نود أن نشكر أن-لور Duchemin ودينيس Duchemin، ناتالي فاجيانيلي وجورتشينكوف باسيل للمساعدة في تصميم وصنع العفن الموصوفة في هذا البروتوكول. وأيده عمل هذه العلاجات (DEQ20140329553)، وكالة الاستخبارات الوطنية (ANR-15-CE13-0015-01، ANR-12-ISV2-0001-01)، البرنامج محقق الشباب التطريز، الجماعة الأوروبية، ن منسق الإغاثة الطارئة CoG ° 682938 افالفي ومن منحة ANR-10-لابكس-0030-إينرت، يديره صندوق الدولة الفرنسية الوكالة الوطنية للبحث تحت دعفينير يشرف البرنامج الإطار المسمى ANR-10-معرض أيدكس-0002-02.

1-إعداد قوالب وتصاعد [اغروس]
<ol><li>إنشاء قالب مع الأبعاد هو مبين في الشكل 1 باستخدام طابعة 3D أو أدوات الورش الميكانيكية التقليدية.</li>
	<li>"الماصة؛" حوالي 1.5 مل من ذاب 1% [اغروس] إلى طبق تركيب بلاستيك 35 ملم. ضع القالب البلاستيك في [اغروس] السائل، مع الحرص على تجنب الجوية الملائمة بين العفن و [اغروس]. ضع الطبق في 4 درجات مئوية، والانتظار حتى [اغروس] يصلب (هذا يستغرق حوالي 5 دقائق)، ثم إزالة العفن البلاستيك.</li>
	<li>لتخزين الطبق المتصاعدة لاستخدامها في وقت لاحق، وتغطي الطبق مع غطاء لها، ثم التفاف الطبق وغطاء محكم مع بارافيلم. الطبق المتصاعدة يمكن تخزينها ثم وجه غطاء لأسفل لمدة 5 أيام في 4 درجات مئوية.</li>
	<li>إعداد مقدما مختبرين 1 مل من 0.7 في المائة نقطة انصهار منخفضة [اغروس] في 1.5 مل أنابيب ايبندورف استخدامها في يوم تصاعد. ملاحظة: سوف تشوه الآبار [اغروس] طبق المتصاعدة مع مرور الوقت كما يتبخر الماء إذا بارافيلم لا يتم التفاف حول الأطباق محكم.</li>
</ol>2-الحصول على الأجنة فوتوكونفيرسيون
<ol><li>إينكروس تيراغرام (fli1a:gal4FFيو بي إس، UAS:kaede) خط وينمو حوالي 200 الأجنة في المتوسط الجنين في الظلام في 28.5 درجة مئوية. لمزيد من التفاصيل حول كيفية عبور خطوط الزرد، يرجى الرجوع إلى "قاعدة بيانات التعليم العلوم جوف"11.</li>
	<li>بعد 5 ساعات ولكن قبل 24 ساعة، علاج الأجنة مع 1-فينيل-2-ال (PTU) لمنع تشكيل الصباغ (0.003% PTU في الجنين المتوسطة).</li>
	<li>التي تظهر في حوالي 1 ساعة قبل بدء فوتوكونفيرسيون، وفحص أجنة تحت ستيريوسكوبي فلورسنت وحدد 5 أجنة صحية للتعبير عن الفلورية الخضراء ألمع. يوصي باستخدام الضوء المنخفض الكثافة عند تصور الأجنة لتجنب التعرض للأجنة للإضاءة المحيطة تجنبا فوتوكونفيرتينج كايد في خلايا غير محددة.</li>
</ol>3-التضمين
<ol><li>إعداد 10 مل من تركيب وسائط: تريكيني 0.02 في المائة و 50 مم متخذي قرارات العمل في المتوسط الجنين.</li>
	<li>إضافة 2 مل من تصاعد المتوسطة إلى الطبق المتصاعدة وتسمح 15-30 دقيقة لحل منتشر في [اغروس].</li>
	<li>وفي الوقت نفسه، تذوب قاسمة 1 مل من 0.7 في المائة نقطة انصهار منخفضة (LMP) [اغروس] عن طريق وضع الأنبوب في كتلة حرارة 70 درجة مئوية لمدة حوالي 5 دقائق.<ol>
<li>انتظر LMP [اغروس] لتبرد قليلاً، ثم إضافة 25 ميليلتر من 8 ملغ/مل تريكيني الحل وميليلتر 40 م 1 متخذي قرارات العمل الحل إلى الأنبوب من نقطة انصهار منخفضة [اغروس]. مزيج من بيبيتينج صعودا وهبوطاً، ثم نقل الأنبوب إلى كتلة حرارة 38 درجة مئوية للحفاظ [اغروس] LMP في حالتها السائلة.</li>
	</ol>
</li>
	<li>في بتري طبق مع الجنين المتوسطة، ديتشوريوناتي بعناية الأجنة تم اختيارها مسبقاً تحت ستيريوميكروسكوبي استخدام الملقط، مع الحرص على عدم الأضرار الأجنة.</li>
	<li>نقل الأجنة إلى طبق منفصل يحتوي على 2 مل من تركيب وسائط.<ol>
<li>عندما يتم إيقاف قلوب الأجنة (يستغرق حوالي 5-10 دقيقة)، نقل الأجنة إلى التركيب صحن وترتيب الأجنة في الآبار باستخدام الملقط حتى أنهم يكذبون بزاوية 25 درجة، ذيول لافتاً نحو الجزء الأعمق من البئر، صفار مواجهة.</li>
		<li>عند الأجنة تقريبا في المكان، قم بإزالة الوسائط، وتضمين الأجنة في ~ 200 ميليلتر من 0.7% LMP [اغروس] يتضمن تريكيني ومتخذي قرارات العمل، وتعديل المواقف للأجنة، إمالة الأجنة إلى اليمين أو اليسار حسب الضرورة.</li>
	</ol>
</li>
	<li>الانتظار حتى بإضافة المجموعات [اغروس] LMP (يستغرق حوالي 5 دقائق)، ثم تصاعد المتوسطة إلى الطبق. الأجنة جاهزة الآن لتكون فوتوكونفيرتيد. ملاحظة: في تريكايني ومتخذي قرارات العمل تستخدم لتخدير الأجنة ووقف القلب لدى الأجنة، على التوالي. تركيب وسائل الإعلام يمكن إعدادها قبل التصوير بيوم واحد، ولكن تأكد من أن حماية وسائل الإعلام من الضوء. ملاحظة: تحديد المواقع الصحيحة للأجنة مهم للسماح لمسار ليزر واضحة للخلايا أحد يرغب في فوتوكونفيرت. وضع رأس الجنين قريبة من بداية البئر حيث يكون ضوء الليزر عدم السفر الآن للوصول إلى الجنين، وحيث أن الأجنة يمكن بسهولة صاعد بعد فوتوكونفيرسيون.</li>
</ol>4-فوتوكونفيرسيون
<ol><li>في مجهر [كنفوكل] تستقيم (مثل إيكا SP8) مجهزة 405 نانومتر، 488 شمال البحر الأبيض المتوسط وشمال البحر الأبيض المتوسط 561 الليزر المصدر، حدد موقع الجنين استخدام القلب أحال الضوء الأبيض (برايتفيلد) وعدسة الهدف (مثل إيكا HCX إيرابو L, × 25، N.A. 0.95 هدف). تحقق من وجود الأسفار كايد الحمراء باستخدام الليزر نانومتر 561 (أي، الليزر 561 والعسف، في كثافة ~ 5%، الكاشف في شمال البحر الأبيض المتوسط 589-728). ثم، تصور البطانة باستخدام الليزر 488 نانومتر (أي، 30 ميغاواط متعدد الأسطر ليزر الأرجون في كثافة ~ 5%، الكاشف في 502-556 nm).</li>
	<li>إدخال وضع "فراب" على البرمجيات اقتناء مجهر. حدد السلطة الليزر ~ 1% لكلا 488 نانومتر و 561 نانومتر الليزر.</li>
	<li>التركيز على طائرة الفائدة، حدد منطقة للفائدة (العائد على الاستثمار)، ثم فوتوكونفيرت الخلايا باستخدام صمام ثنائي نانومتر 405 الليزر طاقة الليزر 25%، مسح ثلاث مرات على مدى العائد على الاستثمار. ينبغي أن تكون غير كافية كايد فوتوكونفيرتيد في العائد على الاستثمار، تفحص 405 نانومتر الليزر فوق المنطقة ثلاث مرات مرة أخرى. كرر هذه الخطوة لكل رويس.</li>
	<li>العودة إلى وضع "TCS SP8" على البرمجيات واكتساب z كدسة، استخدام 561 نانومتر و 488 نانومتر ليزر تسلسلياً. تأكد من تحديد الخيار 'ثنائي' لزيادة سرعة التصوير. ملاحظة: الزمن الذي يستغرقه فوتوكونفيرت والصورة يختلف كل جنين. من المعروف أن تكون هامة لتطوير صمام قلب العادي، لذا تجنب إبقاء قلب توقفت لأكثر من 30 دقيقة، حتى لو كان ذلك يعني ليس لديك وقت فوتوكونفيرت جميع الأجنة 5 ضربات القلب. ملاحظة: أثناء عملية فوتوكونفيرسيون، استخدام كاشفات PMT، حين بعد فوتوكونفيرسيون، من المستحسن استخدام كاشفات الهجين تعيين إلى 'فرز' الوضع. هذا سبب كاشفات الهجين أكثر حساسية، وقادرة على إنتاج صور ذات جودة أفضل، لكن تتلف بسهولة التعرض المفرط.</li>
</ol>5-إلغاء تحميل فوتوكونفيرتيد الأجنة
<ol><li>بعد فوتوكونفيرسيون، استخدم ماصة زجاجية لاضغط لأسفل قليلاً فقط فوق رأس الجنين إلى كسر في [اغروس] LMP، ثم تمتص بلطف الجنين.<ol>
<li>إخراج الجنين من ماصة زجاجية في طبق بتري 35 ملم تحتوي على الجنين المتوسطة مع PTU (ليغسل متخذي قرارات العمل تتضمن المتوسطة).</li>
		<li>نقل الجنين إلى بئر في لوحة 6-جيدا المحتوية على الجنين المتوسطة مع PTU. أثناء هذه الخطوة، تأكد من إبقاء علما بالجنين الذي يذهب إلى فيها جيدا، كما أن هذا ضروري للربط بين موقف فوتوكونفيرتيد الخلايا في مراحل النمو في وقت لاحق.</li>
	</ol>
</li>
	<li>والآن بعد أن يتم إزالة الأجنة من المتوسطة المحتوية على متخذي قرارات العمل، ينبغي أن تبدأ قلوبهم ضرب مرة أخرى في حوالي 5 دقيقة الأجنة العودة إلى الظلام في 28.5 درجة مئوية للسماح للأجنة مواصلة تطوير عادة.</li>
</ol>6-تصوير فوتوكونفيرتيد الخلايا في المراحل الجنينية في وقت لاحق
<ol><li>في المرحلة المرجوة، توقف القلب وإعادة تضمين الأجنة مثل إطار الخطوة 3 من هذا البروتوكول، مع فارق هام أن الأجنة يجب أن تعامل مع متخذي قرارات العمل في أطباق منفصلة وملحوظ لتعقب الأجنة.</li>
	<li>للأجنة حتى 62 هبف، اكتساب z-رزمة شغاف استخدام 561 نانومتر و 488 نانومتر الفلورسنت الأحمر والأخضر إشارات، على التوالي. للأجنة في مراحل أقدم من 62 الليزر هبف، استخدم مولتيفوتون لتعيين 940 نانومتر صورة كايد الأخضر بدلاً من 488 نانومتر الليزر.</li>
</ol>7-صورة التحليل للأجنة تحت 48 هبف
ملاحظة: تحركات الأنسجة افك يمكن أن تكون صعبة لتحليل سبب لها هيكل ثلاثي الأبعاد المعقدة. لتحديد طول منطقة فوتوكونفيرتيد في افك بين المنطقتين غير فوتوكونفيرتيد أو طول منطقة غير فوتوكونفيرتيد بافك بين المنطقتين فوتوكونفيرتيد، يمكن أن يكون من المستصوب خريطة هيكل ثلاثي الأبعاد على خريطة ثنائية الأبعاد. الحصول على صور للأجنة فوتوكونفيرتيد قبل 48 هبف يمكن تحليلها باستخدام الأسلوب التالي.
<ol><li>استيراد الصور المكتسبة في Matlab أو أي برامج مشابهة.</li>
	<li>جارك يدوياً في العائد على الاستثمار، أي البطانة، وتطبيق قناع لإزالة الإشارة خارج هذه المنطقة.</li>
	<li>تطبيق حد كثافة في الصورة لتحديد النقاط على البطانة وارسم لهم في ثلاثة أبعاد. عزل على النقاط المقابلة للجزء الأكثر مباشرة وأضيق من افك، بمحو نقاط الاهتمام لا في الاذين والبطين استخدام الأمر مسح في البرنامج يدوياً.</li>
	<li>استخدم اسطوانة لتتناسب مع النقاط التي تمثل افك حتى الحصول عليها.</li>
	<li>تعريف نظام مرجعي للمقارنة بين عدة عينات. على سبيل المثال، تعتمد في مركز الكتلة النقاط افك كأصل النظام المرجعي ومحور الاسطوانة المجهزة كمحور ع.<ol>
<li>تأكد من أن z-مواقف إيجابية تتوافق دائماً على نفس الجانب من القلب (البطين أو الرجفان).</li>
		<li>مشروع النقاط افك على متن الطائرة س-ص واستخدام القطع ناقص ليصلح لهم.</li>
		<li>قم بتدوير النقاط للوفلر حول محور ع حيث تكون المحور الرئيسي للقطع الناقص والمحور الصادي النظام المرجعي موازية وتتوافق مع القيم y الإيجابية على الجانب الداخلي من افك فيما يتعلق بالجنين.</li>
	</ol>
</li>
	<li>لتجزئة افك، قص dataset ثلاثية الأبعاد مع بعض الطائرات التي تم الحصول عليها عن طريق تناوب النصف الطائرة {y = 0، س > 0} في الاتجاه-z.<ol>
<li>مشروع كثافة البيكسلات المجاورة لهذه الطائرات وتحديد البطانة بطريقة متسقة. على سبيل المثال، رسم يدوياً خط من الرجفان إلى جانب البطين افك في نصف سمك البطانة.</li>
		<li>اقحم نقاط خطوط تمثل البطانة مع شريحة ثلاثي الأبعاد باستخدام مربع الأدوات المفتاح لتمثيل افك مع سطح. ملاحظة: يحدد عدد الطائرات قطع كل دقة التجزئة واستهلاك الوقت لهذه الخطوة. عادة، 8 طائرات بما يكفي لتحقيق نتائج جيدة.</li>
	</ol>
</li>
	<li>تعريف موقع مداري كل نقطة على السطح افك باستخدام الإحداثيات الاسطوانية.<ol>
<li>تحدد في كل موقع مداري منحنى حدودي على طول سطح افك عن طريق حساب طول القوس على السطح بين نقاط متتالية.</li>
		<li>لكل منحنى حدودي، تحديد النقطة على المنحنى الأقرب إلى مركز افك إلى الصفر. وهكذا تماما نقاط افك يرد وصف موقفهم السمتية وموقفهم على المنحنى حدودي.</li>
	</ol>
</li>
	<li>تتكشف افك في صورة ثنائية الأبعاد باستخدام الموقف حدودي من النقاط.</li>
	<li>العثور على حواف المنطقة لقياس النسبة بين كثافة فوتوكونفيرتيد والقنوات غير فوتوكونفيرتيد حواف العتبة الصورة الثنائية. تصحيح النتيجة يدوياً إذا لزم الأمر.</li>
	<li>حساب طول القوس بين الحواف لحساب طول الأنسجة كدالة للموقف مداري.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Chow, R. W., Vermot, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rise+of+photoresponsive+protein+technologies+applications+in+vivo:+a+spotlight+on+zebrafish+developmental+and+cell+biology.">The rise of photoresponsive protein technologies applications in vivo: a spotlight on zebrafish developmental and cell biology.</a> F1000Res. 6, (2017).</li><li>Sehnert, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+troponin+T+is+essential+in+sarcomere+assembly+and+cardiac+contractility.">Cardiac troponin T is essential in sarcomere assembly and cardiac contractility.</a> Nat Genet. 31, 106-110 (2002).</li><li>Peal, D. S., Lynch, S. N., Milan, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+and+development+of+the+atrioventricular+canal+in+zebrafish.">Patterning and development of the atrioventricular canal in zebrafish.</a> J Cardiovasc Transl Res. 4, 720-726 (2011).</li><li>Boselli, F., Freund, J. B., Vermot, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+flow+mechanics+in+cardiovascular+development.">Blood flow mechanics in cardiovascular development.</a> Cell Mol Life Sci. 72 (13), 2545-2559 (2015).</li><li>Steed, E., Boselli, F., Vermot, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemodynamics+driven+cardiac+valve+morphogenesis.">Hemodynamics driven cardiac valve morphogenesis.</a> Biochim Biophys Acta. , (2015).</li><li>Boselli, F., Vermot, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+and+modeling+for+shear+stress+quantification+in+the+embryonic+zebrafish+heart.">Live imaging and modeling for shear stress quantification in the embryonic zebrafish heart.</a> Methods. , (2015).</li><li>Steed, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=klf2a+couples+mechanotransduction+and+zebrafish+valve+morphogenesis+through+fibronectin+synthesis.">klf2a couples mechanotransduction and zebrafish valve morphogenesis through fibronectin synthesis.</a> Nat Commun. 7, 11646 (2016).</li><li>Herwig, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+cellular+mechanisms+of+blood+vessel+fusion+in+the+zebrafish+embryo.">Distinct cellular mechanisms of blood vessel fusion in the zebrafish embryo.</a> Curr Biol. 21 (22), 1942-1948 (2011).</li><li>Boselli, F., Steed, E., Freund, J., Vermot, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anisotropic+shear+stress+patterns+predict+the+orientation+of+convergent+tissue+movements+in+the+embryonic+heart.">Anisotropic shear stress patterns predict the orientation of convergent tissue movements in the embryonic heart.</a> Development. , (2017).</li><li>Lombardo, V. A., Sporbert, A., Abdelilah-Seyfried, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Tracking+Using+Photoconvertible+Proteins+During+Zebrafish+Development.">Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development.</a> J. Vis. Exp. (67), (2012).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biology II: Mouse, Zebrafish, and Chick. Zebrafish Breeding and Embryo Handling. , (2017).</li><li>Watanabe, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+effect+of+2,3-butanedione+monoxime+(BDM)+on+Na(+)/Ca(2+)+exchange+current+in+guinea-pig+cardiac+ventricular+myocytes.">Inhibitory effect of 2,3-butanedione monoxime (BDM) on Na(+)/Ca(2+) exchange current in guinea-pig cardiac ventricular myocytes.</a> Br J Pharmacol. 132 (6), 1317-1325 (2001).</li><li>Jou, C. J., Spitzer, K. W., Tristani-Firouzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blebbistatin+effectively+uncouples+the+excitation-contraction+process+in+zebrafish+embryonic+heart.">Blebbistatin effectively uncouples the excitation-contraction process in zebrafish embryonic heart.</a> Cell Physiol Biochem. 25 (4-5), 419-424 (2010).</li><li>Pestel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+3D+visualization+of+cellular+rearrangements+during+cardiac+valve+formation.">Real-time 3D visualization of cellular rearrangements during cardiac valve formation.</a> Development. 143 (12), 2217-2227 (2016).</li><li>Swinburne, I. A., Mosaliganti, K. R., Green, A. A., Megason, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Long-Term+Imaging+of+Embryos+with+Genetically+Encoded+alpha-Bungarotoxin.">Improved Long-Term Imaging of Embryos with Genetically Encoded alpha-Bungarotoxin.</a> PLoS One. 10 (8), e0134005 (2015).</li><li>Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilayer+mounting+enables+long-term+imaging+of+zebrafish+development+in+a+light+sheet+microscope.">Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope.</a> Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).</li><li>Marchant, J. S., Stutzmann, G. E., Leissring, M. A., LaFerla, F. M., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton-evoked+color+change+of+DsRed+as+an+optical+highlighter+for+cellular+and+subcellular+labeling.">Multiphoton-evoked color change of DsRed as an optical highlighter for cellular and subcellular labeling.</a> Nat Biotechnol. 19 (7), 645-649 (2001).</li><li>Dempsey, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+single-cell+labeling+by+confined+primed+conversion.">In vivo single-cell labeling by confined primed conversion.</a> Nat Methods. 12 (7), 645-648 (2015).</li><li>Mohr, M. A., Pantazis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+neuron+morphology+in+vivo+with+confined+primed+conversion.">Single neuron morphology in vivo with confined primed conversion.</a> Methods Cell Biol. 133, 125-138 (2016).</li><li>Mohr, M. A., Argast, P., Pantazis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+cellular+structures+in+vivo+using+confined+primed+conversion+of+photoconvertible+fluorescent+proteins.">Labeling cellular structures in vivo using confined primed conversion of photoconvertible fluorescent proteins.</a> Nat Protoc. 11 (12), 2419-2431 (2016).</li><li>Mohr, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+Engineering+of+Photoconvertible+Fluorescent+Proteins+for+Dual-Color+Fluorescence+Nanoscopy+Enabled+by+a+Triplet-State+Mechanism+of+Primed+Conversion.">Rational Engineering of Photoconvertible Fluorescent Proteins for Dual-Color Fluorescence Nanoscopy Enabled by a Triplet-State Mechanism of Primed Conversion.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 56 (38), 11628-11633 (2017).</li><li>Dempsey, W. P., Fraser, S. E., Pantazis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PhOTO+zebrafish:+a+transgenic+resource+for+in+vivo+lineage+tracing+during+development+and+regeneration.">PhOTO zebrafish: a transgenic resource for in vivo lineage tracing during development and regeneration.</a> PLoS One. 7 (3), e32888 (2012).</li><li>Dempsey, W. P., Qin, H., Pantazis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+cell+tracking+using+PhOTO+zebrafish.">In vivo cell tracking using PhOTO zebrafish.</a> Methods Mol Biol. 1148, 217-228 (2014).</li></ol>

وأعلن عدم تضارب المصالح.

توقيت فوتوكونفيرسيون: "كايد على الرغم من أن" يظل الزاهية المعرب عنها في EdCs حتى في 96 هبف، تجدر الإشارة إلى أنه مع نمو الجنين، ضوء الليزر ينشر المزيد قبل أن تصل إلى افك، يزيد من صعوبة فوتوكونفيرسيون المحصورة من كايد. الجنينية وفي مراحل يتجاوز 55 هبف، يعني تضخم في البطين والاذين أيضا أن شعا...

الزرد حاليا واحدة من أهم نماذج الفقاريات لدراسة العمليات الخلوية والإنمائية في فيفو. هذا إلى حد كبير بسبب الشفافية الضوئية الزرد وقابليتها لعلم الوراثة، مما يجعلها نموذجا قويا لتطبيق التقنيات البصرية التي تشمل وراثيا ترميز فوتوريسبونسيفي البروتين التكنولوجيات1. محددة لدراسة التطور القلب، الزرد تلقي الأوكسجين كافية عن طريق نشر أن طفرات حتى دون ضربات القلب يمكن البقاء على قيد الحياة من خلال الأسبوع الأول من التنمية، تسمح التحاليل على الآثار من جينات التنموية والقلق تدفق الدم في القلب morphogenesis ليس من الممكن في معظم الفقاريات2.
ويتكون أنبوب القلب الزرد خلال 24 ساعة بعد الإخصاب (hpf). بعد وقت قصير من تشكيلها، يبدأ أنبوب القلب الضرب بنشاط. 36 هبف، انقباض واضح يفصل الأتريوم من البطين. يتم استدعاء هذه المنطقة من انقباض قناة بي (افك)، والخلايا في هذا التغيير المنطقة من مورفولوجيا صدفية إلى مورفولوجيا cuboidal3. الزرد صمام بي morphogenesis يبدأ حوالي 48 ساعة بعد الإخصاب. قبل 5 أيام بعد الإخصاب، واثنين من منشورات صمام تمتد إلى افك ومنع عودة تدفق الدم من البطين إلى الاذين أثناء دورة القلب4. تعقب الخلايا أثناء تشكيل افك وصمام تتحدى الضرب السريع للقلب يجعل من الصعب متابعة الخلايا عن طريق الفحص المجهري التقليدي في الوقت الفاصل بين5،6. ويصف هذا البروتوكول، مقتبس من ستيد et al., 20167، أسلوب يستخدم تيراغرام (fli1a:gal4FFيو بي إس، UAS:kaede)8 الزرد المعدلة وراثيا الخط، الذي أعرب فيه عن البروتين فوتوكونفيرتيبلي كايد في خلايا بطانية، بما في ذلك في البطانة. المخدرات 2، 3-بوتانيديوني-2-مونوكسيمي (متخذي قرارات العمل) تستخدم لإيقاف مؤقتاً قلب الضرب، مما يسمح فوتوكونفيرسيون دقيقة ليشكل بين 36 و 55 هبف، وتصوير عالي الدقة من فوتوكونفيرتيد يشكل نقطة زمنية إنمائية محددة. لقد ثبت سابقا أن يشكل فوتوكونفيرتيد باستخدام هذا الأسلوب يمكن أن تبقى مميزة من جيرانهم غير محولة لمدة خمسة أيام أو أكثر بعد وقت فوتوكونفيرسيون7. هذا البروتوكول أيضا تفاصيل أسلوب يستخدم لتحليل الصور من فوتوكونفيرتيد يشكل في أجنة أصغر سنا من 48 هبف، التي استخدمت بنجاح متابعة تحركات الأنسجة خلال افك التنمية (بوسيلي et al.، في الصحافة)9. ونأمل أن القراء سوف تجد هذا البروتوكول مفيدة لدراسة التنمية افك وصمام في الأجنة العادية، وطفرات أو مورفانتس أو الأجنة المعالجة بالعقاقير. لبروتوكول أعم تتصل بخلية تتبع استخدام البروتينات فوتوكونفيرتيبلي أثناء تطوير الزرد، الرجاء عرض المقالة لومباردو et al.، 201210.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Necessary equipment for raising fish and collecting eggs (see the Zebrafish Book22 for details).</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright confocal microscope (Equipped with lasers operating at 488 nm, 561 nm, and 405 nm, a tunable multiphoton laser, and a Leica HCX IRAPO L, 25 &#215;, N.A. 0.95 objective)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica SP8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat block</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>88870001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm x 10 mm tissue culture dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mold</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8 mg/mL Tricaine stock solution&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M BDM stock solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure low melting point agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTU (1-phenyl-2-thiourea)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P7629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo medium: 30x stock solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab equipped with the Image Analysis, Curve Fitting, Bio-Formats Toolboxes</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8 mg/mL Tricaine stock solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 mg of tricaine powder (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonic acid)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Danieau</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adjust to pH 7, aliquot and store at -20 &#176;C&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M BDM stock solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 g BDM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>112135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL ddH2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aliquot and store at -20 &#176;C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo medium: 30x stock solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50.7 g NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.78 g KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7447-40-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.47 g Magnesium sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;7487-88-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.1 g Calcium nitrite tetrahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>13477-34-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>19.52 g HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7365-45-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adjust to pH 7.2 and store at room temperature</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mold</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PlasCLEAR resin</td>
			<td>Asiga</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plus 39&#160;Freeform Pico 3D printer</td>
			<td>Asiga</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

following endocardial tissue movements via cell photoconversion in the zebrafish embryo

أثناء امبريوجينيسيس، خلايا تغيرات دينامية في سلوك الخلية، وفك رموز الخلوية المنطق الكامن وراء هذه التغيرات هدف أساسي في مجال علم الأحياء التنموي. اكتشاف وتطوير فوتوكونفيرتيبلي البروتينات ساعدت إلى حد كبير فهمنا لهذه التغيرات الدينامية بتوفير أسلوب بصريا تسليط الضوء على الخلايا والأنسجة. ومع ذلك، بينما فوتوكونفيرسيون والوقت الفاصل بين الفحص المجهري، وتحليل الصور اللاحقة أثبتت أن تكون ناجحة جداً في الكشف عن ديناميات الخلوية في الأجهزة مثل الدماغ أو العين، هذا النهج لا يستخدم عادة في القلب النامية المستحقة التحديات التي تفرضها الحركة السريعة للقلب أثناء دورة القلب. يتألف هذا البروتوكول من جزأين. ويصف الجزء الأول أسلوب فوتوكونفيرتينج وبعد ذلك تتبع الخلايا للوفلر (EdCs) خلال قناة بي الزرد (افك) وتطوير صمام قلب بي. الأسلوب الذي ينطوي على وقتيا توقف القلب بدواء من أجل فوتوكونفيرسيون دقيقة تأخذ مكان. قلوب هي السماح باستئناف الضرب عند إزالة المخدرات والتنمية الجنينية يستمر عادة حتى يتم إيقاف القلب مرة أخرى لتصوير عالي الدقة من فوتوكونفيرتيد يشكل نقطة بعد ذلك وقت التنموية. ويصف الجزء الثاني من البروتوكول أسلوب تحليل صورة لقياس طول منطقة فوتوكونفيرتيد أو غير فوتوكونفيرتيد بافك في الأجنة الشباب عن طريق تعيين إشارة الفلورسنت من هيكل ثلاثي الأبعاد على مخطط ثنائي الأبعاد . معا، الجزأين من البروتوكول يسمح أحد لدراسة منشأ والسلوك من الخلايا التي تشكل الزرد افك وصمام القلب بي، ويمكن تطبيقها المحتمل لدراسة طفرات أو مورفانتس أو الأجنة التي قد تم التعامل مع الكواشف التي تعطل التنمية افك و/أو صمام.

مثال على فوتوكونفيرتيد الجنين في 48 هبف وتصويرها مرة أخرى في 80 هبف ويبين الشكل 2 وأفﻻم 1 و 2. تعريض كايد إلى 405 نانومتر الضوء لا رجعة فيه تحولوا من البروتين من شكله أخضر نيون للنموذج الأحمر نيون، تمكين سلوك الخلايا المسماة بالأخضر أو شكلها ?...

Watch this Scientific Journal Video about Following Endocardial Tissue Movements via Cell Photoconversion in the Zebrafish Embryo at JoVE.com

Following Endocardial Tissue Movements via Cell Photoconversion in the Zebrafish Embryo

هذا البروتوكول وصف أسلوب فوتوكونفيرسيون كايد الفلورسنت البروتين في الخلايا للوفلر المعيشة الجنين الزرد التي تمكن من تتبع الخلايا للوفلر خلال قناة بي وتطوير صمام قلب بي .

حركات للوفلر الأنسجة التالية عن طريق فوتوكونفيرسيون خلية في الجنين الزرد

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the ...

following-endocardial-tissue-movements-via-cell-photoconversion

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

6.4K Views.  Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire. هذا البروتوكول وصف أسلوب فوتوكونفيرسيون كايد الفلورسنت البروتين في الخلايا للوفلر المعيشة الجنين الزرد التي تمكن من تتبع الخلايا للوفلر خلال قناة بي وتطوير صمام قلب بي .

Video: Following Endocardial Tissue Movements via Cell Photoconversion in the Zebrafish Embryo

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological systems. In FDAP experiments, the clearance of proteins within living organisms can be measured. A protein of interest is tagged with a photoconvertible fluorescent protein, expressed in vivo and photoconverted, and the decrease in the photoconverted signal over time is monitored. The data is then fitted with an appropriate clearance model to determine the protein half-life. Importantly, the clearance kinetics of protein populations in different compartments of the organism can be examined separately by applying compartmental masks. This approach has been used to determine the intra- and extracellular half-lives of secreted signaling proteins during zebrafish development. Here, we describe a protocol for FDAP experiments in zebrafish embryos. It should be possible to use FDAP to determine the clearance kinetics of any taggable protein in any optically accessible organism.

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP

Protein levels in cells and tissues are often tightly regulated by the balance of protein production and clearance. Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP), the clearance kinetics of proteins can be experimentally measured in vivo.

قياس الاستقرار البروتين المتواجد في الحي اسماك الزرد الأجنة عن طريق الإسفار تسوس بعد Photoconversion (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological ...

Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic conservation, as well as similarities in cellular, molecular, and physiological processes, with other vertebrates including humans. During early ontogeny, zebrafish embryos are optically transparent, allowing researchers to visualize the dynamics of organogenesis using a simple stereomicroscope. Microbead implantation is a method that enables tissue manipulation through the alteration of factors in local environments. This allows researchers to assay the effects of any number of signaling molecules of interest, such as secreted peptides, at specific spatial and temporal points within the developing embryo. Here, we detail a protocol for how to manipulate and implant beads during early zebrafish development.

The zebrafish is an excellent model system for genetic and developmental studies. Bead implantation is a valuable tissue manipulation technique that can be used to interrogate developmental mechanisms by introducing alterations in local cellular environments. This protocol describes how to perform microbead implantation in the zebrafish embryo.

Microbead زرع الأجنة الزرد

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

التصوير الهياكل التحت خلوية في الأجنة الحية اسماك الزرد

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin condensation, microtubule-kinetochore attachment, chromosome segregation, and cytokinesis in a small time frame. Errors in the delicate process can result in human disease, including birth defects and cancer. Traditional approaches investigating human mitotic disease states often rely on cell culture systems, which lack the natural physiology and developmental/tissue-specific context advantageous when studying human disease. This protocol overcomes many obstacles by providing a way to visualize, with high resolution, chromosome dynamics in a vertebrate system, the zebrafish. This protocol will detail an approach that can be used to obtain dynamic images of dividing cells, which include: in vitro transcription, zebrafish breeding/collecting, embryo embedding, and time-lapse imaging. Optimization and modifications of this protocol are also explored. Using H2A.F/Z-EGFP (labels chromatin) and mCherry-CAAX (labels cell membrane) mRNA-injected embryos, mitosis in AB wild-type, auroraBhi1045, and esco2hi2865 mutant zebrafish is visualized. High resolution live imaging in zebrafish allows one to observe multiple mitoses to statistically quantify mitotic defects and timing of mitotic progression. In addition, observation of qualitative aspects that define improper mitotic processes (i.e., congression defects, missegregation of chromosomes, etc.) and improper chromosomal outcomes (i.e., aneuploidy, polyploidy, micronuclei, etc.) are observed. This assay can be applied to the observation of tissue differentiation/development and is amenable to the use of mutant zebrafish and pharmacological agents. Visualization of how defects in mitosis lead to cancer and developmental disorders will greatly enhance understanding of the pathogenesis of disease.

Mitosis is critical to every living organism and defects often lead to cancer and developmental disorders. Using this imaging protocol and zebrafish as a model system, researchers can visualize mitosis in a live vertebrate organism and the multitude of defects that arise when mitotic processes are defective.

مراقبة قسم الميتوزى وديناميكية في الأجنة الزرد لايف

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin ...

Visualizing the Interrenal Steroidogenic Tissue and Its Vascular Microenvironment in Zebrafish

This protocol introduces how to detect differentiated interrenal steroidogenic cells through a simple whole-mount enzymatic activity assay. Identifying differentiated steroidogenic tissues through chromogenic histochemical staining of 3-&#946;-Hydroxysteroid dehydrogenase /&#916;5-4 isomerase (3&#946;-Hsd) activity-positive cells is critical for monitoring the morphology and differentiation of adrenocortical and interrenal tissues in mammals and teleosts, respectively. In the zebrafish model, the optical transparency and tissue permeability of the developing embryos and larvae allow for whole-mount staining of 3&#946;-Hsd activity. This staining protocol, as performed on transgenic fluorescent reporter lines marking the developing pronephric and endothelial cells, enables the detection of the steroidogenic interrenal tissue in addition to the kidney and neighboring vasculature. In combination with vibratome sectioning, immunohistochemistry, and confocal microscopy, we can visualize and assay the vascular microenvironment of interrenal steroidogenic tissues. The 3&#946;-Hsd activity assay is essential for studying the cell biology of the zebrafish interrenal gland because to date, no suitable antibody is available for labeling zebrafish steroidogenic cells. Furthermore, this assay is rapid and simple, thus providing a powerful tool for mutant screens targeting adrenal (interrenal) genetic disorders as well as for determining disruption effects of chemicals on steroidogenesis in pharmaceutical or toxicological studies.

The interrenal gland in zebrafish is the teleostean counterpart of the mammalian adrenal gland. This protocol introduces how to perform the 3-&#946;-hydroxysteroid dehydrogenase (&#916;5-4 isomerase; 3&#946;-Hsd) enzymatic activity assay, which detects differentiated steroidogenic cells in the developing zebrafish.

تصور الأنسجة البين الستيرويدي المنشأ ولها المكروية الأوعية الدموية في الزرد

This protocol introduces how to detect differentiated interrenal steroidogenic cells through a simple whole-mount enzymatic activity assay. Identifying ...

Use of Immunolabeling to Analyze Stable, Dynamic, and Nascent Microtubules in the Zebrafish Embryo

Microtubules (MTs) are dynamic and fragile structures that are challenging to image in vivo, particularly in vertebrate embryos. Immunolabeling methods are described here to analyze distinct populations of MTs in the developing neural tube of the zebrafish embryo. While the focus is on neural tissue, this methodology is broadly applicable to other tissues. The procedures are optimized for early to mid-somitogenesis-stage embryos (1 somite to 12 somites), however they can be adapted to a range of other stages with relatively minor adjustments. The first protocol provides a method to assess the spatial distribution of stable and dynamic MTs and perform a quantitative analysis of these populations with image-processing software. This approach complements existing tools to image microtubule dynamics and distribution in real-time, using transgenic lines or transient expression of tagged constructs. Indeed, such tools are very useful, however they do not readily distinguish between dynamic and stable MTs. The ability to image and analyze these distinct microtubule populations has important implications for understanding mechanisms underlying cell polarization and morphogenesis. The second protocol outlines a technique to analyze nascent MTs specifically. This is accomplished by capturing the de novo growth properties of MTs over time, following microtubule depolymerization with the drug nocodazole and a recovery period after drug washout. This technique has not yet been applied to the study of MTs in zebrafish embryos, but is a valuable assay for investigating the in vivo function of proteins implicated in microtubule assembly.

Immunolabeling methods to analyze distinct populations of microtubules in the developing zebrafish brain are described here, which are broadly applicable to other tissues. The first protocol outlines an optimized method for immunolabeling stable and dynamic microtubules. The second protocol provides a method to image and quantify nascent microtubules specifically.

استخدام إيمونولابيلينج لتحليل Microtubules مستقرة ودينامية، والوليدة في الجنين الزرد

Microtubules (MTs) are dynamic and fragile structures that are challenging to image in vivo, particularly in vertebrate embryos. Immunolabeling methods ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

تصوير لايف من ماوس الثانوي باليت فيوجن

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. Various propositions claim to have been important contributions to the understanding of the mechanical properties of cells and tissues in their spatiotemporal organization in different developmental and morphogenetic processes. However, due to the lack of reliable and accessible tools to measure material properties and tensional parameters in vivo, validating these hypotheses has been difficult. Here we present methods employing atomic force microscopy (AFM) and particle tracking with the aim of quantifying the mechanical properties of the intact zebrafish embryo yolk cell during epiboly. Epiboly is an early conserved developmental process whose study is facilitated by the transparency of the embryo. These methods are simple to implement, reliable, and widely applicable since they overcome intrusive interventions that could affect tissue mechanics. A simple strategy was applied for the mounting of specimens, AFM recording, and nanoparticle injections and tracking. This approach makes these methods easily adaptable to other developmental times or organisms.

The lack of tools to measure material properties and tensional parameters in vivo prevents validating their roles during development. We employed atomic force microscopy (AFM) and nanoparticle-tracking to quantify mechanical features on the intact zebrafish embryo yolk cell during epiboly. These methods are reliable and widely applicable avoiding intrusive interventions.

فؤاد وميكرورهيولوجي في الخلية صفار الجنين الزرد

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause disease when disrupted. Scientists have developed clever techniques to investigate characteristics and natural dynamics of these cells within intact tissue by expressing fluorescent proteins in subsets of cells. However, at times, experiments require more selected visualization of cells within the tissue, sometimes at the single-cell or population-of-cells manner. To achieve this and visualize single cells within a population of cells, scientists have utilized single-cell photoconversion of fluorescent proteins. To demonstrate this technique, we show here how to direct UV light to an Eos-expressing cell of interest in an intact, living zebrafish. We then image those photoconverted Eos+ cells 24 h later to determine how they changed in the tissue. We describe two techniques: single cell photoconversion and photoconversions of populations of cell. These techniques can be used to visualize cell-cell interactions, cell-fate and differentiation, and cell migrations, making it a technique that is applicable in numerous biological questions.

Here, we present a protocol to show how cell photoconversion is achieved through UV exposure to specific areas expressing the fluorescent protein, Eos, in living animals.

فوتوكونفيرسيون خلية واحدة في معيشة سليمة الزرد

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

Morphogenesis requires coordination between genetic patterning and mechanical forces to robustly shape the cells and tissues. Hence, a challenge to understand morphogenetic processes is to directly measure cellular forces and mechanical properties in vivo during embryogenesis. Here, we present a setup of optical tweezers coupled to a light sheet microscope, which allows to directly apply forces on cell-cell contacts of the early Drosophila embryo, while imaging at a speed of several frames per second. This technique has the advantage that it does not require the injection of beads into the embryo, usually used as intermediate probes on which optical forces are exerted. We detail step by step the implementation of the setup, and propose tools to extract mechanical information from the experiments. By monitoring the displacements of cell-cell contacts in real time, one can perform tension measurements and investigate cell contacts&#39; rheology.

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

We present a setup of optical tweezers coupled to a light sheet microscope, and its implementation to probe cell mechanics without beads in the Drosophila embryo.

ميكانيكا خلية السبر مع ملاقط خالية من حبة الضوئية في الجنين المورفولوجية

Morphogenesis requires coordination between genetic patterning and mechanical forces to robustly shape the cells and tissues. Hence, a challenge to ...