常に使用されています。我々 は、読者がこのプロトコルを有用見つける AVC とバルブの開発、正常な胚、変異体、morphants、または薬剤を投与した胚を研究するため願っています。ゼブラフィッシュの開発中に蛍光タンパク質を用いた細胞追跡に関連する一般的なプロトコル、ロンバルドら、2012年10投稿記事をご覧ください。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Materials&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Necessary equipment for raising fish and collecting eggs (see the Zebrafish Book22 for details).</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Upright confocal microscope (Equipped with lasers operating at 488 nm, 561 nm, and 405 nm, a tunable multiphoton laser, and a Leica HCX IRAPO L, 25 &amp;times;, N.A. 0.95 objective)</td><td>Leica</td><td>Leica SP8</td><td></td></tr><tr><td>Heat block</td><td>ThermoScientific</td><td>88870001</td><td></td></tr><tr><td>35 mm x 10 mm tissue culture dish</td><td>Falcon</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>6 well plate</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass pipette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mold</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>8 mg/mL Tricaine stock solution&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 M BDM stock solution</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UltraPure low melting point agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16520-050</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Lonza</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>PTU (1-phenyl-2-thiourea)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>Embryo medium: 30x stock solution</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Software&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matlab equipped with the Image Analysis, Curve Fitting, Bio-Formats Toolboxes</td><td>MathWorks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;8 mg/mL Tricaine stock solution&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 mg of tricaine powder (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonic acid)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>25 mL Danieau</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adjust to pH 7, aliquot and store at -20 &amp;deg;C&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;1 M BDM stock solution&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 g BDM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>112135</td><td></td></tr><tr><td>10 mL ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aliquot and store at -20 &amp;deg;C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Embryo medium: 30x stock solution&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50.7 g NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>0.78 g KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>1.47 g Magnesium sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&amp;nbsp;7487-88-9</td><td></td></tr><tr><td>2.1 g Calcium nitrite tetrahydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>13477-34-4</td><td></td></tr><tr><td>19.52 g HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7365-45-9</td><td></td></tr><tr><td>Adjust to pH 7.2 and store at room temperature</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Mold&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PlasCLEAR resin</td><td>Asiga</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plus 39&amp;nbsp;Freeform Pico 3D printer</td><td>Asiga</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

following endocardial tissue movements via cell photoconversion in the zebrafish embryo

胚発生に伴う細胞細胞行動のダイナミックな変化を受けるし、発生生物学の分野の基本的な目標は、これらの変更の背後にある細胞の論理を読み解きます。発見と蛍光タンパク質の開発が格段に動的変更の私達の理解光学的細胞や組織を強調表示する方法を提供します。ただし、光電、微速度顕微鏡観察およびそれに続く画像解析は、脳や目など臓器の細胞動態を暴くで非常に成功する証明が、このアプローチは通常使用されないため心臓の開発で心臓のサイクル中に心臓の急速な動きによってもたらされる課題。このプロトコルは、2 つの部分で構成されています。最初の部分では、photoconverting とその後中ゼブラフィッシュ房室運河 (AVC)、心臓房室弁開発心内膜細胞 (内分泌かく乱化学物質) を追跡する方法について説明します。正確な光電場所を取るために薬で心臓を一時的停止メソッドが含まれます。心は再開できる発達時間後の時点で photoconverted 内分泌かく乱化学物質の高分解能イメージングのため心臓が再び停止するまでに薬物および萌芽期の開発の除去時に鼓動が通常どおり続行されます。プロトコルの 2 番目の部分は、二次元の地図に立体構造から蛍光信号をマッピングすることにより幼胚の胚で AVC の photoconverted または非 photoconverted 領域の長さを定量化する画像解析法をについて説明します.一緒に、プロトコルの 2 つの部分は、起源とゼブラフィッシュ AVC と房室弁をし、変異体、morphants、またはと扱われている胚を研究するため適用できる可能性のある細胞の挙動を検討する 1 つをことができます。AVC および/または弁の開発を妨害する試薬です。

48 胚 photoconverted の例 hpf 80 でもう一度イメージ化と hpf は図 2映画 1および2で示されています。405 nm の光に楓を公開すると、不可逆的変換蛍光赤フォームにその蛍光緑の形態からの蛋白質、緑または赤いフォームのラベルの付いたセルの動作を有効にする彼らのメランジに尊重します。弁形成の間に近所の人。それは 48 ...

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Following Endocardial Tissue Movements via Cell Photoconversion in the Zebrafish Embryo

このプロトコルは楓生活の心内膜細胞の蛍光タンパク質の光変換の方法を記述するゼブラフィッシュ胎児房室管、心臓房室弁開発中心内膜細胞の追跡を有効にします。.

ゼブラフィッシュ胚における細胞光電を介して次の心内膜組織運動

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the ...

following-endocardial-tissue-movements-via-cell-photoconversion

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

6.4K ビュー.  Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire. このプロトコルは楓生活の心内膜細胞の蛍光タンパク質の光変換の方法を記述するゼブラフィッシュ胎児房室管、心臓房室弁開発中心内膜細胞の追跡を有効にします。.

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Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been described at the morphological level, little is known about the molecular basis of cellular changes that occur as the organism develops. With recent advancements in microfluidics and multiplexing technologies, it is now possible to characterize gene expression in single cells. This allows for investigation of heterogeneity between individual cells of specific cell populations to identify and classify cell subtypes, characterize intermediate states that occur during cell differentiation, and explore differential cellular responses to stimuli. This study describes a protocol to isolate viable, single cells from zebrafish embryos for high throughput multiplexing assays. This method may be rapidly applied to any zebrafish embryonic cell type with fluorescent markers. An extension of this method may also be used in combination with high throughput sequencing technologies to fully characterize the transcriptome of single cells. As proof of principle, the relative abundance of cardiac differentiation markers was assessed in isolated, single cells derived from nkx2.5 positive cardiac progenitors. By evaluation of gene expression at the single cell level and at a single time point, the data support a model in which cardiac progenitors coexist with differentiating progeny. The method and work flow described here is broadly applicable to the zebrafish research community, requiring only a labeled transgenic fish line and access to microfluidics technologies.

This protocol describes a method for isolating single cells from zebrafish embryos, enriching for cells of interest, capturing zebrafish cells in microfluidic based single cell multiplex systems, and assessing gene expression from single cells.

ゼブラフィッシュ胚からの単一細胞の単離とキャラクタリゼーション

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

発生生物学

Imaging Cleared Embryonic and Postnatal Hearts at Single-cell Resolution

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, and allow for the study of the cellular and molecular basis of normal and abnormal cardiac morphogenesis. Recent emerging technologies of retrospective single clonal analyses make the study of cardiac morphogenesis at single cell resolution feasible. However, tissue opacity and light scattering of the heart as imaging depth is increased hinder whole-heart imaging at single cell resolution. To overcome these obstacles, a whole-embryo clearing system that can render the heart highly transparent for both illumination and detection must be developed. Fortunately, in the last several years, many methodologies for whole-organism clearing systems such as CLARITY, Scale, SeeDB, ClearT, 3DISCO, CUBIC, DBE, BABB and PACT have been reported. This lab is interested in the cellular and molecular mechanisms of cardiac morphogenesis. Recently, we established single cell lineage tracing via the ROSA26-CreERT2; ROSA26-Confetti system to sparsely label cells during cardiac development. We adapted several whole embryo-clearing methodologies including Scale and CUBIC (clear, unobstructed brain imaging cocktails and computational analysis) to clear the embryo in combination with whole mount staining to image single clones inside the heart. The heart was successfully imaged at single cell resolution. We found that Scale can clear the embryonic heart, but cannot effectively clear the postnatal heart, while CUBIC can clear the postnatal heart, but damages the embryonic heart by dissolving the tissue. The methods described here will permit the study of gene function at a single clone resolution during cardiac morphogenesis, which, in turn, can reveal the cellular and molecular basis of congenital heart defects.

We describe a protocol to volumetrically image fluorescent protein labeled cells deep inside intact embryonic and postnatal hearts. Utilizing tissue-clearing methods in combination with whole mount staining, single fluorescent protein-labeled cells inside an embryonic or postnatal heart can be imaged clearly and accurately.

イメージングは​​、単一細胞の解像度で胚および出生後の心をクリア

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause disease when disrupted. Scientists have developed clever techniques to investigate characteristics and natural dynamics of these cells within intact tissue by expressing fluorescent proteins in subsets of cells. However, at times, experiments require more selected visualization of cells within the tissue, sometimes at the single-cell or population-of-cells manner. To achieve this and visualize single cells within a population of cells, scientists have utilized single-cell photoconversion of fluorescent proteins. To demonstrate this technique, we show here how to direct UV light to an Eos-expressing cell of interest in an intact, living zebrafish. We then image those photoconverted Eos+ cells 24 h later to determine how they changed in the tissue. We describe two techniques: single cell photoconversion and photoconversions of populations of cell. These techniques can be used to visualize cell-cell interactions, cell-fate and differentiation, and cell migrations, making it a technique that is applicable in numerous biological questions.

Here, we present a protocol to show how cell photoconversion is achieved through UV exposure to specific areas expressing the fluorescent protein, Eos, in living animals.

生活そのままゼブラフィッシュの単一セルの光電

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling processes of excitable neuronal and muscular cells and many other biological processes, such as embryonic developmental patterning. However, there is a need for in vivo electrical activity monitoring in vertebrate embryogenesis. The advances of genetically encoded fluorescent voltage indicators (GEVIs) have made it possible to provide a solution for this challenge. Here, we describe how to create a transgenic voltage indicator zebrafish using the established voltage indicator, ASAP1 (Accelerated Sensor of Action Potentials 1), as an example. The Tol2 kit and a ubiquitous zebrafish promoter, ubi, were chosen in this study. We also explain&#160;the processes of Gateway site-specific cloning, Tol2 transposon-based zebrafish transgenesis, and the imaging process for early-stage fish embryos and fish tumors using regular epifluorescent microscopes. Using this fish line, we found that there are cellular electric voltage changes during zebrafish embryogenesis, and fish larval movement. Furthermore, it was observed that in a few zebrafish malignant peripheral nerve sheath tumors, the tumor cells were generally polarized compared to the surrounding normal tissues.

Here, we show the process of creating a cellular electric voltage reporter zebrafish line to visualize embryonic development, movement, and fish tumor cells in vivo.

ゼブラフィッシュ初期胚および腫瘍の細胞の電気的活動の可視化

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Design and Microinjection of Morpholino Antisense Oligonucleotides and mRNA into Zebrafish Embryos to Elucidate Specific Gene Function in Heart Development

The morpholino oligomer-based knockdown system has been used to identify the function of various gene products through loss or reduced expression. Morpholinos (MOs) have the advantage in biological stability over DNA oligos because they are not susceptible to enzymatic degradation. For optimal effectiveness, MOs are injected into 1-4 cell stage embryos. The temporal efficacy of knockdown is variable, but MOs are believed to lose their effects due to dilution eventually. Morpholino dilution and injection amount should be closely controlled to minimize the occurrence of off-target effects while maintaining on-target efficacy. Additional complementary tools, such as CRISPR/Cas9 should be performed against the target gene of interest to generate mutant lines and to confirm the morphant phenotype with these lines. This article will demonstrate how to design, prepare, and microinject a translation-blocking morpholino against hand2 into the yolk of 1-4 cell stage zebrafish embryos to knockdown hand2 function and rescue these "morphants" by co-injection of mRNA encoding the corresponding cDNA. Subsequently, the efficacy of the morpholino microinjections is assessed by first verifying the presence of morpholino in the yolk (co-injected with phenol red) and then by phenotypic analysis. Moreover, cardiac functional analysis to test for knockdown efficacy will be discussed. Finally, assessing the effect of morpholino-induced blockage of gene translation via western blotting will be explained.

The present protocol describes designing, preparing, and microinjecting a translational-blocking morpholino against a representative cardiac gene; Heart And Neural Crest Derivatives Expressed2 (hand2) into the yolk of newly fertilized zebrafish embryos to knock down gene function. It also shows a transient rescue of these "morphants" by co-injection of mRNA encoding this gene product.

The morpholino oligomer-based knockdown system has been used to identify the function of various gene products through loss or reduced expression.  ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths from the myocardium. Genetic program defects in the Notch signaling cascade are involved in ventricular defects such as Left Ventricular Non-Compaction Cardiomyopathy or Hypoplastic Left Heart Syndrome. Using this protocol, it can be determined that shear stress driven trabeculation and Notch signaling are related to one another. Using Light-sheet Fluorescence Microscopy, visualization of the developing zebrafish heart was possible. In this manuscript, it was assessed whether hemodynamic forces modulate the initiation of trabeculation via Notch signaling and thus, influence contractile function occurs. For qualitative and quantitative shear stress analysis, 4-D (3-D+time) images were acquired during zebrafish cardiac morphogenesis, and integrated light-sheet fluorescence microscopy with 4-D synchronization captured the ventricular motion. Blood viscosity was reduced via gata1a-morpholino oligonucleotides (MO) micro-injection to decrease shear stress, thereby, down-regulating Notch signaling and attenuating trabeculation. Co-injection of Nrg1 mRNA with gata1a MO rescued Notch-related genes to restore trabeculation. To confirm shear stress driven Notch signaling influences trabeculation, cardiomyocyte contraction was further arrested via tnnt2a-MO to reduce hemodynamic forces, thereby, down-regulating Notch target genes to develop a non-trabeculated myocardium. Finally, corroboration of the expression patterns of shear stress-responsive Notch genes was conducted by subjecting endothelial cells to pulsatile flow. Thus, the 4-D light-sheet microscopy uncovered hemodynamic forces underlying Notch signaling and trabeculation with clinical relevance to non-compaction cardiomyopathy.

Here, we present a protocol to visualize developing hearts in zebrafish in 4-Dimensions (4-D). 4-D imaging, via light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), takes 3-Dimensional (3-D) images over time, to reconstruct developing hearts. We show qualitatively and quantitatively that shear stress activates endocardial Notch signaling during chamber development, which promotes cardiac trabeculation.

光シート蛍光顕微鏡のゼブラフィッシュ心臓の開発上のせん断応力を変調効果の 4次元画像をキャプチャするには

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths ...

生物工学

<meta charset="utf8"></head><body>ゼブラフィッシュ心臓における磁気ビーズを用いたin vivoメカノトランスダクション研究

Manipulating Mechanical Forces in the Developing Zebrafish Heart Using Magnetic Beads

Mechanical forces continuously provide feedback to heart valve morphogenetic programs. In zebrafish, cardiac valve development relies on heart contraction and physical stimuli generated by the beating heart. Intracardiac hemodynamics, driven by blood flow, emerge as fundamental information shaping the development of the embryonic heart. Here, we describe an effective method to manipulate mechanical forces in vivo by grafting a 30 &#181;m to 60 &#181;m diameter magnetic bead in the cardiac lumen. The insertion of the bead is conducted through microsurgery in anesthetized larvae without perturbing heart function and enables artificial alteration of the boundary conditions, thereby modifying flow forces in the system. As a result, the presence of the bead amplifies the mechanical forces experienced by endocardial cells and can directly trigger mechanical stimulus-dependent calcium influx. This approach facilitates the investigation of mechanotransduction pathways that govern heart development and can provide insights into the role of mechanical forces in cardiac valve morphogenesis.

<meta charset="utf8"></head><body>著者スポットライト:ゼブラフィッシュの心臓の形成に関与する機械的な力を理解する

This protocol outlines a method for grafting a magnetic bead into the developing zebrafish heart through microsurgery, enabling the manipulation of mechanical forces in vivo and triggering mechanical stimulus-dependent calcium influx in endocardial cells.

磁気ビーズを用いたゼブラフィッシュの心臓部における機械的な力の操作

Mechanical forces continuously provide feedback to heart valve morphogenetic programs. In zebrafish, cardiac valve development relies on heart contraction ...

Immunostaining of Dissected Zebrafish Embryonic Heart 

Zebrafish embryo becomes a popular in vivo vertebrate model for studying cardiac development and human heart diseases due to its advantageous embryology and genetics 1,2. About 100-200 embryos are readily available every week from a single pair of adult fish. The transparent embryos that develop ex utero make them ideal for assessing cardiac defects 3. The expression of any gene can be manipulated via morpholino technology or RNA injection 4. Moreover, forward genetic screens have already generated a list of mutants that affect different perspectives of cardiogenesis 5. 
Whole mount immunostaining is an important technique in this animal model to reveal the expression pattern of the targeted protein to a particular tissue 6. However, high resolution images that can reveal cellular or subcellular structures have been difficult, mainly due to the physical location of the heart and the poor penetration of the antibodies. 
 Here, we present a method to address these bottlenecks by dissecting heart first and then conducting the staining process on the surface of a microscope slide. To prevent the loss of small heart samples and to facilitate solution handling, we restricted the heart samples within a circle on the surface of the microscope slides drawn by an immEdge pen. After the staining, the fluorescence signals can be directly observed by a compound microscope. 
Our new method significantly improves the penetration for antibodies, since a heart from an embryonic fish only consists of few cell layers. High quality images from intact hearts can be obtained within a much reduced procession time for zebrafish embryos aged from day 2 to day 6. Our method can be potentially extended to stain other organs dissected from either zebrafish or other small animals.

Immunostaining of Dissected Zebrafish Embryonic Heart

A rapid way to conduct immunostaining of zebrafish embryonic heart is described. Compared to the whole mount immunostaining approach, this method dramatically increases the penetration of the antibodies, which allows obtaining high resolution images that reveal cellular/subcellular structures in the heart within a much reduced processing time.

ディテールに秘められたゼブラフィッシュ胚心臓の免疫染色

Zebrafish embryo becomes a popular in vivo vertebrate model for studying cardiac development and human heart diseases due to its advantageous embryology ...

ゼブラフィッシュ胚における細胞光電を介して次の心内膜組織運動

要約

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ゼブラフィッシュ胚からの単一細胞の単離とキャラクタリゼーション

イメージングは、単一細胞の解像度で胚および出生後の心をクリア

生活そのままゼブラフィッシュの単一セルの光電

ゼブラフィッシュ初期胚および腫瘍の細胞の電気的活動の可視化

Design and Microinjection of Morpholino Antisense Oligonucleotides and mRNA into Zebrafish Embryos to Elucidate Specific Gene Function in Heart Development

光シート蛍光顕微鏡のゼブラフィッシュ心臓の開発上のせん断応力を変調効果の 4次元画像をキャプチャするには

磁気ビーズを用いたゼブラフィッシュの心臓部における機械的な力の操作

磁気ビーズを用いたゼブラフィッシュの心臓部における機械的な力の操作

磁気ビーズを用いたゼブラフィッシュの心臓部における機械的な力の操作

ディテールに秘められたゼブラフィッシュ胚心臓の免疫染色

ゼブラフィッシュ胚における細胞光電を介して次の心内膜組織運動

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ゼブラフィッシュ胚からの単一細胞の単離とキャラクタリゼーション

イメージングは​​、単一細胞の解像度で胚および出生後の心をクリア

生活そのままゼブラフィッシュの単一セルの光電

ゼブラフィッシュ初期胚および腫瘍の細胞の電気的活動の可視化

Design and Microinjection of Morpholino Antisense Oligonucleotides and mRNA into Zebrafish Embryos to Elucidate Specific Gene Function in Heart Development

光シート蛍光顕微鏡のゼブラフィッシュ心臓の開発上のせん断応力を変調効果の 4次元画像をキャプチャするには

磁気ビーズを用いたゼブラフィッシュの心臓部における機械的な力の操作

磁気ビーズを用いたゼブラフィッシュの心臓部における機械的な力の操作

磁気ビーズを用いたゼブラフィッシュの心臓部における機械的な力の操作

ディテールに秘められたゼブラフィッシュ胚心臓の免疫染色

イメージングは、単一細胞の解像度で胚および出生後の心をクリア