Vorremmo ringraziare Anne-Laure Duchemin, Denise Duchemin, Nathalie Faggianelli e Basile Gurchenkov per aiutare a progettare e realizzare lo stampo descritto nel presente protocollo. Questo lavoro è stato supportato da FRM (DEQ20140329553), l'ANR (ANR-15-CE13-0015-01, ANR-12-ISV2-0001-01), il programma di EMBO Young Investigator, la Comunità europea, ERC CoG N ° 682938 Evalve e dalla concessione ANR-10-LABX-0030-INRT, un fondo di stato francese gestito da Agence Nationale de la Recherche sotto il telaio programma Investissements d'Avenir etichettato ANR-10-IDEX-0002-02.

1. preparazione di stampi e montaggio dell'agarosi
<ol><li>Creare uno stampo con le dimensioni riportate in Figura 1 utilizzando una stampante 3D o strumenti di officina meccanica tradizionale.</li>
	<li>Pipettare circa 1,5 mL di agarosio all'1% fuso in un piatto di montaggio in plastica 35 mm. Posizionare lo stampo plastica in agarosio liquido, avendo cura di evitare di inglobare aria tra lo stampo e l'agarosio. Posizionare il piatto a 4 ° C, aspetta che indurisce l'agarosio (l'operazione dura circa 5 minuti), quindi rimuovere la muffa di plastica.</li>
	<li>Per memorizzare il piatto di montaggio per un uso successivo, coprire il piatto con il suo coperchio, quindi avvolgere il piatto sia il coperchio ermeticamente con parafilm. Il piatto di montaggio possa quindi essere archiviato lato coperchio rivolto verso il basso fino a 5 giorni a 4 ° C.</li>
	<li>Preparare in anticipo le aliquote di 1ml di 0,7% basso punto di fusione dell'agarosi in 1,5 mL provette Eppendorf da utilizzare il giorno del montaggio. Nota: I pozzi dell'agarosi del piatto montaggio si deformano nel tempo come acqua evapora se parafilm non si avvolge strettamente attorno i piatti.</li>
</ol>2. ottenimento di embrioni per la fotoconversione
<ol><li>Zione il Tg (fli1a:gal4FFubs, UAS:kaede) linea e crescere di circa 200 embrioni nel mezzo di embrione al buio a 28,5 ° C. Per maggiori dettagli su come attraversare linee di zebrafish, consultare il Giove Science Education Database11.</li>
	<li>Dopo 5 h ma prima 24h, trattare gli embrioni con 1-fenil-2-tiourea (PTU) per prevenire la formazione di pigmento (0,003% PTU nel mezzo di embrione).</li>
	<li>Circa 1 h prima dell'inizio di fotoconversione, embrioni di schermo sotto uno stereoscopio fluorescente e selezionare 5 embrioni sani che sembrano esprimere la fluorescenza verde più brillante. Luce a bassa intensità quando visualizzare gli embrioni si consiglia di evitare l'esposizione degli embrioni alla luce ambientale al fine di evitare photoconverting Kaede in cellule aspecifiche.</li>
</ol>3. incorporare
<ol><li>Preparare 10 mL di supporti di montaggio: 0,02% tricaina e 50mm BDM nel mezzo di embrione.</li>
	<li>Aggiungere 2 mL di mezzo di montaggio al montaggio piatto e consentire 15-30 min per la soluzione di diffondere in agarosio.</li>
	<li>Nel frattempo, sciogliere un'aliquota di 1 mL di 0,7% basso punto di fusione (LMP) agarosio inserendo il tubo in un blocco di calore 70 ° C per circa 5 min.<ol>
<li>Attendere l'agarosio LMP raffreddare leggermente, quindi aggiungere 25 µ l di soluzione di tricaina 8 mg/mL e 40 µ l di soluzione 1M BDM al tubo del basso punto di fusione dell'agarosi. Mix pipettando su e giù, quindi trasferire il filmato a un blocco di calore di 38 ° C per mantenere l'agarosio LMP allo stato liquido.</li>
	</ol>
</li>
	<li>In un Petri dish con il mezzo di embrione, attentamente dechorionate gli embrioni pre-selezionati sotto lo stereomicroscopio usando il forcipe, avendo cura di non per danneggiare gli embrioni.</li>
	<li>Trasferire gli embrioni per un piatto separato contenente 2 mL di supporti di montaggio.<ol>
<li>Quando vengono interrotti i cuori degli embrioni (dura circa 5-10 min), trasferimento degli embrioni per il montaggio piatto e organizzare gli embrioni nei pozzetti utilizzando pinze, in modo che essi si trovano ad un angolo di 25 gradi, coda rivolta verso la parte più profonda del pozzo, tuorlo rivolto verso l'alto.</li>
		<li>Quando gli embrioni sono all'incirca in luogo, rimuovere il supporto, incorporare gli embrioni in ~ 200 µ l del 0,7% LMP agarosio contenente tricaina e BDM e riadattare le posizioni degli embrioni, inclinando gli embrioni a sinistra o a destra se necessario.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Attendere fino a quando i set di agarosio LMP (dura circa 5 minuti), quindi aggiungere mezzo di montaggio al piatto. Gli embrioni sono ora pronti per essere photoconverted. Nota: La tricaina e BDM sono usati per anestetizzare gli embrioni e per fermare il cuore degli embrioni, rispettivamente. Mezzi di montaggio possono essere preparata il giorno prima di formazione immagine, ma assicuratevi di proteggere il supporto dalla luce. Nota: Il corretto posizionamento degli embrioni è importante per consentire un percorso chiaro laser alle cellule si vuole fotoconvertita. Posizionare la testa dell'embrione vicino all'inizio del pozzo in modo che la luce laser non è necessario andare lontano per raggiungere l'embrione, e affinché gli embrioni possono essere facilmente smontati dopo fotoconversione.</li>
</ol>4. fotoconversione
<ol><li>Un microscopio confocale in posizione verticale (come Leica SP8) equipaggiato con un 405 nm, 488 nm e sorgente 561 nm, individuare l'embrione di cuore utilizzando trasmesso luce bianca (campo chiaro) e una lente obiettiva (come Leica HCX IRAPO L, 25 ×, N.A. 0.95 obiettivo). Verifica per fluorescenza rossa di Kaede utilizzando il 561 nm laser (cioè, laser DPSS 561, al ~ 5% di intensità, rivelatore a 589-728 nm). Quindi, è possibile visualizzare l'endocardio utilizzando laser 488 nm (cioè, 30 mW laser di Argon su più righe a ~ 5% intensità, rivelatore a 502-556 nm).</li>
	<li>Entrare in modalità "FRAP" del software di acquisizione di microscopio. Selezionare la potenza del laser ~ 1% per entrambi 488 nm e 561 nm laser.</li>
	<li>Concentrarsi sul piano di interesse, selezionare una regione di interesse (ROI), poi fotoconvertita cellule usando il diodo 405 nm laser a potenza laser 25%, tre tempi di scansione sopra il ROI. Kaede insufficiente va photoconverted nel ROI, scansione laser 405 nm sopra la zona tre volte ancora. Ripetere questo passaggio per tutti i ROIs.</li>
	<li>Tornare alla modalità "TCS SP8" sul software e acquisire un z-stack, utilizzando il 561 nm e 488 nm laser in sequenza. Assicurarsi di selezionare l'opzione 'bidirectional' per aumentare la velocità di formazione immagine. Nota: Quanto tempo ci vuole per fotoconvertita e immagine che ogni embrione varia. Battito cardiaco è conosciuto per essere importante per lo sviluppo di valvola del cuore normale, quindi evitare di tenere il cuore si è fermato per più di 30 min, anche se questo significa che non hai tempo per fotoconvertita 5 tutti gli embrioni. Nota: Durante il processo di fotoconversione, uso PMT rivelatori, mentre dopo fotoconversione, si consiglia di utilizzare rilevatori di ibrido impostati su modalità di conteggio. Infatti, i rivelatori di ibridi sono più sensibili e sono in grado di produrre immagini di qualità migliore, ma possono essere facilmente danneggiati da sovresposizione.</li>
</ol>5. Smontare gli embrioni photoconverted
<ol><li>Dopo fotoconversione, utilizzare una pipetta di vetro premere verso il basso leggermente appena sopra la testa dell'embrione per rompere l'agarosio LMP, quindi aspirare delicatamente l'embrione.<ol>
<li>Espellere l'embrione dalla pipetta di vetro in una capsula Petri 35 mm contenente mezzo di embrione con PTU (per lavare via BDM contenente mezzo).</li>
		<li>Trasferimento dell'embrione in un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti contenenti embrioni mezzo con PTU. Durante questo passaggio, assicurarsi di tenere nota di quali embrione entra in che bene, come questo è essenziale per correlare la posizione delle cellule photoconverted alle versioni successive fasi di sviluppo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ora che gli embrioni vengono rimossi dal mezzo contenente BDM, loro cuori dovrebbero iniziare a battere nuovamente in circa 5 min ritorno embrioni al buio a 28,5 ° C per permettere embrioni continuare a svilupparsi normalmente.</li>
</ol>6. imaging photoconverted cellule al più tardi stadi embrionali
<ol><li>Nella fase desiderata, fermare il cuore e ri-incorporare gli embrioni come sotto punto 3 del presente protocollo, con l'importante differenza che gli embrioni devono essere trattati con BDM in piatti separati, contrassegnati per tenere traccia di embrioni.</li>
	<li>Per gli embrioni fino a 62 hpf, acquisire z-stack dell'endocardio utilizzando 561 nm e 488 nm per rosso e verde fluorescente segnali, rispettivamente. Per embrioni a livelli oltre 62 anni hpf, utilizzare un multifotonica laser insieme a 940 nm all'immagine verde Kaede invece il laser 488 nm.</li>
</ol>7. image analysis per embrioni sotto il 48 hpf
Nota: I movimenti del tessuto dell'AVC possono essere difficili da analizzare grazie alla sua struttura tridimensionale complessa. Per quantificare la lunghezza di una regione di photoconverted in AVC tra due regioni di non-photoconverted o la lunghezza di una regione di non-photoconverted in AVC tra due regioni di photoconverted, può essere desiderabile per mappare la struttura tridimensionale su un mappa bidimensionale. Immagini di photoconverted embrioni ottenuti prima del 48 hpf possono essere analizzati usando il seguente metodo.
<ol><li>Importare le immagini acquisite in Matlab o software simili.</li>
	<li>Delimitare manualmente il ROI, cioè l'endocardio e applicare una maschera per rimuovere il segnale fuori di questa regione.</li>
	<li>Applicare una soglia di intensità sull'immagine per individuare i punti sull'endocardio e tracciarle in tre dimensioni. Isolare i punti corrispondenti alla parte più stretta e più dritta di AVC, cancellando manualmente i punti di nessun interesse sull'atrio ed il ventricolo utilizzando il comando Cancella nel software.</li>
	<li>Utilizzare un cilindro per adattare i punti che rappresentano l'AVC così ottenuto.</li>
	<li>Definire un sistema di riferimento per confrontare diversi campioni. Ad esempio, è possibile adottare il centro di massa dei punti AVC come l'origine del sistema di riferimento e l'asse del cilindro montato come l'asse z.<ol>
<li>Assicurarsi che il positivi z-posizioni corrispondono sempre sullo stesso lato del cuore (ventricolare o atriale).</li>
		<li>Proiettare i punti AVC sul piano x-y e utilizzare un'ellisse per farli stare.</li>
		<li>Ruotare i punti endocardial intorno all'asse z in modo che l'asse maggiore dell'ellisse e l'asse y del sistema di riferimento sono paralleli e y-valori positivi corrispondono al lato interno dell'AVC per quanto riguarda l'embrione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Per segmentare l'AVC, tagliare il dataset tridimensionale con alcuni aerei ottenuti ruotando il semipiano {y = 0, x > 0} in direzione z.<ol>
<li>L'intensità dei pixel adiacenti del progetto su questi aerei e definire l'endotelio in modo coerente. Ad esempio, disegnare manualmente una linea da atriale al lato ventricolare dell'AVC a metà dello spessore dell'endotelio.</li>
		<li>Interpola i punti delle linee che rappresentano l'endotelio con una spline tridimensionale utilizzando la casella degli strumenti spline per rappresentare l'AVC con una superficie. Nota: Il numero dei piani di taglio determina sia l'accuratezza della segmentazione e il consumo di tempo di questo passaggio. Di solito, 8 aerei sono sufficienti per ottenere buoni risultati.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Definire la posizione azimutale di ogni punto sulla superficie AVC utilizzando coordinate cilindriche.<ol>
<li>Ad ogni posizione azimutale è possibile definire una curva parametrica lungo la superficie dell'AVC calcolando la lunghezza dell'arco sulla superficie tra punti consecutivi.</li>
		<li>Per ogni curva parametrica, definire il punto sulla curva più vicina al centro di AVC a zero. I punti dell'AVC sono così completamente descritto dalla loro posizione azimutale e loro posizione sulla curva parametrica.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Spiegare l'AVC in un'immagine bidimensionale utilizzando la posizione parametrica dei punti.</li>
	<li>Trovare i bordi dell'area da quantificare come i bordi della soglia di immagine binaria il rapporto tra le intensità dei photoconverted e i canali non-photoconverted. Se necessario, correggere manualmente il risultato.</li>
	<li>Calcolare la lunghezza dell'arco tra i bordi per calcolare la lunghezza del tessuto in funzione della posizione azimutale.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Chow, R. W., Vermot, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rise+of+photoresponsive+protein+technologies+applications+in+vivo:+a+spotlight+on+zebrafish+developmental+and+cell+biology.">The rise of photoresponsive protein technologies applications in vivo: a spotlight on zebrafish developmental and cell biology.</a> F1000Res. 6, (2017).</li><li>Sehnert, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+troponin+T+is+essential+in+sarcomere+assembly+and+cardiac+contractility.">Cardiac troponin T is essential in sarcomere assembly and cardiac contractility.</a> Nat Genet. 31, 106-110 (2002).</li><li>Peal, D. S., Lynch, S. N., Milan, D. 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A., Pantazis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+neuron+morphology+in+vivo+with+confined+primed+conversion.">Single neuron morphology in vivo with confined primed conversion.</a> Methods Cell Biol. 133, 125-138 (2016).</li><li>Mohr, M. A., Argast, P., Pantazis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+cellular+structures+in+vivo+using+confined+primed+conversion+of+photoconvertible+fluorescent+proteins.">Labeling cellular structures in vivo using confined primed conversion of photoconvertible fluorescent proteins.</a> Nat Protoc. 11 (12), 2419-2431 (2016).</li><li>Mohr, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+Engineering+of+Photoconvertible+Fluorescent+Proteins+for+Dual-Color+Fluorescence+Nanoscopy+Enabled+by+a+Triplet-State+Mechanism+of+Primed+Conversion.">Rational Engineering of Photoconvertible Fluorescent Proteins for Dual-Color Fluorescence Nanoscopy Enabled by a Triplet-State Mechanism of Primed Conversion.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 56 (38), 11628-11633 (2017).</li><li>Dempsey, W. P., Fraser, S. E., Pantazis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PhOTO+zebrafish:+a+transgenic+resource+for+in+vivo+lineage+tracing+during+development+and+regeneration.">PhOTO zebrafish: a transgenic resource for in vivo lineage tracing during development and regeneration.</a> PLoS One. 7 (3), e32888 (2012).</li><li>Dempsey, W. 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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Temporizzazione di fotoconversione: Kaede anche se rimane brillantemente espressa in EdCs anche a 96 hpf, va notato che l'embrione cresce, luce laser diffonde più prima che raggiunga l'AVC, rendendo più difficile la fotoconversione ristretti di Kaede. At embrionale fasi oltre 55 hpf, la mongolfiera del ventricolo e l'atrio significa anche che il raggio laser viola utilizzato per fotoconversione non può raggiungere le cellule AVC senza passare per l'atrio o ventricolo. Ciò significa che oltre 55 hpf, al fine ...

Zebrafish è attualmente uno dei più importanti modelli vertebrati per studiare i processi cellulari e dello sviluppo in vivo. Ciò è in gran parte dovuto trasparenza ottica di zebrafish e disponibilità allo studio della genetica, che lo rende un potente modello per l'applicazione di tecniche ottiche che coinvolgono geneticamente codificato fotoresponsivi proteina tecnologie1. Specifico per lo studio dello sviluppo del cuore, zebrafish ricevere sufficiente ossigeno tramite diffusione tale che persino mutanti senza battito cardiaco possono sopravvivere attraverso la prima settimana di sviluppo, permettendo analisi sugli effetti dei geni dello sviluppo e perturbato flusso sanguigno sulla morfogenesi del cuore non è possibile nella maggior parte dei vertebrati2.
Il tubo di cuore di zebrafish è formato da 24 ore post fertilizzazione (hpf). Poco dopo la sua formazione, il tubo di cuore inizia a battere attivamente. Da 36 hpf, una costrizione chiara separa l'atrio dal ventricolo. Questa regione di costrizione è chiamata il canale atrioventricolare (AVC) e cellule in questo cambiamento di regione da una morfologia squamosa a morfologia cuboidali3. Inizia di zebrafish valvola atrioventricolare morfogenesi circa 48 h post fertilizzazione. Da 5 giorni post fecondazione, due opuscoli della valvola estendono l'AVC e impediscono il riflusso del sangue dal ventricolo all'atrio durante il ciclo cardiaco4. Rilevamento delle cellule durante la formazione AVC e valvola è impegnativo come il rapido battito del cuore, rende difficile seguire le cellule tramite microscopia time-lapse tradizionale5,6. Questo protocollo, adattato da Steed et al., 20167, descrive un metodo che utilizza la linea transgenica Tg (fli1a:gal4FFubs, UAS:kaede)8 zebrafish, in cui la proteina fotoconvertibile Kaede è espressa in cellule endoteliali, tra cui l'endocardio. La droga 2,3-butanedione-2-monoxime (BDM) viene utilizzato per interrompere temporaneamente il cuore battere, permettendo fotoconversione accurata di EdCs tra 36 e 55 hpf e imaging ad alta risoluzione di photoconverted EdCs intervalli di tempo inerente allo sviluppo specifico. Precedentemente è stato indicato che photoconverted di EdCs utilizzando questo metodo può rimanere distinguibili dai loro vicini non convertiti per cinque giorni o più dopo il tempo di fotoconversione7. Questo protocollo anche i dettagli di un metodo utilizzato per l'analisi di immagine di photoconverted CDE in embrioni più giovani di 48 hpf, che è stato usato con successo per seguire i movimenti dei tessuti durante lo sviluppo AVC (Boselli et al., in stampa)9. Speriamo che i lettori sarebbero trovare questo protocollo utile per lo studio di sviluppo AVC e valvola in embrioni normali e mutanti, morphants o embrioni droga trattato. Per un protocollo più generale relative al rilevamento delle cellule mediante fotoconvertibile proteine durante lo sviluppo di zebrafish, vedere l'articolo di Lombardo et al., 201210.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Necessary equipment for raising fish and collecting eggs (see the Zebrafish Book22 for details).</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright confocal microscope (Equipped with lasers operating at 488 nm, 561 nm, and 405 nm, a tunable multiphoton laser, and a Leica HCX IRAPO L, 25 &#215;, N.A. 0.95 objective)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica SP8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat block</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>88870001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm x 10 mm tissue culture dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mold</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8 mg/mL Tricaine stock solution&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M BDM stock solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure low melting point agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTU (1-phenyl-2-thiourea)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P7629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo medium: 30x stock solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab equipped with the Image Analysis, Curve Fitting, Bio-Formats Toolboxes</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8 mg/mL Tricaine stock solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 mg of tricaine powder (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonic acid)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Danieau</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adjust to pH 7, aliquot and store at -20 &#176;C&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M BDM stock solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 g BDM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>112135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL ddH2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aliquot and store at -20 &#176;C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo medium: 30x stock solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50.7 g NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.78 g KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7447-40-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.47 g Magnesium sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;7487-88-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.1 g Calcium nitrite tetrahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>13477-34-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>19.52 g HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7365-45-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adjust to pH 7.2 and store at room temperature</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mold</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PlasCLEAR resin</td>
			<td>Asiga</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plus 39&#160;Freeform Pico 3D printer</td>
			<td>Asiga</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

following endocardial tissue movements via cell photoconversion in the zebrafish embryo

Durante l'embriogenesi, le cellule subiscono cambiamenti dinamici nel comportamento delle cellule e decifrare la logica cellulare dietro a questi cambiamenti è un obiettivo fondamentale nel campo della biologia dello sviluppo. La scoperta e lo sviluppo di proteine di fotoconvertibile hanno aiutato la nostra comprensione di questi cambiamenti dinamici fornendo un metodo per evidenziare otticamente cellule e tessuti. Tuttavia, mentre fotoconversione, time-lapse microscopia e analisi delle immagini successive hanno dimostrato di essere molto successo nel scoprire dinamica cellulare in organi come il cervello o l'occhio, questo approccio è generalmente non utilizzato nel cuore in via di sviluppo a causa sfide posate dal movimento rapido del cuore durante il ciclo cardiaco. Questo protocollo è costituito da due parti. La prima parte descrive un metodo per photoconverting e successivamente tracking endocardial cellule (EdCs) durante lo sviluppo di valvola atrioventricolare del cuore e zebrafish canale atrioventricolare (AVC). Il metodo prevede di fermare temporaneamente il cuore con un farmaco in ordine per fotoconversione accurata a prendere posto. I cuori sono permesso di riprendere pestaggio dopo l'estrazione della droga e lo sviluppo embrionale prosegue normalmente fino a quando il cuore è fermato di nuovo per l'imaging ad alta risoluzione di photoconverted CDE in un momento dello sviluppo più tardi. La seconda parte del protocollo descrive un metodo di analisi di immagine per quantificare la lunghezza di una regione photoconverted o non photoconverted in AVC in giovani embrioni mappando il segnale fluorescente dalla struttura tridimensionale su una mappa bidimensionale . Insieme, le due parti del protocollo permette di esaminare l'origine e il comportamento delle cellule che compongono il zebrafish AVC e valvola cardiaca atrioventricolare e potenzialmente può essere applicato per lo studio di mutanti, morphants o embrioni che sono stati trattati con reagenti che interrompono lo sviluppo AVC e/o la valvola.

Un esempio di un embrione photoconverted 48 hpf e ripreso nuovamente a 80 hpf è illustrato nella Figura 2, film 1 e 2. Esponendo Kaede a 405 nm luce irreversibilmente converte dalla proteina dalla sua forma verde fluorescente fluorescente rosso forma, consentendo il comportamento delle cellule identificate con il verde o loro forma rosso da seguire con rispettano alla loro differenzialmente colorata vicini di casa durante la...

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Following Endocardial Tissue Movements via Cell Photoconversion in the Zebrafish Embryo

Questo protocollo descrive un metodo per fotoconversione di Kaede proteina fluorescente in cellule endocardial del vivente degli embrioni di zebrafish che consente il tracciamento delle cellule endocardial durante lo sviluppo di valvola atrioventricolare del cuore e del canale atrioventricolare .

Seguendo i movimenti del tessuto Endocardial tramite cella fotoconversione nell'embrione di pesce zebra

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

6.4K Views.  Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire. Questo protocollo descrive un metodo per fotoconversione di Kaede proteina fluorescente in cellule endocardial del vivente degli embrioni di zebrafish che consente il tracciamento delle cellule endocardial durante lo sviluppo di valvola atrioventricolare del cuore e del canale atrioventricolare .

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Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological systems. In FDAP experiments, the clearance of proteins within living organisms can be measured. A protein of interest is tagged with a photoconvertible fluorescent protein, expressed in vivo and photoconverted, and the decrease in the photoconverted signal over time is monitored. The data is then fitted with an appropriate clearance model to determine the protein half-life. Importantly, the clearance kinetics of protein populations in different compartments of the organism can be examined separately by applying compartmental masks. This approach has been used to determine the intra- and extracellular half-lives of secreted signaling proteins during zebrafish development. Here, we describe a protocol for FDAP experiments in zebrafish embryos. It should be possible to use FDAP to determine the clearance kinetics of any taggable protein in any optically accessible organism.

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP

Protein levels in cells and tissues are often tightly regulated by the balance of protein production and clearance. Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP), the clearance kinetics of proteins can be experimentally measured in vivo.

Misurare Protein Stabilità in Living embrioni di zebrafish Usando fluorescenza Decay Dopo Fotoconversione (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic conservation, as well as similarities in cellular, molecular, and physiological processes, with other vertebrates including humans. During early ontogeny, zebrafish embryos are optically transparent, allowing researchers to visualize the dynamics of organogenesis using a simple stereomicroscope. Microbead implantation is a method that enables tissue manipulation through the alteration of factors in local environments. This allows researchers to assay the effects of any number of signaling molecules of interest, such as secreted peptides, at specific spatial and temporal points within the developing embryo. Here, we detail a protocol for how to manipulate and implant beads during early zebrafish development.

The zebrafish is an excellent model system for genetic and developmental studies. Bead implantation is a valuable tissue manipulation technique that can be used to interrogate developmental mechanisms by introducing alterations in local cellular environments. This protocol describes how to perform microbead implantation in the zebrafish embryo.

Microperla impianto nel zebrafish

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

Imaging strutture subcellulari nell&#39;embrione Living Zebrafish

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin condensation, microtubule-kinetochore attachment, chromosome segregation, and cytokinesis in a small time frame. Errors in the delicate process can result in human disease, including birth defects and cancer. Traditional approaches investigating human mitotic disease states often rely on cell culture systems, which lack the natural physiology and developmental/tissue-specific context advantageous when studying human disease. This protocol overcomes many obstacles by providing a way to visualize, with high resolution, chromosome dynamics in a vertebrate system, the zebrafish. This protocol will detail an approach that can be used to obtain dynamic images of dividing cells, which include: in vitro transcription, zebrafish breeding/collecting, embryo embedding, and time-lapse imaging. Optimization and modifications of this protocol are also explored. Using H2A.F/Z-EGFP (labels chromatin) and mCherry-CAAX (labels cell membrane) mRNA-injected embryos, mitosis in AB wild-type, auroraBhi1045, and esco2hi2865 mutant zebrafish is visualized. High resolution live imaging in zebrafish allows one to observe multiple mitoses to statistically quantify mitotic defects and timing of mitotic progression. In addition, observation of qualitative aspects that define improper mitotic processes (i.e., congression defects, missegregation of chromosomes, etc.) and improper chromosomal outcomes (i.e., aneuploidy, polyploidy, micronuclei, etc.) are observed. This assay can be applied to the observation of tissue differentiation/development and is amenable to the use of mutant zebrafish and pharmacological agents. Visualization of how defects in mitosis lead to cancer and developmental disorders will greatly enhance understanding of the pathogenesis of disease.

Mitosis is critical to every living organism and defects often lead to cancer and developmental disorders. Using this imaging protocol and zebrafish as a model system, researchers can visualize mitosis in a live vertebrate organism and the multitude of defects that arise when mitotic processes are defective.

Osservando divisione mitotica e Dynamics in un embrione vivo Zebrafish

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin ...

Visualizing the Interrenal Steroidogenic Tissue and Its Vascular Microenvironment in Zebrafish

This protocol introduces how to detect differentiated interrenal steroidogenic cells through a simple whole-mount enzymatic activity assay. Identifying differentiated steroidogenic tissues through chromogenic histochemical staining of 3-&#946;-Hydroxysteroid dehydrogenase /&#916;5-4 isomerase (3&#946;-Hsd) activity-positive cells is critical for monitoring the morphology and differentiation of adrenocortical and interrenal tissues in mammals and teleosts, respectively. In the zebrafish model, the optical transparency and tissue permeability of the developing embryos and larvae allow for whole-mount staining of 3&#946;-Hsd activity. This staining protocol, as performed on transgenic fluorescent reporter lines marking the developing pronephric and endothelial cells, enables the detection of the steroidogenic interrenal tissue in addition to the kidney and neighboring vasculature. In combination with vibratome sectioning, immunohistochemistry, and confocal microscopy, we can visualize and assay the vascular microenvironment of interrenal steroidogenic tissues. The 3&#946;-Hsd activity assay is essential for studying the cell biology of the zebrafish interrenal gland because to date, no suitable antibody is available for labeling zebrafish steroidogenic cells. Furthermore, this assay is rapid and simple, thus providing a powerful tool for mutant screens targeting adrenal (interrenal) genetic disorders as well as for determining disruption effects of chemicals on steroidogenesis in pharmaceutical or toxicological studies.

The interrenal gland in zebrafish is the teleostean counterpart of the mammalian adrenal gland. This protocol introduces how to perform the 3-&#946;-hydroxysteroid dehydrogenase (&#916;5-4 isomerase; 3&#946;-Hsd) enzymatic activity assay, which detects differentiated steroidogenic cells in the developing zebrafish.

Visualizzare il Tissue interrenale Steroidogenic e la sua Vascolare Microenvironment in Zebrafish

This protocol introduces how to detect differentiated interrenal steroidogenic cells through a simple whole-mount enzymatic activity assay. Identifying ...

Use of Immunolabeling to Analyze Stable, Dynamic, and Nascent Microtubules in the Zebrafish Embryo

Microtubules (MTs) are dynamic and fragile structures that are challenging to image in vivo, particularly in vertebrate embryos. Immunolabeling methods are described here to analyze distinct populations of MTs in the developing neural tube of the zebrafish embryo. While the focus is on neural tissue, this methodology is broadly applicable to other tissues. The procedures are optimized for early to mid-somitogenesis-stage embryos (1 somite to 12 somites), however they can be adapted to a range of other stages with relatively minor adjustments. The first protocol provides a method to assess the spatial distribution of stable and dynamic MTs and perform a quantitative analysis of these populations with image-processing software. This approach complements existing tools to image microtubule dynamics and distribution in real-time, using transgenic lines or transient expression of tagged constructs. Indeed, such tools are very useful, however they do not readily distinguish between dynamic and stable MTs. The ability to image and analyze these distinct microtubule populations has important implications for understanding mechanisms underlying cell polarization and morphogenesis. The second protocol outlines a technique to analyze nascent MTs specifically. This is accomplished by capturing the de novo growth properties of MTs over time, following microtubule depolymerization with the drug nocodazole and a recovery period after drug washout. This technique has not yet been applied to the study of MTs in zebrafish embryos, but is a valuable assay for investigating the in vivo function of proteins implicated in microtubule assembly.

Immunolabeling methods to analyze distinct populations of microtubules in the developing zebrafish brain are described here, which are broadly applicable to other tissues. The first protocol outlines an optimized method for immunolabeling stable and dynamic microtubules. The second protocol provides a method to image and quantify nascent microtubules specifically.

Uso di Immunolabeling per analizzare i microtubuli stabili, dinamici e nascenti nell'embrione di pesce zebra

Microtubules (MTs) are dynamic and fragile structures that are challenging to image in vivo, particularly in vertebrate embryos. Immunolabeling methods ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

Imaging Live di Mouse Seconda Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. Various propositions claim to have been important contributions to the understanding of the mechanical properties of cells and tissues in their spatiotemporal organization in different developmental and morphogenetic processes. However, due to the lack of reliable and accessible tools to measure material properties and tensional parameters in vivo, validating these hypotheses has been difficult. Here we present methods employing atomic force microscopy (AFM) and particle tracking with the aim of quantifying the mechanical properties of the intact zebrafish embryo yolk cell during epiboly. Epiboly is an early conserved developmental process whose study is facilitated by the transparency of the embryo. These methods are simple to implement, reliable, and widely applicable since they overcome intrusive interventions that could affect tissue mechanics. A simple strategy was applied for the mounting of specimens, AFM recording, and nanoparticle injections and tracking. This approach makes these methods easily adaptable to other developmental times or organisms.

The lack of tools to measure material properties and tensional parameters in vivo prevents validating their roles during development. We employed atomic force microscopy (AFM) and nanoparticle-tracking to quantify mechanical features on the intact zebrafish embryo yolk cell during epiboly. These methods are reliable and widely applicable avoiding intrusive interventions.

AFM e Microrheology nella cella tuorlo embrione di pesce zebra

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause disease when disrupted. Scientists have developed clever techniques to investigate characteristics and natural dynamics of these cells within intact tissue by expressing fluorescent proteins in subsets of cells. However, at times, experiments require more selected visualization of cells within the tissue, sometimes at the single-cell or population-of-cells manner. To achieve this and visualize single cells within a population of cells, scientists have utilized single-cell photoconversion of fluorescent proteins. To demonstrate this technique, we show here how to direct UV light to an Eos-expressing cell of interest in an intact, living zebrafish. We then image those photoconverted Eos+ cells 24 h later to determine how they changed in the tissue. We describe two techniques: single cell photoconversion and photoconversions of populations of cell. These techniques can be used to visualize cell-cell interactions, cell-fate and differentiation, and cell migrations, making it a technique that is applicable in numerous biological questions.

Here, we present a protocol to show how cell photoconversion is achieved through UV exposure to specific areas expressing the fluorescent protein, Eos, in living animals.

Cella singola fotoconversione in Zebrafish intatto vivente

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

Morphogenesis requires coordination between genetic patterning and mechanical forces to robustly shape the cells and tissues. Hence, a challenge to understand morphogenetic processes is to directly measure cellular forces and mechanical properties in vivo during embryogenesis. Here, we present a setup of optical tweezers coupled to a light sheet microscope, which allows to directly apply forces on cell-cell contacts of the early Drosophila embryo, while imaging at a speed of several frames per second. This technique has the advantage that it does not require the injection of beads into the embryo, usually used as intermediate probes on which optical forces are exerted. We detail step by step the implementation of the setup, and propose tools to extract mechanical information from the experiments. By monitoring the displacements of cell-cell contacts in real time, one can perform tension measurements and investigate cell contacts&#39; rheology.

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

We present a setup of optical tweezers coupled to a light sheet microscope, and its implementation to probe cell mechanics without beads in the Drosophila embryo.

Tastatura meccanica delle cellule con pinzette ottiche senza tallone nell'embrione della drosofila

Morphogenesis requires coordination between genetic patterning and mechanical forces to robustly shape the cells and tissues. Hence, a challenge to ...