ジョエル Sanneman とによって、カンザス州立大学獣医学の大学、この手法を開発する努力の彼らのサポートのための資金を提供、共焦点顕微鏡コアの博士 Philine の Wangemann に感謝しますpCBASceI だったマリア Jasin (Addgene プラスミド # 26477) からの贈り物 30。U2OS DR GFP の細胞だったマリア Jasin18からの優しい贈り物です。

このプロトコルは U2OS セル - SceI 認識サイト18の書かれているのでご了承ください。セルは U2OS をする必要はありませんが、-SceI サイトを含める必要があります。プロトコルは、調整された (例えば、播種された細胞およびインキュベーション時間の数) にする必要があります使用される電池の種類に応じて。
1. DSB 修復複合体形成反応の定義
<ol><li>85-90% まで 10 cm 組織培養プレート上の U20S DRGFP のセル成長合流。</li>
	<li>メディアを取り外し、2 分のため EDTA の 3 mL の室温 (RT) で孵化させなさい。</li>
	<li>1 mL のトリプシン EDTA に置き換えるし、5 分細胞が顕微鏡下で表示して板の表面から切り離されることを確認の 37 ° C で孵化させなさい。5 mL のダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) 10% 牛胎児血清 (FBS) と 1% ペニシリン/ストレプトマイシンとトリプシンを中和します。</li>
	<li>細胞診断とトリパン ブルー排除法を使用してこの懸濁液中の濃度を決定します。</li>
	<li>シード 6 x 103細胞/ウェルのガラス底 96 ウェル プレートを 200 μ l 添加。また、12 mm coverslips に 8 mL の種子 4 x 106セルは、10 cm のプレートに配置されます。 注: 各井戸または coverslip コントロールを含む単一の時間ポイントを表します。</li>
	<li>37 ° C、5% CO2で一晩細胞を成長します。</li>
	<li>Dsb を誘導
	<ol>
<li>96 ウェル プレート/10 cm 皿からメディアを交換して H2O2を DMEM + 10% と 25 μ M の濃度に希釈して FBS と 37 ° C 1 時間で孵化させなさい。</li>
		<li>PBS x 1 と 3 x と新鮮な DMEM に置換 10 %fbs と 1% ペニシリン/ストレプトマイシンを添加した細胞を洗浄します。37 ° C、0、1、4、8、24、および 48 h. 各実験に H2O2の新鮮な希釈液を使用することを確認、セルを孵化させなさい。 注: ここで使用される H2O2の濃度で細胞を殺す避けるために、老化とアポトーシス細胞の大部分を回避するよう十分なダメージ量が低いことを確認します。回復プロセスを観察するが重要です。これは、最高用量の範囲に感度を測定することによって達成されます。MTT の試金または使用できる水素過酸化物の最小濃度を決定する他の細胞生存率の試金を実行します。</li>
	</ol></li>
	<li>固定し、細胞の構造
	<ol>
<li>1x PBS で 3 回洗浄を行う。各時点の 10 cm のプレートから観察を外し、24 ウェル プレートを固定するための単一の井戸の配置。針と鉗子を使って、coverslip と coverslip の表面から細胞を傷を避け慎重に取り外します。</li>
		<li>4% パラホルムアルデヒド (PFA) と 15 分のためのインキュベーションでセル指定の H2O2露出と新鮮な DMEM 置換 (0、1、4、8、24、および 48 h) の 1 時間後の時間を修正。</li>
		<li>PBS で 3 回固定 coverslips を洗います。1x PBS で希釈した 0.5% 非イオン性洗剤でセルを permeabilize します。3 x PBS で洗浄する前に常温では、15 分間インキュベートします。 注: 透過後、coverslips の貯蔵可能です PBS で 4 ° C で少なくとも 1 週間の。</li>
	</ol></li>
	<li>複雑な視覚化を修復します。
	<ol>
<li>3% ウシ血清アルブミン (BSA) と 0.1% 非イオン性洗剤 1x PBS で希釈した溶液に 96 ウェル プレート/coverslips をブロック (3 %bsa 溶液) 室温 1 時間</li>
		<li>1x PBS で 3 回を洗う前に常温では、1 h 3 %bsa 溶液の製造元の仕様に従って希釈、関心の修復タンパク質を対象とする一次抗体とインキュベートします。</li>
		<li>96 ウェル プレート/coverslips を 3 %bsa 溶液で製造元のプロトコルに従って希釈した二次抗体とインキュベートします。セカンダリ fluorophores が重複する励起または発光スペクトルを持っていないことを確認します。</li>
		<li>洗浄のセル PBS 3 時間後 1x PBS で製造元の仕様に従って希釈 DAPI を追加し、室温で 5 分間インキュベートします。</li>
		<li>スライド マウント エージェント、ダウン セル側の顔を確かめるのドロップで coverslips をマウントします。慎重に、coverslips、ワイプで任意の余分なマウント エージェントを吸収します。</li>
		<li>速乾性の透明なマニキュアで coverslips をシールし、スライドとカバーガラスの完全なシールを確保します。</li>
		<li>実験にバイアスを導入することを避けるために (興味の DNA 修復遺伝子からの信号) で他のチャネルの前に、DAPI チャネルに焦点を当てて共焦点顕微鏡画像を取る。</li>
		<li>また、目的の地域の Z セクションを取り、すべての検出可能な病巣を可視化する 1 つの平面にイメージを凝縮によって画像を取得できます。 注: DSB 解像度または興味の蛋白質を選択した時点で見られない場合、決定 Dsb が最初の時点の広い範囲を選択することにより解決する場合 (0-48 h 投稿 DSB 誘導)。注目ポイントは、DSB 誘導法と関心の修復タンパク質によって異なります。</li>
	</ol></li>
	<li>蛍光顕微鏡画像の核を定義するのに ImageJ フリーソフトを使用します。 注: 顕微鏡画像を開くには、ImageJ でバイオ形式プラグインをインストールしなければなりません。<ol>
<li>ImageJ の「プラグイン」ツールバーから ImageJ ウィンドウに画像ファイルをドラッグすることによってまたは「バイオ フォーマット インポーター」を選択することによって共焦点画像 (.czi または .tif) を開きます。 注:「バイオ形式インポート オプション」ウィンドウが表示されます。</li>
		<li>構成 DAPI と蛍光画像「バイオ形式インポート オプション」ウィンドウ内に画像を分割する「分割チャンネル」を選択します。</li>
		<li>ドロップ ダウン メニューから「カラー オプション」で「発色」を選択します。DAPI を開き、ヒストン H2AX、"OK"を選択 (H2AX) イメージとして個別のウィンドウに、DAPI イメージを選択します。</li>
		<li>「イメージ」ツールバーと核を選択する「しきい値を調整」オプションを選択します。 注:「しきい値」ウィンドウが表示されます。</li>
		<li>イメージのしきい値を調整するには、完全に「しきい値」ウィンドウの下のバーを右にスライドします。核が明瞭な輪郭と背景黒で完全に赤く表示されるまでは、一番上のバーを調整します。選択して適用。「調整しきい値」ウィンドウを閉じます。</li>
		<li>「分析」ツールバー「分析粒子」オプションを選択します。画面に表示される「分析粒子」ウィンドウを参照してください。</li>
		<li>核の最小サイズを入力します。 注: 入力サイズ以下の粒子は核としてはカウントされません。</li>
		<li>「表示」ドロップ ダウン メニューから「アウトライン」を選択します。「マネージャーに追加」オプションをを選択します。「ROI マネージャー」ウィンドウ開くには"OK"をクリックしてします。 注: 核の概要が別ウィンドウで表示されます。</li>
		<li>「ROI マネージャー」ウィンドウから選択することができます核に番号を割り当てます。</li>
	</ol></li>
	<li>蛍光顕微鏡画像で H2AX 巣を定量化するのに ImageJ を使用します。
	<ol>
<li>(蛍光共役二次抗体で染色)"H2AX"巣ウィンドウを選択します。「プロセス」ツールバーを選択し、、核内で巣を検索する「検索マキシマ」を選択します。 注:「見つけるマキシマ」ウィンドウが開きます。</li>
		<li>「出力の種類」のドロップ ダウン メニューから「シングル ポイント」オプションを選択し、、「プレビュー ポイントの選択」を選択マキシマ/巣を視覚化します。画像 (図 1) の蛍光強度に応じて「ノイズ耐性」の値を入力します。小さな黒い点と白いウィンドウの外観を確認します。 注: これらのドットは、検出されている H2AX 巣/マキシマを表しています。ノイズ許容値は、分析対象のすべてのイメージのために一定に維持されなければなりません。低/高ノイズ耐性は核内であまりにも多くの/いくつかマキシマ (巣) を描くし、核内病巣の正確な表現はできません。</li>
		<li>核「ROI マネージャー」ウィンドウから H2AX 巣を定量化する必要がありますを選択します。「すべて表示」オプションをチェックし、すべての核を選択します。</li>
		<li>選択した核内でマキシマ/巣の数を測定する「測定」を選択します。 注: マキシマ/巣の数が 255、すなわちの倍数として表示されます、1 つの最大値が 255 の「RawIntDen」(統合密度) を読む。</li>
		<li>"RawIntDen"の値をコピーして、データ分析用ソフトウェアを貼り付けること。</li>
	</ol></li>
</ol>2. 長期的な二重鎖 DNA 切断するためのローカリゼーションの分析
<ol><li>96 ウェル プレート/coverslips 前述のセクション 1.1 と 1.2 での種子のセル。</li>
	<li>
二本鎖 DNA 切断の誘導
	<ol>
<li>メーカーの仕様によると脂質ベースのトランスフェクション試薬を用いた - SceI 発現ベクターを細胞を transfect します。エンドヌクレアーゼ表現を最大限にトランスフェクション後の 24-72 時間を待ちます。単数形の大きな核 γ H2AX フォーカスを持つセルを配置することによって、遺伝子導入が成功したかを確認します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
画像の取得
	<ol>
<li>修正を permeabilize、ブロック、および 1.8 のセクションで説明されているように 96 ウェル プレート/coverslips を洗います。</li>
		<li>共同 γ H2AX と関心の修復タンパク質に対する抗体と細胞を孵化させなさい (ここでは、RAD51 に対する主な抗体を使用) 3 %bsa 溶液の製造元の仕様に従って希釈します。</li>
		<li>96 ウェル プレート/coverslips 1x PBS で 3 回洗います。96 ウェル プレート/coverslips を 3 %bsa 溶液で製造元のプロトコルに従って希釈した二次抗体とインキュベートします。セカンダリ fluorophores が重複する励起または発光スペクトルを持っていないことを確認します。</li>
		<li>大規模な核 γ H2AX フォーカスされているセルを識別します。バイアスを避けるためにこれらの細胞の写真を撮るだけ。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
長期的な SceI の解析による巣
	<ol>
<li>大規模な γ H2AX 巣と関心の修復タンパク質の共局在の巣を持つ細胞数をカウントすることによって、手動で長期的な巣を分析します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Lindahl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Instability+and+decay+of+the+primary+structure+of+DNA.">Instability and decay of the primary structure of DNA.</a> Nature. 362 (6422), 709-715 (1993).</li><li>Branzei, D., Foiani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+DNA+repair+throughout+the+cell+cycle.">Regulation of DNA repair throughout the cell cycle.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (4), 297-308 (2008).</li><li>Ciccia, A., Elledge, S. 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著者が明らかに何もありません。

DNA の分析損傷修理一般、二本鎖 DNA 切断の修復具体的には研究の活発な領域その結果基礎生物学6,20に腫瘍にまたがるため。この原稿の詳細14Dsb の修復タンパク質機能を解明するため正確に時間を楽しみ、このメソッドを介して Dsb の解像度に RAD51 と γ H2AX 蛋白質の貢献を暴き出すアプローチを使用できます。修復動態比較とノッ?...

毎日、人間の体のあらゆる細胞は推定 10,000 殺到 DNA 病変1。この実存的な脅威は、セルと同様、突然変異、発癌のリスクが私たちを置く死。ゲノムの忠実性を保護するために哺乳類細胞は一連の複雑な蛋白質の関連付けと修正と DNA 損傷に対応するため進化してきた。この応答は、まとめて DNA 損傷応答 (DDR)2,3と呼ばれる、複数の経路に編成されます。DDR は、DNA 損傷、時間的、空間的調整で DNA 修理蛋白質の蓄積で構成されています。DDR はよく伝搬または破損した DNA2,4、5のレプリケーション中に発生する被害の激化を避けるために細胞周期の停止を誘導します。ターンも、修理が完了した後修理錯体の関連付けを解除によって細胞周期の停止をオフに細胞の生存のため必要です。
DNA 損傷の様々 な種類、Dsb は最も有害があります。Dsb の修復に失敗したは、染色体組換え誘発または全体の染色体腕の損失など大規模な削除につながります。Dsb の修復は 2 経路6,7、8に分かれています。相同組換え (HR) は、姉妹を必要と染色体 DNA のテンプレートとして使用する、従って細胞周期9,10S と G2/M 後期に限られます。非相同末端結合 (NHEJ) は、これらの制限はありませんが、Dsb11,12を修復するときに小さな削除を引き起こすことができます。
DSB 修復具体的、DDR 一般に調査のアクティブな領域。便利な区切られた経路にまとめられ、にもかかわらず多大な冗長性があります。確かに、複数経路13,14,15,16(BRCA1、BRCA2、および例の複雑な RPA) 多くのタンパク質が関与しています。1 つの経路による病変の修復は、別経路14で修復する必要があります中間の損傷につながることができます。必要な時間の正確な量を適切な場所に右の蛋白質を採用、複雑なタスクと組み合わせて、これらの経路の多階層を規制する必要があります。
最近の報告書は、修理複雑な形成、解像度、およびローカリゼーションの各別々 にできる障害17示すことによって DDR の複雑さを強調表示します。次のプロトコルの全体的な目標は、決定的に DSB を修復する細胞の能力を分析することです。蛍光顕微鏡を用いた、Dsb の誘導代表時点で損傷部位で修理蛋白質の蓄積を視覚化できます。
この技術は、一般的に使用される方法をいくつかの利点を持っています。多くの場合、修理は単一の時間ポイントで調査およびアセンブリの動的過程と修理錯体の解離を表すことができません。フル解像度の最初のライセンス認証から修理の完全な範囲を観察することにより、修理の遅れは完全に抑制として誤認されたないこと。逆に、それは当該対策を不活性化することができる修復反応の誘導は通常または過度の活性化として誤認しないことを保証します。
遅延タンパク質複合体形成と修復タンパク質の誤ローカリゼーションただし、可能性があります明確に区別しないでこの方法で。修復タンパク質がミスとローカライズされた局在の遅延か確かめるには、細胞の DNA の酵素の開裂を「長期的な」DSB を導入できます。結果病変はそれが修復された明瞭な大型核修理フォーカスの結果、募集から時間制限を解除するたびに改修されました。これは、長期的な DSB を誘導するまれな切削エンドヌクレアーゼ (例えば、SceI) の使用に既存のアプローチを変更することによって実現できます。Dsb の寿命は、蛍光顕微鏡でとらえどころのない修復タンパク質の可視化を実現。 にします。抗体の品質、低い研究蛋白質が DNA の修復に影響を与えることがわかったときに役に立つかもしれない機能の制限による検出を妨げてと強化された豊かさが可視化を向上することはまた。
特に、我々 は無料の画像処理と解析ソフトウェア (例えばImageJ) について明示的な指示を提供します。これはより多くのオーディエンスに DNA 損傷修復の尋問を開く、画像解析の主要な金融の障壁を削除します。

<table><tbody><tr><td>12 mm Coverslips</td><td>VWR</td><td>89015-725</td><td></td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyde (PFA)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>24-well plate</td><td>VWR</td><td>82050-892</td><td></td></tr><tr><td>96-well glass bottom plate</td><td>Cellvis</td><td>P96-1.5H-N</td><td></td></tr><tr><td>Anti-H2AX Alexa488</td><td>EMD Millipore</td><td>05-636-AF488</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Rad51 (D4B10)&amp;nbsp;</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>8875S</td><td></td></tr><tr><td>Bio-formats plugin for ImageJ</td><td>National Institute of Health (NIH)&amp;nbsp;</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>VWR</td><td>97061-416</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, High Glucose</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12100046</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15576-028</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>VWR</td><td>89510-194</td><td></td></tr><tr><td>Goat Anti-Rabbit IgG Alexa594</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>&amp;nbsp;A-11012&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen Peroxide</td><td>sigma-Aldrich</td><td>216763-100ML</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ Software</td><td>National Institute of Health (NIH)&amp;nbsp;</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td></tr><tr><td>I-SceI Expression Vector</td><td>Addgene</td><td>26477</td><td></td></tr><tr><td>Nail Polish- Insta Dri</td><td>Sally and Hansen</td><td>Clearly Quick (103)</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Bio Basic</td><td>PD8117</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Reagent</td><td>Life Technologies</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049-500ML</td><td></td></tr><tr><td>TurboFect Transfection Reagent</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R0531</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr></tbody></table>

characterizing dna repair processes at transient and long-lasting double-strand dna breaks by immunofluorescence microscopy

DNA の二本鎖切断 (Dsb) の修理は非常に調整されたプロセス、形成し複数タンパク質の修復複合体の解像度が必要です。このプロセスは、関連付けを促進するタンパク質の無数およびこれらの病変に蛋白質の脱退によって規制されています。蛋白質の広大な図書館の機能画面を実行する能力に大部分のおかげで、二本鎖 DNA 切断の修復に必要な遺伝子のより深い理解があります。よくノックアウトまたは化学的阻害剤スクリーンは、DSB の修復に必要な蛋白質のマーカーとして高められた毒性を使用して修理プロセスに関与する蛋白質を識別します。識別する新規細胞タンパク質ゲノムの忠実性を維持に関与するに役立つ、機能解析が必要です興味の蛋白質は、ローカリゼーション、形成、または修復複合体の解像度を促進するかどうかの決定。
蛍光顕微鏡による、明瞭な核の巣として修理蛋白質の蓄積を容易に検出できます。したがって、DNA 損傷のサイトでこれらの蛋白質の加盟および脱退は、二本鎖 DNA 切断の誘導後代表的な間隔でこれらの核の巣を観察することによってアクセスできます。このアプローチは、修理欠陥が修理不完全な遅れに同時に発生しない場合も誤ローカライズされた修復因子蛋白質を識別できます。このシナリオでは、長期的な二重鎖 DNA 切断は細胞と酵素の認識部位が細胞のゲノムに統合されました珍しい切削エンドヌクレアーゼ (例えば、SceI) を表現することによって設計することができます。結果として得られる病変は特に忠実な修復酵素の認識部位、胸の谷間の別のラウンドをプロンプトを再導入すると解決するは難しい。その結果、修復の動態の違いが解消されます。修理錯体が形成されていない場合、ローカリゼーションは妨害されました。このプロトコルでは、修復反応として修復タンパク質の局在の変化を識別するために必要な方法について説明します。

図 1は、ImageJ を用いたマキシマ/巣定量化のため正しいノイズ差別の選択を示しています。DAPI のイメージをマージし、関心の修復タンパク質は、左のパネルにあります。図 1 aは 90 のノイズの識別を示していて、巣の正しい数をマークします。エッジ (ピンクの矢印で描かれている) (黄色の矢印で表示) 核外の巣で核は定量?...

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Characterizing DNA Repair Processes at Transient and Long-lasting Double-strand DNA Breaks by Immunofluorescence Microscopy

二本鎖 DNA 切断の修復は、病変を対処した後、休憩だけでなく、その解像度で修復複合体の形成だけではなくを必要とする動的なプロセスです。ここは、蛍光顕微鏡過渡的かつ長期的な二本鎖切断ツールとしてこのゲノム維持機構を解剖します。

蛍光顕微鏡を用いた過渡的長期的な二本鎖 DNA 切断の DNA 修復プロセスの特性

The repair of double-stranded breaks (DSBs) in DNA is a highly coordinated process, necessitating the formation and resolution of multi-protein repair ...

characterizing-dna-repair-processes-at-transient-long-lasting-double

Research

JoVE Journal

Cancer Research

9.0K ビュー.  Kansas State University. 二本鎖 DNA 切断の修復は、病変を対処した後、休憩だけでなく、その解像度で修復複合体の形成だけではなくを必要とする動的なプロセスです。ここは、蛍光顕微鏡過渡的かつ長期的な二本鎖切断ツールとしてこのゲノム維持機構を解剖します。

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Application of Laser Micro-irradiation for Examination of Single and Double Strand Break Repair in Mammalian Cells

Highly coordinated DNA repair pathways exist to detect, excise and replace damaged DNA bases, and coordinate repair of DNA strand breaks. While molecular biology techniques have clarified structure, enzymatic functions, and kinetics of repair proteins, there is still a need to understand how repair is coordinated within the nucleus. Laser micro-irradiation offers a powerful tool for inducing DNA damage and monitoring the recruitment of repair proteins. Induction of DNA damage by laser micro-irradiation can occur with a range of wavelengths, and users can reliably induce single strand breaks, base lesions and double strand breaks with a range of doses. Here, laser micro-irradiation is used to examine repair of single and double strand breaks induced by two common confocal laser wavelengths, 355 nm and 405 nm. Further, proper characterization of the applied laser dose for inducing specific damage mixtures is described, so users can reproducibly perform laser micro-irradiation data acquisition and analysis.

Confocal fluorescence microscopy and laser micro-irradiation offer tools for inducing DNA damage and monitoring the response of DNA repair proteins in selected sub-nuclear areas. This technique has significantly advanced our knowledge of damage detection, signaling, and recruitment. This manuscript demonstrates these technologies to examine single and double strand break repair.

マイクロ レーザーの単一の試験と哺乳類細胞における二重鎖切断修復のためのアプリケーション

Highly coordinated DNA repair pathways exist to detect, excise and replace damaged DNA bases, and coordinate repair of DNA strand breaks. While molecular ...

がん研究

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of programmed DNA breaks in lymphocytes. The Ataxia-Telangiectasia Mutated kinase (ATM), ATM- and Rad3-Related kinase (ATR) and the catalytic subunit of DNA-dependent Protein Kinase (DNA-PKcs) are among the first that are activated upon induction of DNA damage, and are central regulators of a network that controls DNA repair, apoptosis and cell survival. As part of a tumor-suppressive pathway, ATM and ATR activate p53 through phosphorylation, thereby regulating the transcriptional activity of p53. DNA damage also results in the formation of so-called ionizing radiation-induced foci (IRIF) that represent complexes of DNA damage sensor and repair proteins that accumulate at the sites of DNA damage, which are visualized by fluorescence microscopy. Co-localization of proteins in IRIFs, however, does not necessarily imply direct protein-protein interactions, as the resolution of fluorescence microscopy is limited. 
In situ Proximity Ligation Assay (PLA) is a novel technique that allows the direct visualization of protein-protein interactions in cells and tissues with unprecedented specificity and sensitivity. This technique is based on the spatial proximity of specific antibodies binding to the proteins of interest. When the interrogated proteins are within ~40 nm an amplification reaction is triggered by oligonucleotides that are conjugated to the antibodies, and the amplification product is visualized by fluorescent labeling, yielding a signal that corresponds to the subcellular location of the interacting proteins. Using the established functional interaction between ATM and p53 as an example, it is demonstrated here how PLA can be used in suspension cell cultures to study the direct interactions between proteins that are integral parts of the DNA damage response.

Here, it is demonstrated how the in situ Proximity Ligation Assay (PLA) can be used to detect and visualize the direct protein-protein interactions between ATM and p53 in suspension cell cultures exposed to genotoxic stress.

近接ライゲーションアッセイを用いた懸濁細胞培養におけるDNA損傷誘発タンパク質複合体の検出と可視化

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

生化学

Immunofluorescence Microscopy of &#947;H2AX and 53BP1 for Analyzing the Formation and Repair of DNA Double-strand Breaks

DNA double-strand breaks (DSB) are serious DNA lesions. Analysis of the formation and repair of DSB is relevant in a broad spectrum of research areas including genome integrity, genotoxicity, radiation biology, aging, cancer, and drug development. In response to DSB, the histone H2AX is phosphorylated at Serine 139 in a region of several megabase pairs forming discrete nuclear foci detectable by immunofluorescence microscopy. In addition, 53BP1 (p53 binding protein 1) is another important DSB-responsive protein promoting repair of DSB by nonhomologous end-joining while preventing homologous recombination. According to the specific functions of &#947;H2AX and 53BP1, the combined analysis of &#947;H2AX and 53BP1 by immunofluorescence microscopy may be a reasonable approach for a detailed analysis of DSB. This manuscript provides a step-by-step protocol supplemented with methodical notes for performing the technique. Specifically, the influence of the cell cycle on &#947;H2AX foci patterns is demonstrated in normal fibroblasts of the cell line NHDF. Further, the value of the &#947;H2AX foci as a biomarker is depicted in x-ray irradiated lymphocytes of a healthy individual. Finally, genetic instability is investigated in CD34+ cells of a patient with acute myeloid leukemia by immunofluorescence microscopy of &#947;H2AX and 53BP1.

This manuscript provides a protocol for the analysis of DNA double-strand breaks by immunofluorescence microscopy of &#947;H2AX and 53BP1.

ΓH2AX、53BP1 形成と DNA 二重鎖切断の修復を分析するための蛍光顕微鏡観察

DNA double-strand breaks (DSB) are serious DNA lesions. Analysis of the formation and repair of DSB is relevant in a broad spectrum of research areas ...

Immunofluorescence Imaging of DNA Damage and Repair Foci in Human Colon Cancer Cells

The purpose of the manuscript is to provide a step-by-step protocol for performing immunofluorescence microscopy to study the radiation-induced DNA damage response induced by neutron-gamma mixed-beam used in boron neutron capture therapy (BNCT). Specifically, the proposed methodology is applied for the detection of repair proteins activation which can be visualized as foci using antibodies specific to DNA double-strand breaks (DNA-DSBs). DNA repair foci were assessed by immunofluorescence in colon cancer cells (HCT-116) after irradiation with the neutron-mixed beam. DNA-DSBs are the most genotoxic lesions and are repaired in mammalian cells by two major pathways: non-homologous end-joining pathway (NHEJ) and homologous recombination repair (HRR). The frequencies of foci, immunochemically stained, for commonly used markers in radiobiology like &#947;-H2AX, 53BP1 are associated with DNA-DSB number and are considered as efficient and sensitive markers for monitoring the induction and repair of DNA-DSBs. It was established that &#947;-H2AX foci attract repair proteins, leading to a higher concentration of repair factors near a DSB. To monitor DNA damage at the cellular level, immunofluorescence analysis for the presence of DNA-PKcs representative repair protein foci from the NHEJ pathway and Rad52 from the HRR pathway was planned. We have developed and introduced a reliable immunofluorescence staining protocol for the detection of radiation-induced DNA damage response with antibodies specific for repair factors from NHEJ and HRR pathways and observed radiation-induced foci (RIF). The proposed methodology can be used for investigating repair protein that is highly activated in the case of neutron-mixed beam radiation, thereby indicating the dominance of the repair pathway.

Radiation-induced DNA damage response activated by neutron mixed-beam used in boron neutron capture therapy (BNCT) has not been fully established. This protocol provides a step-by-step procedure to detect radiation-induced foci (RIF) of repair proteins by immunofluorescence staining in human colon cancer cell lines after irradiation with the neutron-mixed beam.

ヒト大腸癌細胞におけるDNA損傷および修復病巣の免疫蛍光イメージング

The purpose of the manuscript is to provide a step-by-step protocol for performing immunofluorescence microscopy to study the radiation-induced DNA damage ...

Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging (ESI)

The limits to optical resolution and the challenge of identifying specific protein populations in transmission electron microscopy have been obstacles in cell biology. Many phenomena cannot be explained by in vitro analysis in simplified systems and need additional structural information in situ, particularly in the range between 1 nm and 0.1 &#181;m, in order to be fully understood. Here, electron spectroscopic imaging, a transmission electron microscopy technique that allows simultaneous mapping of the distribution of proteins and nucleic acids, and an expression tag, miniSOG, are combined to study the structure and organization of DNA double-strand break repair foci.

Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging ESI

Electron spectroscopic imaging can image and distinguish nucleic acid from protein at nanometer resolution. It can be combined with the miniSOG system, which is able to specifically label tagged proteins in transmission electron microscopy samples. We illustrate the use of these technologies using double-strand break repair foci as an example.

電子分光イメージングと組み合わせたminiSOGタグ付きのDNA修復タンパク質の可視化（ESI）

The limits to optical resolution and the challenge of identifying specific protein populations in transmission electron microscopy have been obstacles in ...

生物学

Advanced Confocal Microscopy Techniques to Study Protein-protein Interactions and Kinetics at DNA Lesions

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological approach to analyzing protein kinetics at DNA lesions over time or protein-protein interactions on locally microirradiated chromatin. We also show how to recognize individual phases of the cell cycle using the Fucci cellular system to study cell-cycle-dependent protein kinetics at DNA lesions. A methodological description of the use of two UV lasers (355 nm and 405 nm) to induce different types of DNA damage is also presented. Only the cells microirradiated by the 405-nm diode laser proceeded through mitosis normally and were devoid of cyclobutane pyrimidine dimers (CPDs). We also show how microirradiated cells can be fixed at a given time point to perform immunodetection of the endogenous proteins of interest. For the DNA repair studies, we additionally describe the use of biophysical methods including FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) and FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) in cells with spontaneously occurring DNA damage foci. We also show an application of FLIM-FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) in experimental studies of protein-protein interactions.

Laser microirradiation is a useful tool for studies of DNA repair in living cells. A methodological approach for the use of UVA lasers to induce various DNA lesions is shown. We have optimized a method for local microirradiation that maintains the normal cell cycle; thus, irradiated cells proceed through mitosis.

タンパク質-タンパク質相互作用や DNA 損傷速度論を研究する共焦点の顕微鏡検査の技術を高度な

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological ...

Visualization of DNA Repair Proteins Interaction by Immunofluorescence

Mammalian cells are constantly exposed to chemicals, radiations, and naturally occurring metabolic by-products, which create specific types of DNA insults. Genotoxic agents can damage the DNA backbone, break it, or modify the chemical nature of individual bases. Following DNA insult, DNA damage response (DDR) pathways are activated and proteins involved in the repair are recruited. A plethora of factors are involved in sensing the type of damage and activating the appropriate repair response. Failure to correctly activate and recruit DDR factors can lead to genomic instability, which underlies many human pathologies including cancer. Studies of DDR proteins can provide insights into genotoxic drug response and cellular mechanisms of drug resistance.
There are two major ways of visualizing&#160;proteins in vivo: direct observation, by tagging the protein of interest with a fluorescent protein and following it by live imaging, or indirect immunofluorescence on fixed samples. While visualization of fluorescently tagged proteins allows precise monitoring over time, direct tagging in N- or C-terminus can interfere with the protein localization or function. Observation of proteins in their unmodified, endogenous version is preferred. When DNA repair proteins are recruited to the DNA insult, their concentration increases locally and they form groups, or &#8220;foci&#8221;, that can be visualized by indirect immunofluorescence using specific antibodies.
Although detection of protein foci does not provide a definitive proof of direct interaction, co-localization of proteins in cells indicates that they regroup to the site of damage and can inform of the sequence of events required for complex formation. Careful analysis of foci spatial overlap in cells expressing wild type or mutant versions of a protein can provide precious clues on functional domains important for DNA repair function. Last, co-localization of proteins indicates possible direct interactions that can be verified by co-immunoprecipitation in cells, or direct pulldown using purified proteins.

Following DNA damage, human cells activate essential repair pathways to restore the integrity of their genome. Here, we describe the method of indirect immunofluorescence as a means to detect DNA repair proteins, analyze their spatial and temporal recruitment, and help interrogate protein-protein interaction at the sites of DNA damage.

免疫蛍光によるDNA修復タンパク質相互作用の可視化

Mammalian cells are constantly exposed to chemicals, radiations, and naturally occurring metabolic by-products, which create specific types of DNA ...

Visualizing and Quantifying Endonuclease-Based Site-Specific DNA Damage

Cells are continuously exposed to various DNA damaging agents, inducing different cellular responses. Applying biochemical and genetic approaches is essential in revealing cellular events associated with the recruitment and assembly of DNA repair complexes at the site of DNA damage. In the last few years, several powerful tools have been developed to induce site-specific DNA damage. Moreover, novel seminal techniques allow us to study these processes at the single-cell resolution level using both fixed and living cells. Although these techniques have been used to study various biological processes, herein we present the most widely used protocols in the field of DNA repair, Fluorescence Immunostaining (IF) and Chromatin Immunoprecipitation (ChIP), which in combination with endonuclease-based site-specific DNA damage make it possible to visualize and quantify the genomic occupancy of DNA repair factors in a directed and regulated fashion, respectively. These techniques provide powerful tools for the researchers to identify novel proteins bound to the damaged genomic locus as well as their post-translational modifications necessary for their fine-tune regulation during DNA repair.

This article introduces essential steps of immunostaining and chromatin immunoprecipitation. These protocols are commonly used to study DNA damage-related cellular processes and to visualize and quantify the recruitment of proteins implicated in DNA repair.

エンドヌクレアーゼベースの部位特異的DNA損傷の可視化と定量化

Cells are continuously exposed to various DNA damaging agents, inducing different cellular responses. Applying biochemical and genetic approaches is ...

RPA2免疫蛍光染色によるG1期一本鎖DNA病巣の検出

Visualizing Single-Stranded DNA Foci in the G1 Phase of the Cell Cycle

DNA has dedicated cellular repair pathways capable of coping with lesions that could arise from both endogenous and/or exogenous sources. DNA repair necessitates collaboration between numerous proteins, responsible for covering a broad range of tasks from recognizing and signaling the presence of a DNA lesion to physically repairing it. During this process, tracks of single-stranded DNA (ssDNA) are often created, which are eventually filled by DNA polymerases. The nature of these ssDNA tracks (in terms of both length and number), along with the polymerase recruited to fill these gaps, are repair pathway-specific. The visualization of these ssDNA tracks can help us understand the complicated dynamics of DNA repair mechanisms.
This protocol provides a detailed method for the preparation of G1 synchronized cells to measure ssDNA foci formation upon genotoxic stress. Using an easy-to-utilize immunofluorescence approach, we visualize ssDNA by staining for RPA2, a component of the heterotrimeric replication protein A complex (RPA). RPA2 binds to and stabilizes ssDNA intermediates that arise upon genotoxic stress or replication to control DNA repair and DNA damage checkpoint activation. 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) staining is used to visualize DNA replication to exclude any S phase cells. This protocol provides an alternative approach to the conventional, non-denaturing 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU)-based assays and is better suited for the detection of ssDNA foci outside the S phase.

著者スポットライト:治療上の洞察のためのDNA修復中の一本鎖DNAの可視化 

The following protocol presents the detection of single-stranded DNA foci in the G1 phase of the cell cycle utilizing cell cycle synchronization followed by RPA2 immunofluorescent staining.

細胞周期のG1期における一本鎖DNA病巣の可視化

DNA has dedicated cellular repair pathways capable of coping with lesions that could arise from both endogenous and/or exogenous sources. DNA repair ...

蛍光顕微鏡を用いた過渡的長期的な二本鎖 DNA 切断の DNA 修復プロセスの特性

要約

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マイクロレーザーの単一の試験と哺乳類細胞における二重鎖切断修復のためのアプリケーション

近接ライゲーションアッセイを用いた懸濁細胞培養におけるDNA損傷誘発タンパク質複合体の検出と可視化

ΓH2AX、53BP1 形成と DNA 二重鎖切断の修復を分析するための蛍光顕微鏡観察

ヒト大腸癌細胞におけるDNA損傷および修復病巣の免疫蛍光イメージング

電子分光イメージングと組み合わせたminiSOGタグ付きのDNA修復タンパク質の可視化（ESI）

タンパク質-タンパク質相互作用や DNA 損傷速度論を研究する共焦点の顕微鏡検査の技術を高度な

免疫蛍光によるDNA修復タンパク質相互作用の可視化

エンドヌクレアーゼベースの部位特異的DNA損傷の可視化と定量化

細胞周期のG1期における一本鎖DNA病巣の可視化

細胞周期のG1期における一本鎖DNA病巣の可視化

蛍光顕微鏡を用いた過渡的長期的な二本鎖 DNA 切断の DNA 修復プロセスの特性

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マイクロ レーザーの単一の試験と哺乳類細胞における二重鎖切断修復のためのアプリケーション

近接ライゲーションアッセイを用いた懸濁細胞培養におけるDNA損傷誘発タンパク質複合体の検出と可視化

ΓH2AX、53BP1 形成と DNA 二重鎖切断の修復を分析するための蛍光顕微鏡観察

ヒト大腸癌細胞におけるDNA損傷および修復病巣の免疫蛍光イメージング

電子分光イメージングと組み合わせたminiSOGタグ付きのDNA修復タンパク質の可視化（ESI）

タンパク質-タンパク質相互作用や DNA 損傷速度論を研究する共焦点の顕微鏡検査の技術を高度な

免疫蛍光によるDNA修復タンパク質相互作用の可視化

エンドヌクレアーゼベースの部位特異的DNA損傷の可視化と定量化

細胞周期のG1期における一本鎖DNA病巣の可視化

細胞周期のG1期における一本鎖DNA病巣の可視化

マイクロレーザーの単一の試験と哺乳類細胞における二重鎖切断修復のためのアプリケーション