この出版物で報告された研究がによって国立科学研究所の一般医療賞数 R35GM124913、パデュー大学 PI4D インセンティブ プログラム、および PVM 内部競争の下で健康の国民の協会のサポートされていた基本的な研究資金プログラムです。内容は著者の責任と資金調達エージェントの公式見解を必ずしも表さない。メダカ Tol2 構築、ASAP1 構造体のマイケル ・ リンありがとう川上浩一、 ubiプロモーターのレナード ・ ゾンを Addgene を構築します。

ゼブラフィッシュ、AAALAC 承認の動物施設に収容され、パーデュー大学動物ケアおよび使用委員会 (PACUC) によって承認されたプロトコルに従ってすべての実験を行った。
1. メダカ Tol2 トランスポゾン プラスミド構築準備
注: メダカ Tol2 トランスポゾン、メダカに発見されたは、ゼブラフィッシュ研究コミュニティ8,9で広く使用されています。正常にゲートウェイ ・部位特異的組換えベース クローン システムに採用されており、メダカ Tol2 キット10として知られています。メダカ Tol2 キットも遺伝子導入の効率を向上させながら、カスタマイズされた式の構造物の作成のより便利な方法ことができます。したがって、このシステムの活用し、検証されたユビキチンプロモーターを使用して ASAP111をドライブするユビキタス ASAP1 式ゼブラフィッシュ行を作成する簡単な決断だった。
<ol><li>中間エントリ ASAP1 構造を作成: pDONR221 ASAP1<ol>
<li>Addgene から pcDNA3.1/Puro CAG ASAP1 (プラスミド #52519)、遺伝的コード化の電圧センサー ASAP1 構成要素を取得します。ASAP1 コーディング領域を増幅するには、プライマー (図 1) の 5' 端に attB 配列の両脇にカスタマイズされたプライマー (attB1 ASAP1F、attB2 ASAP1R) を使用して PCR を設定します。Phusion DNA ポリメラーゼはその高効率化のために選ばれた、以前に公開されたプロトコル12に基づいて PCR 条件を最適化します。</li>
		<li>TAE は、200 μ L のヒント、正規ピペットを使用してゲル 1% に 50 μ L の PCR の製品を読み込むし、約 30 分間水平ゲルタンクで 160 V で電気泳動を行います。</li>
		<li>UV transilluminator の下でゲルをチェック (353 nm)、以前に公開された13,14、UV transilluminator 下刃/メスを使用して目的のバンドを消費税し、含んでいるゲルの DNA のサンプルを入れてきれいな 1.5 mL 遠心機チューブ。</li>
		<li>ASAP1 PCR の製品のゲルの浄化を実行します。製造元の指示に従って商業 DNA ゲル精製キットを使用して摘出したゲルの DNA を回復し、水の 20 μ L に DNA を溶出します。サンプルとして 1 μ L をとり、分光光度計を用いた DNA 濃度を測定します。空白のコントロール15として水を使用してソフトウェアの指示を流れ。</li>
		<li>100 を取る ng の PCR の製品の浄化し、150 混ぜる ng のテの 10 μ L の pDONR221 プラスミドのバッファー (10 mM トリス、1 mM EDTA pH 8.0)16。反応に BP Clonase II の 2 μ L を追加し、一晩室温で反応を孵化させなさい。</li>
		<li>2 日目、反応にプロティナーゼ K の 1 μ L を追加し、30 分の 37 ° C で反応をインキュベートします。</li>
		<li>変換を実行します。反応を転送し、有能なエシェリヒア属大腸菌のセルし、30 分間氷の上細胞をインキュベート Top10 の 50 μ L でそれをミックスします。その後、転送 1 分の 42 ° C の水浴に反応管はすぐにチューブを削除し、2 分間氷の上を孵化させなさい。次に、37 ° C のシェーカーにチューブを入れて、1 時間インキュベートします。</li>
		<li>チューブを取り出して、カナマイシン LB プレート上に細胞をプレートします。次に、プレート一晩 (16-18 h) 37 ° c. で孵化させなさい</li>
		<li>シングルと十分に分離コロニーをピックアップし、3 ml の LB 培地の 14 mL 細胞培養管にそれらを接種します。37 ° c 250 rpm (1 分あたり回転) の回転速度とシェーカーで一晩文化それら。</li>
		<li>Miniprep の次の命令マニュアル17商業 miniprep キットを使用してを実行します。</li>
		<li>3-4 プラスミドをシーケンス サンガーと肯定的な pDONR221 ASAP1 を識別するシーケンスは M13F と M13R の配列のプライマーを使用してクローンします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>マイクロインジェクションのメダカ Tol2 コンストラクトを作成する: pDestTol2-ubi-ASAP1<ol>
<li>シーケンスを検証 pDONR221 ASAP1 クローンと測定分光光度計の次に空白制御15として水を使用してソフトウェア命令を使用してその DNA 濃度を選択します。</li>
		<li>PDONR221 ASAP1 の 100 μ g を取るし、メダカ Tol2 キット 5 終わりプラスミドの 100 μ g と混ぜる (pENTR5'_ubi、Addgene #27320) 100、p3E polyA (メダカ Tol2 キット #302) の μ g と pDestTol2pA2 の 150 μ g (メダカ Tol2 キット #394)。8 μ L に容量を調整チューブ 1.5 mL 容マイクロで TE バッファー (トリス、1 ミリメートルの EDTA、pH 8.0 10 mM) を使用し、2-5 秒の簡単な渦でよく混ぜます。プラス、LR Clonase II の 2 μ L を追加し、一晩室温で反応を孵化させなさい。</li>
		<li>2 日目、10 μ L ピペットを使用して反応にプロティナーゼ K の 1 μ L を追加し、30 分の 37 ° C で反応をインキュベートします。</li>
		<li>変換を実行して (手順 1.1.7-11) 上記のように肯定的なクローンを識別します。</li>
		<li>測定シーケンスの DNA の集中を確認15分光光度計を用いた pDestTol2 ユービーアイ ASAP1 クローン (図 1 b)。通常、濃度は 200ng/μ L の周りです。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. メダカ Tol2 トランスポザーゼ mRNA と注射溶液を準備します。
<ol><li>連勝大腸菌グリセロール ストック (100 μ g/mL アンピシリン) と LB プレート pCS2FA トランスポザーゼ プラスミド (メダカ Tol2 キット #396) の滅菌接種ループを使用して。インキュベーターの 37 ° C でプレートを一晩インキュベートします。次の日、単一コロニーを拾うし、lb (100 μ g/mL アンピシリン) 3 mL に滅菌 10 μ L ピペット チップを使用してそれを接種します。一晩 250 rpm の回転速度とシェーカーで 37 ° C で培養します。</li>
	<li>その取扱説明書に続く商業 miniprep キットを使用してE. 大腸菌文化 miniprep を実行します。14,000 rpm で 1 分遠心分離機による TE バッファーの 30-50 μ L にプラスミド DNA を溶出し、その DNA 濃度を分光光度計で測定します。</li>
	<li>私にプラスミッドの 1-2 μ g のエンドヌクレアーゼをリニア化し、浄化のクリーニング キットがなかった後の取扱説明書を次の DNA と DNA 消化。5 μ L の水に 1 分 14,000 rpm で遠心分離で DNA を溶出します。予想される濃度は約 200-300 ng/μ L。</li>
	<li>生体外のトランスクリプションを実行しないと私は商業 SP6 転写キットを使用して DNA のテンプレートとして pCS2FA トランスポザーゼを線形化します。</li>
	<li>反応が完了すると、mRNA 商業 RNA クリーニング キットの製造元の指示に従ってメダカ Tol2 転移を浄化します。最後に、mRNA を 20 μ L RNAase 無料水に溶出し、分光光度計で RNA 濃度を測定します。予想される濃度は 1-3 μ g/μ L のサンプルは、必要な場合-80 ° C のフリーザーで保存できます。</li>
	<li>20 ng/μ L pDestTol2-ユービーアイを混合することによってマイクロインジェクション ソリューションを準備-ASAP1 とメダカ Tol2 トランスポザーゼ mRNA (100 ng/μ L) ピペットで遠心管に。繰り返し融解と凍結、分注 6 μ L チューブ/による核酸の劣化を防止し、将来使用するため-80 ° C のフリーザーで保存します。</li>
</ol>3. マイクロインジェクション
<ol><li>注入前に午後 4-6 繁殖タンク男性少なくとも 2 名と女性 2 名を設定します。これらの魚は、午後に取り込まれないする必要があります。この手順は魚の無駄の量を減らす、繁殖応答を誘導しながらも、次の朝をそれらをきれいにする時間を節約します。</li>
	<li>次の朝、削除準備注射液 (pDestTol2-ubi-ASAP1 構造とメダカ Tol2 mRNA)-80 ° C のフリーザーから氷の場所と。</li>
	<li>魚のタンクを繁殖の仕切りを引き、魚の仲間を許可します。一般的に、魚は分割線から撤退した後 20-30 分以内の卵を産みます。そうでない場合は、1-2 時間以上を待ちます。いくつかの魚は、すべての卵を置くかもしれない。この場合、魚の胚のコレクションのこの実験を繰り返します。</li>
	<li>待っている間、針の先端の鉗子、またはワイパーは繊細なタスクに分割することにより面取りを作成する角度で壊れたで準備があることを確認します。<ol>
<li>次のパラメーターを使用してマイクロ ピペット引き手を引いて、毛細管ガラスから針: 熱 545;プル 60;速度 80;時間 250;圧力 500。(接眼部径推定法の定規) と郭清範囲の下に鉗子で角約 45 ° で鉗子を保持することによって針を破る。マイクロインジェクター設定によって変数をすることができます必要なニードル径が小さい直径、胚の死亡率を減少させるため推奨。</li>
	</ol>
</li>
	<li>魚は、卵を産んでいる、一度 10 cm 径シャーレでそれらを収集し、郭清範囲にそれらをもたらします。すべて異常な胚を削除および魚の無駄。</li>
	<li>ピペットに準備された 3% の agarose 注入受精卵型します。場所に胚を保つために余分な水を削除します。</li>
	<li>すべての行は、実行可能な胚で満ちている、一度単一のすべてのセルが約 45 ° の角度で水平方向にある針に向かって同じ方向を向くように配置します。これする注入が簡単に後で。</li>
	<li>手袋を着用しながら 20 μ L ロード ピペットを使用して、ヒントし、氷のチューブから準備された構成の 5 μ L を削除します。</li>
	<li>慎重に先端近くに試薬を痛まなくて、タッパーを出すまで壊れた毛管チューブのバック エンドに先端を挿入します。空気の泡がある場合、は、先端を壊さないようにして、針を振る。</li>
	<li>マイクロインジェクション針ホルダーにまっすぐ針を挿入し、針の位置に固定されるまで慎重に締め。約 45 ° までの角度を調整します。</li>
	<li>針が準備し、添付、顕微鏡およびガス圧力タンクを入れます。商業 CO2タンクは通常この目的に適しています。保持と射出圧力で噴射量を調整: 0.5 psi の保持のため、放出の 30 の psi を近似します。必ずペダルを押すときに解決策が出てくることを確認してください。</li>
	<li>ボリュームおよび 〜 150 μ m の解決策の流れ調整鉱物油のドロップでステージ マイクロメータを使用する (約 2 nL)。背圧針のうち点滴少量できるようになることを確認します。十分な背圧がない場合、毛細管は針を入力して mRNA を破壊する液体になります。</li>
	<li>針が校正され、受精胚の単一のセルにコンストラクトを注入を開始します。 注: これは大量の練習、忍耐力と繊細さ、細胞膜を貫通しにくいためかかります。セル、卵黄はない、トランスジェニックゼブラフィッシュを生成するために薬液を注入することが重要です。これは morpholino 注入から異なります。どっち針に入る限り構造体は、セル、セルの問題ではないです。セルではなく卵黄に注入される場合、遺伝子は非常に低い成功率を持ちます。単一セル段噴射も重要であるまたは体細胞キメラ魚が作成されます。これは生殖細胞に入る遺伝子の可能性が低くなります。</li>
	<li>胚の場所で保持でき、胚を動かさずに圧力を適用するのに針の支持を提供するためにゲルのノッチのエッジを使用します。針の先端は、単一のセル、ソリューションの適切な量を解放するためにペダルを押します。胚のすべてに対してこのプロセスを繰り返します。</li>
	<li>完了したら、魚システム水と使い捨て 3.4 mL 転送ピペット agarose の切り込みからそれらを洗浄によってラベル付けされた皿に注入された胚を転送します。胚を開発できるようにする 28.5 ° C の定温器に格納します。死んだ魚の胚を取り外し終日戻って確認し、魚の水に 0.1% メチレン ブルーと水を交換します。</li>
	<li>注入後、約 6-8 時間取る 10 個々 の注入は胚を魚し、名手法18を使用してそれらからゲノム DNA を準備します。</li>
	<li>次の朝は、卵黄以外の組織における GFP を示す胚を整理する蛍光光源を解剖顕微鏡を使用します。これらの魚の胚は、注入されたコンス トラクターを含める必要があります。</li>
	<li>19を前述のように、トランスポゾン動作をチェックするメダカ Tol2 消費税分析を実行します。摘出したプラスミドを検出できる場合保持、注入された胚を魚し、それらを上げます。摘出したプラスミドを検出されない場合は、メダカ Tol2 物品税法の肯定的な結果を達成するまでメダカ Tol2 mRNA マイクロインジェクションの合成とプロセスを繰り返します。</li>
</ol>4 遺伝子組換え ASAP1 魚、Tg の確立 (ubi: ASAP1)
<ol><li>ゼブラフィッシュ本20で前述した成人に注入された魚 (F0世代) を上げます。これは通常約 4 ヶ月がかかります。</li>
	<li>シングル大人 F0に魚を取るし、反対の性別の野生型魚シングル クロスします。後の日に繁殖した魚の胚を収集します。0.1% メチレン ブルーと水の魚で 28.5 ° C の定温器で収集した魚の胚を維持。</li>
	<li>3 日目、GFP フィルターと蛍光解剖顕微鏡の下に魚の胚を確認します。存在する場合、緑の魚の胚を整理し、F1世代遺伝子組換え魚、Tg として大人にそれらを上げる (ubi: ASAP1)。 注: 親の F0魚のほとんどは細菌ライン遺伝子キメラ メンデル比は想定されていません。</li>
	<li>野生型の魚の単一の F1成魚をクロスし、魚の胚を収集します。緑の魚の胚を整理し、F2世代魚として大人にそれらを上げます。 注: 緑と非緑の魚の胚に近くなるはず 1:1 単一の遺伝子があるか。</li>
	<li>悪性末梢神経鞘腫瘍 (鞘) のような腫瘍の電気潜在的な変更を表示するクロス F2世代 Tg (ubi: ASAP1) rpl35hi258/重量魚と魚。目に見える腫瘍が 6-8 ヶ月大人21,22を開始することが知られています。</li>
</ol>5. イメージング
<ol><li>ゼブラフィッシュ胚の画像、複数の F2世代創始者に魚を取る個々 のペアで野生型魚とそれらを交差します。ステージング ガイド23ゼブラフィッシュによると異なる必要な発達段階で魚の胚を収集します。</li>
	<li>魚の胚の初期段階で、皮をむくし、慎重に 10 cm 径シャーレ魚システム水で郭清範囲下組の鉗子を用いた胚の絨毛を削除します。</li>
	<li>3.4 mL 使い捨て可能な移動のピペットを使用して 3% セルロースと凹面ガラスのスライドにいくつかの魚の胚を転送します。蛍光郭清範囲の下に針を使用して携帯電話の GFP のアクティビティを表示する目的の位置に胚を調整します。</li>
	<li>魚の胚 (12 体節期以前) の移動の段階では、スライドに転送する前に魚の胚を麻酔するのに 0.05 %tricaine 酸イマチニブを使用します。簡単に言えば、彼らはスイミングとボディ バランスの損失を停止するまで魚の胚が魚水 0.05 %tricaine 酸イマチニブに出現しました。また、スライドに 0.05 %tricaine メシル酸、セルロースとのドロップを追加します。</li>
	<li>未満 12 体節期魚胚、互換性のあるカメラとソフトウェア イメージング用エピ蛍光顕微鏡を使用します。12 体節胚の魚よりも古い、蛍光解剖顕微鏡を使用します。</li>
	<li>腫瘍のセル電圧をイメージ、最初鞘腫魚を識別します。その後、0.05 %tricaine 酸イマチニブで魚を麻酔します。全体のマウント用に、10 cm 径シャーレに魚を置きます。腫瘍細胞の電気的活動を表示するには、魚腫瘍のうち全台紙のイメージング後解剖にしたことがあります。</li>
</ol>

<ol>
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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+Imaging+of+Voltage+and+Calcium+Signals+Reveals+Neural+Processing+In+Vivo.">Subcellular Imaging of Voltage and Calcium Signals Reveals Neural Processing In Vivo.</a> Cell. 166 (1), 245-257 (2016).</li><li>Chamberland, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+two-photon+imaging+of+subcellular+voltage+dynamics+in+neuronal+tissue+with+genetically+encoded+indicators.">Fast two-photon imaging of subcellular voltage dynamics in neuronal tissue with genetically encoded indicators.</a> Elife. 6, (2017).</li><li>Hochbaum, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All-optical+electrophysiology+in+mammalian+neurons+using+engineered+microbial+rhodopsins.">All-optical electrophysiology in mammalian neurons using engineered microbial rhodopsins.</a> Nature Methods. 11 (8), 825-833 (2014).</li><li>Sugiyama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+cell-cycle+progression+in+the+developing+zebrafish+embryo.">Illuminating cell-cycle progression in the developing zebrafish embryo.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 106 (49), 20812-20817 (2009).</li></ol>

著者が明らかに何もありません。

萌芽期の開発および人間の病気中の細胞およびティッシュ レベル電気活動が長い時間前に発見されたが生体内での動的電気的変化とその生物学的役割まだ主は不明のまま。電気的変化を定量化を視覚化して主要な課題の 1 つです。パッチ ・ クランプの技術は単一のセルを追跡するため、休憩が、彼らは多くの細胞で構成されているために、脊椎動物の胚への応用は限られました。現?...

生体電気は、イオン チャネルと1の細胞膜にあるポンプを介する内因性電気信号を指します。細胞膜と結合電気潜在的な現在の変化の間でイオン交換が興奮性神経細胞と筋肉細胞のプロセスを通知するに不可欠です。さらに、生体電気とイオン勾配エネルギー貯蔵、生合成および代謝産物の輸送を含む他の重要な生物学的機能のさまざまながあります。生体信号は、体軸、細胞周期、細胞分化1などの胚パターン形成の調節因子としても発見されました。したがって、シグナリングのこのタイプの誤規制から生じる多くの人間の先天性疾患を理解するために重要です。パッチク ランプは、単一のセルを記録するため広く使用されています、萌芽期の開発の生体の中に複数のセルの同時モニタリングのための理想には程遠いです。また、電圧敏感な小さな分子はまた生体内特異性、感度、毒性などのアプリケーションに最適ではありません。
多様性の創出遺伝子蛍光電圧インジケーター (GEVIs) を提供していますこの問題を克服するために新しいメカニズムをエンコードでき、萌芽期の開発の研究を簡単に適用にもかかわらず、本来神経を監視するためだった2,3のセルします。現在利用可能な GEVIs の 1 つは加速センサーの活動電位 1 (ASAP1)4です。それは電圧敏感なホスファターゼと円形に置換された緑色蛍光タンパク質の電位センサー ドメインの細胞外ループで構成されます。したがって、ASAP1 は、細胞電位変化の可視化 (偏波: 明るい緑色; 脱分極: ダーク グリーン)。ASAP1 が 2 ms オンとオフ反応ありサブスレッショルド潜在的な変更4を追跡することができます。したがって、この遺伝子解析ツールは生きているセルのリアルタイム生体監視機能の有効性の新しいレベルのことができます。萌芽期の開発で多くの人間の病気、癌などの生体電気の役割のさらなる理解が新しいに光を当てるメカニズム, 病気の治療と予防のために重大であります。
ゼブラフィッシュは、発生生物学、がん5,6を含む人間の病気の研究に強力な動物モデルを実証されています。彼らは、人間とオーソログ遺伝子の 70% を共有して同様の脊椎動物の生物学7。ゼブラフィッシュは、比較的簡単なケア、ラージ クラッチ サイズ卵、扱いやすい遺伝学、簡単な遺伝子、透明な外部萌芽期の開発、それらの生体内イメージング5,6の優れたシステムを作るを提供します。既に現在の突然変異体の魚行の大規模なソースと完全に配列されたゲノム、ゼブラフィッシュは科学的発見の比較的無制限の範囲を提供します。
生体内でリアルタイム電気細胞の活性を調べるためには、私たちはゼブラフィッシュ モデル システムと ASAP1 の活用します。本稿では、メダカ Tol2 トランスポゾン遺伝子導入を用いたゼブラフィッシュ ゲノムに電圧蛍光バイオ センサー ASAP1 を組み込む方法について説明し、萌芽期の開発、魚幼虫の動きの間にそしてライブ腫瘍細胞の電気活動を可視化します。.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>14mL cell culture tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60818-725</td>
			<td>E.Coli culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose electrophoresis tank</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Owl B2</td>
			<td>DNA eletrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose RA</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>N605-500G</td>
			<td>For making the injection gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attb1-ASAP1-F primer</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td>GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCACCATGGAGACGACTGTGAGGTATGAACA</td>
			<td>ASAP1 coding region amplification for subcloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attb2-ASAP1-R primer</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td>GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTTAGGTTACCACTTCAAGTTGTTTCTTCTGTGAAGCCA</td>
			<td>ASAP1 coding region amplification for subcloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright field dissection scope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ 745</td>
			<td>Dechorionation, microinjection, mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Color camera</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>AxioCam MRc</td>
			<td>Fish embryo image recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concave slide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48336-001</td>
			<td>For holding fish embryos during imaging process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable transfer pipette 3.4 ml</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>13-711-9AM</td>
			<td>Fish embryos and water transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endonuclease enzyme, Not I</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0189L</td>
			<td>For linearizing plasmid DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifuorescent compound scope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axio Imager.A2</td>
			<td>Fish embryo imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifuorescent stereo dissection scope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stereo Discovery.V12</td>
			<td>Fish embryo imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent light source</td>
			<td>Lumen dynamics</td>
			<td>X-cite seris 120</td>
			<td>Light source for fluorescence microscopes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps #5</td>
			<td>WPI</td>
			<td>500342</td>
			<td>Dechorionation and needle breaking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gateway BP Clonase II Enzyme mix</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11789020</td>
			<td>Gateway BP recombination cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gateway LR Clonase II Plus enzyme</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12538120</td>
			<td>Gateway LR recombination cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel DNA Recovery Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4002</td>
			<td>DNA gel purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading tip</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>930001007</td>
			<td>For loading injection solution into capilary needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcellulose (1600cPs)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>43146</td>
			<td>Fish embryo mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9140</td>
			<td>Suppresses fungal outbreaks in Petri dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection mold</td>
			<td>Adaptive Science Tools</td>
			<td>TU-1</td>
			<td>To prepare agaorse mold tray for holding fish embryos during injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector</td>
			<td>WPI</td>
			<td>Pneumatic Picopump PV820</td>
			<td>Microinjection injector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-manipulator</td>
			<td>WPI</td>
			<td>Microinjector mm33 rechts</td>
			<td>Microinjection operation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter instrument</td>
			<td>P-1000</td>
			<td>For preparing capillary needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>J217-500ml</td>
			<td>For calibrating injection volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AM1340</td>
			<td>mRNA in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monocolor camera</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>AxioCam MRm</td>
			<td>Fish embryo image recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4020</td>
			<td>Prepare small amount of plasmid DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Petri dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-088</td>
			<td>For holding fish or fish embryos during imaging process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Clean &#38; Concentrator-5</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1015</td>
			<td>mRNA cleaning after in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>NanoDrop 2000</td>
			<td>For measuring DNA and RNA concentrations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage Micrometer</td>
			<td>Am Scope</td>
			<td>MR100</td>
			<td>Microinjection volume calibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>T100</td>
			<td>DNA amplification for gene cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin wall glass capillaries</td>
			<td>WPI</td>
			<td>TW100F-4</td>
			<td>Raw glass for making cappilary needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tol2-exL1 primer</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td>GCACAACACCAGAAATGCCCTC</td>
			<td>Tol2 excise assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tol2-exR primer</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td>ACCCTCACTAAAGGGAACAAAAG</td>
			<td>Tol2 excise assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOP10 Chemically Competent E. coli</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>C404006</td>
			<td>Used for transformation during gene cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine mesylate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040</td>
			<td>For anesthetizing fish or fish embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV trans-illuminator 302nm</td>
			<td>UVP</td>
			<td>M-20V</td>
			<td>DNA visualization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>2853</td>
			<td>For transformation process of gene cloning</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of cellular electrical activity in zebrafish early embryos and tumors

生体電気、イオン チャネルを介する内因性電気シグナル伝達と細胞膜にあるポンプなど興奮性神経細胞と筋肉細胞のプロセスおよび他の多くの生物学的プロセスのシグナル伝達に重要な役割を果たしている萌芽期発達のパターン。しかし、生体内で電気的活動は、脊椎動物の胚発生の監視の必要性があります。遺伝的コード化蛍光電圧インジケーター (GEVIs) の進歩はこのような課題に対してソリューションを提供する可能にしました。ここでは、確立された電圧インジケーター、ASAP1 を用いたトランスジェニック電圧インジケーター ゼブラフィッシュを作成する方法について説明 (加速センサーの活動電位 1)、例として。メダカ Tol2 キットとユビキタス ゼブラフィッシュ プロモーター、ユービーアイは本研究で選ばれました。我々 はまた、ゲートウェイ サイト固有のクローニング、メダカ Tol2 トランスポゾンを用いたゼブラフィッシュ遺伝子と正規 epifluorescent 顕微鏡を使用して初期段階魚胚および魚腫瘍イメージング プロセスのプロセスを説明します。この魚のラインを使用すると、ゼブラフィッシュ胚発生と魚の幼虫の動きの間に細胞の電気電圧の変化があることがわかった。さらに、いくつかのゼブラフィッシュ悪性末梢神経鞘腫瘍の周囲の正常組織に腫瘍細胞が一般に偏極が比較して観察されました。

成功した射出、以上 50% 注入魚胚体細胞に緑の蛍光性の程度が表示され、それらのほとんどはメダカ Tol2 トランスポゾン消費税法 (図 2) によってプラスになります。2 4 世代のアウトなしの野生型魚 (まで蛍光魚 50%、メンデルの予想比) とクロス後、遺伝子導入魚は、萌芽期の開発の間に細胞の膜電位を追跡するイメージングの実験のために使用?...

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Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

ゼブラフィッシュ初期胚および腫瘍の細胞の電気的活動の可視化

ここでは、胚の動きを可視化する携帯電話の電気電圧記者ゼブラフィッシュ ラインを作成するプロセスを示す、魚腫瘍細胞の生体内で。

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

visualization-cellular-electrical-activity-zebrafish-early-embryos

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.7K ビュー.  Purdue University. ここでは、胚の動きを可視化する携帯電話の電気電圧記者ゼブラフィッシュ ラインを作成するプロセスを示す、魚腫瘍細胞の生体内で。

ビデオ: Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological systems. In FDAP experiments, the clearance of proteins within living organisms can be measured. A protein of interest is tagged with a photoconvertible fluorescent protein, expressed in vivo and photoconverted, and the decrease in the photoconverted signal over time is monitored. The data is then fitted with an appropriate clearance model to determine the protein half-life. Importantly, the clearance kinetics of protein populations in different compartments of the organism can be examined separately by applying compartmental masks. This approach has been used to determine the intra- and extracellular half-lives of secreted signaling proteins during zebrafish development. Here, we describe a protocol for FDAP experiments in zebrafish embryos. It should be possible to use FDAP to determine the clearance kinetics of any taggable protein in any optically accessible organism.

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP

Protein levels in cells and tissues are often tightly regulated by the balance of protein production and clearance. Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP), the clearance kinetics of proteins can be experimentally measured in vivo.

光変換後の蛍光減衰を使用して生活ゼブラフィッシュ胚におけるタンパク質の安定性の測定（FDAP）

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological ...

発生生物学

Mechanical Vessel Injury in Zebrafish Embryos

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes. External development and optical transparency make these embryos especially amenable to microscopy, and numerous transgenic lines that label specific cell types with fluorescent proteins are available, making the zebrafish embryo an ideal system for visualizing the interaction of vascular, hematopoietic, and other cell types during injury and repair in vivo. Forward and reverse genetics in zebrafish are well developed, and pharmacological manipulation is possible. We describe a mechanical vascular injury model using micromanipulation techniques that exploits several of these features to study responses to vascular injury including hemostasis and blood vessel repair. Using a combination of video and timelapse microscopy, we demonstrate that this method of vascular injury results in measurable and reproducible responses during hemostasis and wound repair. This method provides a system for studying vascular injury and repair in detail in a whole animal model.

This article describes a method for creating a mechanical vessel injury in zebrafish embryos. This injury model provides a platform for studying hemostasis, injury-related inflammation, and wound healing in an organism ideally suited for real-time microscopy.

ゼブラフィッシュ胚における機械的血管損傷

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes.  External development ...

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo development due to their similar developmental process. Although genetic factors are known to affect early embryonic development, the discovery of such factors has been a serious challenge. Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. One of the main decisions that have to be made when planning a microarray experiment is whether to use a one- or two-color approach. Two-color design increases technical replication, minimizes variability, improves sensitivity and accuracy as well as allows having loop designs, defining the common reference samples. Although microarray is a powerful biological tool, there are potential pitfalls that can attenuate its power. Hence, in this technical paper we demonstrate an optimized protocol for RNA extraction, amplification, labeling, hybridization of the labeled amplified RNA to the array, array scanning and data analysis using the two-color analysis strategy.

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcripts on a genome-wide basis. Therefore, this protocol provides an optimized technical procedure in a two-color custom made bovine array using Day 7 bovine embryos to demonstrate the feasibility of using low amount of total RNA.

のトランスクリプトームプロファイリング<em&gt;生体内で</em二色マイクロアレイプラットフォームを使用&gt;産ウシ着床前の胚

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been described at the morphological level, little is known about the molecular basis of cellular changes that occur as the organism develops. With recent advancements in microfluidics and multiplexing technologies, it is now possible to characterize gene expression in single cells. This allows for investigation of heterogeneity between individual cells of specific cell populations to identify and classify cell subtypes, characterize intermediate states that occur during cell differentiation, and explore differential cellular responses to stimuli. This study describes a protocol to isolate viable, single cells from zebrafish embryos for high throughput multiplexing assays. This method may be rapidly applied to any zebrafish embryonic cell type with fluorescent markers. An extension of this method may also be used in combination with high throughput sequencing technologies to fully characterize the transcriptome of single cells. As proof of principle, the relative abundance of cardiac differentiation markers was assessed in isolated, single cells derived from nkx2.5 positive cardiac progenitors. By evaluation of gene expression at the single cell level and at a single time point, the data support a model in which cardiac progenitors coexist with differentiating progeny. The method and work flow described here is broadly applicable to the zebrafish research community, requiring only a labeled transgenic fish line and access to microfluidics technologies.

This protocol describes a method for isolating single cells from zebrafish embryos, enriching for cells of interest, capturing zebrafish cells in microfluidic based single cell multiplex systems, and assessing gene expression from single cells.

ゼブラフィッシュ胚からの単一細胞の単離とキャラクタリゼーション

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the cells are located. Specifically, they have been developed to analyze the electrical activity of excitable cells, such as spinal neurons. In such a scenario, it is crucial to preserve the integrity of the spinal cell, but it is also important to preserve the anatomy and physiological shape of the systems involved. Indeed, the comprehension of the manner in which the nervous system-and other complex systems-works must be based on a systemic approach. For this reason, the live zebrafish embryo was chosen as a model system, and the spinal neuron membrane voltage changes were evaluated without interfering with the physiological conditions of the embryos. 
Here, an approach combining the employment of zebrafish embryos with a FRET-based biosensor is described. Zebrafish embryos are characterized by a very simplified nervous system and are particularly suited for imaging applications thanks to their transparency, allowing for the employment of fluorescence-based voltage indicators at the plasma membrane during zebrafish development. The synergy between these two components makes it possible to analyze the electrical activity of the cells in intact living organisms, without perturbing the physiological state. Finally, this non-invasive approach can co-exist with other analyses (e.g., spontaneous movement recordings, as shown here).

Protocols described here allow for the study of the electrical properties of excitable cells in the most non-invasive physiological conditions by employing zebrafish embryos in an in vivo system together with a fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based genetically encoded voltage indicator (GEVI) selectively expressed in the cell type of interest.

生きたゼブラフィッシュ胚における運動ニューロン膜電位のバイオセンシング

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and zebrafish embryos. Our system comprises a chamber featuring a simple setup that is nevertheless robust to induce and maintain a specific oxygen concentration and temperature in any experimental solution of choice. The presented system is very cost-effective but highly functional, it allows induction and sustainment of hypoxia for direct experiments in vivo and for various time periods up to 48 h.
To monitor and study the effects of hypoxia, we have employed two methods - measurement of levels of hypoxia-inducible factor 1alpha (HIF-1&#945;) in whole embryos or specific tissues and determination of retinal stem cell proliferation by 5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine (EdU) incorporation into the DNA. HIF-1&#945; levels can serve as a general hypoxia marker in the whole embryo or tissue of choice, here embryonic retina. EdU incorporation into the proliferating cells of embryonic retina is a specific output of hypoxia induction. Thus, we have shown that hypoxic embryonic retinal progenitors decrease proliferation within 1 h of incubation under 5% oxygen of both frog and zebrafish embryos.
Once mastered, our setup can be employed for use with small aquatic model organisms, for direct in vivo experiments, any given time period and under normal, hypoxic or hyperoxic oxygen concentration or under any other given gas mixture.

We introduce a novel hypoxic chamber system for use with aquatic organisms such as frog and zebrafish embryos. Our system is simple, robust, cost-effective and allows the induction and sustainment of hypoxia in vivo and for up to 48 h. We present 2 reproducible methods to monitor the effectiveness of hypoxia.

生きた蛙およびゼブラフィッシュの胚における低酸素の誘導

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to numerous cell types throughout the body. Understanding the biology of the neural crest has been limited, reflecting a lack of genetically tractable models that can be studied in vivo and in real-time. Zebrafish is a particularly important developmental model for studying migratory cell populations, such as the neural crest. To examine neural crest migration into the developing eye, a combination of the advanced optical techniques of laser scanning microscopy with long wavelength multi-photon fluorescence excitation was implemented to capture high-resolution, three-dimensional, real-time videos of the developing eye in transgenic zebrafish embryos, namely Tg(sox10:EGFP) and Tg(foxd3:GFP), as sox10 and foxd3 have been shown in numerous animal models to regulate early neural crest differentiation and likely represent markers for neural crest cells. Multi-photon time-lapse imaging was used to discern the behavior and migratory patterns of two neural crest cell populations contributing to early eye development. This protocol provides information for generating time-lapse videos during zebrafish neural crest migration, as an example, and can be further applied to visualize the early development of many structures in the zebrafish and other model organisms.

A combination of the advanced optical techniques of laser scanning microscopy with long wavelength multi-photon fluorescence excitation was implemented to capture high-resolution, three-dimensional, real-time imaging of neural crest migration in Tg(sox10:EGFP) and Tg(foxd3:GFP) zebrafish embryos.

リアルタイムで開発を可視化する多光子タイムラプス イメージング: ゼブラフィッシュ胚の神経堤細胞の可視化

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is the formation of the transient organizers, the node and notochordal plate, from cells that have passed through the primitive streak. The proper formation of these signaling centers is essential for the development of the body plan and techniques to visualize them are of high interest to mouse developmental biologists. The node and notochordal plate lie on the ventral surface of gastrulating mouse embryos around embryonic day (E) 7.5 of development. The node is a cup-shaped structure whose cells possess a single slender cilium each. The proper subcellular localization and rotation of the cilia in the node pit determines left-right asymmetry. The notochordal plate cells also possess single cilia albeit shorter than those of the node cells. The notochordal plate forms the notochord which acts as an important signaling organizer for somitogenesis and neural patterning. Because the cells of the node and notochordal plate are transiently present on the surface and possess cilia, they can be visualized using scanning electron microscopy (SEM). Among other techniques used to visualize these structures at the cellular level is whole mount immunofluorescence (WMIF) using the antibodies against the proteins that are highly expressed in the node and notochordal plate. In this report, we describe our optimized protocols to perform SEM and WMIF of the node and notochordal plate in developing mouse embryos to help in the assessment of tissue shape and cellular organization in wild-type and gastrulation mutant embryos.

The node and notochordal plate are transient signaling organizers in developing mouse embryos that can be visualized using several techniques. Here, we describe in detail how to perform two of the techniques to study their structure and morphogenesis: 1) scanning electron microscopy (SEM); and 2) whole mount immunofluorescence (WMIF).

ノードと走査型電子顕微鏡と蛍光抗体法マウント全体を使用して Gastrulating のマウス胚における脊索板を可視化

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. Although many immunohistochemistry protocols have been optimized for mammalian tissue and tissue sections, these protocols often require modification and optimization for non-mammalian model organisms. Zebrafish are increasingly used as a model system in basic, biomedical, and translational research to investigate the molecular, genetic, and cell biological mechanisms of developmental processes. Zebrafish offer many advantages as a model system but also require modified techniques for optimal protein detection. Here, we provide our protocol for whole-mount fluorescence immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae. This protocol additionally describes several different mounting strategies that can be employed and an overview of the advantages and disadvantages each strategy provides. We also describe modifications to this protocol to allow detection of chromogenic substrates in whole mount tissue and fluorescence detection in sectioned larval tissue. This protocol is broadly applicable to the study of many developmental stages and embryonic structures.

Here, we present a protocol for fluorescent antibody-mediated detection of proteins in whole preparations of zebrafish embryos and larvae.

ゼブラフィッシュ胚と幼虫の全山免疫賦形化学

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs during early development are technically challenging due to the limiting cell number. Moreover, many approaches require a miRNA of interest to be defined in assays such as northern blotting, microarray, and qPCR. Therefore, the expression of many miRNAs and their isoforms have not been studied during early development. Here, we demonstrate a protocol for small RNA sequencing of sorted cells from early mouse embryos to enable relatively unbiased profiling of miRNAs in early populations of neural crest cells. We overcome the challenges of low cell input and size selection during library preparation using amplification and gel-based purification. We identify embryonic age as a variable accounting for variation between replicates and stage-matched mouse embryos must be used to accurately profile miRNAs in biological replicates. Our results suggest that this method can be broadly applied to profile the expression of miRNAs from other lineages of cells. In summary, this protocol can be used to study how miRNAs regulate developmental programs in different cell lineages of the early mouse embryo.

We describe a technique for profiling microRNAs in early mouse embryos. This protocol overcomes the challenge of low cell input and small RNA enrichment. This assay can be used to analyze changes in miRNA expression over time in different cell lineages of the early mouse embryo.

初期マウス胚からのシーケンシングのための小型RNAライブラリーの調製

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...

ゼブラフィッシュ初期胚および腫瘍の細胞の電気的活動の可視化

要約

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光変換後の蛍光減衰を使用して生活ゼブラフィッシュ胚におけるタンパク質の安定性の測定（FDAP）

ゼブラフィッシュ胚における機械的血管損傷

のトランスクリプトームプロファイリング

ゼブラフィッシュ胚からの単一細胞の単離とキャラクタリゼーション

生きたゼブラフィッシュ胚における運動ニューロン膜電位のバイオセンシング

生きた蛙およびゼブラフィッシュの胚における低酸素の誘導

リアルタイムで開発を可視化する多光子タイムラプスイメージング: ゼブラフィッシュ胚の神経堤細胞の可視化

ノードと走査型電子顕微鏡と蛍光抗体法マウント全体を使用して Gastrulating のマウス胚における脊索板を可視化

ゼブラフィッシュ胚と幼虫の全山免疫賦形化学

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リアルタイムで開発を可視化する多光子タイムラプス イメージング: ゼブラフィッシュ胚の神経堤細胞の可視化

ノードと走査型電子顕微鏡と蛍光抗体法マウント全体を使用して Gastrulating のマウス胚における脊索板を可視化

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リアルタイムで開発を可視化する多光子タイムラプスイメージング: ゼブラフィッシュ胚の神経堤細胞の可視化