我々 はこのプロトコルで記述されている金型を助けるためバジーレ Gurchenkov ナタリー Faggianelli、デニス · Duchemin アン ロール Duchemin を感謝したいです。この作品は FRM (DEQ20140329553)、(ANR-15-CE13-0015-01、ANR-12-ISV2-0001-01) ANR、エンボ若い調査官プログラム ERC CoG N ° 682938 欧州共同体によってサポートされない Evalve ・ グラント ANR-10-LABX-0030-INRT、フランスの州の資金管理ANR-10-アイデックス-0002-02 というラベルの付いたフレーム プログラム Investissements d'Avenir の下のアジャンス ナシオナル デ ラ凝った。

1. 金型の製作やアガロースをマウント
<ol><li>3 D プリンターまたは伝統的な機械的ワーク ショップ ツールを使用して図 1に示す寸法の金型を作成します。</li>
	<li>35 mm プラスチック製取り付け皿に溶かし 1% アガロースゲルの約 1.5 mL のピペットします。金型と agarose の間の空気を避けるために世話液体の agarose のプラスチック金型を配置します。4 ° C で皿を配置、agarose 硬化 (この所要時間約 5 分) まで待つプラスチック金型を削除します。</li>
	<li>後で使用できるマウント料理を保存するには、カバー、ふた付き皿を皿とパラフィルムでしっかりと蓋をラップします。取り付け皿を格納、ことができます蓋面 4 ° C で最大 5 日間を下</li>
	<li>事前に 1.5 mL で 0.7% 低融点アガロースの因数を 1 mL エッペン チューブ取り付けの日に使用準備します。 注: パラフィルムがしっかりと料理の周りラップされていない場合、水が蒸発する、取り付け皿の agarose の井戸が時間の経過とともに変形をします。</li>
</ol>2. 光変換の胚を取得
<ol><li>Tg (fli1a:gal4FFubsUAS:kaede)異なる線し、約 200 胚胚中 28.5 ° C で暗闇の中での成長ゼブラフィッシュのラインを交差させる方法の詳細については、ゼウス科学教育データベース11を参照してください。</li>
	<li>5 時間後、24 時間前に、1-フェニル-2-チオ尿素 (PTU) 色素形成を防ぐために胚を扱う (0.003% 胚中 PTU)。</li>
	<li>明るい緑の蛍光性を表現する表示される光電、蛍光万国実体写真下画面胚、選択 5 健康な胚の開始前に約 1 時間。Photoconverting 非特異的細胞で楓を避けるために胚の周囲の光への露出を避けるために胚を視覚化するときの強度の低い光の使用お勧めします。</li>
</ol>3. 埋め込み
<ol><li>メディアのマウントの 10 mL を準備: 0.02 %tricaine と 50 mM BDM 胚中。</li>
	<li>取り付け皿にメディアをマウントの 2 mL を追加でき、agarose に拡散して解決のための 15-30 分。</li>
	<li>一方で、約 5 分の 70 ° C の熱ブロックに管を置くことによって 0.7% (LMP) 低融点アガロースの 1 mL の約数を溶かします。<ol>
<li>わずかに冷却する LMP agarose のため待機し、低融点アガロースのチューブに 8 mg/mL tricaine ソリューションを 25 μ l 添加し 1 M BDM 溶液 40 μ L を追加します。上下、ピペッティングによるミックスは、液体状態で LMP アガロースを保つために 38 ° C の熱ブロックにチューブを転送します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ペトリネットの胚を損傷しないように注意を取って、鉗子を用いた顕微鏡下で事前に選択された胚を胚中、慎重に dechorionate と料理します。</li>
	<li>メディアのマウントの 2 mL を含む別の皿に胚を転送します。<ol>
<li>胚の心を停止する時 (約 5-10 分を取る)、取付に胚料理、彼らは 25 度の角度でうそをつくように鉗子を使用して井戸に胚を手配転送ツインテールだけでなく、上向き卵黄の深部に向かって指しています。</li>
		<li>胚が大体の場所でメディアを削除、tricaine と、BDM を含む 0.7% LMP agarose の 〜 200 μ L に胚を埋め込むし、胚の位置を再調整は、必要に応じて左右に胚を傾斜します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>LMP agarose セット (所要時間約 5 分) は、メディアをマウントを料理に追加されるまで待ちます。胚は、photoconverted をする準備が整いました。 注: tricaine と、BDM 胚を麻酔してそれぞれ胚の心臓を停止する使用されます。マウント メディア イメージング、前日を準備することができますが、メディアを光から保護してください。 注: は胚の正しい位置 photoconvert たいセルへ明確なレーザーのパスを許可することが重要です。レーザー光は、胚に到達するまで旅行する必要はありません、胚は光電後簡単にマウントされませんすることができます、ので、井戸の開始の近くに胚の頭を位置します。</li>
</ol>4. 光電
<ol><li>装備されて、405 (ライカ SP8) のような正立型共焦点顕微鏡の 488 nm nm と 561 nm レーザー ソースを見つける胚白色光 (明視野観察) と対物レンズに透過心による (ライカ HCX IRAPO L、25 × 0.95 エヌ ・ エイのような目的)。561 nm レーザー (すなわち、~ 5% 強度、589 728 nm での DPSS 561 レーザー) を用いた赤い楓蛍光性をチェックします。その後、488 nm レーザー (すなわち、~ 5% 強度、502-556 nm に設定器で 30 mW マルチライン アルゴン レーザー) を用いて心内膜を視覚化します。</li>
	<li>顕微鏡集録ソフトウェアに「縛る」モードを入力します。両方 488 の ~ 1% のレーザー出力を選択して nm と 561 nm のレーザーです。</li>
	<li>興味の面に焦点を当てる、その後、405 nm のダイオードを用いた photoconvert 細胞レーザー スキャン、投資収益率を 3 倍の 25% レーザー出力で利益率 (ROI) の地域を選択します。不十分な楓は、投資収益率で photoconverted をする必要があります、405 nm レーザー領域の上 3 回再びスキャンします。僅かにこの手順を繰り返します。</li>
	<li>ソフトウェアに「TCS SP8」モード戻るし、、561 を使用して z スタックを取得 nm、488 nm レーザーの順番に。画像処理速度を上げるため 'の双方向' オプションを選択することを確認します。 メモ: どのくらいそれは photoconvert にかかるし、それぞれの胚をイメージが違います。心臓の鼓動が正常な心臓弁の開発にとって重要である、それを意味する必要はありません時間を photoconvert すべて 5 胚場合でも 30 分以上停止して心を維持しないように知られています。 注: 使用 PMT 検出器、光電過程光電後しばらくお勧め 'カウント' モードに設定ハイブリッド検出器を使用します。これは、ハイブリッド検出器より敏感なより良い品質の画像を作り出すことができるが露出オーバーで簡単に破損しているためにです。</li>
</ol>5. photoconverted 胚のアンマウント
<ol><li>光電後に、、LMP アガロースを破るし、胎児をやさしく吸う胚の頭の上に少しだけ押しにガラス ピペットを使用します。<ol>
<li>ガラス ピペットから胚を胚媒体 (媒体を含んでいる BDM を洗い流す) に PTU を含む 35 mm のペトリ皿に取り出します。</li>
		<li>PTU と胚媒体を含んでいる 6 ウェル プレートには井戸に胚を転送します。このステップの間に胚のノートを保つことを確認は、これは後で発達段階で photoconverted のセルの位置を関連付けるに不可欠なまあに入ります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>今では、胚は、BDM 含む媒体から削除されます、彼らの心は戻り胚胚は通常を開発し続けることを許可するように 28.5 ° C で暗闇の中を約 5 分で再び暴行を始めるべきです。</li>
</ol>6 その後の胚の段階で photoconverted 細胞のイメージング
<ol><li>必要な段階では、心臓を停止させるし、胚が胚を追跡する別のマーク付きの料理で BDM と見なす必要がある重要な違いがこのプロトコルの手順 3 の下のような胚を再埋め込みます。</li>
	<li>62 までの胚の hpf 561 を使用して心内膜の z スタックを取得 nm、488 nm の赤と緑の蛍光信号をそれぞれ。62 より古い段階で胚の hpf、多光子を使用してレーザー セット 940 nm 488 nm レーザーではなく緑の楓をイメージします。</li>
</ol>7. 画像解析による胚下 48 hpf
注: AVC の組織の動きが複雑な三次元構造を分析することは困難にすることができます。2 つの非 photoconverted 領域または 2 つの photoconverted の地域間 avc 非 photoconverted 領域の長さ間の AVC の photoconverted 領域の長さを定量化することができます上に立体の構造をマップするが望ましい、二次元の地図。Photoconverted 胚の画像取得 48 前に hpf は、次の方法を使用して分析できます。
<ol><li>Matlab または任意の同様のソフトウェアで取得した画像をインポートします。</li>
	<li>投資収益率、すなわち、心内膜を手動で外縁し、この地域外の信号を削除するマスクを適用します。</li>
	<li>心内膜上の点を識別し、3 次元にそれらをプロットする画像を輝度しきい値を適用します。アトリウムとソフトウェアの消去コマンドを使用して心室に興味のポイントを手動で消去することによって、AVC の狭いとほとんどストレートの部分に対応する箇所を特定します。</li>
	<li>ように入手された AVC を表す点に合わせてシリンダーを使用します。</li>
	<li>いくつかのサンプルを比較するための参照システムを定義します。たとえば、参照系の原点と z 軸として装着シリンダーの軸として AVC ポイントの重心を採用します。<ol>
<li>心臓 (心房または心室筋) の同じ側に正の z 位置が常に対応していることを確認します。</li>
		<li>X y 平面上の AVC ポイントのプロジェクトし、それらに合わせて楕円を使用してください。</li>
		<li>楕円の長軸と参照系の y 軸が平行し、正の y 値は胎児に関して AVC 内部側に対応心内膜ポイント z 軸の周りを回転します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>半平面を回転させることにより得られるいくつかの面で三次元データセットをカット、AVC をセグメント化、{y = 0、x > 0} z 方向で。<ol>
<li>これらの平面の隣接ピクセルの強度をプロジェクトし、一貫した方法で、内皮を定義します。たとえば、手動でからラインを描く、心房内皮の半分の厚さで AVC の心室側に。</li>
		<li>表面と AVC を表すスプライン ツールボックスを使用して 3 次元スプラインと内皮を表すラインのポイントを補間します。 注: 分割の精度とこのステップの時間消費の両方切断面の数を決定します。通常、飛行機 8、良い結果を達成するために十分であります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>円筒座標を使用して AVC 表面の各ポイントの方位の位置を定義します。<ol>
<li>各方位の位置でサーフェス間の連続する点の円弧の長さを計算することによって、AVC の表面に沿ってパラメトリック曲線を定義します。</li>
		<li>各のパラメトリック曲線曲線ゼロに AVC の中心に最も近いポイントを定義します。AVC のポイントはこうしてパラメトリック曲線上の方位の位置とその位置によって完全に説明しました。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ポイントのパラメトリック位置を使用して二次元のイメージに、AVC を展開します。</li>
	<li>バイナリ イメージの閾値のエッジとして、photoconverted の強度と非 photoconverted チャンネル間の比率を定量化する領域のエッジを見つけます。必要に応じて、手動で結果を修正します。</li>
	<li>方位角の位置の関数として組織の長さを計算するためのエッジ間の円弧の長さを計算します。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Chow, R. W., Vermot, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rise+of+photoresponsive+protein+technologies+applications+in+vivo:+a+spotlight+on+zebrafish+developmental+and+cell+biology.">The rise of photoresponsive protein technologies applications in vivo: a spotlight on zebrafish developmental and cell biology.</a> F1000Res. 6, (2017).</li><li>Sehnert, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+troponin+T+is+essential+in+sarcomere+assembly+and+cardiac+contractility.">Cardiac troponin T is essential in sarcomere assembly and cardiac contractility.</a> Nat Genet. 31, 106-110 (2002).</li><li>Peal, D. S., Lynch, S. N., Milan, D. 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A., Sporbert, A., Abdelilah-Seyfried, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Tracking+Using+Photoconvertible+Proteins+During+Zebrafish+Development.">Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development.</a> J. Vis. Exp. (67), (2012).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biology II: Mouse, Zebrafish, and Chick. Zebrafish Breeding and Embryo Handling. , (2017).</li><li>Watanabe, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+effect+of+2,3-butanedione+monoxime+(BDM)+on+Na(+)/Ca(2+)+exchange+current+in+guinea-pig+cardiac+ventricular+myocytes.">Inhibitory effect of 2,3-butanedione monoxime (BDM) on Na(+)/Ca(2+) exchange current in guinea-pig cardiac ventricular myocytes.</a> Br J Pharmacol. 132 (6), 1317-1325 (2001).</li><li>Jou, C. J., Spitzer, K. W., Tristani-Firouzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blebbistatin+effectively+uncouples+the+excitation-contraction+process+in+zebrafish+embryonic+heart.">Blebbistatin effectively uncouples the excitation-contraction process in zebrafish embryonic heart.</a> Cell Physiol Biochem. 25 (4-5), 419-424 (2010).</li><li>Pestel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+3D+visualization+of+cellular+rearrangements+during+cardiac+valve+formation.">Real-time 3D visualization of cellular rearrangements during cardiac valve formation.</a> Development. 143 (12), 2217-2227 (2016).</li><li>Swinburne, I. A., Mosaliganti, K. R., Green, A. A., Megason, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Long-Term+Imaging+of+Embryos+with+Genetically+Encoded+alpha-Bungarotoxin.">Improved Long-Term Imaging of Embryos with Genetically Encoded alpha-Bungarotoxin.</a> PLoS One. 10 (8), e0134005 (2015).</li><li>Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilayer+mounting+enables+long-term+imaging+of+zebrafish+development+in+a+light+sheet+microscope.">Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope.</a> Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).</li><li>Marchant, J. S., Stutzmann, G. E., Leissring, M. A., LaFerla, F. M., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton-evoked+color+change+of+DsRed+as+an+optical+highlighter+for+cellular+and+subcellular+labeling.">Multiphoton-evoked color change of DsRed as an optical highlighter for cellular and subcellular labeling.</a> Nat Biotechnol. 19 (7), 645-649 (2001).</li><li>Dempsey, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+single-cell+labeling+by+confined+primed+conversion.">In vivo single-cell labeling by confined primed conversion.</a> Nat Methods. 12 (7), 645-648 (2015).</li><li>Mohr, M. A., Pantazis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+neuron+morphology+in+vivo+with+confined+primed+conversion.">Single neuron morphology in vivo with confined primed conversion.</a> Methods Cell Biol. 133, 125-138 (2016).</li><li>Mohr, M. A., Argast, P., Pantazis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+cellular+structures+in+vivo+using+confined+primed+conversion+of+photoconvertible+fluorescent+proteins.">Labeling cellular structures in vivo using confined primed conversion of photoconvertible fluorescent proteins.</a> Nat Protoc. 11 (12), 2419-2431 (2016).</li><li>Mohr, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+Engineering+of+Photoconvertible+Fluorescent+Proteins+for+Dual-Color+Fluorescence+Nanoscopy+Enabled+by+a+Triplet-State+Mechanism+of+Primed+Conversion.">Rational Engineering of Photoconvertible Fluorescent Proteins for Dual-Color Fluorescence Nanoscopy Enabled by a Triplet-State Mechanism of Primed Conversion.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 56 (38), 11628-11633 (2017).</li><li>Dempsey, W. P., Fraser, S. E., Pantazis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PhOTO+zebrafish:+a+transgenic+resource+for+in+vivo+lineage+tracing+during+development+and+regeneration.">PhOTO zebrafish: a transgenic resource for in vivo lineage tracing during development and regeneration.</a> PLoS One. 7 (3), e32888 (2012).</li><li>Dempsey, W. P., Qin, H., Pantazis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+cell+tracking+using+PhOTO+zebrafish.">In vivo cell tracking using PhOTO zebrafish.</a> Methods Mol Biol. 1148, 217-228 (2014).</li></ol>

利害の対立が宣言されていません。

光電のタイミング: 96 でも内分泌かく乱化学物質の鮮やかな表現が楓のまま hpf、胚が大きくなると、レーザー光を拡散させるより楓の限られた光電をより困難になり、AVC に達する前にそれに注意してください。At 萌芽期段階の 55 以降 hpf、心室と心房のバルーニングもの光電用バイオレット レーザー ビームが心房または心室のどちらかを最初の通過せず AVC 細胞を達することができな...

ゼブラフィッシュは現在体内細胞および進化のプロセスを勉強する最も重要な脊椎動物モデルの一つです。これがゼブラフィッシュの光透過性の主因と遺伝学は、遺伝子を含む光学的手法を適用するための強力なモデルはそれにこうしてエンコード光応答性タンパク質技術1。心臓の研究に固有のゼブラフィッシュを受け取る拡散を介して十分な酸素ハートビートなしも突然変異体は発達遺伝子および摂動の影響に関する分析を許可、開発の最初の週を生き残ることができるようにほとんどの脊椎動物2で可能ではない心臓の形態形成に関する血流。
ゼブラフィッシュの心臓の管は 24 時間ポスト受精 (hpf) によって形成されます。その形成直後後心臓の管は、積極的に暴行を開始します。36 で hpf、明確な収縮心室から心房を分離します。収縮のこの地域は、立方形態3房室運河 (AVC) とこの地域の変更細胞扁平上皮の形態から呼び出されます。ゼブラフィッシュ房室弁の形態形成開始 48 時間前後は、受精を投稿します。5 日ポスト受精、2 つの弁尖は、AVC に拡張し、4心周期の間に、心室から心房への血液の逆流を防ぐ。AVC と弁形成過程における細胞の追跡を介して伝統的なタイムラプス顕微鏡5,6セルに従うことが困難な心の急速な打撃としては困難です。このプロトコルは、スティードら2016年7から適応で楓の蛍光蛋白質の表現に使用されるなTg (fli1a:gal4FFubsUAS:kaede)8ゼブラフィッシュ遺伝子組換え回線を使用する方法を記述します。血管内皮細胞は、心内膜を含みます。36 55 の hpf と発生時間の特定ポイントで photoconverted 内分泌かく乱化学物質の高分解能イメージングの内分泌かく乱化学物質の正確な光電に暴行、心臓を一時的に停止、薬 2, 3-butanedione-2-ジアセチルモノオキシム (BDM) が使用されます。以前、内分泌かく乱化学物質 photoconverted このメソッドを使用してが変換されていない近所の人たちと区別することができますまま光電7時間後 5 日間以上に示されています。このプロトコル 48 より若い胚における内分泌かく乱化学物質 photoconverted の画像解析に使用するメソッドの詳細も hpf は、AVC 開発 (Boselliらプレスで)9中に組織の動きに従う正常に使用されています。我々 は、読者がこのプロトコルを有用見つける AVC とバルブの開発、正常な胚、変異体、morphants、または薬剤を投与した胚を研究するため願っています。ゼブラフィッシュの開発中に蛍光タンパク質を用いた細胞追跡に関連する一般的なプロトコル、ロンバルドら、2012年10投稿記事をご覧ください。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Necessary equipment for raising fish and collecting eggs (see the Zebrafish Book22 for details).</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright confocal microscope (Equipped with lasers operating at 488 nm, 561 nm, and 405 nm, a tunable multiphoton laser, and a Leica HCX IRAPO L, 25 &#215;, N.A. 0.95 objective)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica SP8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat block</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>88870001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm x 10 mm tissue culture dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mold</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8 mg/mL Tricaine stock solution&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M BDM stock solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure low melting point agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTU (1-phenyl-2-thiourea)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P7629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo medium: 30x stock solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab equipped with the Image Analysis, Curve Fitting, Bio-Formats Toolboxes</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8 mg/mL Tricaine stock solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 mg of tricaine powder (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonic acid)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Danieau</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adjust to pH 7, aliquot and store at -20 &#176;C&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M BDM stock solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 g BDM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>112135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL ddH2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aliquot and store at -20 &#176;C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo medium: 30x stock solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50.7 g NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.78 g KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7447-40-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.47 g Magnesium sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;7487-88-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.1 g Calcium nitrite tetrahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>13477-34-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>19.52 g HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7365-45-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adjust to pH 7.2 and store at room temperature</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mold</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PlasCLEAR resin</td>
			<td>Asiga</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plus 39&#160;Freeform Pico 3D printer</td>
			<td>Asiga</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

following endocardial tissue movements via cell photoconversion in the zebrafish embryo

胚発生に伴う細胞細胞行動のダイナミックな変化を受けるし、発生生物学の分野の基本的な目標は、これらの変更の背後にある細胞の論理を読み解きます。発見と蛍光タンパク質の開発が格段に動的変更の私達の理解光学的細胞や組織を強調表示する方法を提供します。ただし、光電、微速度顕微鏡観察およびそれに続く画像解析は、脳や目など臓器の細胞動態を暴くで非常に成功する証明が、このアプローチは通常使用されないため心臓の開発で心臓のサイクル中に心臓の急速な動きによってもたらされる課題。このプロトコルは、2 つの部分で構成されています。最初の部分では、photoconverting とその後中ゼブラフィッシュ房室運河 (AVC)、心臓房室弁開発心内膜細胞 (内分泌かく乱化学物質) を追跡する方法について説明します。正確な光電場所を取るために薬で心臓を一時的停止メソッドが含まれます。心は再開できる発達時間後の時点で photoconverted 内分泌かく乱化学物質の高分解能イメージングのため心臓が再び停止するまでに薬物および萌芽期の開発の除去時に鼓動が通常どおり続行されます。プロトコルの 2 番目の部分は、二次元の地図に立体構造から蛍光信号をマッピングすることにより幼胚の胚で AVC の photoconverted または非 photoconverted 領域の長さを定量化する画像解析法をについて説明します.一緒に、プロトコルの 2 つの部分は、起源とゼブラフィッシュ AVC と房室弁をし、変異体、morphants、またはと扱われている胚を研究するため適用できる可能性のある細胞の挙動を検討する 1 つをことができます。AVC および/または弁の開発を妨害する試薬です。

48 胚 photoconverted の例 hpf 80 でもう一度イメージ化と hpf は図 2映画 1および2で示されています。405 nm の光に楓を公開すると、不可逆的変換蛍光赤フォームにその蛍光緑の形態からの蛋白質、緑または赤いフォームのラベルの付いたセルの動作を有効にする彼らのメランジに尊重します。弁形成の間に近所の人。それは 48 ...

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Following Endocardial Tissue Movements via Cell Photoconversion in the Zebrafish Embryo

このプロトコルは楓生活の心内膜細胞の蛍光タンパク質の光変換の方法を記述するゼブラフィッシュ胎児房室管、心臓房室弁開発中心内膜細胞の追跡を有効にします。.

ゼブラフィッシュ胚における細胞光電を介して次の心内膜組織運動

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

6.4K ビュー.  Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire. このプロトコルは楓生活の心内膜細胞の蛍光タンパク質の光変換の方法を記述するゼブラフィッシュ胎児房室管、心臓房室弁開発中心内膜細胞の追跡を有効にします。.

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Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological systems. In FDAP experiments, the clearance of proteins within living organisms can be measured. A protein of interest is tagged with a photoconvertible fluorescent protein, expressed in vivo and photoconverted, and the decrease in the photoconverted signal over time is monitored. The data is then fitted with an appropriate clearance model to determine the protein half-life. Importantly, the clearance kinetics of protein populations in different compartments of the organism can be examined separately by applying compartmental masks. This approach has been used to determine the intra- and extracellular half-lives of secreted signaling proteins during zebrafish development. Here, we describe a protocol for FDAP experiments in zebrafish embryos. It should be possible to use FDAP to determine the clearance kinetics of any taggable protein in any optically accessible organism.

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP

Protein levels in cells and tissues are often tightly regulated by the balance of protein production and clearance. Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP), the clearance kinetics of proteins can be experimentally measured in vivo.

光変換後の蛍光減衰を使用して生活ゼブラフィッシュ胚におけるタンパク質の安定性の測定（FDAP）

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological ...

発生生物学

Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic conservation, as well as similarities in cellular, molecular, and physiological processes, with other vertebrates including humans. During early ontogeny, zebrafish embryos are optically transparent, allowing researchers to visualize the dynamics of organogenesis using a simple stereomicroscope. Microbead implantation is a method that enables tissue manipulation through the alteration of factors in local environments. This allows researchers to assay the effects of any number of signaling molecules of interest, such as secreted peptides, at specific spatial and temporal points within the developing embryo. Here, we detail a protocol for how to manipulate and implant beads during early zebrafish development.

The zebrafish is an excellent model system for genetic and developmental studies. Bead implantation is a valuable tissue manipulation technique that can be used to interrogate developmental mechanisms by introducing alterations in local cellular environments. This protocol describes how to perform microbead implantation in the zebrafish embryo.

ゼブラフィッシュ胚におけるマイクロビーズの移植

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

リビングゼブラフィッシュ胚における細胞内構造のイメージング

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin condensation, microtubule-kinetochore attachment, chromosome segregation, and cytokinesis in a small time frame. Errors in the delicate process can result in human disease, including birth defects and cancer. Traditional approaches investigating human mitotic disease states often rely on cell culture systems, which lack the natural physiology and developmental/tissue-specific context advantageous when studying human disease. This protocol overcomes many obstacles by providing a way to visualize, with high resolution, chromosome dynamics in a vertebrate system, the zebrafish. This protocol will detail an approach that can be used to obtain dynamic images of dividing cells, which include: in vitro transcription, zebrafish breeding/collecting, embryo embedding, and time-lapse imaging. Optimization and modifications of this protocol are also explored. Using H2A.F/Z-EGFP (labels chromatin) and mCherry-CAAX (labels cell membrane) mRNA-injected embryos, mitosis in AB wild-type, auroraBhi1045, and esco2hi2865 mutant zebrafish is visualized. High resolution live imaging in zebrafish allows one to observe multiple mitoses to statistically quantify mitotic defects and timing of mitotic progression. In addition, observation of qualitative aspects that define improper mitotic processes (i.e., congression defects, missegregation of chromosomes, etc.) and improper chromosomal outcomes (i.e., aneuploidy, polyploidy, micronuclei, etc.) are observed. This assay can be applied to the observation of tissue differentiation/development and is amenable to the use of mutant zebrafish and pharmacological agents. Visualization of how defects in mitosis lead to cancer and developmental disorders will greatly enhance understanding of the pathogenesis of disease.

Mitosis is critical to every living organism and defects often lead to cancer and developmental disorders. Using this imaging protocol and zebrafish as a model system, researchers can visualize mitosis in a live vertebrate organism and the multitude of defects that arise when mitotic processes are defective.

ライブゼブラフィッシュ胚における有糸分裂とダイナミクスを観察します

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin ...

Visualizing the Interrenal Steroidogenic Tissue and Its Vascular Microenvironment in Zebrafish

This protocol introduces how to detect differentiated interrenal steroidogenic cells through a simple whole-mount enzymatic activity assay. Identifying differentiated steroidogenic tissues through chromogenic histochemical staining of 3-&#946;-Hydroxysteroid dehydrogenase /&#916;5-4 isomerase (3&#946;-Hsd) activity-positive cells is critical for monitoring the morphology and differentiation of adrenocortical and interrenal tissues in mammals and teleosts, respectively. In the zebrafish model, the optical transparency and tissue permeability of the developing embryos and larvae allow for whole-mount staining of 3&#946;-Hsd activity. This staining protocol, as performed on transgenic fluorescent reporter lines marking the developing pronephric and endothelial cells, enables the detection of the steroidogenic interrenal tissue in addition to the kidney and neighboring vasculature. In combination with vibratome sectioning, immunohistochemistry, and confocal microscopy, we can visualize and assay the vascular microenvironment of interrenal steroidogenic tissues. The 3&#946;-Hsd activity assay is essential for studying the cell biology of the zebrafish interrenal gland because to date, no suitable antibody is available for labeling zebrafish steroidogenic cells. Furthermore, this assay is rapid and simple, thus providing a powerful tool for mutant screens targeting adrenal (interrenal) genetic disorders as well as for determining disruption effects of chemicals on steroidogenesis in pharmaceutical or toxicological studies.

The interrenal gland in zebrafish is the teleostean counterpart of the mammalian adrenal gland. This protocol introduces how to perform the 3-&#946;-hydroxysteroid dehydrogenase (&#916;5-4 isomerase; 3&#946;-Hsd) enzymatic activity assay, which detects differentiated steroidogenic cells in the developing zebrafish.

腎間のステロイド合成組織とゼブラフィッシュにおけるその血管微小環境の可視化

This protocol introduces how to detect differentiated interrenal steroidogenic cells through a simple whole-mount enzymatic activity assay. Identifying ...

Use of Immunolabeling to Analyze Stable, Dynamic, and Nascent Microtubules in the Zebrafish Embryo

Microtubules (MTs) are dynamic and fragile structures that are challenging to image in vivo, particularly in vertebrate embryos. Immunolabeling methods are described here to analyze distinct populations of MTs in the developing neural tube of the zebrafish embryo. While the focus is on neural tissue, this methodology is broadly applicable to other tissues. The procedures are optimized for early to mid-somitogenesis-stage embryos (1 somite to 12 somites), however they can be adapted to a range of other stages with relatively minor adjustments. The first protocol provides a method to assess the spatial distribution of stable and dynamic MTs and perform a quantitative analysis of these populations with image-processing software. This approach complements existing tools to image microtubule dynamics and distribution in real-time, using transgenic lines or transient expression of tagged constructs. Indeed, such tools are very useful, however they do not readily distinguish between dynamic and stable MTs. The ability to image and analyze these distinct microtubule populations has important implications for understanding mechanisms underlying cell polarization and morphogenesis. The second protocol outlines a technique to analyze nascent MTs specifically. This is accomplished by capturing the de novo growth properties of MTs over time, following microtubule depolymerization with the drug nocodazole and a recovery period after drug washout. This technique has not yet been applied to the study of MTs in zebrafish embryos, but is a valuable assay for investigating the in vivo function of proteins implicated in microtubule assembly.

Immunolabeling methods to analyze distinct populations of microtubules in the developing zebrafish brain are described here, which are broadly applicable to other tissues. The first protocol outlines an optimized method for immunolabeling stable and dynamic microtubules. The second protocol provides a method to image and quantify nascent microtubules specifically.

ゼブラフィッシュ胚の安定した、動的、および初期の微小管を分析する反応の利用

Microtubules (MTs) are dynamic and fragile structures that are challenging to image in vivo, particularly in vertebrate embryos. Immunolabeling methods ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

マウス二次口蓋融合のライブイメージング

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. Various propositions claim to have been important contributions to the understanding of the mechanical properties of cells and tissues in their spatiotemporal organization in different developmental and morphogenetic processes. However, due to the lack of reliable and accessible tools to measure material properties and tensional parameters in vivo, validating these hypotheses has been difficult. Here we present methods employing atomic force microscopy (AFM) and particle tracking with the aim of quantifying the mechanical properties of the intact zebrafish embryo yolk cell during epiboly. Epiboly is an early conserved developmental process whose study is facilitated by the transparency of the embryo. These methods are simple to implement, reliable, and widely applicable since they overcome intrusive interventions that could affect tissue mechanics. A simple strategy was applied for the mounting of specimens, AFM recording, and nanoparticle injections and tracking. This approach makes these methods easily adaptable to other developmental times or organisms.

The lack of tools to measure material properties and tensional parameters in vivo prevents validating their roles during development. We employed atomic force microscopy (AFM) and nanoparticle-tracking to quantify mechanical features on the intact zebrafish embryo yolk cell during epiboly. These methods are reliable and widely applicable avoiding intrusive interventions.

原子間力顕微鏡とゼブラフィッシュ胚の卵黄細胞のレオロジー

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause disease when disrupted. Scientists have developed clever techniques to investigate characteristics and natural dynamics of these cells within intact tissue by expressing fluorescent proteins in subsets of cells. However, at times, experiments require more selected visualization of cells within the tissue, sometimes at the single-cell or population-of-cells manner. To achieve this and visualize single cells within a population of cells, scientists have utilized single-cell photoconversion of fluorescent proteins. To demonstrate this technique, we show here how to direct UV light to an Eos-expressing cell of interest in an intact, living zebrafish. We then image those photoconverted Eos+ cells 24 h later to determine how they changed in the tissue. We describe two techniques: single cell photoconversion and photoconversions of populations of cell. These techniques can be used to visualize cell-cell interactions, cell-fate and differentiation, and cell migrations, making it a technique that is applicable in numerous biological questions.

Here, we present a protocol to show how cell photoconversion is achieved through UV exposure to specific areas expressing the fluorescent protein, Eos, in living animals.

生活そのままゼブラフィッシュの単一セルの光電

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

Morphogenesis requires coordination between genetic patterning and mechanical forces to robustly shape the cells and tissues. Hence, a challenge to understand morphogenetic processes is to directly measure cellular forces and mechanical properties in vivo during embryogenesis. Here, we present a setup of optical tweezers coupled to a light sheet microscope, which allows to directly apply forces on cell-cell contacts of the early Drosophila embryo, while imaging at a speed of several frames per second. This technique has the advantage that it does not require the injection of beads into the embryo, usually used as intermediate probes on which optical forces are exerted. We detail step by step the implementation of the setup, and propose tools to extract mechanical information from the experiments. By monitoring the displacements of cell-cell contacts in real time, one can perform tension measurements and investigate cell contacts&#39; rheology.

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

We present a setup of optical tweezers coupled to a light sheet microscope, and its implementation to probe cell mechanics without beads in the Drosophila embryo.

ショウジョウバエの胚のビーズ無料光ピンセット プローブ細胞力学

Morphogenesis requires coordination between genetic patterning and mechanical forces to robustly shape the cells and tissues. Hence, a challenge to ...