鉄のバイオアベイラビリティに関する知識は、食品中の鉄の栄養価を評価するために不可欠です。Caco-2細胞バイオアッセイは、この重要な研究ニーズを満たすために開発されました。このバイオアッセイは、さまざまな食事からの鉄のバイオアベイラビリティを測定するための費用効果が高く、ハイスループットなアプローチです。
鉄のバイオアベイラビリティに影響を与える因子の特性評価や、in vivo研究の目的の改善に使用できます。手順を実演するのは、私の研究室の研究技術者であるYongpei Changです。まず、Caco-2細胞を7〜10日間培養し、十分な細胞が利用可能になったら、コラーゲンコーティングされていないフラスコに細胞を播種します。
次に、フラスコ内の細胞を7日間増殖させ、別の日に培地を交換します。7日目にマルチウェルプレートを播種するために細胞を使用する。Caco-2細胞を50, 000細胞/センチメートル四方の密度で6ウェルコラーゲンコーティングプレートに播種します。
HEPES、FBS、および1%抗生物質抗真菌溶液を補充したDMEMをプレートに追加します。その後、5%二酸化炭素で摂氏37度で12日間インキュベートします。一貫した毎日のスケジュールで、少なくとも2日ごとに培地を交換し続けます。
次に、パイプ、抗生物質抗真菌溶液、ヒドロコルチゾン、インスリン、セレン、トリヨードチロニンおよび上皮成長因子を添加した最小必須培地を調製する。培養液をこの調製した培地2ミリリットルと交換します。翌日、pH 7の最小必須培地1ミリリットルと交換します。
次に、酸洗浄透析膜を取り付けたシリコンOリングを使用して滅菌インサートリングを作成します。13日目に、冷蔵庫からインサートを取り外し、水を切り、0.5モルの塩酸と交換します。使用前に少なくとも1時間は層流フードに入れたままにしてください。
次に0.5モルの塩酸を排出し、滅菌した18メガオームの水ですすいでください。使用する準備ができるまで、層流フード内の滅菌18メガオームの水に保管してください。6ウェルプレートのセルを含むウェルにリングを挿入して2チャンバーシステムを作成し、インサートを含むプレートをインキュベーターに戻します。
パンクレアチン-胆汁溶液を調製するために、可溶化パンクレアチンおよび胆汁抽出物に87.5グラムの弱陽イオン交換樹脂を加え、室温で30分間振とう機を使用して成分を混合する。スラリーを大きなカラムに注ぎ、カラムを排出します。次に、カラム溶離液を遠心分離します。
滅菌済みの50ミリリットルの遠沈管でサンプルを計量します。塩酸を使用してpHを調整し、140ミリモルの塩化ナトリウムと5ミリモルの塩化カリウムを含む10ミリリットルの生理食塩水を加えます。次に、調製したブタペプシン溶液0.5ミリリットルをサンプルに加えることにより、胃消化プロセスを設定します。
次に、ロッキングシェーカーで摂氏37度で1時間穏やかな設定でインキュベートし、1.0モルの重炭酸ナトリウムでpHを5.5〜6.0に調整することにより、各サンプルの腸内消化プロセスを開始します。各サンプルチューブに2.5ミリリットルのパンクレアチン胆汁溶液を加え、1.0モルの重炭酸ナトリウムでpHを6.9〜7.0に調整します。140ミリモルの塩化ナトリウムと5ミリモルの塩化カリウムを含む溶液を使用して、各チューブに正確に15グラムの総材料が含まれるように液体を追加します。
次に、各腸消化物1.5ミリリットルを、6ウェル培養プレートのCaco-2細胞を含むウェルの上部チャンバーに移します。プレートカバーを元に戻し、摂氏37度で5%の二酸化炭素をロッキングシェーカーで毎分6振動で2時間インキュベートします。ダイジェストと一緒にインサートリングを取り外します。
次に、pH 7の最小必須培地1ミリリットルを各ウェルに加え、プレートをインキュベーターに22時間戻します。次に、細胞培養培地を取り除き、2ミリリットルの18メガオーム水を細胞単層に加えます。それを超音波処理器に移し、細胞タンパク質と細胞フェリチン分析のためにマイクロ遠心管に細胞溶解物全体を収穫します。
マンテカ品種は、2年連続で白と赤のモデル化された色クラスの参照対照と比較して高い鉄の利用可能性を示しました。白豆と黄色の豆の品種からの鉄のバイオアベイラビリティは、それらを小麦粉に加工した後に増加を示しました。しかし、鉄のバイオアベイラビリティは、クランベリー、赤腎臓、黒の品種の減少を示しました。
適切なCaco-2細胞単層培養は、このバイオアッセイの使用を成功させるために不可欠です。成長と維持の詳細に正確に注意を払うことは、バイオアッセイの一貫した応答の鍵です。このモデルは、他のアプローチの欠点と高コストを打ち消し、研究者がメカニズムを特定し、鉄のバイオアベイラビリティを阻害および促進する要因をより完全に評価することを可能にします。
