提示された作品は、SNF Ambizione 親睦 (PZ00P2_142533) とベルックス研究助成 (Amplebig) によって支えられました。については実験的な作品をベティーナ ワーグナーに感謝したいと思います。

1. 生態系の選択とバイオ フィルム サンプリング
<ol><li>興味の水圏生態系を選択し、バイオ フィルムが成長サンプリング サイトを検索します。中の水の流れが遅いとストリームの浅い部分、石河床のバイオ フィルムの添付ファイルの適切な17,18。</li>
	<li>オプション: サイトにバイオ フィルムの添付ファイル、またはサイト内のバイオ フィルムのバラツキを減らすこと十分なサーフェスがあるない場合人工バイオ フィルム添付ファイル (例えばスライド ガラス、セラミック タイル) 基板に配置サイトことを確認しながら彼らは水の流れについては、同じような深さと光強度19で同じ方向に配置されます。</li>
	<li>サンプリングのサイト、光の強度を測定する携帯用装置を使用で環境条件を決定する水の温度、電気伝導度、酸素、表面のバイオ フィルムの真上の pH をからサンプリングすることです。サンプリングのコースで、平均値を計算するために繰り返し測定 (3-5) を取る。</li>
	<li>オプション: 関連する決定するために取る水試料水化学パラメーター (溶存有機炭素 (DOC)、K+、ナ+、Ca2 +Mg2 +、Cl-、F - その4-2、PO42-、3-2、SiO44 -)。</li>
	<li>保護手袋を使用して、各サイト (または人工基) から (サイズ、形状、および種類) に匹敵する石を収集します。石は、同様の流れと光条件18にさらされる必要があります。</li>
	<li>0.22 μ m フィルターをサイトから十分な河川水をフィルター (例えば、 1 サンプルあたり 15 mL) すべての収集のサンプルの準備ができます。</li>
	<li>柔らかい歯ブラシを使用して、フィルター選択されたストリーム水20の 15 ml フラスコ (ブラシすべてバイオ フィルムが除去されるまで) に基板からバイオを削除します。</li>
	<li>0.01% パラホルムアルデヒドと 0.1% グルタルアルデヒド21のサンプルを修正します。</li>
</ol>2. 最適な流れ-フローサイトメトリー (FC) パラメーターの決定
<ol><li>光顕微鏡とサブサンプルを転送 (X/0.75 40 を使用して目的; 必要な場合 100 × 1.3 油目的) サンプル22,23の種を識別し、。</li>
	<li>識別される注文適切なカルチャのコレクションから単一の種 (例えば実験的藻類やゲッティンゲン大学 [EPSAG] で藻類の文化コレクション [CCAC] ケルン大学で藻類の文化コレクション場合監視される中央ヨーロッパの生態系における)。</li>
	<li>同様の環境条件 (例えば光、温度、pH) で継続的に単一の種をバイオ フィルムがから採取された環境に育ちます。1 ° C と 0.5 内滞在環境試料から pH ポイントをお勧めします。</li>
	<li>デタッチ/細胞の分散、遠沈管に単一種のサンプルの 15 mL を入れて水お風呂の中央にチューブを入れし、水没、試料の液体の表面がお風呂の表面と同じレベルでされるように。超音波照射 45 kHz24,25で 1 分のサンプル</li>
	<li>プレート リーダーを使用して単一種の吸収及び蛍光スペクトルを記録します。プレート リーダーの指示のための選択を参照してください。この例では、200 μ L のサンプル量で読み込まれた 96 ウェル平底透明ポリスチ板と吸光度を測定しました。(使用する設定: (a) 蛍光スキャン モード; 発光波長ステップ サイズを 10 nm、発光スキャン数 30、帯域幅 20 nm、100 を得る 25 点滅、20 米国統合時間または (b) 吸光度スキャン モード; 25 が点滅し、帯域幅 9 nm)。</li>
	<li>レーザー、ダイクロイック スプリッター フィルターの組み合わせで異なる種が特定のプロパティをあるすべてのそれらの蛍光の範囲をカバーすると流れの cytometer を設定します。中央ヨーロッパのストリームで、405 nm、488 nm と 638 nm レーザー役に立つ結果を生成します。</li>
	<li>サンプルのすべてのイベントの少なくとも 99% を含める (すべての流れの cytometers は適用されません) のフォトマルの電圧設定と測定された蛍光の範囲を調整します。</li>
	<li>また、種バイオ フィルムの存在に関する知識を使用できる場合は、手順 2.2 から始めます。蛍光特性がわかっている場合は、ステップ 2.6 開始します。</li>
</ol>3. オプション: 準備流れフローサイトメトリーによるリファレンス ・ データベースの
注: FC にはバイオ フィルム中の現在のセルの分類同定はできません。FC として、バイオ フィルムと同様の条件で栽培、バイオ フィルムに存在する知られている単一種の測定の参照データベースは、データの解釈を助けることができます。
<ol><li>
参照: 単一種
	<ol>
<li>最適化された FC パラメーターを使用して 2.5-7 で設定、単一の種 (パラホルムアルデヒドとグルタルアルデヒドで固定し、流れの cytometer の適切なサイズのフィルターで濾過) の光と蛍光特性を測定します。</li>
		<li>バイオ フィルム (ステップ 6.1.2 を参照) からのデータと同じ方法で単一種からデータを正規化します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
破損や腐食セルを参照する: バイオ健康の最も重要な指標の一つは、破損している死んでいる細胞バイオ フィルム中に存在の一部です。これらの細胞を定量化するには、腐食のセル参照を作成できます。<ol>
<li>希釈したバイオ フィルムの 1 mL のサブサンプルを取り出して卓上遠心分離機で 10 分間室温 8,000 × gで遠心分離機のそれら。1 mL 90% エタノールで結果として得られるペレットを中断し、4 ° C で一晩懸濁液を保存次の日を繰り返します。</li>
		<li>FC に最適化された設定を使用すると、破損や腐食セル (固定およびフィルター処理) の光と蛍光特性を測定します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
参照: microplastics メモ:バイオ フィルムにおける塑性粒子を監視に興味がある場合、彼らが十分に異なるかどうか確認光生物粒子および識別のため蛍光特性から。<ol>
<li>Microplastics プロデューサーの指示に従って塑性粒子を中断し、(2.7 から FC パラメーターを使用して) その光と蛍光特性を測定します。</li>
		<li>バイオ フィルムのサンプルに塑性粒子を追加し、4 ° C で 1 泊以上を残す</li>
		<li>サスペンションと上記と同じ FC パラメーターでメジャーをフィルターします。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 試料の調製及び保管
<ol><li>設定されている FC と FC リファレンス ・ データベースが準備ができて、1 つは 1.1-7 の手順に従って採取した新鮮なバイオ フィルム試料の評価を続行できます。デタッチ/分散バイオを遠沈管に (ステップ 1.7 参照) フラスコからサンプル 15 mL を転送します。</li>
	<li>水槽の中央に各チューブを入れて、水没して試料の液体の表面がお風呂の表面と同じレベルで。超音波照射 45 kHz で 1 分のサンプル</li>
	<li>0.01% パラホルムアルデヒドと 0.1% グルタルアルデヒド (nanopure 水の株式) のサンプルを修正します。解析の準備ができるまで 4 ° C で保存します。</li>
	<li>重要: フローサイトメトリー分析用サンプルの半分を使用してストレージの安全のため、蛍光活性化細胞ソーティングや光学顕微鏡 (セクション 6 を参照) を持つ省略可能な検証のために半分。 :に注意してください、冷蔵庫に保管、固定バイオ フィルム サンプル保つ必要がありますその光と蛍光特性まで 3 週間。</li>
</ol>5. FC を通してサンプルの実行
<ol><li>サンプルが冷蔵庫の中に格納されていた場合、それらをすばやく超音波または粒子を分離する数回をピペットします。計測する前に 50 μ m フィルター (フィルター サイズは FC 毛細血管の幅によって異なります) と、サブサンプルをフィルターします。</li>
	<li>個々 のサンプルを読み込む (これは使用される流れの cytometer で依存 1-2 mL) 流れの cytometer に各粒子の光と蛍光特性を測定し、。各生物の複製 (3 つの技術的なレプリケートします) 3 回測定を繰り返します。</li>
	<li>.Csv 形式で FC からデータをエクスポートします。</li>
</ol>6. データの準備・相関分析
FC は、各測定の光学特性および蛍光範囲のいくつかのパラメーター (例えば、信号領域、高さ、幅) を分析できます。測定された変数の相関分析を実行して高い相関されていないこれらの測定のみ。これは通常 (例えば、信号領域) 1 つの FC パラメーターがすべて削除され、関連付けることがまた削除高い蛍光測定 (通常同じレーザーを発すると隣接するフィルター)。
<ol><li>
Matlab のツールボックスとしてチトクロームを実行します。
	<ol>
<li>CYT ソフトウェア16などすべての技術と生物学的に分析することをすべてのサンプルから .csv 形式でインポート削減 FC データをレプリケートします。([+、ファイル フィルター *.csv、インポート ファイルを選択) します。</li>
		<li>逆双曲線正弦変換を使用してすべてのサンプルの蛍光のチャンネルを変換します。補因子の値は、選択する必要があります。最も光合成バイオ フィルムと流れの cytometers が最適化の 150 作品特定の実験のセットアップと従属栄養性バイオ フィルムの必要があります。(右-クリック/変換/入力因子 150)</li>
		<li>品質管理、視覚的に、(CYT) で個々 のサンプルとレプリケーションの技術および生物学的レベルで異常値がないかどうかを確認する個々 の光や蛍光灯チャンネルのヒストグラムを比較します。外れ値は、複製間大幅シフト蛍光/光分布で現れます。(チャンネル] を選択 [データ プロット)<ol>
<li>代替方法: は蛍光分布の平均値を主成分分析 (PCA) を実行し、技術、生物学的複製クラスター一緒にかどうかを確認します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>差し込み印刷技術は各生物の複製で複製し、それぞれ同じ数のパーティクル (セル、セル フラグメントおよび非生物的微粒子) で表現されます、ので、粒子の総数によって分析、生物の複製をサブサンプリング埋め込み (bh SNE) バーンズ小屋確率隣人は、約 150,000 (最高の可視化結果の26) のためです。(データを右クリックし、マージ/サブサンプルを選択)</li>
		<li>サンプルの比較は、比較されるべきサンプルのみを選択することが重要です。サンプルを選択し、bh SNE27を実行します。アルゴリズムが完了、新しいチャンネルと、名前付きの bh SNE1 と bh SNE2 が表示されます。これらは、散布 (viSNE マップ) のデータの視覚化に使用できるすべての分析された粒子の SNE 座標です。(データを選択、チャンネル、右クリック、bh SNE を選択、正規化されたデータをはい)</li>
		<li>ViSNE マップで粒子の類似性に従って配置や視覚的に分離可能なクラスターにグループ化されます。それらはよく分かれている、CYT 用意されている描画ツールを使用して、異なる光/蛍光特性クラスターとマークと名前の光/蛍光プロパティの検査します。(選択チャネル bh SNE1、bh SNE2)</li>
		<li>オプション: 単一微生物種 (と同じフローサイトメトリー測定し、同様の条件で成長した!) のリファレンス ・ データベースを使用する場合は、Matlab に viSNE マップをエクスポートし、マップ上にリファレンス ・ データベースをプロジェクトします。このように、特定のクラスターは、特定種/分類学的グループ (https://github.com/anzezupanic/FC_analysis でダウンロード可能なスクリプト) に接続できます。(セッション/保存)</li>
		<li>トラブルシューティング: bh SNE 解析に視覚的に分離可能なクラスターが単一の大きなものを返さない場合に多くのパーティクルで使用された bh SNE。サンプルごとのパーティクル量を減らして再度実行してください。クラスターがスパースではなく個々 のポイントがない場合は、使用される粒子の数を増やします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>オプション: bh-SNE のクラスタ リングに依存せず、他のクラスタ リング手法 (例えば、階層、重心ベースまたはクラスタ リングに基づく密度) 正規化されたデータで使用でき (https://github.com/ viSNE 地図上に重ねられますanzezupanic/FC_analysis)。</li>
	<li>クラスターを特定したら、各サンプルの各生物の複製に属する各クラスター内のパーティクルの数をカウントします。適切な (例えばホームズ) と ANOVA および Tukey のテストを使用して、サンプル間の違いを評価する多重比較補正。</li>
</ol>7. オプション: 検証蛍光活性化細胞ソーティングを使用してクラスターの解釈
<ol><li>クラスターを特定したら、FACS がレーザーと蛍光フィルターの類似 (または同一) 構成サンプル必要な場合それらをソートするのに蛍光活性化セル (FACS) を並べ替えを使用します。</li>
	<li>それぞれの特定されたクラスターの CYT クラスターを定義する光と蛍光のゲートがあります。各クラスター、FACS で粒子を整理し、光学顕微鏡を使用して並べ替えられた細胞を識別するこれらのゲートを使用します。</li>
</ol>

<ol>
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著者が明らかに何もありません。

上記で説明したプロトコルは比較的簡単に実装です。しかし、提示された既定の設定がすべて光合成バイオ フィルムはこれまでテストに適していることが示されている、(プロトコルで説明) の最適化はメソッドから得られる情報を最大限に必要です。確かに、バイオ フィルムの光と蛍光特性環境条件 (季節、温度、水の化学組成)1によって異なることができます。そのため?...

バイオ フィルムは微生物や生態系における生物多様性の分布に影響を与える第一次生産、栄養循環や水の浄化に至る、淡水の生態系で重要な役割を再生する微生物の動的コンソーシアム1。 彼らのコミュニティの構造がより寛容種2,3に向けて迅速にシフト バイオ フィルムは化学薬品、ストレス、環境の変化にさらされているとき。感度が高くは、しかし、現在の方法のどれも実際に迅速かつ簡単な方法でバイオ フィルムのコミュニティのダイナミックをトレースに最適です環境監視4、魅力的なモデル システムにバイオ フィルムを回します。
一般的に使用される一連のバイオ フィルムを特徴付けるメソッドは機能的及び構造的エンドポイントの測定から成っています。社会全体のレベルで細胞外酵素の活動と同様、光合成と呼吸の活動情報を提供バイオ5,6,7,8 の機能の状態に ,9。バイオマスの発生は全体的なバイオ フィルムの成長の指標として使用されます。構造変更現在測定顕微鏡またはヌクレオチド ベースの技術 (例えば、勾配ゲル電気泳動法 (dgge 法)、自動化されたリボソーム遺伝子間スペーサーを変化させる伝統的な種の同定を使用してのいずれかメタゲノム解析 (アリサ))10、11,12。これらのメソッドは、情報を提供するが、特定の知識を必要とする、または実行に時間がかかり、またはまだ開発中でいます。最後に、新しい細胞外高分子物質 (EPS)13,14とバイオ アーキテクチャの1、敏感な中評価法低スループットし、に向かって開発されていません。監視の目的。
淡水のバイオ フィルムの完全な特性評価、それはバイオ フィルムの機能、構成とアーキテクチャに洞察力を提供するいくつかの異なる方法を組み合わせる必要は明らかです。環境モニタリングのため、他の一方で、バイオ フィルムの変化を検出し、機能と構造のレベルでシフトの基本的な生物学的解釈を有効にすることができる高速で機密性の高いメソッドが必要です。
監視目的のため、十分に高速であり同時にバイオ フィルムのコミュニティのための十分な情報を提供します。 ストリームのバイオ フィルム (河床) の光合成のコンポーネントの微生物群集特性に対する新しい方法を開発しています。15生物学的解釈を許容する構造。それは単一セル フローサイトメトリー (FC) バイオ フィルムのサンプルに基づいており、計算可視化と相まって単一セルのレベルのバイオ フィルムの光や蛍光灯の特性に関する情報を提供します。
バイオ フィルムのサンプリング後のワークフローは、超音波処理、固定とフローサイトメトリーによるサンプルを評価することによって続いてサンプルのサイズに基づくフィルタ リングの形態の試料で構成されます。取得したデータは、1 回の測定で複数の細胞特性の情報: 粒子サイズ、密度、色素含有量バイオ フィルム中の非生物的コンテンツ (例: microplastics)。このデータ セットは埋め込み (viSNE)16データの高速かつ簡単な解釈を可能にする視覚的確率的近傍を用いた計算可視化分析よりも。設定し、メソッドを最適化する数週間が必要ですセットアップ後、結果の解釈にバイオ フィルム サンプルを収集からほんの数時間がかかります。
他のものより本手法の主な利点は、解析と高情報内容の速度です。また、数週間後にその光の損失と蛍光特性なしコレクション サンプルを保存ことができます。これは、サンプル数が多いが大規模なサンプリング研究やバイオモニタ リングなど、必要なが大量の探索的研究小規模で情報を提供することも非常に便利です。
提案するプロトコルは、ストリームのさまざまな場所から収集された光合成バイオ フィルム (河床) の流れフローサイトメトリー分析に基づいています。プロトコル、例えば監視目的のため、適切なサイトの選択の多くの手順は、研究の目標に依存し、処方することが。その他はより少ない自由を許可する、プロトコルが密接に続いているこれは詳細なプロトコルの下で明らかにされてする必要が。
プロトコルは、バイオ フィルムを用いた環境モニタリングのためのサイトの選択から始まります。次のステップは、その測定監視環境でバイオ フィルムに住んでいる異なった光合成有機体の識別を有効にするを設定する流れの cytometer (FC) です。これは種バイオ フィルムと流れの cytometer レーザーと光で測定を有効にするとフィルター設定に存在の蛍光特性を識別するサイトからバイオ フィルムのサンプルを収集することにより実行されます。波長です。バイオ フィルムができる FC をセットアップした後、定期的に、フローサイトメトリーを用いてバイオ フィルムと視覚的クラスタ リングによって分析されたデータに存在する単一粒子の光と蛍光特性のサイトから収集します。結果の解釈、FC のリファレンス ・ データベースはローカルのバイオ生物種とその表現を構築し、FC データで別の分類を識別するためにデータベースを使用可能です。検証は、FACS、本種の分類同定を顕微鏡ベースを使用して単一セルの特定のクラスターの蛍光ベースの並べ替えを介して可能です。プロトコルの概略は、図 1で与えられます。

<table><tbody><tr><td>Multimeter</td><td>WTW</td><td>MultiLine 3620 IDS</td><td>For measuring temperature, pH, dissolved oxygen</td></tr><tr><td>Ultrasonic cleaner</td><td>VWR International</td><td>97043-986</td><td>Tank dimesions: 15*14*10 cm</td></tr><tr><td>Flow cytometer</td><td>Beckman Coulter</td><td>Gallios</td><td>Lasers: 405, 488 and 638 nm. Filters bands in Supplementary Table 11. Sgier et, Nat Comm, 2016.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Plate reader</td><td>Tecan</td><td>Infinite M200</td><td>used for selecting appropriate setting of the FC</td></tr><tr><td>Cell sorter</td><td>Beckman Coulter</td><td>MoFlo Astrios</td><td>Settings in Supplementary Table 12. Sgier et, Nat Comm, 2016.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fluorescence microscope</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert 135</td><td>Zeiss EC Plan-Neofluar 40x/0.75 objective</td></tr><tr><td>SOFTWARE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>MathWorks</td><td>R2013a</td><td>software for numerical computing</td></tr><tr><td>CYT</td><td>Dana Pe&#039;er Lab</td><td>Version 1.1</td><td>free interactive visualization tool for analysis of cytometry data</td></tr></tbody></table>

characterization of aquatic biofilms with flow cytometry

バイオ フィルムは、淡水の生態系で重要な役割を再生する微生物の動的のコンソーシアムです。彼らのコミュニティの構造を変更すると、バイオ フィルムは環境の変化に迅速に対応、水質の指標としてこうして使用することができます。現在、バイオ フィルムの評価はほとんど統合的で機能的なエンドポイントに基づいて、光合成や呼吸の活動などバイオ フィルムのコミュニティの構造に関する情報を提供していません。フローサイトメトリーと計算可視化、淡水のバイオ フィルムの培養部で特に、群集組成の評価のための代替、機密性の高い、使いやすいメソッドを提供しています。流れの cytometer を介して全体のサンプルを実行する後にのみ基本的なサンプル準備が必要です。単一セルの光と蛍光の情報は、計算可視化と生物学的解釈のため使用されます。他の方法でその主な利点は、解析と高情報内容自然の速度です。フローサイトメトリーは 1 回の測定で複数の細胞とバイオ フィルム特性に関する情報を提供します: 粒子サイズ、密度、色素含有量、バイオ フィルム、および粗い分類情報の非生物的コンテンツ。ただし、種レベルでのバイオ フィルム構成の情報は提供しません。水生生物の生態系の環境を監視するためのメソッドの使用方法の可能性が高いと下流に通知手順初期バイオ フィルム評価として補完的でより詳細な方法で調査の詳細についています。

ここ (図 1) に示す手順を使用して、スイス連邦共和国のローカル ストリームのいくつかのサイトから採取したサンプルを分析しました。各サイトで 3 つの類似大きさで分類された石 (10-12 cm) が撮影された、バイオ フィルムは石をはらっていた。サンプルだったし、超音波処理、修正、フィルターおよびフローサイトメトリーで分析した後。流?...

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Characterization of Aquatic Biofilms with Flow Cytometry

フローサイトメトリーによる水生バイオ フィルムの特性

視覚的クラスタ リングと組み合わせてフローサイトメトリー水生バイオ フィルムを研究するための使いやすい高速メソッドを提供しています。バイオ フィルムの特性評価、バイオ フィルムのコミュニティ構造の変化の検出とバイオ フィルムに埋め込まれた非生物的微粒子の検出に使用できます。

Biofilms are dynamic consortia of microorganism that play a key role in freshwater ecosystems. By changing their community structure, biofilms respond ...

characterization-of-aquatic-biofilms-with-flow-cytometry

Research

JoVE Journal

Environment

8.9K ビュー.  Eawag - Swiss Federal Institute for Aquatic Science and Technology. 視覚的クラスタ リングと組み合わせてフローサイトメトリー水生バイオ フィルムを研究するための使いやすい高速メソッドを提供しています。バイオ フィルムの特性評価、バイオ フィルムのコミュニティ構造の変化の検出とバイオ フィルムに埋め込まれた非生物的微粒子の検出に使用できます。

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Unraveling the Unseen Players in the Ocean - A Field Guide to Water Chemistry and Marine Microbiology

Here we introduce a series of thoroughly tested and well standardized research protocols adapted for use in remote marine environments. The sampling protocols include the assessment of resources available to the microbial community (dissolved organic carbon, particulate organic matter, inorganic nutrients), and a comprehensive description of the viral and bacterial communities (via direct viral and microbial counts, enumeration of autofluorescent microbes, and construction of viral and microbial metagenomes). We use a combination of methods, which represent a dispersed field of scientific disciplines comprising already established protocols and some of the most recent techniques developed. Especially metagenomic sequencing techniques used for viral and bacterial community characterization, have been established only in recent years, and are thus still subjected to constant improvement. This has led to a variety of sampling and sample processing procedures currently in use. The set of methods presented here provides an up to date approach to collect and process environmental samples. Parameters addressed with these protocols yield the minimum on information essential to characterize and understand the underlying mechanisms of viral and microbial community dynamics. It gives easy to follow guidelines to conduct comprehensive surveys and discusses critical steps and potential caveats pertinent to each technique.

Here, we present a comprehensive protocol to assess the organic and inorganic nutrient availability and the abundance and structure of microbial and viral communities in remote marine environments.

水化学と海洋微生物学へのフィールドガイド - 海における幽玄選手の解明

Here we introduce a series of thoroughly tested and well standardized research protocols adapted for use in remote marine environments. The sampling ...

環境学

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological properties compared to free living microorganisms. Biofilms in nature are often difficult to investigate and reside under poorly defined conditions1. Using a transparent substratum it is possible to device a system where simple biofilms can be examined in a non-destructive way in real-time: here we demonstrate the assembly and operation of a flow cell model system, for in vitro 3D studies of microbial biofilms generating high reproducibility under well-defined conditions2,3.
The system consists of a flow cell that serves as growth chamber for the biofilm. The flow cell is supplied with nutrients and oxygen from a medium flask via a peristaltic pump and spent medium is collected in a waste container. This construction of the flow system allows a continuous supply of nutrients and administration of e.g. antibiotics with minimal disturbance of the cells grown in the flow chamber. Moreover, the flow conditions within the flow cell allow studies of biofilm exposed to shear stress. A bubble trapping device confines air bubbles from the tubing which otherwise could disrupt the biofilm structure in the flow cell.
The flow cell system is compatible with Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM) and can thereby provide highly detailed 3D information about developing microbial biofilms. Cells in the biofilm can be labeled with fluorescent probes or proteins compatible with CLSM analysis. This enables online visualization and allows investigation of niches in the developing biofilm. Microbial interrelationship, investigation of antimicrobial agents or the expression of specific genes, are of the many experimental setups that can be investigated in the flow cell system.

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Protocol describing the application of a flow cell system for growing and analyzing microbial biofilms for Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM).

フローセル内の緑膿菌と出芽酵母のバイオフィルム

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

免疫・感染学

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly constituted by proteins and exopolysaccharides, among other factors 7-10. The microbial community encased within the biofilm often shows the differentiation of distinct subpopulation of specialized cells 11-17. These subpopulations coexist and often show spatial and temporal organization within the biofilm 18-21.
Biofilm formation in the model organism Bacillus subtilis requires the differentiation of distinct subpopulations of specialized cells. Among them, the subpopulation of matrix producers, responsible to produce and secrete the extracellular matrix of the biofilm is essential for biofilm formation 11,19. Hence, differentiation of matrix producers is a hallmark of biofilm formation in B. subtilis.
We have used fluorescent reporters to visualize and quantify the subpopulation of matrix producers in biofilms of B. subtilis 15,19,22-24. Concretely, we have observed that the subpopulation of matrix producers differentiates in response to the presence of self-produced extracellular signal surfactin 25. Interestingly, surfactin is produced by a subpopulation of specialized cells different from the subpopulation of matrix producers 15.
We have detailed in this report the technical approach necessary to visualize and quantify the subpopulation of matrix producers and surfactin producers within the biofilms of B. subtilis. To do this, fluorescent reporters of genes required for matrix production and surfactin production are inserted into the chromosome of B. subtilis. Reporters are expressed only in a subpopulation of specialized cells. Then, the subpopulations can be monitored using fluorescence microscopy and flow cytometry (See Fig 1).
The fact that different subpopulations of specialized cells coexist within multicellular communities of bacteria gives us a different perspective about the regulation of gene expression in prokaryotes. This protocol addresses this phenomenon experimentally and it can be easily adapted to any other working model, to elucidate the molecular mechanisms underlying phenotypic heterogeneity within a microbial community.

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Microbial biofilms are generally constituted by distinct subpopulations of specialized cells. Single-cell analysis of these subpopulations requires the use of fluorescent reporters. Here we describe a protocol to visualize and monitor several subpopulationswithin B. subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry.

の単一細胞解析枯草菌</em蛍光顕微鏡とフローサイトメトリーを用いて>バイオフィルム

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Characterizing Microbiome Dynamics &#8211; Flow Cytometry Based Workflows from Pure Cultures to Natural Communities

The investigation of pure cultures and monitoring of microbial community dynamics is vital to understand and control natural ecosystems and technical applications driven by microorganisms. Next generation sequencing methods are widely utilized to resolve microbiomes, but they are generally resource and time intensive and deliver mostly qualitative information. Flow cytometric microbiome analysis does not suffer from those disadvantages and can provide relative subcommunity abundances and absolute cell numbers at-line. Although it does not deliver direct phylogenetic information, it can enhance the analysis depth and resolution of sequencing approaches. In sharp contrast to medical applications in both research and routine settings, flow cytometry is still not widely used for microbiome analysis. Missing information on sample preparation and data analysis pipelines may create an entry barrier for the researchers facing microbiome analysis challenges that would often be textbook flow cytometry applications. Here, we present three comprehensive workflows for pure cultures, complex communities in clear medium and complex communities in challenging matrices, respectively. We describe individual sampling and fixation procedures and optimized staining protocols for the respective sample sets. We elaborate the cytometric analysis with a complex research centered and an application focused bench top device, describe the cell sorting procedure and suggest data analysis packages. We furthermore propose important experimental controls and apply the presented workflows to the respective sample sets.

Flow cytometric analysis has proven valuable for investigating pure cultures and monitoring microbial community dynamics. We present three comprehensive workflows, from sampling to data analysis, for pure cultures and complex communities in clear medium as well as in challenging matrices, respectively.

特徴マイクロバイ ダイナミクス-フローサイトメトリー ベースの自然なコミュニティに純粋培養からワークフロー

The investigation of pure cultures and monitoring of microbial community dynamics is vital to understand and control natural ecosystems and technical ...

Fluorescently Labeled Bacteria as a Tracer to Reveal Novel Pathways of Organic Carbon Flow in Aquatic Ecosystems

Elucidating trophic interactions, such as predation and its effects, is a frequent task for many researchers in ecology. The study of microbial communities has many limitations, and determining a predator, prey, and predatory rates is often difficult. Presented here is an optimized method based on the addition of fluorescently labelled prey as a tracer, which allows for reliable quantitation of the grazing rates in aquatic predatory eukaryotes and estimation of nutrient transfer to higher trophic levels.

Presented here is a protocol for a single-cell, epifluorescence microscopy-based technique to quantify grazing rates in aquatic predatory eukaryotes with high precision and taxonomic resolution.

水生生態系における有機炭素流の新しい経路を明らかにするトレーサーとしての蛍光標識細菌

Elucidating trophic interactions, such as predation and its effects, is a frequent task for many researchers in ecology. The study of microbial ...

Concurrent Quantification of Cellular and Extracellular Components of Biofilms

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is a powerful tool for investigation of biofilms. Very few investigations have successfully quantified concurrent distribution of more than two components within biofilms because: 1)&#160;selection of fluorescent dyes having minimal spectral overlap is complicated, and 2)&#160;quantification of multiple fluorochromes poses a multifactorial problem. Objectives: Report a methodology to quantify and compare concurrent 3-dimensional distributions of three cellular/extracellular components of biofilms grown on relevant substrates. Methods: The method consists of distinct, interconnected steps involving biofilm growth, staining, CLSM imaging, biofilm structural analysis and visualization, and statistical analysis of structural parameters. Biofilms of Streptococcus mutans (strain UA159) were grown for 48 hr on sterile specimens of Point 4 and TPH3 resin composites. Specimens were subsequently immersed for 60 sec in either Biot&#232;ne PBF (BIO) or Listerine Total Care (LTO) mouthwashes, or water (control group; n=5/group). Biofilms were stained with fluorochromes for extracellular polymeric substances, proteins and nucleic acids before imaging with CLSM. Biofilm structural parameters calculated using ISA3D image analysis software were biovolume and mean biofilm thickness. Mixed models statistical analyses compared structural parameters between mouthwash and control groups (SAS software; &#945;=0.05). Volocity software permitted visualization of 3D distributions of overlaid biofilm components (fluorochromes). Results: Mouthwash BIO produced biofilm structures that differed significantly from the control (p&#60;0.05) on both resin composites, whereas LTO did not produce differences (p&#62;0.05) on either product. Conclusions: This methodology efficiently and successfully quantified and compared concurrent 3D distributions of three major components within S. mutans biofilms on relevant substrates, thus overcoming two challenges to simultaneous assessment of biofilm components. This method can also be used to determine the efficacy of antibacterial/antifouling agents against multiple biofilm components, as shown using mouthwashes. Furthermore, this method has broad application because it facilitates comparison of 3D structures/architecture of biofilms in a variety of disciplines.

A protocol for the concurrent quantification and comparison of three cellular and extracellular components within biofilms is presented. The methodology involves the use of confocal laser scanning microscopy, biofilm structural analysis and visualization software, and statistical analysis software.

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is a powerful tool for investigation of biofilms. Very few investigations have successfully quantified ...

Methods for Characterizing the Co-development of Biofilm and Habitat Heterogeneity

Biofilms are surface-attached microbial communities that have complex structures and produce significant spatial heterogeneities. Biofilm development is strongly regulated by the surrounding flow and nutritional environment. Biofilm growth also increases the heterogeneity of the local microenvironment by generating complex flow fields and solute transport patterns. To investigate the development of heterogeneity in biofilms and interactions between biofilms and their local micro-habitat, we grew mono-species biofilms of Pseudomonas aeruginosa and dual-species biofilms of P. aeruginosa and Escherichia coli under nutritional gradients in a microfluidic flow cell. We provide detailed protocols for creating nutrient gradients within the flow cell and for growing and visualizing biofilm development under these conditions. We also present protocols for a series of optical methods to quantify spatial patterns in biofilm structure, flow distributions over biofilms, and mass transport around and within biofilm colonies. These methods support comprehensive investigations of the co-development of biofilm and habitat heterogeneity.

Biofilms have complex interactions with their surrounding environment. To comprehensively investigate biofilm-environment interactions, we present here a series of methods to create heterogeneous chemical environment for biofilm development, to quantify local flow velocity, and to analyze mass transport in and around biofilm colonies.

バイオフィルムと生息地異質の共同開発を特徴付けるための方法

Biofilms are surface-attached microbial communities that have complex structures and produce significant spatial heterogeneities. Biofilm development is ...

生物工学

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic cooperation, competition, or predation. The study of biofilms is important in many biological fields, including environmental science, food production, and medicine. However, few studies have focused on such bacterial biofilms, partially due to the difficulty of investigating them. Most of the methods for qualitative and quantitative biofilm analyses described in the literature are only suitable for biofilms forming on abiotic surfaces or on homogeneous and thin biotic surfaces, such as a monolayer of epithelial cells.
While laser scanning confocal microscopy (LSCM) is often used to analyze in situ and in vivo biofilms, this technology becomes very challenging when applied to bacterial biofilms on fungal hyphae, due to the thickness and the three dimensions of the hyphal networks. To overcome this shortcoming, we developed a protocol combining microscopy with a method to limit the accumulation of hyphal layers in fungal colonies. Using this method, we were able to investigate the development of bacterial biofilms on fungal hyphae at multiple scales using both LSCM and scanning electron microscopy (SEM). This report describes the protocol, including microorganism cultures, bacterial biofilm formation conditions, biofilm staining, and LSCM and SEM visualizations.

This protocol describes a new method to grow and qualitatively analyze bacterial biofilms on fungal hyphae by confocal and electron microscopy.

共焦点顕微鏡および電子顕微鏡を用いて糸状菌コロニー上の細菌のバイオフィルムの定性的マルチスケール解析のための新しい方法

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic ...

Molecular Probe Optimization to Determine Cell Mortality in a Photosynthetic Organism (Microcystis aeruginosa) Using Flow Cytometry

Microbial subpopulations in field and laboratory studies have been shown to display high heterogeneity in morphological and physiological parameters. Determining the real time state of a microbial cell goes beyond live or dead categories, as microbes can exist in a dormant state, whereby cell division and metabolic activities are reduced. Given the need for detection and quantification of microbes, flow cytometry (FCM) with molecular probes provides a rapid and accurate method to help determine overall population viability. By using SYTOX Green and SYTOX Orange in the model cyanobacteria Microcystis aeruginosa to detect membrane integrity, we develop a transferable method for rapid indication of single cell mortality. The molecular probes used within this journal will be referred to as green or orange nucleic acid probes respectively (although there are other products with similar excitation and emission wavelengths that have a comparable modes of action, we specifically refer to the fore mentioned probes). Protocols using molecular probes vary between species, differing principally in concentration and incubation times. Following this protocol set out on M.aeruginosa the green nucleic acid probe was optimized at concentrations of 0.5 &#181;M after 30 min of incubation and the orange nucleic acid probe at 1 &#181;M after 10 min. In both probes concentrations less than the stated optimal led to an under reporting of cells with membrane damage. Conversely, 5 &#181;M concentrations and higher in both probes exhibited a type of non-specific staining, whereby &#39;live&#39; cells produced a target fluorescence, leading to an over representation of &#39;non-viable&#39; cell numbers. The positive controls (heat-killed) provided testable dead biomass, although the appropriateness of control generation remains subject to debate. By demonstrating a logical sequence of steps for optimizing the green and orange nucleic acid probes we demonstrate how to create a protocol that can be used to analyse cyanobacterial physiological state effectively.

Molecular Probe Optimization to Determine Cell Mortality in a Photosynthetic Organism Microcystis aeruginosa Using Flow Cytometry

Microbial populations contain substantial cell heterogeneity, which can dictate overall behavior. Molecular probe analysis through flow cytometry can determine physiological states of cells, however its application varies between species. This study provides a protocol to accurately determine cell mortality within a cyanobacterium population, without underestimating or recording false positive results.

光合成生物における細胞死を決定するための分子プローブの最適化（<em&gt;アオコ緑膿菌</em&gt;）フローサイトメトリーを使用して

Microbial subpopulations in field and laboratory studies have been shown to display high heterogeneity in morphological and physiological parameters. ...

医学

Real-time Imaging and Quantification of Fungal Biofilm Development Using a Two-Phase Recirculating Flow System

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. While models for the growth under flow have been developed, many of these systems are expensive, or do not allow imaging while the cells are under flow. We have developed a novel apparatus that allows us to image the growth and development of Candida albicans cells under flow and in real-time. Here, we detail the protocol for the assembly and use of this flow apparatus, as well as the quantification of data that are generated. We are able to quantify the rates that the cells attach to and detach from the slide, as well as to determine a measure of the biomass on the slide over time. This system is both economical and versatile, working with many types of light microscopes, including inexpensive benchtop microscopes, and is capable of extended imaging times compared to other flow systems. Overall, this is a low-throughput system that can provide highly detailed real-time information on the biofilm growth of fungal species under flow.

We describe the assembly, operation, and cleaning of a flow apparatus designed to image fungal biofilm formation in real time while under flow. We also provide and discuss quantitative algorithms to be used on the acquired images.

リアルタイム イメージングと二相循環フロー システムを用いた菌バイオ フィルム開発の定量

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. ...

フローサイトメトリーによる水生バイオフィルムの特性

要約

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