Sunulan iş SNF Ambizione Bursu (PZ00P2_142533) ve bir Velux Araştırma Bursu (Amplebig) tarafından desteklenmiştir. Bettina Wagner deneysel çalışma ile yardım için teşekkür etmek istiyorum.

1. ekosistem seçimi ve biyofilm örnekleme
<ol><li>Faiz bir sucul ekosistem seçin ve biyofilmler yetiştiği örnekleme siteleri bulmak. Sığ bir dere ile parçaları orta su akışını yavaş ve taşlı streambed biyofilm eki için uygun17,18vardır.</li>
	<li>İsteğe bağlı: site biyofilm eki için veya bir site içinde biyofilmler değişkenliği azaltmak için yeterli yüzeyler varsa, yapay yüzeylerde biyofilm ek (Örneğin cam slaytlar, seramik) için site, o emin yaparken yeri Bunlar su akışı ile ilgili ve benzer derinlik ve ışık şiddeti19aynı yönde yerleştirilir.</li>
	<li>Örnekleme sitesinde, ışık yoğunluğunu ölçmek için taşınabilir aletleri kullanımı çevre koşulları belirlemek için su sıcaklığı, iletkenlik, oksijen ve pH hemen üzerinde yüzey biyofilm olduğunu örneklemeyi için. Örnekleme boyunca, tekrarlanan (3-5) ortalama değerleri hesaplamak için tedbirler.</li>
	<li>İsteğe bağlı: kimya parametreleri almak su örnekleri ilgili belirlemek için su (çözünmüş organik karbon (DOC), K+, Na+, Ca+ 2, Mg2 +, Cl-, F-, SO42 -, PO42 - , Hayır32 -, SiO44 -).</li>
	<li>Koruyucu eldiven kullanarak, benzer taşlar (boyut, şekil ve türü) her site (veya yapay yüzeylerde) toplamak. Taşlar benzer akış ve ışık koşullarında18maruz.</li>
	<li>Yeterli akış su sitesinden 0,22 mikron filtrelerden filtre uygulayarak tüm toplanan örnekleri (Örneğin, örnek başına 15 mL) için hazırdır.</li>
	<li>Yumuşak bir diş fırçası biyofilm--dan belgili tanımlık substrate (tüm biyofilm kaldırılana kadar fırça) bir şişesi süzülmüş akış su2015 mL ile kaldırmak için kullanın.</li>
	<li>Örnekleri %0.01 paraformaldehyde ve % 0.1 oxazolidin21' düzeltmek.</li>
</ol>2. en iyi akış sitometrik (FC) parametreleri tespiti
<ol><li>Subsamples ışık mikroskop için transfer (40 X / 0,75 kullanarak amaç; gerekli bir 100 × 1.3 petrol hedefi kullanırsanız) ve örnekleri22,23' mevcut türler tanımlamak.</li>
	<li>Tanımlanan sipariş tek tür uygun kültür koleksiyonlarından (Örneğin deneysel Phycology ve kültür koleksiyonu algler, Goettingen Üniversitesi [EPSAG] veya kültür koleksiyonu yosun Köln Üniversitesi [CCAC] adlı Eğer İzleme Merkezi Avrupa ekosistemleri gerçekleştirilir).</li>
	<li>Biyofilm örnekleri üzerinden alınan çevre için tek tür benzer çevre koşulları (Örneğin, ışık, sıcaklık, pH) içinde sürekli büyür. 1 ° C ve 0,5 içinde kalan çevre örnekleri noktasından pH tavsiye edilir.</li>
	<li>Hücreleri ayırma/dağıtmak için tek tür örnekleri 15 mL santrifüj tüpler içine koymak ve tüpler bir su banyosu ortasına koyup daldırın, böylece örnek sıvı yüzeyinin banyo yüzeyi olarak aynı düzeyde. Örnekleri 1 dk. 45 kHz24,25için solüsyon içeren temizleyicide.</li>
	<li>Bir plaka okuyucu kullanarak tek türün absorbans ve floresan spectra kaydedin. Lütfen yönergeleri için tercih edilen plaka okuyucu bakın. Bu örnekte, 96-şey düz dipli şeffaf polystyrol plakaları 200 µL numune hacmi ile doluydu ve absorbans ölçüldü. (Kullanılan ayarlar: (a) Floresan tarama modu; boyutu 10 nm, emisyon tarama sayısı 30, bant genişliği 20 nm, 100, kazanç emisyon dalga boyu adım 25 yanıp söner, 20 ABD entegrasyon zaman ya da (b) absorbans tarama modu; 25 yanıp söner, bant genişliği 9 nm).</li>
	<li>Akış Sitometresi kadar lazerler, dikroik kırma ve birlikte farklı türler belirli özelliklere sahip bu floresan aralıkların kapak filtreleri ayarlayın. Merkez Avrupa akışları, bir 405 nm, 488 nm ve 638 nm lazer yararlı sonuçlar üretmek.</li>
	<li>Photomultipliers (tüm akışı cytometers için geçerli değil) voltaj ayarı ve ölçülen fluorescences dizi örnekleri tüm olayların en az % 99 içerecek şekilde ayarlayın.</li>
	<li>Alternatif olarak, türler içinde biyofilmler mevcut bilgi varsa, adım 2.2 ile başlayın. Floresan özellikleri biliniyorsa, adım 2.6 ile başlayın.</li>
</ol>3. isteğe bağlı: Bir akış sitometrik başvuru veritabanı hazırlanması
Not: FC taksonomik kimlik hücre içinde biyofilm mevcut izin vermez. Benzer koşullar biyofilmler olarak yetiştirilen biyofilmler bulunması için bilinen tek türün FC ölçü referans veritabanı verileri yorumu ile yardımcı olabilir.
<ol><li>
Referans: tek tür
	<ol>
<li>En iyi duruma getirilmiş FC parametrelerini kullanarak, 2,5 – 7'ayarlayın (Sabit paraformaldehyde ve oxazolidin ve akış sitometresi için uygun büyüklükte filtrelerden filtre) tek tür optik ve floresan özelliklerini ölçmek.</li>
		<li>(Bkz. Adım 6.1.2) biyofilmler üzerinden veri olarak aynı şekilde tek tür verileri normalleştirmek.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Başvurma: zarar görmüş ve çürüyen hücrelere Biyofilm sağlık en önemli göstergeleri biri hasarlı/ölen hücreleri biyofilm içinde mevcut bölümüdür. Bu hücreler ölçmek için bir başvuru hücre bozulması hazırlanabilir.<ol>
<li>1 mL subsamples, seyreltilmiş biyofilmler al ve onları 8.000 x g de oda sıcaklığında 10 dakika içinde bir masa üstü santrifüj için santrifüj kapasitesi. 1 mL % 90 etanol elde edilen Pelet askıya alma ve süspansiyon gecede 4 ° C'de depolayın Ertesi gün tekrarlayın.</li>
		<li>En iyi duruma getirilmiş FC ayarları kullanarak, zarar görmüş ve çürüyen bir hücre (sabit ve filtre) optik ve floresan özelliklerini ölçmek.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Referans: microplastics Not: microplastic parçacıklar biyofilmler izleme ilgilenen varsa, onlar yeterince farklı olup olmadığını kontrol optik biyotik parçacıklar ve floresan özellikleri tanımlama.<ol>
<li>Microplastic parçacıklar microplastics üreticinin talimatlarına göre askıya alma ve (2,7 FC parametreleri kullanarak) optik ve floresan özelliklerini ölçmek.</li>
		<li>Biyofilm örnek microplastic parçacıkları eklenir ve gece 4 ° C'de bırakılır</li>
		<li>Süspansiyon ve ölçü aynı FC parametreleri ile filtre.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. örnek hazırlama ve depolama
<ol><li>Bir kez FC kurulmuş olan ve FC başvuru veritabanı hazırdır, bir taze biyofilm örnekleri, adımları 1.1-7 göre toplanan değerlendirilmesi ile devam edebilirsiniz. Biyofilm ayırmak/dağıtmak için örnekleri 15 mL (bkz. Adım 1,7) şişeler santrifüj tüpler içine aktarın.</li>
	<li>Her tüp su banyosu ortasına koymak ve böylece örnek sıvı yüzeyinin banyo yüzeyi olarak aynı düzeyde daldırın. Örnekleri 1 dk. 45 kHz için solüsyon içeren temizleyicide.</li>
	<li>Örnekleri %0.01 paraformaldehyde ve % 0,1 oxazolidin (nanopure su stokta) düzeltin. Analiz için hazır kadar 4 ° C'de depolayın.</li>
	<li>Önemli: örnekleri yarısı Akış Sitometresi Analizi için kullanın ve muhafazası için güven ve floresan aktif hücre sıralama ve/veya ışık mikroskobu (bkz. Bölüm 6) ile isteğe bağlı doğrulama için ikiye tutun. Not: buzdolabında saklanan, üç hafta kadar optik ve floresan özellikleri sabit biyofilm örnekleri tutmalı.</li>
</ol>5. FC örneğini çalıştırmak
<ol><li>Örnekleri buzdolabında saklanan vardı, onları hızlı bir şekilde solüsyon içeren temizleyicide veya birkaç kez parçacıklar ayırmak için pipet. Subsamples 50 mikron filtre (filtre boyutu FC kılcal damar genişliğine bağlıdır) ile ölçme önce filtre uygulayın.</li>
	<li>Bireysel örnekleri yük (1-2 mL, bu kullanılan akış sitometresi bağlıdır) akış sitometresi içine ve her bir parçacık optik ve floresan özelliklerini ölçmek. Ölçüm her biyolojik Çoğalt (üç teknik çoğaltır) başına üç kez tekrarlayın.</li>
	<li>Verileri FC .csv formatında verilecek.</li>
</ol>6. veri hazırlama ve korelasyon analizi
FC her ölçülen optik özelliği ve floresan Spektrometre aralığı için çeşitli parametreleri (Örneğin, sinyal alanı, yükseklik, genişlik) analiz edebilirsiniz. Korelasyon analizi üzerinde ölçülen değişkenleri çalıştırın ve sadece değil son derece correlated bu ölçümler tutun. Bu genellikle her bir FC parametre (Örneğin, sinyal alan) kaldırır ve de kaldır yüksek korelasyon (genellikle aynı lazer dallanma ve filtreler komşu) Floresan ölçümleri.
<ol><li>
Matlab Toolbox'dan olarak CYT çalıştırın:
	<ol>
<li>Tüm teknik ve biyolojik dahil olmak üzere CYT yazılım16, analiz edilecek olan tüm örneklerini .csv formatında veri alma azaltılmış FC çoğaltır. (Basılı tutup tıklatın + dosya *.csv filtre, dosyaları içe aktarma için seçin).</li>
		<li>Ark hiperbolik sinüsünü dönüştürme kullanarak tüm örnekleri floresan kanalları dönüşümü. Kofaktör değerini seçilmiş olması gerekir; En Kemotrofik biyofilmler ve akış cytometers ama en iyi duruma getirme için 150 çalışmalar özellikle deneysel kurulumları ve heterotrofiktir biyofilmler için gerekli olabilir. (Sağ-Right-Click/dönüştürme/girin kofaktör 150)</li>
		<li>Kalite kontrol için görsel olarak çubuk grafikler tek tek örnekler ve çoğaltma teknik ve biyolojik düzeyinde hiçbir aykırı olduğundan emin olmak için tek tek görme duyusuyla ilgili ve floresan kanalları (CYT) karşılaştırın. Aykırı önemli ölçüde değiştirdi floresan/optik dağılımları arasında çoğaltır tezahür edecektir. (Veri, kanal, arsa seçin)<ol>
<li>Alternatif: asıl bileşen analizi (PCA) Floresan dağıtımları medyan değerleri üzerinde çalıştırın ve teknik ve biyolojik çoğaltır birlikte küme emin olun.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Birleştirme teknik her biyolojik REPLICATE çoğaltır ve biyolojik çoğaltır, her parçacıklar (hücreler, hücre parçası ve abiyotik parçacıklar) aynı sayıda tarafından temsil edilir ve parçacıklar toplam sayısı analiz subsample Barnes-Hut Stokastik komşu (bh-SNE) katıştırma yaklaşık 150.000 (için en iyi görsel sonuçları26) olduğunu. (Veri, sağ tıklama, birleştirme/Subsample seçin)</li>
		<li>Örnekler arasındaki karşılaştırma için sadece karşılaştırılacak olan örnekleri seçmek önemlidir. Örnekleri seçin ve bh-SNE27çalıştırın. Sonra algoritma bitmiş, yeni kanallar, adlandırılmış bh-SNE1 ve bh-SNE2 görünür. Bir dağılım çizim (viSNE harita) verileri görselleştirmek için kullanılan tüm analiz parçacıklar SNE koordinatlarını bunlar. (Verileri seçin, kanalları, sağ tıklama, bh-SNE seçin, Evet normalleştirilmiş veri)</li>
		<li>ViSNE eşleminde, parçacıklar benzerliklerine göre konumlandırılmış ve görsel olarak ayrılabilir kümeler halinde gruplandırılmış. Kümeleri ve mark ve adı optik/floresan özelliklerini de ayrılır ve CYT içinde çizim araçlarını kullanarak farklı optik/floresan özelliklere sahip kontrol edin. (Kanal bh-SNE1, bh-SNE2)</li>
		<li>İsteğe bağlı: tek mikrobiyal türün (aynı akış sitometresi ayarı ile ölçülen ve benzer koşullar altında yetiştirilen!) bir başvuru veritabanı varsa, viSNE haritalar Matlab verebilir ve haritalar başvuru veritabanı proje. Bu şekilde, belirli kümeler belirli türler/taksonomik grupların (komut dosyaları elde edilebilir için download vasıl https://github.com/anzezupanic/FC_analysis) bağlanabilir. (Oturum/Kaydet)</li>
		<li>Sorun giderme: bh-SNE analiz görsel olarak ayrılabilir kümeleri ama tek büyük bir döndürmezse, çok fazla parçacıklar bh-SNE içinde kullanılmıştır. Örnek başına daha az parçacıkları ile yeniden deneyin. Kümeleri, ama oldukça seyrek bireysel puan varsa, kullanılan parçacıkları sayısını artırmak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>İsteğe bağlı: kümeleme için bh-SNE güvenmek yerine, diğer kümeleme Yöntemleri (Örneğin, hiyerarşik, centroid tabanlı veya kümeleme göre yoğunluğu) normalleştirilmiş veri kullanılabilen ve viSNE harita (https://github.com/ üzerinde üst üste anzezupanic/FC_analysis).</li>
	<li>Bir kez kümeleri tespit edilmiştir, parçacıklar biyolojik her çoğaltma her örnek ait her küme sayısını saymak. ANOVA ve Tukey'nın test uygun (Örneğinile Holmes) kullanarak örnekleri, arasındaki farklılıkları değerlendirmek düzeltme birden fazla karşılaştırma için.</li>
</ol>7. isteğe bağlı: Doğrulama floresans aktif hücre sıralama kullanarak küme yorumlama
<ol><li>Kümeleri tespit edilmiştir sonra floresans aktif hücre (FACS) sıralama FACS lazerler ve floresan filtreler aynı (veya benzer) yapılandırılmasını sahip olması koşuluyla istenirse, örnekleri dışarı sıralamak için kullanabilirsiniz.</li>
	<li>Tanımlanan her küme için küme tanımlamak optik ve floresan kapıları CYT sağlar. Bu kapılardan FACS ile her küme parçacıkları çözmek ve daha sonra ışık mikroskobu kullanılarak sıralanmış hücrelerini tanımlamak için kullanın.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Battin, T. J., Besemer, K., Bengtsson, M. M., Romani, A. M., Packmann, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ecology+and+biogeochemistry+of+stream+biofilms.">The ecology and biogeochemistry of stream biofilms.</a> Nat Rev Microbiol. 14 (4), 251-263 (2016).</li><li>Rotter, S., Heilmeier, H., Altenburger, R., Schmitt-Jansen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+stressors+in+periphyton+-+comparison+of+observed+and+predicted+tolerance+responses+to+high+ionic+loads+and+herbicide+exposure.">Multiple stressors in periphyton - comparison of observed and predicted tolerance responses to high ionic loads and herbicide exposure.</a> J Appl Ecol. 50 (6), 1459-1468 (2013).</li><li>Tlili, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pollution-induced+community+tolerance+(PICT):+towards+an+ecologically+relevant+risk+assessment+of+chemicals+in+aquatic+systems.">Pollution-induced community tolerance (PICT): towards an ecologically relevant risk assessment of chemicals in aquatic systems.</a> Freshw Biol. 61 (12), 2141-2151 (2016).</li><li>Lavoie, I., Lavoie, M., Fortin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mine+of+information:+Benthic+algal+communities+as+biomonitors+of+metal+contamination+from+abandoned+tailings.">A mine of information: Benthic algal communities as biomonitors of metal contamination from abandoned tailings.</a> Science of the Total Environment. 425, 231-241 (2012).</li><li>Tlili, A., Montuelle, B., Berard, A., Bouchez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+chronic+and+acute+pesticide+exposures+on+periphyton+communities.">Impact of chronic and acute pesticide exposures on periphyton communities.</a> Sci Total Environ. 409 (11), 2102-2113 (2011).</li><li>Dorigo, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lotic+biofilm+community+structure+and+pesticide+tolerance+along+a+contamination+gradient+in+a+vineyard+area.">Lotic biofilm community structure and pesticide tolerance along a contamination gradient in a vineyard area.</a> Aquat Microb Ecol. 50 (1), 91-102 (2007).</li><li>Pesce, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+single+and+joint+toxic+effects+of+diuron+and+its+main+metabolites+on+natural+phototrophic+biofilms+using+a+pollution-induced+community+tolerance+(PICT)+approach.">Evaluation of single and joint toxic effects of diuron and its main metabolites on natural phototrophic biofilms using a pollution-induced community tolerance (PICT) approach.</a> Aquat Toxicol. 99 (4), 492-499 (2010).</li><li>Ricart, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+low+concentrations+of+the+phenylurea+herbicide+diuron+on+biofilm+algae+and+bacteria.">Effects of low concentrations of the phenylurea herbicide diuron on biofilm algae and bacteria.</a> Chemosphere. 76 (10), 1392-1401 (2009).</li><li>Martinez, A., Kominoski, J. S., Larranaga, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leaf-litter+leachate+concentration+promotes+heterotrophy+in+freshwater+biofilms:+Understanding+consequences+of+water+scarcity.">Leaf-litter leachate concentration promotes heterotrophy in freshwater biofilms: Understanding consequences of water scarcity.</a> Sci Total Environ. , 1677-1684 (2017).</li><li>Corcoll, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+four+DNA+extraction+methods+for+comprehensive+assessment+of+16S+rRNA+bacterial+diversity+in+marine+biofilms+using+high-throughput+sequencing.">Comparison of four DNA extraction methods for comprehensive assessment of 16S rRNA bacterial diversity in marine biofilms using high-throughput sequencing.</a> Fems Microbiol Lett. 364 (14), (2017).</li><li>Welsh, A. K., McLean, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+bacteria+in+mixed+biofilm+communities+using+denaturing+gradient+gel+electrophoresis+(DGGE).">Characterization of bacteria in mixed biofilm communities using denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE).</a> Curr Protoc Microbiol. , (2007).</li><li>Ranjard, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+bacterial+and+fungal+soil+communities+by+automated+ribosomal+intergenic+spacer+analysis+fingerprints:+Biological+and+methodological+variability.">Characterization of bacterial and fungal soil communities by automated ribosomal intergenic spacer analysis fingerprints: Biological and methodological variability.</a> Appl Environm Microbiol. 67 (10), 4479-4487 (2001).</li><li>Stewart, T. J., Traber, J., Kroll, A., Behra, R., Sigg, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+extracellular+polymeric+substances+(EPS)+from+periphyton+using+liquid+chromatography-organic+carbon+detection-organic+nitrogen+detection+(LC-OCD-OND).">Characterization of extracellular polymeric substances (EPS) from periphyton using liquid chromatography-organic carbon detection-organic nitrogen detection (LC-OCD-OND).</a> Environ Sci Pollut R. 20 (5), 3214-3223 (2013).</li><li>Kroll, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mixed+messages+from+benthic+microbial+communities+exposed+to+nanoparticulate+and+ionic+silver:+3D+structure+picks+up+nano-specific+effects,+while+EPS+and+traditional+endpoints+indicate+a+concentration-dependent+impact+of+silver+ions.">Mixed messages from benthic microbial communities exposed to nanoparticulate and ionic silver: 3D structure picks up nano-specific effects, while EPS and traditional endpoints indicate a concentration-dependent impact of silver ions.</a> Environ Sci Pollut R. 23 (5), 4218-4234 (2016).</li><li>Sgier, L., Freimann, R., Zupanic, A., Kroll, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+combined+with+viSNE+for+the+analysis+of+microbial+biofilms+and+detection+of+microplastics.">Flow cytometry combined with viSNE for the analysis of microbial biofilms and detection of microplastics.</a> Nat Commun. 7, 11587 (2016).</li><li>Amir el, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=viSNE+enables+visualization+of+high+dimensional+single-cell+data+and+reveals+phenotypic+heterogeneity+of+leukemia.">viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia.</a> Nat Biotechnol. 31 (6), 545-552 (2013).</li><li>Mora-Gomez, J., Freixa, A., Perujo, N., Barral-Fraga, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limits+of+the+biofilm+concept+and+types+of+aquatic+biofilms.">Limits of the biofilm concept and types of aquatic biofilms.</a> Aquatic Biofilms: Ecology, Water Quality and Wastewater Treatment. , 3-27 (2016).</li><li>Matthaei, C. D., Guggelberger, C., Huber, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+disturbance+history+affects+patchiness+of+benthic+river+algae.">Local disturbance history affects patchiness of benthic river algae.</a> Freshw Biol. 48 (9), 1514-1526 (2003).</li><li>Tlili, A., Hollender, J., Kienle, C., Behra, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropollutant-induced+tolerance+of+in+situ+periphyton:+Establishing+causality+in+wastewater-impacted+streams.">Micropollutant-induced tolerance of in situ periphyton: Establishing causality in wastewater-impacted streams.</a> Water Res. 111, 185-194 (2017).</li><li>Robinson, C. T., Rushforth, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+physical+disturbance+and+canopy+cover+on+attached+diatom+community+structure+in+an+idaho+stream.">Effects of physical disturbance and canopy cover on attached diatom community structure in an idaho stream.</a> Hydrobiologia. 154, 49-59 (1987).</li><li>Pomati, F., Nizzetto, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+triclosan-induced+ecological+and+trans-generational+effects+in+natural+phytoplankton+communities:+A+trait-based+field+method.">Assessing triclosan-induced ecological and trans-generational effects in natural phytoplankton communities: A trait-based field method.</a> Ecotoxicology. 22 (5), 779-794 (2013).</li><li>Hulliger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methoden zur Untersuchung und Beurteilung der Fliessgew&#228;sser. , (2007).</li><li>Tlili, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+spatio-temporal+changes+in+pollution-induced+community+tolerance+to+zinc+in+autotrophic+and+heterotrophic+biofilm+communities.">In situ spatio-temporal changes in pollution-induced community tolerance to zinc in autotrophic and heterotrophic biofilm communities.</a> Ecotoxicology. 20 (8), 1823-1839 (2011).</li><li>Foladori, P., Laura, B., Gianni, A., Giuliano, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+sonication+on+bacteria+viability+in+wastewater+treatment+plants+evaluated+by+flow+cytometry+-+Fecal+indicators,+wastewater+and+activated+sludge.">Effects of sonication on bacteria viability in wastewater treatment plants evaluated by flow cytometry - Fecal indicators, wastewater and activated sludge.</a> Water Res. 41 (1), 235-243 (2007).</li><li>Buesing, N., Gessner, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+detachment+procedures+for+direct+counts+of+bacteria+associated+with+sediment+particles,+plant+litter+and+epiphytic+biofilms.">Comparison of detachment procedures for direct counts of bacteria associated with sediment particles, plant litter and epiphytic biofilms.</a> Aquat Microb Ecol. 27 (1), 29-36 (2002).</li><li>van der Maaten, L., Hinton, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+Data+using+t-SNE.">Visualizing Data using t-SNE.</a> J Mach Learn Res. 9, 2579-2605 (2008).</li><li>van der Maaten, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerating+t-SNE+using+Tree-Based+Algorithms.">Accelerating t-SNE using Tree-Based Algorithms.</a> J Mach Learn Res. 15, 3221-3245 (2014).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Yukarıda açıklanan iletişim kuralı uygulamak oldukça kolaydır. Sunulan varsayılan ayarları tüm Kemotrofik biyofilm şimdiye kadar test için uygun olduğu gösterilmiştir, ancak, (iletişim kuralında tanımlandığı gibi) en iyi duruma getirme yönteminden elde ettiği bilgileri en üst düzeye çıkarmak için gerekli iken. Nitekim, biyofilmler optik ve floresan özelliklerini, çevre koşulları (sezon, sıcaklık, su kimyasal bileşimi)1bağlı olarak değişebilir. Bu nedenle, FC ...

Tatlı su ekosistemleri, mikroorganizmalar ve onların biyolojik çeşitlilik ve ekosistem içinde dağılımını etkileyen birincil üretim, besin Bisiklete binme ve su arıtma arasında değişen önemli bir rol oynamaktadır dinamik konsorsiyumlar mikroorganizma, biyofilmler vardır 1. onların toplum yapısı hızla biyofilmler çevre koşulları değişen veya stresler, kimyasallar gibi maruz karşı daha hoşgörülü türler2,3vardiya. Geçerli yöntemlerden hiçbiri aslında bir biyofilm topluluk dinamik hızlı ve kolay bir şekilde izlemek için mükemmel uygundur ancak onların yüksek hassasiyet çevresel izleme4için çekici model sistemleri biyofilmler dönüşüyor.
Fonksiyonel ve yapısal bitiş noktaları ölçümü oluşan biyofilmler karakterize yöntemleri yaygın olarak kullanılan küme. Tüm toplum düzeyinde fotosentetik ve solunum aktivite yanı sıra ekstraselüler enzim aktivitesi sağlar bilgi biyofilm5,6,7,8 fonksiyonel durumunu ,9. Biyokütle tahakkuk genel biyofilm büyüme için bir göstergesi olarak kullanılır. Yapısal değişiklikler şu anda ya ışık mikroskobu ile veya nükleotid tabanlı teknikleri (degrade jel elektroforez (DGGE), otomatik ribozomal intergenic rondela denaturingÖrneğin, geleneksel tür kimliği kullanarak ölçülür Analizi (furkan), metagenomics)10,11,12. Bu yöntemler bilgi sağlar ama gerçekleştirmek, ya da belirli bilgi gerektirir zaman alıcı veya hala geliştiriliyor. Son olarak, hücre dışı polimer maddeler (EPS)13,14 ve biyofilm Mimarlık1, duyarlı, süre değerlendirilmesi için yeni yöntemler düşük işlem hacmi ve henüz doğru geliştirilmiştir değil izleme amacıyla.
Tatlı su biyofilmler tam karakterizasyonu için bu biyofilm işlevi, kompozisyon ve mimarisi hakkında bilgi sağlayan birkaç farklı yöntem birleştirmek için gerekli olduğunu belirgindir. Çevre kontrolü için öte yandan, biyofilm değişiklikleri algılayıp temel biyolojik yorumu orijinalinde fonksiyonel ve yapısal düzeyinde etkinleştirmek hızlı ve duyarlı Yöntem gereklidir.
Mikrobiyal topluluk karakterizasyonu için izleme amacıyla hızlı ve aynı zamanda biyofilm toplum üzerinde yeterli bilgi sağlayan akış biyofilmler (periphyton), Kemotrofik bileşen için yeni bir yöntem geliştirdik yapısı biyolojik yorumu15izin vermek için. Tek hücreli akış sitometresi biyofilm örnekleri üzerinde (FC) dayalı ve hesaplamalı görselleştirme ile birleştiğinde ve biyofilm tek hücre düzeyinde optik ve floresan özellikleri hakkında bilgi sağlar.
İş akışı biyofilm örnekleme sonra numune hazırlama sonication, fiksasyon ve örnek akış sitometresi tarafından değerlendirilmesi tarafından takip örneklerin boyutu tabanlı filtreleme şeklinde oluşur. Alınan veri tek bir ölçüm çeşitli hücresel özellikleri hakkında bilgi vermek: parçacık boyutu, yoğunluk, pigment içeriği, biyofilm abiyotik içeriği (Örneğin microplastics). Bu veri kümesini (viSNE)16hızlı ve kolay bir yorum veri sağlar, katıştırma visual Stokastik komşu kullanarak hesaplama görselleştirme ile analiz daha var. Bir kaç hafta ayarlamak ve yöntemi, en iyi duruma getirmek için gerekli olmasına rağmen bir kez kurmak, bu biyofilm örnekleri sonuçlarını yorumlama için toplanıyor sadece birkaç saat sürer.
Diğerleri sunulan yönteminin ana avantajları hızı yüksek-bilgi-içerik ve analiz edilmektedir. Ayrıca, örnekler koleksiyon floresans özellikleri ve onların optik kaybı olmadan sonra birkaç hafta saklanır. Çok sayıda örnekleri karakterizasyonu, biomonitoring program veya büyük örnekleme çalışmaları gibi gereklidir, ancak aynı zamanda önemli bir miktar daha küçük keşif çalışmaları bilgi sağlayabilir bu çok yararlı olabilir.
Sunulan Protokolü akış sitometrik analizinde bir akışı farklı konumlardan toplanan Kemotrofik biyofilmler (periphyton) temel alır. İletişim kuralı, Örneğin siteleri için izleme amacıyla, uygun seçimi birçok adım araştırma hedefleri üzerinde bağlıdır ve bu nedenle reçete olamaz. Diğerleri daha az özgürlük izin ve protokol yakından takip eder, bu açık ayrıntılı iletişim kuralında aşağıdaki yapılır gerektirir.
Protokol biyofilm tabanlı çevresel izleme siteleri seçimi ile başlar. Böylece onun ölçümleri biyofilmler izlenen ortamda yaşayan farklı Kemotrofik organizmalar arasında ayrımcılık etkinleştirmek sonraki adım için akış sitometresi (FC) düzmece. Bu sitelerden farklı türler mevcut biyofilm ve akış sitometresi lazer ve optik ölçüm, uygun etkinleştirmek filtreleri ayarlama floresan özelliklerini tanımlayan biyofilm örnekleri toplayarak yapılır dalga boylarında. FC set-up edildikten sonra biyofilmler olabilir siteleri düzenli olarak, optik ve floresan özellikleri tek parçacık akışı-sitometresi tarafından ölçülen biyofilm ve görsel kümeleme tarafından analiz veri mevcut toplanan. Sonuçlar daha iyi yorumlayabilmek için FC başvuru veritabanı, yerel biyofilm-canlı türlerine ve onların fenotipleri ve farklı Taksonomiler FC veri tanımlamak için veritabanını kullanmak mümkündür. Doğrulama floresans tabanlı tek hücre FACS ve taksonomik tanımlaması mikroskobu tabanlı mevcut türler kullanarak tanımlanan kümelerini sıralama yoluyla mümkündür. İletişim kuralının bir şematik resim 1' de verilmiştir.

<table><tbody><tr><td>Multimeter</td><td>WTW</td><td>MultiLine 3620 IDS</td><td>For measuring temperature, pH, dissolved oxygen</td></tr><tr><td>Ultrasonic cleaner</td><td>VWR International</td><td>97043-986</td><td>Tank dimesions: 15*14*10 cm</td></tr><tr><td>Flow cytometer</td><td>Beckman Coulter</td><td>Gallios</td><td>Lasers: 405, 488 and 638 nm. Filters bands in Supplementary Table 11. Sgier et, Nat Comm, 2016.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Plate reader</td><td>Tecan</td><td>Infinite M200</td><td>used for selecting appropriate setting of the FC</td></tr><tr><td>Cell sorter</td><td>Beckman Coulter</td><td>MoFlo Astrios</td><td>Settings in Supplementary Table 12. Sgier et, Nat Comm, 2016.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fluorescence microscope</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert 135</td><td>Zeiss EC Plan-Neofluar 40x/0.75 objective</td></tr><tr><td>SOFTWARE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>MathWorks</td><td>R2013a</td><td>software for numerical computing</td></tr><tr><td>CYT</td><td>Dana Pe&#039;er Lab</td><td>Version 1.1</td><td>free interactive visualization tool for analysis of cytometry data</td></tr></tbody></table>

characterization of aquatic biofilms with flow cytometry

Biyofilmler tatlı su ekosistemleri önemli bir rol oynamak dinamik konsorsiyumlar mikroorganizma, vardır. Onların toplum yapısını değiştirerek biyofilmler çevresel değişikliklere hemen tepki vermek ve böylece su kalitesi göstergeleri olarak kullanılabilir. Şu anda, biyofilm değerlendirme hangi bilgileri biyofilm toplum yapısına vermeyeceğini bütünleştirici ve fonksiyonel bitiş noktaları, etkinlik, fotosentetik veya solunum gibi çoğunlukla dayanmaktadır. Akış Sitometresi ve hesaplamalı görselleştirme topluluk bileşimi, tatlı su biyofilmler photoautotrophic parçası özellikle değerlendirilmesi için alternatif, hassas ve kullanımı kolay bir yöntem sağlar. Yalnızca temel numune hazırlama, sonra tüm örnek akış sitometresi ile çalıştığı gerektirir. Tek hücreli optik ve floresan bilgi Hesaplamalı görselleştirme ve biyolojik yorumu için kullanılır. Başlıca avantajları diğer yöntemler üzerinde analiz ve yüksek bilgi içerik doğa hızı vardır. Akış Sitometresi birkaç cep ve biyofilm özellikleri tek bir ölçüm üzerinde bilgi sağlar: parçacık boyutu, yoğunluk, pigment içeriği, abiyotik içeriğinde biyofilm ve kaba taksonomik bilgi. Ancak, bu bilgileri ilgili biyofilm kompozisyon türleri düzeyde sağlamaz. Biz çevre sucul ekosistemler izleme için yöntem kullanımındaki yüksek potansiyel görüyorum ve bir ilk biyofilm değerlendirme olarak aşağı bilgilendirir adım araştırmalar tamamlayıcı ve daha ayrıntılı yöntemlerle ayrıntılı.

Burada sunulan (Şekil 1) yordamını kullanarak yerel bir Stream İsviçre çeşitli sitelerden alınan örnekleri analiz edildi. Her sitede üç benzer büyüklükteki taşlar (10-12 cm) alınmış ve biyofilmler pulunu fırça. Örnekler vardı o zaman sonicated, sabit, filtre ve daha sonra akış sitometresi tarafından analiz. Akış Sitometresi ve kullanılan referans veritabanı kurulumu aynı bir önceki kağıt15' te açıklan...

Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Aquatic Biofilms with Flow Cytometry at JoVE.com

Characterization of Aquatic Biofilms with Flow Cytometry

Akış sitometresi ile su biyofilmler karakterizasyonu

Akış Sitometresi görsel kümeleme ile birlikte su biyofilmler çalışmak için kullanımı kolay ve hızlı bir yöntem sunar. Biyofilm karakterizasyonu, biyofilm toplum yapısındaki değişikliklerin tespiti ve biyofilm içinde gömülü abiyotik parçacıklar tespiti için kullanılabilir.

Biofilms are dynamic consortia of microorganism that play a key role in freshwater ecosystems. By changing their community structure, biofilms respond ...

characterization-of-aquatic-biofilms-with-flow-cytometry

Research

JoVE Journal

Environment

9.0K Görüntüleme.  Eawag - Swiss Federal Institute for Aquatic Science and Technology. Akış Sitometresi görsel kümeleme ile birlikte su biyofilmler çalışmak için kullanımı kolay ve hızlı bir yöntem sunar. Biyofilm karakterizasyonu, biyofilm toplum yapısındaki değişikliklerin tespiti ve biyofilm içinde gömülü abiyotik parçacıklar tespiti için kullanılabilir.

Video: Characterization of Aquatic Biofilms with Flow Cytometry

Unraveling the Unseen Players in the Ocean - A Field Guide to Water Chemistry and Marine Microbiology

Here we introduce a series of thoroughly tested and well standardized research protocols adapted for use in remote marine environments. The sampling protocols include the assessment of resources available to the microbial community (dissolved organic carbon, particulate organic matter, inorganic nutrients), and a comprehensive description of the viral and bacterial communities (via direct viral and microbial counts, enumeration of autofluorescent microbes, and construction of viral and microbial metagenomes). We use a combination of methods, which represent a dispersed field of scientific disciplines comprising already established protocols and some of the most recent techniques developed. Especially metagenomic sequencing techniques used for viral and bacterial community characterization, have been established only in recent years, and are thus still subjected to constant improvement. This has led to a variety of sampling and sample processing procedures currently in use. The set of methods presented here provides an up to date approach to collect and process environmental samples. Parameters addressed with these protocols yield the minimum on information essential to characterize and understand the underlying mechanisms of viral and microbial community dynamics. It gives easy to follow guidelines to conduct comprehensive surveys and discusses critical steps and potential caveats pertinent to each technique.

Here, we present a comprehensive protocol to assess the organic and inorganic nutrient availability and the abundance and structure of microbial and viral communities in remote marine environments.

Su Kimya ve Deniz Mikrobiyoloji A Field Guide - Okyanusu&#39;nda gaybı Oyuncular çözülüyor

Here we introduce a series of thoroughly tested and well standardized research protocols adapted for use in remote marine environments. The sampling ...

Çevre

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological properties compared to free living microorganisms. Biofilms in nature are often difficult to investigate and reside under poorly defined conditions1. Using a transparent substratum it is possible to device a system where simple biofilms can be examined in a non-destructive way in real-time: here we demonstrate the assembly and operation of a flow cell model system, for in vitro 3D studies of microbial biofilms generating high reproducibility under well-defined conditions2,3.
The system consists of a flow cell that serves as growth chamber for the biofilm. The flow cell is supplied with nutrients and oxygen from a medium flask via a peristaltic pump and spent medium is collected in a waste container. This construction of the flow system allows a continuous supply of nutrients and administration of e.g. antibiotics with minimal disturbance of the cells grown in the flow chamber. Moreover, the flow conditions within the flow cell allow studies of biofilm exposed to shear stress. A bubble trapping device confines air bubbles from the tubing which otherwise could disrupt the biofilm structure in the flow cell.
The flow cell system is compatible with Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM) and can thereby provide highly detailed 3D information about developing microbial biofilms. Cells in the biofilm can be labeled with fluorescent probes or proteins compatible with CLSM analysis. This enables online visualization and allows investigation of niches in the developing biofilm. Microbial interrelationship, investigation of antimicrobial agents or the expression of specific genes, are of the many experimental setups that can be investigated in the flow cell system.

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Protocol describing the application of a flow cell system for growing and analyzing microbial biofilms for Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM).

Pseudomonas aeruginosa ve Saccharomyces cerevisiae Biyofilm Akış Hücreler

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly constituted by proteins and exopolysaccharides, among other factors 7-10. The microbial community encased within the biofilm often shows the differentiation of distinct subpopulation of specialized cells 11-17. These subpopulations coexist and often show spatial and temporal organization within the biofilm 18-21.
Biofilm formation in the model organism Bacillus subtilis requires the differentiation of distinct subpopulations of specialized cells. Among them, the subpopulation of matrix producers, responsible to produce and secrete the extracellular matrix of the biofilm is essential for biofilm formation 11,19. Hence, differentiation of matrix producers is a hallmark of biofilm formation in B. subtilis.
We have used fluorescent reporters to visualize and quantify the subpopulation of matrix producers in biofilms of B. subtilis 15,19,22-24. Concretely, we have observed that the subpopulation of matrix producers differentiates in response to the presence of self-produced extracellular signal surfactin 25. Interestingly, surfactin is produced by a subpopulation of specialized cells different from the subpopulation of matrix producers 15.
We have detailed in this report the technical approach necessary to visualize and quantify the subpopulation of matrix producers and surfactin producers within the biofilms of B. subtilis. To do this, fluorescent reporters of genes required for matrix production and surfactin production are inserted into the chromosome of B. subtilis. Reporters are expressed only in a subpopulation of specialized cells. Then, the subpopulations can be monitored using fluorescence microscopy and flow cytometry (See Fig 1).
The fact that different subpopulations of specialized cells coexist within multicellular communities of bacteria gives us a different perspective about the regulation of gene expression in prokaryotes. This protocol addresses this phenomenon experimentally and it can be easily adapted to any other working model, to elucidate the molecular mechanisms underlying phenotypic heterogeneity within a microbial community.

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Microbial biofilms are generally constituted by distinct subpopulations of specialized cells. Single-cell analysis of these subpopulations requires the use of fluorescent reporters. Here we describe a protocol to visualize and monitor several subpopulationswithin B. subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry.

Tek hücreli Analizi Bacillus subtilis</emFloresan Mikroskobu ve Akım Sitometri Kullanma> Biyofilmler

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Characterizing Microbiome Dynamics &#8211; Flow Cytometry Based Workflows from Pure Cultures to Natural Communities

The investigation of pure cultures and monitoring of microbial community dynamics is vital to understand and control natural ecosystems and technical applications driven by microorganisms. Next generation sequencing methods are widely utilized to resolve microbiomes, but they are generally resource and time intensive and deliver mostly qualitative information. Flow cytometric microbiome analysis does not suffer from those disadvantages and can provide relative subcommunity abundances and absolute cell numbers at-line. Although it does not deliver direct phylogenetic information, it can enhance the analysis depth and resolution of sequencing approaches. In sharp contrast to medical applications in both research and routine settings, flow cytometry is still not widely used for microbiome analysis. Missing information on sample preparation and data analysis pipelines may create an entry barrier for the researchers facing microbiome analysis challenges that would often be textbook flow cytometry applications. Here, we present three comprehensive workflows for pure cultures, complex communities in clear medium and complex communities in challenging matrices, respectively. We describe individual sampling and fixation procedures and optimized staining protocols for the respective sample sets. We elaborate the cytometric analysis with a complex research centered and an application focused bench top device, describe the cell sorting procedure and suggest data analysis packages. We furthermore propose important experimental controls and apply the presented workflows to the respective sample sets.

Flow cytometric analysis has proven valuable for investigating pure cultures and monitoring microbial community dynamics. We present three comprehensive workflows, from sampling to data analysis, for pure cultures and complex communities in clear medium as well as in challenging matrices, respectively.

Karakteristik Microbiome Dynamics-akış sitometresi doğal topluluklar için iş akışları saf kültürler dayalı

The investigation of pure cultures and monitoring of microbial community dynamics is vital to understand and control natural ecosystems and technical ...

Fluorescently Labeled Bacteria as a Tracer to Reveal Novel Pathways of Organic Carbon Flow in Aquatic Ecosystems

Elucidating trophic interactions, such as predation and its effects, is a frequent task for many researchers in ecology. The study of microbial communities has many limitations, and determining a predator, prey, and predatory rates is often difficult. Presented here is an optimized method based on the addition of fluorescently labelled prey as a tracer, which allows for reliable quantitation of the grazing rates in aquatic predatory eukaryotes and estimation of nutrient transfer to higher trophic levels.

Presented here is a protocol for a single-cell, epifluorescence microscopy-based technique to quantify grazing rates in aquatic predatory eukaryotes with high precision and taxonomic resolution.

Floresan Etiketli Bakteriler Sucul Ekosistemlerde Organik Karbon Akışının Yeni Yollarını Ortaya Çıkaracak Bir İzleyici Olarak

Elucidating trophic interactions, such as predation and its effects, is a frequent task for many researchers in ecology. The study of microbial ...

Concurrent Quantification of Cellular and Extracellular Components of Biofilms

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is a powerful tool for investigation of biofilms. Very few investigations have successfully quantified concurrent distribution of more than two components within biofilms because: 1)&#160;selection of fluorescent dyes having minimal spectral overlap is complicated, and 2)&#160;quantification of multiple fluorochromes poses a multifactorial problem. Objectives: Report a methodology to quantify and compare concurrent 3-dimensional distributions of three cellular/extracellular components of biofilms grown on relevant substrates. Methods: The method consists of distinct, interconnected steps involving biofilm growth, staining, CLSM imaging, biofilm structural analysis and visualization, and statistical analysis of structural parameters. Biofilms of Streptococcus mutans (strain UA159) were grown for 48 hr on sterile specimens of Point 4 and TPH3 resin composites. Specimens were subsequently immersed for 60 sec in either Biot&#232;ne PBF (BIO) or Listerine Total Care (LTO) mouthwashes, or water (control group; n=5/group). Biofilms were stained with fluorochromes for extracellular polymeric substances, proteins and nucleic acids before imaging with CLSM. Biofilm structural parameters calculated using ISA3D image analysis software were biovolume and mean biofilm thickness. Mixed models statistical analyses compared structural parameters between mouthwash and control groups (SAS software; &#945;=0.05). Volocity software permitted visualization of 3D distributions of overlaid biofilm components (fluorochromes). Results: Mouthwash BIO produced biofilm structures that differed significantly from the control (p&#60;0.05) on both resin composites, whereas LTO did not produce differences (p&#62;0.05) on either product. Conclusions: This methodology efficiently and successfully quantified and compared concurrent 3D distributions of three major components within S. mutans biofilms on relevant substrates, thus overcoming two challenges to simultaneous assessment of biofilm components. This method can also be used to determine the efficacy of antibacterial/antifouling agents against multiple biofilm components, as shown using mouthwashes. Furthermore, this method has broad application because it facilitates comparison of 3D structures/architecture of biofilms in a variety of disciplines.

A protocol for the concurrent quantification and comparison of three cellular and extracellular components within biofilms is presented. The methodology involves the use of confocal laser scanning microscopy, biofilm structural analysis and visualization software, and statistical analysis software.

Hücresel ve Biyofilmler Ekstrasellüler Bileşenleri Eşzamanlı Kantitasyonu

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is a powerful tool for investigation of biofilms. Very few investigations have successfully quantified ...

Methods for Characterizing the Co-development of Biofilm and Habitat Heterogeneity

Biofilms are surface-attached microbial communities that have complex structures and produce significant spatial heterogeneities. Biofilm development is strongly regulated by the surrounding flow and nutritional environment. Biofilm growth also increases the heterogeneity of the local microenvironment by generating complex flow fields and solute transport patterns. To investigate the development of heterogeneity in biofilms and interactions between biofilms and their local micro-habitat, we grew mono-species biofilms of Pseudomonas aeruginosa and dual-species biofilms of P. aeruginosa and Escherichia coli under nutritional gradients in a microfluidic flow cell. We provide detailed protocols for creating nutrient gradients within the flow cell and for growing and visualizing biofilm development under these conditions. We also present protocols for a series of optical methods to quantify spatial patterns in biofilm structure, flow distributions over biofilms, and mass transport around and within biofilm colonies. These methods support comprehensive investigations of the co-development of biofilm and habitat heterogeneity.

Biofilms have complex interactions with their surrounding environment. To comprehensively investigate biofilm-environment interactions, we present here a series of methods to create heterogeneous chemical environment for biofilm development, to quantify local flow velocity, and to analyze mass transport in and around biofilm colonies.

Biyofilm ve Habitat Heterojen Eş-geliştirme karakterize Yöntemleri

Biofilms are surface-attached microbial communities that have complex structures and produce significant spatial heterogeneities. Biofilm development is ...

Biyomühendislik

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic cooperation, competition, or predation. The study of biofilms is important in many biological fields, including environmental science, food production, and medicine. However, few studies have focused on such bacterial biofilms, partially due to the difficulty of investigating them. Most of the methods for qualitative and quantitative biofilm analyses described in the literature are only suitable for biofilms forming on abiotic surfaces or on homogeneous and thin biotic surfaces, such as a monolayer of epithelial cells.
While laser scanning confocal microscopy (LSCM) is often used to analyze in situ and in vivo biofilms, this technology becomes very challenging when applied to bacterial biofilms on fungal hyphae, due to the thickness and the three dimensions of the hyphal networks. To overcome this shortcoming, we developed a protocol combining microscopy with a method to limit the accumulation of hyphal layers in fungal colonies. Using this method, we were able to investigate the development of bacterial biofilms on fungal hyphae at multiple scales using both LSCM and scanning electron microscopy (SEM). This report describes the protocol, including microorganism cultures, bacterial biofilm formation conditions, biofilm staining, and LSCM and SEM visualizations.

This protocol describes a new method to grow and qualitatively analyze bacterial biofilms on fungal hyphae by confocal and electron microscopy.

Yeni Bir Yöntem Filamentli Mantar kolonileri ile ilgili Bakteriyel Biyofilmler Niteliksel Çok ölçekli Analizi için kullanılması Eşodaklı ve Elektron Mikroskobu

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic ...

Molecular Probe Optimization to Determine Cell Mortality in a Photosynthetic Organism (Microcystis aeruginosa) Using Flow Cytometry

Microbial subpopulations in field and laboratory studies have been shown to display high heterogeneity in morphological and physiological parameters. Determining the real time state of a microbial cell goes beyond live or dead categories, as microbes can exist in a dormant state, whereby cell division and metabolic activities are reduced. Given the need for detection and quantification of microbes, flow cytometry (FCM) with molecular probes provides a rapid and accurate method to help determine overall population viability. By using SYTOX Green and SYTOX Orange in the model cyanobacteria Microcystis aeruginosa to detect membrane integrity, we develop a transferable method for rapid indication of single cell mortality. The molecular probes used within this journal will be referred to as green or orange nucleic acid probes respectively (although there are other products with similar excitation and emission wavelengths that have a comparable modes of action, we specifically refer to the fore mentioned probes). Protocols using molecular probes vary between species, differing principally in concentration and incubation times. Following this protocol set out on M.aeruginosa the green nucleic acid probe was optimized at concentrations of 0.5 &#181;M after 30 min of incubation and the orange nucleic acid probe at 1 &#181;M after 10 min. In both probes concentrations less than the stated optimal led to an under reporting of cells with membrane damage. Conversely, 5 &#181;M concentrations and higher in both probes exhibited a type of non-specific staining, whereby &#39;live&#39; cells produced a target fluorescence, leading to an over representation of &#39;non-viable&#39; cell numbers. The positive controls (heat-killed) provided testable dead biomass, although the appropriateness of control generation remains subject to debate. By demonstrating a logical sequence of steps for optimizing the green and orange nucleic acid probes we demonstrate how to create a protocol that can be used to analyse cyanobacterial physiological state effectively.

Molecular Probe Optimization to Determine Cell Mortality in a Photosynthetic Organism Microcystis aeruginosa Using Flow Cytometry

Microbial populations contain substantial cell heterogeneity, which can dictate overall behavior. Molecular probe analysis through flow cytometry can determine physiological states of cells, however its application varies between species. This study provides a protocol to accurately determine cell mortality within a cyanobacterium population, without underestimating or recording false positive results.

Moleküler Probe Optimizasyonu (a Fotosentetik Organizmaya Hücre Ölümlerini belirleme<em&gt; Microcystis aeruginosa</em&gt;) Akım Sitometri Kullanımı

Microbial subpopulations in field and laboratory studies have been shown to display high heterogeneity in morphological and physiological parameters. ...

Tıp

Real-time Imaging and Quantification of Fungal Biofilm Development Using a Two-Phase Recirculating Flow System

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. While models for the growth under flow have been developed, many of these systems are expensive, or do not allow imaging while the cells are under flow. We have developed a novel apparatus that allows us to image the growth and development of Candida albicans cells under flow and in real-time. Here, we detail the protocol for the assembly and use of this flow apparatus, as well as the quantification of data that are generated. We are able to quantify the rates that the cells attach to and detach from the slide, as well as to determine a measure of the biomass on the slide over time. This system is both economical and versatile, working with many types of light microscopes, including inexpensive benchtop microscopes, and is capable of extended imaging times compared to other flow systems. Overall, this is a low-throughput system that can provide highly detailed real-time information on the biofilm growth of fungal species under flow.

We describe the assembly, operation, and cleaning of a flow apparatus designed to image fungal biofilm formation in real time while under flow. We also provide and discuss quantitative algorithms to be used on the acquired images.

Gerçek zamanlı görüntüleme ve miktar iki aşamalı dolaşım akış sistemi kullanarak mantar biyofilm gelişimi

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. ...

Akış sitometresi ile su biyofilmler karakterizasyonu

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Su Kimya ve Deniz Mikrobiyoloji A Field Guide - Okyanusu'nda gaybı Oyuncular çözülüyor